DE69226942T2

DE69226942T2 - Verfahren zur herstellung von optisch aktivem norborneol

Info

Publication number: DE69226942T2
Application number: DE69226942T
Authority: DE
Inventors: Bunji Ibaraki-Shi Isaka 567 Kageyama; Kyozo Hirakata-Shi Osaka 573-01 Kawata; Masanori Toyonaka-Shi Osaka 565 Nakae; Takayasu Sakai-Shi Osaka 590-01 Sonoyama
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1991-12-06
Filing date: 1992-12-04
Publication date: 1999-05-20
Anticipated expiration: 2012-12-05
Also published as: CA2101945C; ES2120454T3; US5459067A; WO1993011256A1; KR100260542B1; NZ246087A; AU655698B2; DE69226942D1; EP0570593A4; EP0570593A1; AU3094792A; JP3231325B2; DK0570593T3; EP0570593B1; ATE170926T1; CA2101945A1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem Norborneol durch Behandlung eines Esters des Typs exo-Norbornan mit einem Mikroorganismus.

Stand der Technik

Eines der bekannten Verfahren zur Herstellung von Norborneol ist das folgende chemische Syntheseverfahren: Norbornan als Ausgangsmaterial wird mit einer organischen Säure in Reaktion gebracht, um einen Norbornanester herzustellen; anschließend wird dieser Ester chemisch deacetyliert, um Norborneol zu erhalten. Nach solch einem chemischen Syntheseverfahren werden vier Typen von Stereoisomeren ((+, -) - (endo, exo) - Norborneol) hergestellt, so daß komplizierte Reinigungsschritte erforderlich sind, um optisch aktives Norborneol durch chemische Synthese zu erhalten.
Als Verfahren für die biologische Herstellung von Norborneol ist das folgende Verfahren bekannt: Ein Norbornanester wird mit einem Mikroorganismus in Kontakt gebracht oder mit einem Enzym zur Reaktion gebracht, und der Ester wird hydrolysiert (Tetrahedron Letters, 27, 2843-2844, 1986; Agr. Biol. Chem. 38, 1961- 1964, 1974). In den letzten Jahren haben Th. Oberhauser et al. von einem Verfahren zur Herstellung von (-)-Norborneol aus (±)- Norbornylacetat berichtet, bei dem eine Lipase verwendet wurde, die aus Candida cylindraceae stammte (Th. Oberhauser et al., Tetrahedron, 43, 3931-3941, 1987). Außerdem berichteten Oritani et al. von einem Verfahren zur Herstellung von (-)-Borneol und (-)-Isoborneol aus (±)-Bornylacetat und (±)-Isobornylacetat unter Verwendung einer Kultur aus Trichoderma sp., Trichoderma koningi, Bacillus subtilis var. Niger und Absidia hyalospora (T. Oritani et al., Agr. Biol. Chem., 38(10), 1961-1964, 1974). Allerdings haben die Reaktionen eine geringe Selektivität und daher haben die erhaltenen Produkte eine geringe optische Rein heit. Die japanische Offenlegungsschrift Nr. 2-273196 offenbart eine optische Auflösungsmethode, bei der ein Inhibitor einen racemischen Bestandteil auflöst, indem selektiv die Reaktion eines der Enantiomere durch einen biologischen Katalysator inhibiert wird. Dieses Verfahren kann zur Herstellung optisch aktiven Norborneols verwendet werden. Allerdings hat dieses Verfahren die folgenden Nachteile: Screening ist erforderlich, um einen effektiven Inhibitor für die Selektion optisch aktiven Norborneols zu erhalten, und ein Inhibitor sollte während der Reinigung nach der Reaktion entfernt werden, es ist daher eine komplizierte Manipulation erforderlich. In Anbetracht dieser Umstände besteht Bedarf für ein verbessertes biologisches Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem Norborneol, bei dem ein Ester mit einem Mikroorganismus oder Enzym in Kontakt gebracht wird, und das hohe Stereoselektivität während der Hydrolyse des Esters aufweist.

