DE3217908C2

DE3217908C2 -

Info

Publication number: DE3217908C2
Application number: DE3217908A
Authority: DE
Inventors: Tokio Oshima; Tomio Kimura; Tetsuo Omata; Noritada Ube Yamaguchi Jp Iwamoto
Original assignee: Ube Industries Ltd
Current assignee: Ube Corp
Priority date: 1981-05-14
Filing date: 1982-05-12
Publication date: 1989-02-09
Also published as: JPS57186495A; US4443548A; NL8201979A; DE3217908A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-α-Methylphenylalaninen der allgemeinen Formel (I):

in der R¹ und R² unabhängig voneinander jeweils stehen für ein Wasserstoffatom oder einen Methylrest.

Es ist bekannt, daß L-α-Methylphenylalanine, jedoch nicht D-α-Methylphenylalanine pharmakologische Aktivitäten aufweisen. So ist beispielsweise L-3,4-Dihydroxy-α-Methylphenylalanin ein ausgezeichneter Hypotensor, wohingegen D-3,4-Dihydroxy-α-Methylphenylalanin keine Hypotensor-Aktivitäten aufweist. Infolgedessen stellt eine wirksame optische Trennung von chemisch synthetisierten DL-α-Methylphenylalaninen ein wichtiges, zu lösendes Problem dar.

Es sind verschiedene optische Trennungsmethoden von razemischen Mischungen von α-Methylphenylalaninen bekannt, einschließlich physikalischer Methoden, wie z. B. Diastereomer-Methoden, wie sie z. B. in der GB-PS 9 36 074 beschrieben werden, Methoden der fraktionierten Kristallisation, wie sie z. B. in der FR-PS 15 31 877 beschrieben werden, und biochemische Methoden unter Einsatz von Mikroorganismen.

Die bekannten Diastereomer-Methoden haben den Nachteil, daß die Ausbeute an den gewünschten Verbindungen gering ist, daß die Gewinnung der gewünschten Verbindungen vergleichsweise mühsam ist und daß ferner das Trennungsmittel teuer ist und daß die Wiedergewinnung des Trennungsmittels nicht einfach zu bewerkstelligen ist. Die bekannten Methoden der fraktionierten Kristallisation sind deshalb nachteilig, weil das razemische Gemisch oftmals vor der optisch aktiven Verbindung kristallisiert, gelegentlich selbst dann, wenn Kristalle der gewünschten optisch aktiven Verbindung als Keime verwendet werden. Nachteilig ist des weiteren, daß sowohl der Trennungsgrad (%) als auch die Kristallisation der gewünschten optischen aktiven Verbindung langsam verläuft.

Bei den bekannten biochemischen Trennungsverfahren werden N-Succinyl- oder N-Benzoylderivate von DL-α-Methylphenylalaninen als Substrate für die asymmetrische Hydrolyse durch mikrobielle Enzyme verwendet. Nachteilig an diesen biochemischen Trennungsverfahren ist, daß die Wiederverwendung der verbleibenden Substrate (d. h. der D-Derivate) schwierig ist und daß ferner die Ausbeute an gewünschter Verbindung niedrig ist.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein biochemisches Trennungsverfahren für DL-α-Methylphenylalanine der angegebenen Formel (I) anzugeben, bei dem die erwähnten Nachteile der bekannten Verfahren nicht mehr auftreten, so daß die Herstellung von L-α-Methylphenylalaninen in vorteilhaften Ausbeuten erreicht wird.

