DE2616673C2 - Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von L(+)-Weinsäure und deren Salzen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren, bei dem man cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze enzymatisch hydrolysiert und dadurch spezifisch L(+)-Weinsäure bzw. deren Salze erzeugt L(+)-Weinsäure wird in großen Mengen als Zusatz zu Arzneimitteln und Lebensmitteln sowie als industrielle Ausgangsverbindung verwendet.

Bisher hat man L( +)-Weinsäure praktisch nur nach einem Verfahren hergestellt, bei dem als Ausgangsverbin-'"- dung Roh-Weinstein diente, der als Nebenprodukt bei der Erzeugung von Wein anfällt. Die für dieses Verfahren zur Verfügung stehende Menge an diesem Rohprodukt wird jedoch weltweit wegen der erhöhten Nachfrage laufend knapper und der Preis erhöht sich. Weinsäure, die auf synthetischem Wege in der Industrie erhalten wird, fällt gewöhnlich als optisch inaktive DL-Weinsäure an. Diese DL-Weinsäure weist eine niedrigere Löslichkeit als L(+)-Weinsäure auf und ist deshalb für wirtschaftliche Verwendungszwecke nachteilig.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein mikrobiologisches Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Herstellung von L( + )-Weinsäure oder deren Salzen, die als Ausgangsverbindungen für L( + )-Weinsäure brauchbar sind, in einem wirtschaftlichen bzw. technischen Maßstab gestattet. Die Erfindung löst diese Aufgabe. Gemäß einem in der DE-OS 26 00 589 gemachten Vorschlag, gemäß den Ansprüchen 1 und 2, soll das wasserunlösliche Calciumsaiz der cis-Epoxybernsteinsäure in einem geeigneten Nährmedium mit einem Mikroorganismus bebrütet werden, der befähigt ist, cis-Epoxybernsteinsäure zu L( +)-Weinsäure zu hydrolysieren. Für diese in-situ-HydroIyse werden unter anderem Mikroorganismen von der Gattung Acinetobacter, Agrobacterium, Rhizobium und Pseudomonas vorgeschlagen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von L( +)-Weinsäure und deren Salzen ist dadurch gekennzeichnet, daß man cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze enzymatisch mit dem Enzym eines der Mikroorganismen Acetobacter curtus Nr. 4, Nr. 10 oder Nr. 21 bzw. Corynebacterium S-13 hydrolysiert, ausgenommen die Ausführungsform, daß der enzymerzeugende Mikroorganismus direkt in Anwesenheit von Calcium-cis-epoxysuccinat als Substrat bebrütet wird.

Nach vorliegender Erfindung kann man L( + )-Weinsäure und deren Salze, die vom wirtschaftlichen Standpunkt aus betrachtet sehr bedeutsam sind, in einfacher Weist; in großen Mengen und hohen Ausbeuten und mit hoher Selektivität erzeugen. Infolgedessen weist die Erfindung einen außerordentlich hohen wirtschaftlichen Wert auf.

Das erfindungsgemäß verwendeteEnzym, das die Epoxygruppe der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze zu hydrolysieren vermag — im folgenden kurz als »cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolyse« bezeichnet — ist ein neues Enzym, das entdeckt worden ist. Es ist gekennzeichnet durch die Aktivität, eine asymmetrische Hydrolyse und eine Ringspaltung an der Epoxygruppe der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salzen zu bewerkstelligen. κ. In der anliegenden Zeichnung zeigt die F i g. 1 in einer graphischen Darstellung die enzymatische Aktivität der

erfindungsgemäß eingesetzten cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase als Funktion des pH-Wertes, während F i g. 2 eine graphische Darstellung der enzymatischen Aktivität der erfindungsgemäß verwendeten cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase als Funktion der Temperatur zeigt.

Die erfindungsgemäß eingesetzte cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase besitzt die in der Tabelle I angegebe-

! nen Eigenschaften.

'§ Die Form, in der das Enzym eingesetzt wird, ist nicht in irgendeiner Weise begrenzt. Gewöhnlich kann man es

jedoch in Form von Anzuchtflüssigkeiten, lebenden Mikrobenzellen, getrockneten Mikrobenzellen, zellfreien

Extrakten, raffinierten Zellflüssigkeiten, unbeweglichen Enzymen oder in Gel eingeschlossenen Mikroorganis- |

men verwenden.