Offenbarung der Erfindung

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiven Norborneols mit hoher Reinheit zur Verfügung gestellt, bei dem man einen Ester vom exo-Norbornan-Typ mit einem Mikroorganismus behandelt.
Ein Verfahren zur Herstellung von (2S)-exo-Norborneol oder eines Esters vom Typ (2R)-exo-Norbornan in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung schließt einen Schritt ein, bei dem man einen Mikroorganismus oder behandelte Zellen desselben mit einem Ester vom Typ (±)-exo-Norbornan in Kontakt bringt, der durch die Formel (I) dargestellt wird:
in der R eine Acylgruppe darstellt, A und B unabhängig voneinander Wasserstoff darstellen oder A und B zur Bildung einer chemischen Bindung zusammengenommen werden,
wobei der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pseudomonas aeruginosa, Acetobacter pasteurianus, Arthrobacter sp. SHS-0145, Rhodotorula pallida, Rhodotorula rubra, und Saccharomyces sp SHS-20030.
Erfindungsgemäß wird der Ester vom (2S)-exo-Norbornan-Typ selektiv hydrolysiert, indem Ester vom Typ (±)-exo-Norbornan-Typ, die durch die oben erwähnte Formel (I) dargestellt werden, mit den oben erwähnten Mikroorganismen oder behandelten Zellen derselben in Kontakt gebracht werden. Aufgrund dieser Hydrolyse werden optisch aktive Alkohole und unveränderte Ester vom Typ (2R)-exo- Norbornan erhalten.
Nach dem obigen Verfahren wird Alkohol vom Typ (2S)-exo-Norbornan oder Ester vom Typ (2R)-exo-Norbornan aus dem Reaktionsgemisch erhalten.
Ester vom Typ (±)-exo-Norbornan, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird durch Formel (I) dargestellt:
in der R eine Acylgruppe darstellt, A und B unabhängig voneinander Wasserstoff darstellen oder A und B zur Bildung einer chemischen Bindung zusammengenommen werden.
In Formel (I) ist die Acylgruppe vorzugsweise eine aliphatische Acylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, und besonders bevor zugt eine aliphatische Acylgruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen. Beispiele für die aliphatische Acylgruppe schließen ein Acetyl, Propionyl, Butyryl, Isobutyryl, Pentanoyl und Hexanoyl. Besonders bevorzugte Beispiele der aliphatischen Acylgruppe schließen ein Formyl, Acetyl, Propinonyl und Isobutyryl. Die Acylgruppe kann eine Cycloalkylcarbonylgruppe mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen sein, und besonders bevorzugt eine Cycloalkylcarbonylgruppe mit 4 bis 7 Kohlenstoffatomen. Beispiele für die Cycloalkylcarbonylgruppe schließen ein Cyclopropancarbonyl, Cyclobutancarbonyl, Cyclopentancarbonyl, und Cyclohexancarbonyl. Alternativ können Arylcarbonylgruppen verwendet werden, und besonders vorzugsweise eine Arylcarbonylgruppe mit 7 bis 11 Kohlenstoffatomen. Beispiele für die Arylcarbonylgruppe schließen ein Benzoyl, p-Toluoyl und Naphthoyl.
Die oben erwähnte Verbindung ist kommerziell erhältlich oder kann durch chemische Synthese einfach hergestellt werden. Beispielsweise wird Norbornen mit einer geeigneten organischen Säure (z. B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure) in der Gegenwart eines sauren Katalysators zur Reaktion gebracht; oder ein Vinylester einer geeigneten organischen Säure und Cyclopentadien werden einer Diels-Alder-Reaktion unterworfen, wobei der erwünschte Ester vom Typ (±)-exo-Norbornan (I) mit hoher Ausbeute erhalten werden kann.
In der vorliegenden Erfindung werden als Mikroorganismen Pseudomonas aeruginosa, Acetobacter pasteurianus, Arthrobacter sp. SHS-0145, Rhodotorula pallida, Rhodotorula rubra oder Saccharom yces sp- SHS-20030 verwendet.
Noch genauer werden Stämme verwendet wie Pseudomonas aeruginosa IFO 12582, Acetobacter pasteurianus ATCC 9432, Acetobacter pasteurianus ATCC 12873, Arthrobacter sp. SHS-0145 (FERM BP-4060), Rhodotorula pallida IFO 0715, Rhodotorula rubra IFO 1101, Rhodotorula rubra ATCC 2510 und Saccharomyces sp. SHS-20030 (FERN BP- 4061). Arthrobacter sp. SHS-0145 und Saccharomyces sp. SHS-20030 wurden beide hinterlegt beim Ministerium für Internationalen Handel und Industrie (MITI), Abteilung für industrielle Wissenschaft und Technologie, Fermentations-Forschungsinstitut mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-4060 und FERM BP-4061 am 2. November 1992 in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag über die Internationale Anerkennung für die Hinterlegung von Mikroorganismen für Patentzwecke.
Die oben erwähnten Mikroorganismen werden in einem Medium gezüchtet, das Nährstoffe enthält, die generell zum Züchten von Mikroorganismen verwendet werden, wie Glucose, Sucrose, Restmolasse, Polypepton, Fleischextrat, Hefeextrat, Schweinefleischpulver, Sojabohnenpulver, Phosphatsalze, Magnesium, Eisen und ähnliches.
In einem erfindungsgemäßen Verfahren wird (±)-exo-Norbornanester mit dem oben erwähnten Mikroorganismus oder behandelten Zellen derselben in Kontakt gebracht. Insbesondere wird beispielsweise Ester vom Typ (±)-exo-Norbornan (I) direkt zu einer Kultur des oben erwähnten Mikroorganismus gegeben, so daß eine Konzentration von 0,5 bis 10% resultiert und die so erhaltene Kultur wird weiter kultiviert, wobei der Ester hydrolysiert wird, um Alkohol vom Typ Norbornan 2S-(II) und Ester vom Typ Norbornan 2R-(I) erhalten wird. Anstelle obiger Kultur kann eine Zellsuspension oder ein Zellextrakt für diese Hydrolyse verwendet werden. Die Zellsuspension wird erhalten, indem Zellen der Kultur durch Zentrifugation, Filtration, etc. gesammelt werden und indem die gesammelten Zellen in einem Puffer resuspendiert werden, dessen pH-Wert für die Reaktion geeignet ist oder in einem Puffer, der ein organisches Lösungsmittel enthält. Der Zellextrakt wird hergestellt, indem die gesammelten Zellen unter Verwendung lytischer Enzyme oder generell unter Verwendung von Ultraschall, French-Presse, etc. aufgeschlossen werden und die Zelltrümmer durch Zentrifugation, etc. entfernt werden.