Gelöst wird die gestellte Aufgabe dadurch, daß man ein DL-α-Methylphenylalaninamid der allgemeinen Formel (II):

in der R¹ und R² die angegebenen Bedeutungen haben, mittels eines durch in üblicher Weise vorgenommene Züchtung eines Mikroorgansimus vom Genustyp Mycobacterium oder eines Mikroorganismus eines der folgenden Stämme:

Klebsiella pneumonia
IFO-3317 (ATCC-8329)
Bacillus subtilis	IFO-3026
Candida utilis	IFO-0396
Rhizopus chinensis	IFO-4768
Trichoderma viride	IFO-4847
Nocardia asteroides	IFO-3424
Streptomyces griseus	IFO-3356
Ustilago zeae	IFO-5346

Gibberella fujikuroi
IFO-5268
Torulopsis candida	IFO-0768
Pseudomonas fluorescens	IFO-3081
Rhodotorula minuta var texensis	IFO-0412

erhaltenen Kulturmediums oder mittels der aus einem solchen Kulturmedium gewonnenen Zellen, immobilisierten Zellen, zellfreien Extrakte, rohen oder gereinigten, ggf. an Träger gebundenen, Enzympräparationen bei einer Temperatur von 20 bis 50°C und pH-Werten von 5 bis 10 hydrolysiert und das entsprechende L-α-Methylphenylalanin isoliert.

Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlichen DL-α-Methylphenylalaninamide lassen sich leicht herstellen, beispielsweise durch Umsetzung von Ammoniumcyanid mit Phenylacetonen unter Erzeugung der Aminonitrilderivate und Hydrolyse der Nitrilgruppe der erhaltenen Aminonitrilderivate in Gegenwart einer Säure.

Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendbaren Mikroorganismen sind erhältlich von dem IFO-Institut, d. h. dem Institute for Fermentation in Osaka, Japan, und dem NIHJ-Institut, d. h. dem National Institute of Health, Japan.

Es besteht noch keine eindeutige Klarheit darüber, welches das Enzym ist, das die Hydrolyse des L-Isomeren der DL-α-Methylphenylalaninamide katalysiert. Es wird jedoch angenommen, daß es das Enzym Amidase ist.

Beispiele für Träger, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden können, sind natürliche Produkte, wie beispielsweise Alginsäure, Carrageenan, Collagen, Cellulose, Acetylcellulose, Agar, Cellophan und Collodion sowie synthetische Polymere, wie beispielsweise Polyacrylamide, Polystyrole, Polyethylenglykole, Polypropylenglykole, Polyurethane und Polybutadiene. Die Immobilisierung der Zellen oder des Enzyms auf dem Träger kann nach üblichen bekannten Verfahren erfolgen unter normalen Bedingungen, so daß die Aktivität des Enzyms nicht beeinträchtigt wird.

Die Reaktionstemperatur für die asymmetrische Hydrolyse liegt bei 20 bis 50°C. Um jedoch eine Abnahme der Enzymaktivität auf ein Minimum zu vermindern, hat sich die Anwendung von Reaktionstemperaturen von 25°C bis 40°C als besonders vorteilhaft erwiesen. Die Reaktionsdauer der asymmetrischen Hydrolyse kann bei 5 bis 50 Stunden liegen. Die Reaktionsdauer läßt sich jedoch durch Erhöhung der Reaktionstemperatur oder durch Erhöhung der Menge des einzusetzenden Enzymes verkürzen. Die Reaktion erfolgt bei pH-Werten von 5 bis 10, vorzugsweise bei pH-Werten von 7 bis 9.

Die Menge an Mikroorganismus, die vorzugsweise bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt wird, entspricht einem Gewichtsverhältnis von 0,01 bis 2, ausgedrückt als gefriergetrocknete Zellen, bezogen auf das Gewicht der DL-α-Methylphenylalaninamide. In den Fällen, in denen Kulturmedien oder Kulturen der Mikroorganismen, Enzympräparate, hergestellt aus den Mischungen oder Zellen oder immobilisierte Produkte verwendet werden, läßt sich die im Einzelfalle optimale Menge ausgehend von der Menge an gefriergetrockneten Zellen bestimmen. Vorteilhafte Substratkonzentrationen, d. h. Konzentrationen von DL-α-Methylphenylalaninamiden in der Reaktionsmischung liegen bei 1 bis 40, vorzugsweise 5 bis 30 Gew.-%.