Tabelle I: Enzymatische Eigenschaften

1. Aktivität

Verwandelt cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze in L( + )-Weinsäure oder deren Salze aufgrund Kj

asymmetrischer Hydrolyse und Ringspaltung der Epoxygruppe der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren jj

Salzen.
2. Substraieigenheiten

Wirkt nicht auf trans-Epoxybernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure oder deren Salze. 3. pH-Wert

Optimum bei pH 8, stabil bei pH 3 bis 11 (vgl. F i g. 1).

4. Messung der enzymatischen Aktivität

Reagierenlassen des Enzyms bei pH 8 auf cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze, Bestimmen der erzeugten Menge L(+ )-Weinsäure oder deren Salze, beispielsweise durch Titrieren mit Perjodsäure, und Angeben des Ergebnisses, in mMol/Minuten/mg (ml) des verwendeten Enzyms.

5. Bereich der zweckmäßigen Arbeitstemperaturen

25 bis 55° C (60° C ist für eine Höchstdauer von 20 Minuten tclerierbar).

6. Inaktivierungstemperatur

Inaktivierung nach 24stündigem Stehen bei 65° C.

7. Inhibitor
p-Chlorquecksilberbenzoesäure

8. Reinigungsverfahren

Die Reinigung erfolgt durch Brechen der angezüchteten Zellen mittels eines Homogenisators, Extrahieren des Homogenisats mittels Zentrifugieren, Fraktionieren des Extrakts mit Ammoniumsulfat in an sich bekannter Weise, Dialysieren der Fraktion und Abtrennung einer rohen Enzymlösung, Raffinieren dieser rohen Enzymlösung mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von entweder Diäthylaminoäthylcellulose oder eines Dextrangels.

9. Michaelis-Konstante 1,47 χ ΙΟ-²Mol/Liter

Die bakteriologischen Eigenschaften von Acetobacter curtus Nr. 4 (FERM-P Nr. 2879), Acetobacter curtus Nr. 10 (FERM-P Nr. 2880) und Acetobacter curtus Nr. 21 (FERM-P Nr. 2881), die sämtlich neue Species sind und die erfindungsgemäß als Quellen für cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase verwendet werden, sind aus Tabelle II ersichtlich. Die Eigenschaften von Corynebacterium S-13 (FERM-P Nr. 2891), ebenfalls eine neue Species, das in gleicher Weise verwendet werden kann, sind aus Tabelle III ersichtlich.

Tabelle II: Bakteriologische Eigenschaften

Mikroorganismus:

Acetobacter curtus

Nr. 4 Nr.

Hinterlegungsnummer:

FERM-P Nr. 2879 FERM-P Nr. 2880

Nr.

FERM-P Nr. 2881 -30

Morphologische Eigenschaften

1. Gestalt der Zellen

2. Größe der Zellen

3. Beweglichkeit

4. Geißelbildung

5. Sporenbildung

6. metachromatische Granula

7. ' Gramfärbung

8. säurefeste Färbung (Zichl-Neelsen-Färbung)

Wachstum auf verschiedenen Nährböden 1. Bouillon-Agar Plattenkultur

2. Schrägagar

3. Agarstichkultur

4. Gelatinestichkultur

5. Nährflüssigkeit, stationär

6. Lackmusmilch

kurze Stäbchen	dito
(0,3-0,4)μπι χ	dito
(0,2-1,0)μπι
keine	dito
keine	dito
keine	dito
keine	dito
negativ	dito
negativ	dito
kreisförmige	dito
Kolonien
scharfe Grenzen	dito
glatte Oberflächen	dito
hemisphärisch	dito
erhaben
glänzend	dito
undurchsichtig	dito
milchigweiß	dito
lineares Wachstum	dito
milchigweiß	dito
glänzend	dito
keine Änderung	dito
im Medium
lineares Wachstum	dito
nahe der Ober
fläche
lineares Wachstum	dito
nahe der Ober
fläche ohne
Verflüssigung
gleichmäßig,	dito
etwas trübe
keine Änderung	dito

dito (0,2—0,4)μπι χ (0,6—0,8)μπι dito dito dito dito dito dito

dito

dito dito dito

dito dito dito dito dito dito dito

dito

dito

dito dito

40

45

50

55

:60

65

I I .