Erfindungsgemäß bezieht sich das in Kontakt bringen eines Ester vom Typ (±)-exo-Norbornan mit einem Mikroorganismus auf die direkte Zugabe eines Esters vom Typ (±)-exo-Norbornan zu einer Kultur; und das in Kontakt bringen eines Esters vom Typ (±)-exo- Norbornan mit behandelten Zellen eines Mikroorganismus bezieht sich auf Zugabe eines Esters vom Typ (±)-exo-Norbornan zu einer Zellsuspension oder einen Zellextrakt anstelle der Kultur.
Damit die Reaktion effizient durchgeführt werden kann, kann der hinzuzugebende (±)-Ester (I) in einem hydrophoben Lösungsmittel wie n-Hexan oder in einem hydrophilen Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid, Methanol und Ethanol in einer Konzentration von 10 bis 75% gelöst verwendet werden.
Eine Reaktionsabfolge der oben erwähnten erfindungsgemäßen Hydrolyse ist im folgenden Verfahrens-Diagramm a gezeigt: (Verfahrens-Diagramm a)
In diesem Verfahrens-Diagramm sind R, A und B das gleiche wie oben beschrieben.
Wie in dem oben erwähnten Verfahrens-Diagramm gezeigt, wird unter den exo-Norbornanestern nur 2S-(I) selektiv hydrolysiert und zu Alkohol vom Typ exo-Norbornan 2S-(II) umgewandelt. Der größte Teil des Esters vom Typ Norbornan 2R- (I) bleibt in der Reaktionslösung zurück, ohne eine Reaktion eingegangen zu sein. Daher wird eine Reaktionslösung erhalten, die Alkohol vom Typ Norbornan 2S-(II) und Ester vom Typ Norbornan 2R-(I) enthält. So erhaltener Alkohol 2S-(II) und Ester vom Typ exo-Norbornan 2R-(I) der keine Reaktion eingeht, können durch bekannte Methoden voneinander abgetrennt werden. Beispielsweise können Alkohol 2S-(II) und Ester vom Typ exo-Norbornan 2R-(I) durch Chromatographie voneinander getrennt werden. Zusätzlich ist es auch möglich, daß Alkohol zu 2S-(II) durch eine geeignete Methode wasserlöslich gemacht wird (z. B. Alkohol 2S-(II) wird mit einer organischen Säure wie Phthalsäureanhydrid zur Reaktion gebracht, um einen Halbester zu bilden), und der so erhaltene Alkohol 2S- (II) extrahiert wird, um den gewünschten optisch aktiven Bestandteil vom Typ Norbornan zu erhalten.
Im folgenden wird der Fall beschrieben, daß (±)-exo-Norbornylacetat verwendet wird. (Verfahrens-Diagramm b)
Wie in der Reaktionsabfolge b gezeigt, wird zu dem Reaktionsgemisch, das durch die erfindungsgemäße Behandlung zur Extraktion von Norborneol(-)-2 und Norbornylacetat(-)-1 erhalten wurde, das 0,1- bis 2fache des Volumens eines geeigneten Lösungsmittels hinzugegeben. Als Lösungsmittel können Chloroform, Dichlormethan, Ethylacetat, n-Hexan, etc. allein oder in Kombination verwendet werden. Das extrahierte Norborneol(-)-2 und Norbornylacetat(-)-1 werden in geeigneter Weise konzentriert. Anschließend wird das 1- bis 2fache an Volumen eines organischen Säureanhydrids wie Maleinsäureanhydrid und Phthalsäureanhydrid zu dem so hergestellten Konzentrat hinzugegeben, um ein wasserlösliches Addukt von Norborneol (-)-2 und einer organischen Säure (Maleinsäure, Phthalsäure, etc.) zu bilden. Außerdem wird eine Lösung eines basischen Bestandteils wie Natriumbicarbonat zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben, um es zu neutralisieren. Danach wandern das organische Säureaddukt von Norborneol(-)-2 und Norbornylacetat(-)-1 in eine wäßrige Schicht bzw. eine Schicht aus einem organischen Lösungsmittel. Die wäßrige Schicht wird abgetrennt und einer alkalischen Behandlung unterworfen. Danach wird die so behandelte wäßrige Schicht mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Dichlormethan extrahiert und konzentriert; als Ergebnis kann Norborneol(-)-2 mit hoher optischer Reinheit erhalten werden. Norbornylacetat(-)-1 kann aus der Schicht aus organischem Lösungsmittel gewonnen werden, welche erhalten wird, indem sie von der wäßrigen Schicht abgetrennt wird, indem die Lösungsmittelschicht konzentriert wird. Nachdem Norbornylacetat(-)-1 erhalten wurde, wird es in Kontakt gebracht mit einer kommerziell verfügbaren Lipase, Esterase, etc. oder es wird chemisch diacetyliert, wodurch Norborneol(+)-2 mit hoher optischer Reinheit leicht erhalten werden kann.
Wenn so erhaltenes (-)-exo-Norborneol oder (+)-exo-Norborneol wenn gewünscht mittels bekannter Methoden gereinigt wird, beispielsweise wie in A. Irwin, J. B. Jones: A. Am. Chem. Soc. 98, 8476-8481 (1976), etc. beschrieben, kann eine optisch aktive Substanz mit höherer Reinheit leicht erhalten werden. Beispielsweise werden durch das oben beschriebene Verfahren diese Bestandteile in wasserlösliche Bestandteile überführt. Anschließend wird (-)- oder (+)-Phenethylamin zu den entsprechenden, so erhaltenen Komponenten hinzugegeben, um die jeweiligen Phenethylaminsalze zu bilden, wodurch eine optisch aktive Substanz mit hoher Reinheit von 98% enantiomerem Überschuß (ee) oder mehr erhalten werden kann. Alternativ können diese Bestandteile gereinigt werden, indem allgemein eine Säulenchromatographie verwendet wird.
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung im Detail durch erläuternde Beispiele und Referenzbeispiele beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist darauf nicht beschränkt.