Die asymmetrische Hydrolysereaktion wird unterbrochen oder beendet, nachdem die Hydrolyse der L-α-Methylphenylalaninamide einen Umwandlungsgrad von fast oder praktisch 100% erreicht hat, worauf die L-α-Methylphenylalanine und D-α-Methylphenylalaninamide getrennt aus der Reaktionsmischung isoliert werden. Die Trennung läßt sich leicht unter Anwendung üblicher Trennungsmethoden durchführen, beispielsweise durch fraktionierte Kristallisation und Lösungsmittelextraktion. D-α-Methylphenylalaninamide werden durch den Mikroorganismus, der zur asymmetrischen Hydrolyse verwendet wird, nicht angegriffen, weshalb praktisch die gesamten D-α-Methylphenylalaninamide aus der razemischen Mischung wiedergewonnen werden können. Die D-α-Methylphenylalaninamide lassen sich leicht nach üblichen bekannten Verfahren hydrolysieren, beispielsweise durch Erhitzen in Gegenwart einer wäßrigen Säure oder einer alkalischen Lösung. Die erhaltenen D-α-Methylphenylalanine können dann mit Natriumhypochlorit behandelt werden unter Erzeugung von Phenylacetonen, die dann wiederum als Ausgangsverbindungen für die Synthese der beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Substrate dienen können.

Das erfindungsgemäße Verfahren weist gegenüber bekannten biochemischen Verfahren insbesondere folgende Vorteile auf:

(1) Die verwendeten Ausgangsverbindungen oder Substrate lassen sich leicht und billig herstellen;
(2) die Trennung der gewünschten Verbindungen aus dem zurückbleibenden Substrat (d. h. dem D-Isomer) in der Reaktionsmischung ist vergleichsweise einfach, und das gewonnene D-Isomer läßt sich als Ausgangsverbindung für die Synthese von weiterem Substrat einsetzen und
(3) die optische Reinheit und die Ausbeute der hergestellten Verbindungen sind hoch.

Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren der Erfindung näher veranschaulichen. In den folgenden Beispielen wurden die Ausbeuten an L-α-Methylphenylalaninen nach der folgenden Gleichung berechnet:

Beispiele 1 bis 11

100 ml eines Kulturmediums eines pH-Wertes von 7,0 mit einem Gehalt an 5 Gew.-% Glycerin, 5 Gew.-% Maisquellwasser, 0,5 Gew.-% Ammoniumsulfat und 1 ml einer Mischung von anorganischen Salzen wurden in eine Schüttelflasche eingeführt. Die anorganische Salzmischung wurde hergestellt durch Lösen von 20 g MgSO₄ · 7 H₂O, 5 g FeSO₄ · 7 H₂O, 2 g CaCl₂, 0,2 g MnCl₂ · 4 H₂O, 0,1 g NaMoO₄ · 2 H₂O und 0,1 g NaCl in 1000 ml destilliertem Wasser. Nach Sterilisierung des Flascheninhaltes wurden jeweils zwei Schlingenfüllungen der in der folgenden Tabelle 1 angegebenen Mikroorganismen aus einer Agar-Schräge inokuliert, worauf die Kultur 65 Stunden lang bei 30°C geschüttelt wurde.

Daraufhin wurden 2 g DL-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalaninamid in die Flasche gegeben, worauf die Kultur nochmals 48 Stunden lang bei 30°C geschüttelt wurde. Die Zellen wurden dann von der Reaktionsmischung durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt. Das Filtrat wurde unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeits-Chromatographen analysiert. Auf diese Weise wurde die Ausbeute an 3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalanin bestimmt.

Aus der Literatur waren keine speziellen optischen Drehungsdaten für L- oder D-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalanin bekannt. Demzufolge wurde das erhaltene 3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalanin nach einem Verfahren, wie es in dem folgenden Beispiel 12 beschrieben ist, in N-Acetyl-3,4-dimethoxy-α-methylphenylalanin überführt. Aus den speziellen optischen Drehungsdaten der N-Acetylderivate, die sich in der Literatur finden, ergab sich, daß das 3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalanin, das in jedem der Beispiele erhalten worden war, das L-Isomer war.

Die Ergebnisse der Beispiele 1 bis 11 sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt.