Tabelle II (Fortsetzung)

dito	dito
dito	5,0-6,5
dito	dito
dito	dito

Mikroorganismus: Acetobacter curtus

Nr.4 Nr. 10 · Nr.21

Hinterlegungsnummer:

FERM-P Nr. 2879 FERM-P Nr. 2880 FERM-P Nr. 2881

III. Physiologische Eigenschaften

1. Reduktion von Nitrat + — —

2. Denitrifikation — — —

3. Methylrot-Reaktion — — —

■4. Voges-Proskauer-Reaktion — — —

5. Indolbildung — — —

6. Schwefelwasserstoffbildung — — — 7. Stärkehydrolyse — — —

8. Verwendung von Citronensäure + + + + (durch jeweilige Verwendung von

Koser- und Christensen-Medium

9. Verwendung von anorganischen + + + Stickstoffquellen

(Nitrate und Ammoniumsalze)

10. Pigmentbildung — — —

11. Urease + + + +

12. Oxidase + + + 13. Katalase — — —

14. Phenylalanindes.aminase — — —

15. Hydrolyse von — — — Sorbitan-monooleatpoly-

oxyäthylen

30 16. A) pH-Wert für das Wachstum 3,7-7,5

B) pH-Optimum für das Wachstum 5,5—6,5

17. A) Wachstumstemperatur 15—36°C

B) Temperaturoptimum 30±3°C

für das Wachstum

18. Sauerstoffbedarf aerob dito dito

19. O-F-Prüfung mittels der Hugh-Leifson-Methode

1. L-Arabinose + + +

2. D-Xylose + + + 3. D-Glukose + + +

4. D-Mannose τ + +

5. D-Fructose — — —

6. D-Galactose + + + + + + 7 Maltose — — —

8. Saccharose — — —

9. Lactose ± + ±

10. D-Trehalose — — —

11. D-Sorbit — — —

12. D-Mannit — — — 13. Inosit — — —

14. Glycerin — — —

14. Stärke ' - - —

Bei den vorgenannten Kohlenhydraten wird keine Gaserzeugung beobachtet

20. Assimilierbarkeit von Alkoholen

1. Methanoi — — —

Z Äthanol + + +

3. Propanol — — —

4. Butanol — — —

5. Isobutanol _ _ —

21. Assimilierbarkeit von organischen Säuren

1. Essigsäure — — —

Z Milchsäure -f + +

3. Benztraubensäure + + +

4. Buttersäure — — —

5. Gluconsäure

Tabelle 11 (Fortsetzung)

Mikroorganismus:

Acetobacter curtus

Nr. 4 Nr. 10

Hinterlegungsnummer:

FERM-P Nr.2879 FERM-P Nr. 2880

Nr.21

FERM-P Nr. 2881

6. L(-l-)-Weinsäure +

7. cis-Epoxybernsteinsäure + 22. Andere Eigenschaften

1. Oxydation von Äthanol +(schwach) zu Essigsäure bei pH 4;5

2. Oxydation von + Milchsäure zu CO2

3. Erzeugung von Essigsäure + aus Glukose

4. Erzeugung von Ketogluconsäure — ausGluconsäure

5. Erzeugung von 5-tCeto- — gluconsäure aus Glukose dito

dito

IV. Quelle der Isolierung

Tabelle III

Boden dito

dito

Mikroorganismus:
Corynebacterium S — 13
Hinterlegungsnummer:
FERM-P Nr. 2891

Morphologische Eigenschaften 1. Gestalt der Zellen

2. Größe der Zellen

3. Beweglichkeit

4. Gcißelbildung

5. Sporenbildung

6. metachromatische Granula

7. Gnimfärbung

8. säurefeste Färbung (Ziehl-Neelson-Färbung)