Beispiel 1

Acetobacter pasteurianus ATCC 9432 wurden in 3 l GPBY Medium gegeben (4% D-Glucose, 2% Polypepton, 2% Fleischextrakt, 2% Hefeextrakt, 0,2% Kaliumphosphat, 0,2% Magnesiumsulfat und 0,2% Calciumcarbonat, pH-Wert 7,0), das kurz vorher in einem 5 l Kleingefäßfermenter hergestellt worden war und bei 28ºC 24 Stunden lang kultiviert. Die Kultur wurde bei 1000 G 10 Minuten lang zentrifugiert, um feste Bestandteile zu entfernen, und dann bei der hohen Geschwindigkeit von 20 000 G für 15 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Die gesammelten Zellen wurden 2mal in einer Salzlösung gewaschen. Als Resultat wurden 19,8 g feuchter Zellen erhalten. Die feuchten Zellen wurden in 600 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH-Wert 6,5) suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 12 g (±)-exo-Norbornylacetat ((±)-1) gegeben und das Gemisch wurde unter Rühren bei 30ºC 1 Stunde lang zur Reaktion gebracht. Im Verlauf der Reaktion wurde 0,1 N Natriumhydroxid in kleinen Mengen zu dem Reaktionsgemisch gegeben, und der pH-Wert des Reaktionsgemisch wurde bei 6,5 ± 0,2 gehalten. Nach Ablauf der Reaktion wurde 1 ml des Reaktionsgemisches entnommen. Zu 1 ml des Reaktionsgemischs wurde 1 ml Chloroform gegeben, um die Reaktionsprodukte Norborneol(-)-2 und Norbornylacetat (-)-1 zu extrahieren. Die Extrakte wurden durch Gaschromatographie analysiert (Säule für optische Auflösung CDX-B Typ (e 0,25 mm · 30 m), Säulentemperatur 50ºC bis 210ºC, hergestellt durch J & W Corp.), wobei 8,5 mg/ml exo-Norbornylacetat, 5,2 mg/ml (-)-(1S,2S,4R)-exo-Norborneol (-)-2 und 0,3 mg/ml (+)-(1R,2R,4S)-exo-Norborneol(+)-2 detektiert wurden. Das Reaktionsgemisch wurde 2mal mit Toluol extrahiert (300 ml und 100 ml). Die Toluolschichten, die durch diese Extraktion erhalten wurden, wurden zusammengegeben, so daß 380 ml Toluollösung erhalten wurden. Die Toluollösung wurde auf 50 ml aufkonzentriert. Dann wurden 4,2 g Maleinsäureanhydrid zu der konzentrierten Lösung gegeben und bei 115ºC 4 Stunden lang zur Reaktion gebracht. Danach wurden zu dieser Reaktionslösung 300 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung gegeben, 5 Minuten lang gerührt und dann 10 Minuten lang stehen gelassen. Nach der Reaktion wurde eine wäßrige Schicht von einer Toluolschicht abgetrennt, wobei etwa 300 ml einer wäßrigen Schicht und etwa 50 ml einer Toluolschicht erhalten wurden.
Zu 200 ml der so erhaltenen wäßrigen Schicht wurde konzentrierte Salzsäure gegeben, wodurch die wäßrige Schicht sauer gemacht wurde. Die saure wäßrige Schicht wurde mit 100 ml Dichlormethan extrahiert und konzentriert, um 5,9 g des Maleinsäurebestandteils zu erhalten. Der so erhaltene Maleinsäurebestandteil wurde in 50 ml Methanol gelöst. Dann wurden 4 g Kaliumhydroxid, gelöst in 50 ml Wasser, in Tropfen zu der Maleinsäurebestandteil-Lösung hinzugegeben, und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang zur Reaktion gebracht. Nach Abschluß der Reaktion wurde das Reaktionsprodukt mit Dichlormethan extrahiert und durch Konzentration des Extraktes wurden farblose Kristalle von (-)-(1S,2S,4R)-exo-Norborneol(-)-2 erhalten. Ausbeute: 2, 8 g (64%), [α]²&sup5;D: -3,01º (C = 1,46, CHCl&sub3;), und optische Reinheit: 90% ee.