Tabelle 1

Beispiel 12

Aus einer Kultur von Mycobacterium avium chester (IFO-3154), hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt und danach 2× mit destilliertem Wasser gewaschen.

Die gewaschenen Zellen wurden zu 100 ml einer 0,1 M-Phosphatpufferlösung zugegeben, die einen pH-Wert von 7,0 aufwies und 2 g DL-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalaninamid enthielt. Die erhaltene Mischung wurde dann 20 Stunden lang bei einer Temperatur von 30°C inkubiert.

Nach Beendigung der Reaktion wurden die Zellen aus der Reaktionsmischung durch Zentrifugieren abgetrennt. Die erhaltene Reaktionsmischung wurde dann mittels eines Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeits-Chromatographen analysiert. Dabei ergab sich, daß die erhaltene Reaktionsmischung 950 mg L-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalanin (Ausbeute=95%) und 1030 mg D-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalaninamid enthielt.

Die Reaktionsmischung wurde mit 200 ml Benzol extrahiert. Auf diese Weise wurden 970 mg des öligen, nicht umgesetzten D-3,4- Dimethoxy-α-methylphenylalaninamides mit einer spezifischen optischen Drehung [α]_d von +20,5° (c=1, Methanol) wiedergewonnen.

Des weiteren wurde die wäßrige Schicht nach der Extraktion unter Verwendung von Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2,0 gebracht. Die erhaltene Lösung wurde dann zur Trockne eingedampft. Auf diese Weise wurden 980 mg L-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalaninhydrochloridkristalle mit einer spezifischen optischen Drehung [α]_d von +5,4° (c=1, Methanol) erhalten. Daraufhin wurden die erhaltenen Kristalle in 20 ml Iso-Propanol gelöst, worauf 2,0 ml Triethylamin und 2,0 ml Essigsäureanhydrid zugegeben wurden. Die erhaltene Lösung wurde über Nacht stehengelassen und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der erhaltene Rückstand wurde in 2,0 ml Wasser aufgenommen, worauf der pH-Wert der erhaltenen Lösung durch Verwendung von konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf 2,0 eingestellt wurde. Die erhaltene Lösung wurde dann mit Ethylacetat extrahiert, worauf die extrahierte Ethylacetatschicht getrocknet und unter vermindertem Druck destilliert wurde. Auf diese Weise wurden 800 mg L-N-Acetyl-3,4-dimethoxy-α-methylphenylalaninkristalle mit einem Schmelzpunkt von 182°C bis 185°C und einer spezifischen optischen Drehung [α]_d von -53,0° (c=1, Methanol) erhalten.

Der ermittelte Wert für die spezifische optische Drehung war identisch mit dem entsprechenden Wert, der in der Literatur für L-N-Acetyl-3,4-dimethoxy-α-methylphenylalanin angegeben wird.

Demzufolge wurde bestätigt, daß die erhaltene Acetylverbindung die L-Acetylverbindung war und daß das erhaltene 3,4-Dimethoxy- a-methylphenylalanin ebenfalls das L-Isomer war. Es hatte eine optische Reinheit von 96,4%. Weiterhin war das wiedergewonnene 3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalaninamid das D-Isomer.

Beispiel 13

Die gewaschenen Zellen von Mycobacterium avium chester (IFO-3154), hergestellt wie in Beispiel 12 beschrieben, wurden mit kaltem Aceton gewaschen. Dies bedeutet, daß mit Aceton getrocknete Zellen erhalten wurden.

DL-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalaninamid wurde in destilliertem Wasser gelöst, worauf Substratlösungen mit verschiedenen, in Tabelle 2 angegebenen Konzentrationen und einem pH-Wert von 7,0 hergestellt wurden.

Die erwähnten mit Aceton getrockneten Zellen wurden zu 10 ml der Substratlösungen in solchen Mengen zugegeben, daß das Gewichtsverhältnis der getrockneten Zellen zum Substrat bei 0,2 lag. Dann wurde die Reaktion bei einer Temperatur von 30°C durchgeführt. Die Reaktionsdauer betrug 20 Stunden. Die erhaltene Reaktionsmischung wurde analysiert, um die Ausbeute an L-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalanin zu bestimmen. Zu der Bestimmung wurde ein Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeits-Chromatograph verwendet.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengestellt.