Beispiel 2

Norbornylacetat und Norborneol wurden von 400 ml des die Zellsuspension und (±)-exo-Norbornylcetat ((±)-1) enthaltenden Reaktionsgemischs, das auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 erhalten wurde, mit 300 ml Toluol auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 extrahiert. Der Extrakt wurde auf etwa 50 ml aufkonzentriert. Zu der konzentrierten Lösung wurden 4,2 g Phthalsäureanhydrid gegeben und bei 115ºC 4 Stunden Lang zur Reaktion gebracht. Danach wurden 200 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung zu der Reaktionslösung gegeben, bei Raumtemperatur etwa 5 Minuten lang gerührt und 10 Minuten lang stehen gelassen. Nach der Reaktion wurde eine Toluolschicht von einer wäßrigen Schicht abgetrennt, wobei 50 ml einer Toluolschicht und 200 ml einer wäßrigen Schicht erhalten wurden. Zu 200 ml der so erhaltenen wäßrigen Schicht wurde konzentrierte Salzsäure hinzugegeben, wodurch die wäßrige Schicht sauer gemacht wurde. Danach wurde die saure wäßrige Schicht mit 100 ml Dichlormethan extrahiert, und das Dichlormethan wurde abdestilliert, um 7,3 g Phthalsäuremonoester zu erhalten. Der so erhaltene Phthalsäuremonoester wurde in 75 ml Ethylacetat gelöst. Danach wurden 3,4 g (-)-Phenethylamin in Tropfen zu der Phthalsäuremonoesterlösung gegeben, um 9,0 g Phenethylenaminsalz zu erhalten. Das Aminsalz wurde 2mal mit 45 ml Ethanol umkristallisiert. Dann wurden Toluol und Wasser zu den so erhaltenen Kristallen gegeben, und 8,3 ml eines 7,3%igen Salzsäurelösung wurde in Tropfen zu dem Kristall gegeben und danach wurde die Toluolschicht abgetrennt. Die Toluolschicht wurde konzentriert und in 20 ml Methanol gelöst. Dann wurde eine 7,4%ige Natriumhydroxidlösung in Tropfen zu dem Methanol gege ben, indem die Toluolschicht gelöst worden war und bei 50ºC 2 Stunden lang zur Reaktion gebracht. Das Reaktionsprodukt wurde mit Dichlormethan extrahiert und der Extrakt wurde konzentriert, um 1,3 g farblose Kristalle von (-)-(1S,2S,4R)-exo-Norborneol(- )-2 zu erhalten. Ausbeute: 50%, [α]²&sup5;D: -3,20º (C = 1,30, CHCl&sub3;), und optische Reinheit: 98% ee.

Beispiel 3

Zunächst wurden 50 ml der in Beispiel 1 erhaltenen Toluolschicht unter reduziertem Druck konzentriert, um 4,9 g ölartigen Norbornylacetats(-)-1 zu erhalten. Dieses Norbornylacetat wurde in 50 ml Methanol gelöst. Dann wurden 50 ml 8%igen Natriumhydroxids in Tropfen zu der Lösung gegeben und bei 50ºC 2 Stunden lang zur Reaktion gebracht. Danach würde das Reaktionsprodukt mit Dichlormethan extrahiert. Der so erhaltene Extrakt wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um kristallisiert zu werden, wobei 3,1 g farbloser Kristalle von (+ )-(1R,2R,4S)-exo-Norborneol(+)-2 erhalten wurden. Ausbeute: 71%, und optische Reinheit: 95% ee oder mehr.

Beispiel 4

Zunächst wurde 1 l des in Beispiel 1 beschriebenen GPBY Mediums in einen 2 l Minigefäßfermenter gegeben, und mit Acetobacter pasteurianus ATCC 9432 inkubiert, gefolgt von einer 24-stündigen Kultivierung bei 30ºC. Dann wurden 10 g (±)-exo-Norbornylacetat zu der Kultur gegeben, und die Kultur wurde für weitere 4 Stunden zur Reaktion gebracht. Das so erhaltene Reaktionsprodukt wurde mit 400 ml Chloroform extrahiert. Der Extrakt wurde einer Gaschromatographie unterworfen, bei der der Gehalt einer im Extrakt vorhandenen Komponente gemessen wurde. Erhalten wurden 10,3 mg/ml exo-Norbornylacetat, 6,2 mg/ml (-)-(1S,2S,4R)-exo- Norborneol(-)-2, und 0,5 mg/ml (+)-(1R,2R,4S)-exo-Norborneol(+)- 2.

Beispiel 5

Zunächst wurden zur Herstellung einer Zellsuspension 20 ml 0,1 M Trishydrochloridpuffer (pH-Wert 7,2) zu 10 g nasser Zellen von Acetobacter pasteurianus ATCC 9432 gegeben, die auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 erhalten wurden. Die Zellen wurden durch eine French-Presse aufgeschlossen. Dann wurden 0,3 mg Desoxyribonuklease zu etwa 30 ml des so erhaltenen Lysates gegeben. Das Lysat wurde auf Eis 20 Minuten lang behandelt und bei 30 000 G 15 Minuten lang zentrifugiert, wodurch gebrochene Zellen und Zelltrümmer entfernt wurden, so daß 22 ml Zellextrakt erhalten wurden. Dann wurden 100 mg (±)-exo-Norbornylacetat zu 10 ml Zellextrakt gegeben und unter leichtem Rühren in einen Inkubator bei 30ºC 1 Stunde lang zur Reaktion gebracht. Nach Abschluß der Reaktion wurde das Reaktionsprodukt mit 10 ml Chloroform extrahiert. Der Extrakt wurde einer Gaschromatographie unterworfen, wodurch der Gehalt eines im Extrakt vorhandenen Bestandteils gemessen wurde. Dies ergab, daß die Konzentrationen an exo-Norbornylacetat, (-)-(1S,2S,4R)-exo-Norborneol(-),-2 und (+)- (1R,2R,4S)-exo-Norborneol(+)-2 4,6 mg/ml, 3,0 mg/ml und 0,3 mg/ml, respektive, waren.

Beispiel 6

Zunächst wurden 50 ml des in Beispiel 1 beschriebenen GPBY Mediums in eine 500 ml Flasche gegeben und dann sterilisiert. Das Medium wurde mit einem in Tabelle 1 gezeigten Mikroorganismus inokuliert und bei 30ºC 24 Stunden lang kultiviert. Dann wurden 500 mg (±)-exo-Norbornylacetat zu der Kultur gegeben und diese für 16 Stunden kultiviert, nachdem sie mit einem Gummiband versiegelt wurde. Das Norbornylacetat und Norborneol der Kultur wurden durch Gaschromatographie auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 analysiert. Die Resultate sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
*NAC: exo-Norbornylacetat

Beispiel 7

Zunächst wurde 1 l des in Beispiel 1 beschriebenen GPBY Mediums in einen 2 l Minigefäßfermenter gebracht. Dann wurden Pseudomonas aeruginosa IFO 12582 und Saccharomyces SD. SHS-20030 (FERM BP-4061), respektive, in Kontakt mit dem Medium gebracht und bei 30ºC 24 Stunden lang kultiviert. Jede Kultur wurde wie in Beispiel 1 beschrieben zentrifugiert, wobei die Zellen in jeder Kultur gesammelt und gewaschen wurden. Die Zellen von jeder Kultur wurden in einem 0,05 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) suspendiert, so daß die optische Dichte (660 nm) davon 10 war. (±)- exo-Norbornylacetat war vorher in Dimethylsulfoxid gelöst worden, um eine Konzentration von SO Gew.-% zu erhalten.
Danach wurden 100 ml jeder Zellsuspension in eine 500 ml Flasche gebracht, und 2,0 ml 50% (±)-exo-Norbornylacetatlösung wurden zu jeder Zellsuspension gegeben. Jede Flasche wurde mit einem Gummiband versiegelt und dann wurde jede Zellsuspension bei 30ºC zur Reaktion gebracht. Der Fortlauf der Reaktion wurde auf Basis der zugegebenen Menge 0,1 N Natriumhydroxid überwacht, die notwendig war, um einen pH-Wert von 7,0 aufrechtzuerhalten. Am Ende der Reaktion wurde eine kleine Menge des Reaktionsgemischs (0,5 ml) genommen, und ein Reaktionsprodukt wurde mittels Gaschromatographie auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 bestätigt. Zum Zeitpunkt als etwa 70% des zugegebenen Norbornylacetats verbraucht waren, wurde die Reaktion beendet und 100 ml Toluol wurden zu dem Reaktionsgemisch gegeben. So wurden Norbornylacetat und Norborneol extrahiert. Der Extrakt jeder Reaktionslösung wurde auf etwa 25 ml aufkonzentriert. Dann wurden 0,4 g Maleinsäureanhydrid zu jedem Extrakt gegeben, und bei 115ºC 4 Stunden lang zur Reaktion gebracht. Zu jeder Reaktionslösung wurden 25 ml gesättigtem Natriumbicarbonat gegeben und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang gerührt, und danach etwa 10 Minuten lang stehen gelassen. Als ein Ergebnis bildeten sich in jeder Reaktionslösung eine wäßrige Schicht und eine Toluolschicht. Durch Konzentration der Toluolschicht wurde ölartiges (-)-exo-Norbornylacetat(-)-1 erhalten. Dieses Norbornylacetat wurde in 10 ml Methanol gelöst, und 8% Natriumhydroxid wurde in Tropfen zu der so erhaltenen Lösung gegeben und bei 50ºC 2 Stunden lang unter alkalischen Bedingungen zur Reaktion gebracht. Dann wurde dieses Reaktionsprodukt mit 10 ml Dichlormethan extrahiert. Der Extrakt wurde konzentriert, wodurch (+)-(1R,2R,4S)-exo-Norboneol(+)-2 kristallisiert wurde. Der so erhaltene Kristall wurde mittels Gaschromatographie analysiert. Die Resultate sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
Zunächst wurden 50 ml des Antibiotischen Mediums 3 (Difco) in eine 500 ml Flasche gegeben. Das Medium wurde mit Arthrobacter sp. SHS-0145 (FERM BP-4060) inokuliert und 20 Stunden lang bei 30ºC kultiviert. Danach wurden 100 mg (±)-exo-Norbornylacetat zur Kultur gegeben, und die Kultur wurde weitere 8 Stunden lang zur Reaktion gebracht. Zu dieser Kultur wurden 20 ml Chloroform gegeben, wodurch Norbornylacetat und Norborneol extrahiert wurden. Der entsprechende Gehalt an (-)-(1S,2S,4R)-exo-Norborneol(- -2, (+)-(1R,2R,4S)-exo-Norborneol(+)-2 in dem Extrakt wurde mittels Gaschromatographie auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 gemessen. Dies ergab das 1,02 mg/ml (-)-(1S,2S,4R)-exo-Norborneol(-)-2 und 0,11 mg/ml (+)-(1R,2R,4S)-exo-Norborneol(+)-2 im Extrakt enthalten waren.
Im folgenden werden die bakteriologischen Eigenschaften von Arthrobacter sp. SHS-0145 (FERM BP-4060) beschrieben.