Konzentration des Substrates (DL-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalaninamid) (Gew.-%)
Ausbeute an L-3,4-Dimethoxy-α-methyl- phenylalanin (%)
1
100
2	100
5	100
10	100
20	86
30	72
40	49

Beispiel 14

Die gewaschenen Zellen von Mycobacterium avium chester (IFO-3154), hergestellt wie in Beispiel 12 beschrieben, wurden gefriergetrocknet.

Die gefriergetrockneten Zellen wurden dann zu 10 ml destilliertem Wasser mit einem Gehalt von 10 Gew.-% DL-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalaninamid und einem pH-Wert von 7,5 in einem Gewichtsverhältnis von Zellen zum Substrat, wie in der folgenden Tabelle 3 angegeben, zugegeben. Die erhaltenen Mischungen wurden bei einer Temperatur von 30°C 20 Stunden lang inkubiert. Die Reaktionsmischungen wurden dann zum Zwecke der Bestimmung der Ausbeuten an L-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalanin mittels eines Hochgeschwindig keits-Flüssigkeits-Chromatographen analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengestellt.

Gefriergetrocknete Zellen Substrat (Gew.-Verhältnis)
Ausbeute an L-3,4-Dimethoxy-α-methyl- phenylalanin (%)
0,01
68
0,05	89
0,1	97
0,5	100
1,0	100

Beispiel 15

50 mg der gefriergetrockneten Zellen von Mycobacterium avium chester (IFO-3154), hergestellt wie in Beispiel 14 beschrieben, wurden in 5 ml einer 0,2 M-Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 suspendiert, worauf die Zellen unter Kühlung unter Verwendung einer sog. französischen Presse bei einem Druck von 137928,6 kPa aufgebrochen wurden. Die erhaltene Mischung wurde dann unter 20 000×g 30 Minuten lang zentrifugiert. Zu 5 ml der überstehenden Lösung, die erhalten wurde, wurden 100 mg DL-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalaninamid zugegeben, worauf der pH-Wert der Mischung auf 7,5 eingestellt wurde. Daraufhin wurde die Mischung bei einer Temperatur von 30°C 20 Stunden lang inkubiert.

Die erhaltene Reaktionsmischung wurde dann mittels eines Hoch geschwindigkeits-Flüssigkeits-Chromatographen analysiert. Das L-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalanin wurde in einer Ausbeute von 85% erhalten.

Beispiel 16

Zu 5 ml eines zellfreien Extraktes von Mycobacterium avium chester (IFO-3154), hergestellt wie in Beispiel 15 beschrieben, wurde Ammoniumsulfat zugegeben. Der Ammoniumsulfatniederschlag, erhalten bei einer Sättigung von 25% bis 75% Ammoniumsulfat, wurde durch Zentrifugieren abgetrennt. Dann wurden 5 ml einer 0,2 M-Phosphatpufferlösung mit 100 mg DL-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalaninamid mit einem pH-Wert von 7,5 zugegeben. Die Mischung wurde dann bei einer Temperatur von 30°C 20 Stunden lang inkubiert.

Die auf diese Weise erhaltene Reaktionsmischung wurde mittels eines Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeits-Chromatographen analysiert. Danach wurde L-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalanin in einer Ausbeute von 58% erhalten.

Beispiel 17

10 ml des zellfreien Extraktes von Mycobacterium avium chester (IFO-3154), hergestellt wie in Beispiel 15 beschrieben, wurden durch eine Kolonne eines Durchmessers von 1,5 cm und einer Höhe von 65 cm, gefüllt mit Sephadex G-75, geschickt. Es wurden Fraktionen mit Enzymaktivität aufgefangen. Diese Fraktionen wurden unter Verwendung einer semipermeablen Membran auf ein Volumen von 5 ml konzentriert.