1. Morphologische Eigenschaften

Zellen dieses Stammes sind Gram-positive Stäbchen und haben verschiedene Formen und Größen. In einer frühen logarithmischen Wachstumsphase (Bouillon-Agar-Medium, 30ºC, 8 bis 12 Stunden Kultivierung) werden die Zellen stäbchenförmig mit einer Größe von 1,0 bis 1, 1 · 3,0 bis 4,0 um. In einer späten logarithmischen Wachstumsphase werden die Zellen kurz-stäbchenförmig (Bouillon-Agar-Medium, 30ºC, 24 bis 48 Stunden Kultivierung). In einer stationären Phase werden die Zellen kokkenförmig (1,0 bis 1,1 um Durchmesser, Bouillon-Agar-Medium, 30ºC, 72 bis 96 Stunden Kultivierung). Sporulation wird nicht beobachtet. Die Zellen sind beweglich.

2. Kultureigenschaften

Wachstum auf einer Bouillon-Agar-Platte (30ºC, 7 Tage Kultivierung): Flache schimmernde runde leicht gelbe bis leicht gelblich-weiße Kolonien mit einem Durchmesser von 1,4 bis 1,6 mm werden innerhalb von 24 Stunden gebildet.
Wachstum auf eine geneigten Schicht aus Bouillon-Agar (30ºC, 7 Tage Kultivierung): Der Stamm wird leicht wachsen gelassen entlang eines Inokulierungsabstriches.
Wachstum in einem Bouillon-Soft-Agar (30ºC, 7 Tage Kultivierung): Der Stamm wächst moderat auf einer Oberfläche, und das Wachstum wird nur im oberen Teil einer Stabkultur beobachtet.
Statische Bouillonkultivierung (30ºC, 7 Tage Kultivierung): Der Stamm wächst hauptsächlich unter Bildung eines dicken Überzuges auf der Oberfläche der Kultur. Die Kulturlösung wird leicht trübe, und die Menge eines Präzipitats ist gering. Geruch wird praktisch nicht festgestellt.

3. Wachstum

Wachstumstemperatur: Mögliche Wachstumstemperatur 10 bis 37ºC, und optimale Wachstumstemperatur 24 bis 32ºC (Peptonwasser).
Hitzeresistenz: Der Stamm überlebt nicht mehr als 30 Minuten in Magermilch bei 63ºC.
Wachstums-pH: Möglicher Wachstums-pH 5,2 bis 10, und maximaler Wachstums-pH 6,0 bis 9,0 (Peptonwasser).
Verhalten bezüglich Sauerstoff: aerob. Wachstum in einer anaeroben Atmosphäre (Gas pack®, Bouillon-Agar-Platte) wird nicht beobachtet.

4. Zusammensetzung der Zellwand: meso-DAP (meso-Diaminopimersäure) wird nicht gefunden.

5. G + C-Gehalt der DNA: 57%

6. Hauptsächliche verschiedene physiologische Charakteristika OF-Test: Oxidativ (D-Glucose)

Säurebildung: Säure wird hergestellt aus D-Glucose, Galactose, D-Mannose, Sucrose, Trehalose, Fructose (schwach) und Mannitol (schwach), aber kaum Säure wird hergestellt aus L-Arabinose und D-Xylose. Säure wird nicht hergestellt aus Lactose, Ribose, Sorbose, Rhamnose, Inositol, Cellobiose und Maltose.
Litmusmilch: Negativ
Verflüssigung von Gelatine: Negativ
VP-Reaktion: Negativ
MR-Reaktion: Negativ
Herstellung von Hydrogensulfiden: Negativ
Verwendung von Zitronensäure: Positiv (Christensen-Medium, Simmons-Medium)
Verwendung von anorganischen Stickstoffquellen: Ammoniumsalz und Nitrat werden verwendet.
Urease: Positiv
Catalase: Positiv
Oxidase: Positiv
DNase: Negativ
Reduktion von Methylenblau: Positiv

7. Quelle für die Isolierung: Boden in Japan

Im folgenden werden die mikrobiologischen Eigenschaften von Saccharomyces sp. SHS-20030 (FERM BP-4061), der in Beispiel 6 und 7 verwendet wird, beschrieben.

1. Morphologische Eigenschaften

Form: Dieser Stamm ist eine Hefe mit sphärischer oder ovaler Form mit 3,5 bis 4, 5 · 5 bis 6 um und wächst hauptsächlich durch Knospung. Multipolare Knospung wird beobachtet (Malzextrat-Agar- Medium, 28ºC, 3 Tage Kultivierung). Mycelium wird nicht beobachtet.
Ascospore: Eine bis vier Sporen mit einer sphärischen oder beinahe ovalen Form werden gebildet (Gorodokawa-Agar-Medium, 28ºC, 10 Tage Kultivierung).

2. Assimilierung und Fermentierung von Zuckern

Die Assimilierung und Fermentierung von Glucose, Galactose, Sucrose, Maltose und Raffinose wird beobachtet. Die Assimilierung und Fermentierung von Lactose, Cellobiose und Stärke wird nicht beobachtet.