Daraufhin wurden 100 mg DL-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalaninamid zugegeben. Die Mischung wurde dann bei einer Temperatur von 30°C 20 Stunden lang inkubiert.

Die Reaktionsmischung wurde dann mit einem Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeits-Chromatographen analysiert. Es wurde L-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalanin in einer Ausbeute von 48% erhalten.

Beispiel 18

Die gewaschenen Zellen von Mycobacterium avium chester (IFO-3154) (entsprechend 1,0 g gefriergetrockneter Zellen), hergestellt wie in Beispiel 12 beschrieben, wurden in 15 ml einer 0,1 M-Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 suspendiert, worauf 3,75 g Acrylamidmonomer, 0,2 g N,N′-Methylenbisacrylamid (d. h. ein Quervernetzungsmittel), 2,5 ml einer 5%igen wäßrigen 3-Dimethylaminopropionitrillösung (d. h. die Lösung eines Polymerisationspromotors) und 2,5 ml einer wäßrigen Kaliumpersulfatlösung (d. h. die Lösung eines Polymerisationsinitiators) zugegeben wurden. Die erhaltene Mischung wurde dann eine Stunde lang bei einer Temperatur von 25°C stehengelassen. Danach war die Gelierung der Mischung beendet.

Das erhaltene Gel wurde zerkleinert und mit Wasser gewaschen. Das erhaltene immobilisierte Produkt (die Gelpartikel hatten einen Partikeldurchmesser von 0,2 bis 0,5 mm) wurde in eine Kolonne eines Durchmessers von 2 cm und einer Höhe von 50 cm eingefüllt. Daraufhin wurde destilliertes Wasser mit 10 Gew.-% DL-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalaninamid mit einem pH-Wert von 7,5 bei einer Temperatur von 30°C mit einer Raumgeschwindigkeit von 0,2/Stunde auf die Kolonne aufgegeben.

Bei dieser kontinuierlichen Reaktion wurde eine Ausbeute an L-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalanin von 85% oder darüber erhalten, bis die Reaktionszeit auf 200 Stunden angestiegen war.

Beispiel 19 (nachgereicht)

Nach dem in Beispiel 12 beschriebenen Verfahren wurde DL-3,4- Dimethoxy-α-methylphenylalaninamid unter Verwendung von verschiedenen Stämmen der Gattung Mycobacterium, die in der folgenden Tabelle aufgeführt sind, hydrolisiert. Die erhaltenen Ausbeuten an L-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalanin sind in der folgenden Tabelle ebenfalls aufgeführt.

Tabelle

Beispiel 20 (nachgereicht)

Nach dem in den Beispielen 1 bis 11 beschriebenen Verfahren wurde DL-3,4-Dimethoxy-α-methylphenylalaninamid unter Verwendung von Rhodotorula minuta var texensis IFO-0412 hydrolysiert. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Ausbeute: 48%
[α]_d: -45°

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von L-α-Methylphenylalaninen der allgemeinen Formel (I): in der R¹ und R² unabhängig voneinander jeweils stehen für ein Wasserstoffatom oder einen Methylrest, dadurch gekennzeichnet, daß man ein DL-α-Methylphenylalaninamid der folgenden allgemeinen Formel (II): in der R¹ und R² die angegebenen Bedeutungen haben, mittels eines durch in üblicher Weise vorgenommene Züchtung eines Mikroorganismus vom Genustyp Mycobacterium oder eines Mikroorganismus eines der folgenden Stämme: Klebsiella pneumonia IFO-3317 (ATCC-8329) Bacillus subtilis IFO-3026 Candida utilis IFO-0396 Rhizopus chinensis IFO-4768 Trichoderma viride IFO-4847 Nocardia asteroides IFO-3424 Streptomyces griseus IFO-3356 Ustilago zeae IFO-5346

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus in einem Gewichtsverhältnis von 0,01 bis 2, bezogen auf gefriergetrocknete Zellen und bezogen auf das Gewicht der DL-α-Methylphenylalaninamide, einsetzt.