3. Anderer physiologischer Test

Assimilierung von Paraffin: Negativ
Assimilierung von Kaliumnitrat: Negativ
Abbau von Arbutin: Negativ
Bedarf an Vitamin: Keiner

INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT

Das Verfahren für die Verwendung des erfindungsgemäß erhaltenen optisch aktiven Alkohols vom Norbornan-Typ wird in den folgenden Referenzbeispielen beschrieben.

Referenzbeispiel 1

Zunächst wurden 2,8 g (0,025 Mole) (-)-(1S,2S,4R)-exo-Norborneol, erhalten in Beispiel 1, in 56 ml Methylenchlorid gelöst. Zu diesem Gemisch wurden 8,1 g Pyridiniumchlorochromat (PPC) (molares Verhältnis 1,5) und 1 g molekulares Sieb 4A® hinzugegeben und bei einer Temperatur von 25 bis 30ºC 1 Stunde lang zur Reaktion gebracht. Die Reaktionslösung wurde mit 56 ml Toluol verdünnt, danach wurde die Reaktionslösung durch eine Säule mit 28 g Silicagel gelassen, wobei eine nicht gelöste Substanz entfernt wurde. Durch Konzentrierung der Ausflußlösung bis zur Trockene wurde rohes (+)-Norcamphor als weißes, kristallines Puder erhalten. Das so erhaltene (+)-Norcamphor wurde in 45 ml Tetrahydrofuranlösung gelöst. Die so erhaltene Lösung wurde in Tropfen zu 30 ml LDA-Tetrahydrofuranlösung (molares Verhältnis 1, 1) bei -10 bis -15ºC gegeben. Die so erhaltene Lösung wurde 20 Minuten lang bei -10 bis -15ºC zur Reaktion gebracht. Danach wurden 3,3 g Allylbromid (molares Verhältnis 1,1) in Tropfen zu der Reaktionslösung bei 0ºC oder weniger gegeben und bei Raumtemperatur 3 Stunden lang zur Reaktion gebracht. Die Reaktionslösung wurde in 70 ml Eiswasser gegossen und mit verdünnter Salzsäure angesäuert. Danach wurde die Reaktionslösung 2mal mit 50 ml Toluol extrahiert. Die Toluolschicht wurde mit Wasser gewaschen und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abdestilliert. Als ein Resultat wurde rohes (+ )-exo-3-(2-Propenyl)-bicyclo[2,2,1]heptan-2-on als ein öliger Rest erhalten Das (+)-exo-3-(2-Propenyl)-bicyclo[2,2,1]heptan-2-on wurde aufgereinigt, indem Fraktionen bei einer Kochtemperatur im Bereich von 92 bis 103ºC/10 bis 12 mm Hg unter reduziertem Druck gesammelt wurden. Ausbeute: 3,07 g (82%), chemische Reinheit (GC): 98,6%, Endosiomer: 0,4%, optische Reinheit (HPLC): 90% ee, und spezifische Rotation: [α]²&sup5;D + 84,6º (C = 1,0, CHCl3).

Referenzbeispiel 2

Die Reaktion und die Behandlung wurden unter Verwendung des in Beispiel 2 erhaltenen (-)-(1S,2S,4R)-exo-Norborneol auf dieselbe Weise wie in Referenzbeispiel 1 durchgeführt. Das Rohprodukt wurde unter reduziertem Druck durch Destillierung gereinigt, und Fraktionen wurden am Siedepunkt gesammelt im Bereich von 74 bis 86ºC/3 bis 4 mm Hg, um das gewünschte (+)-exo-3-(2-Propenyl)- bicyclo[2, 2,1]heptan-2-on zu erhalten. Ausbeute: 1,38 g (78%), chemische Reinheit (GC): 98,8%, Endosiomer: 0,9%, optische Reinheit (HPLC): 98% ee, spezifische Rotation: [α]²&sup5;D + 89º (C = 1,286, CHCl&sub3;), IR(Film) 3060, 1740, 1640, 1460, 1440, 1310, 1090 cm&supmin;¹. ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ1,30-2,00 (m, 8H), 2,5-2,6 (m, 3H) δ4,90-5,20 (m, 2H), 5,7-5,9 (m, 1H).
Die Bestandteile, die in den oben erwähnten Referenzbeispielen erhalten wurden, können unter Verwendung des Verfahrens (J. Med. Chem. 31(9), 1847-1854 (1988)) als TXA&sub2;-Rezeptorantagonist verwendet werden, der pharmazeutisch verwendbar ist.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von (2S)-exo-Norborneol oder von Estern des Typs (2R)-exo-Norbornan, bei dem man einen Mikroorganismus oder behandelte Zellen desselben in Kontakt mit einem Ester vom Typ (±)-exo-Norbornan bringt, der durch die Formel (I) dargestellt wird:

in der R eine Acylgruppe darstellt, A und B unabhängig voneinander Wasserstoff darstellen oder A und B zur Bildung einer chemischen Bindung zusammengenommen werden, wobei der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pseudomonas aeruginosa, Acetobacter pasteurianus, Arthrobacter sp. SHS-0145, Rhodotorula pallida, Rhodotorula rubra, und Saccharomyces sp. SHS-20030.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem R eine Acetylgruppe ist.

3. Arthrobacter sp. SHS-0145 (FERM Nr. BP-4060).