Wachstum auf verschiedenen Nährböden

1. Bouillon-Agar Plattenkultur

2. Schrägagar

3. Agarstichkultur

4. Gelatinestichkultur

5. Nährflüssigkeit, stationär

6. Lackmusmilch

Physiologische Eigenschaften

1. Reduktion von Nhrat

2. Denitrifikation

3. Methylrot-Reaktion

4. Voges-Proskauer-Reaktion

5. Indolbildung

pleomorphe lange Stäbchen; vermutlich sind V-förmige, Y-förmige oder Palisaden-Anordnungen möglich
(0,4-0,7) μΐη x (1,0-8,0) μΐη
keine
keine
keine

verschiedene Granula
positiv
negativ

kreisförmige Kolonien
scharfe Grenzen
rauhe Oberfläche
erhaben bei den Falten
glänzend während des Anfangsstadiums der Anzucht, allmählicher Verlust des Glanzes undurchsichtig
schwach scharlachrot
lineares Wachstum mit gelegentlicher Faltenbildung

lineares Wachstum nahe der Oberfläche lineares Wachstum nahe der
Oberfläche ohne Verflüssigung
schwache Bildung eines Oberflächenhäutchens
.schwache Trübung
Sediment positiv
schwach alkalisch

Tabelle III (Fortsetzung)

Mikroorganismus:
Corynebacterium S—13
Hinterlegungsnummer:
FERM-P Nr. 2891

6. Schwefelwasserstoffbildung +

7. Stärkehydrolyse — _]0 8. Verwendung von Citronensäure (durch jeweilige —

Verwendung von Köser- und Christensen-Medium

9 Verwendung von anorganischen Stickstoffquellen + (Nitrate und Ammoniumsalze)

10. Pigmentbildung —

11. Urease

12. Oxidase -

13. Katalase +

14. Hydrolyse von Sorbitanmonooleat-polyoxyäthylen +

15.	A)	pH-Wert für das Wachstum	L-Arabinose	4,5-9,0
	B)	pH-Optimum für das Wachstum	D-Xylose	5,5-7,0
16.	A)	Wachstumstemperatur	D-Glukose	20-400C
	B)	Temperaturoptimum für das Wachstum	D-Mannose	30±3°C
17.	Sauerstoffbedarf	D-Fructose	aerob
18.	O-F-Prüfung mittels der Hugh-Leifson-Methode	D-Galactose
	1.	Maltose	—
	2.	Saccharose	—
	3.	Lactose
	4.	D-Trehalose	—
	5.	D-Sorbit	-I-
	6.	D-Mannit	—
	7.	Inosit	_
	8.	Glycerin	—
	9.	Stärke	—
	10.	—
	11.	+
	12.	+
	13.	—
	14.	+
	15.

1.

'"■ °^ια11ν<; ~ I

Bei den vorgenannten Kohlehydraten wird keine Gaserzeugung beobachtet.
19. Assimilierbarkeit von cis-Epoxybernsteinsäure +

IV. Quelle der Isolierung Boden

Bemerkungen: In den Tabellen II und III bedeutet das Zeichen » + « ein bestätigendes Ergebnis, und die Anzahl der Pluszeichen sieigt mit dem Anstieg der angezeigten Größe, während das Zeichen »—« ein negatives Ergebnis bedeutet. In der Tabelle II bedeutet das Zeichen » ± «, daß das Ergebnis keine definitive Bewertung weder im Sinne von » +« noch im Sinne von »—«zuläßt.

Das Studium der vorgenannten bakteriologischen Eigenschaften im Hinblick auf die Angaben in dem Buch »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology«, 8. Auflage, 1974, läßt erkennen, daß die drei Stämme

. FERM-P Nr. 2879, FERM-P Nr. 2880 und FERM-P Nr. 2881 miteinander praktisch gleiche bakteriologische Eigenschaften besitzen. Sie sind gleichbleibend gramnegative, aerobe, kurzstabförmige Mikroorganismen. Es ist

einleuchtend, daß sie unter Teil 7 oder Teil 10 dieses Buches klassifiziert werden müssen. Weiterhin zeigt die Tatsache, daß bei allen drei Stämmen keine Beweglichkeit, keine Sporenbildung, weiter ein negatives Ergebnis der Katalase-Prüfung, die Oxydation von Äthanol zu Essigsäure und Milchsäure zu Kohlendioxid bei einem pH-Wert von 4,5, weiterhin die Tatsache, daß sie ein annehmbares Wachstum bei pH 4,5 zeigen und daß sie praktisch keine Zucker abbauen können, vielmehr aus Zuckern Säure bilden, daß diese Bakterien zur Gattung Acetobacter gehören. Es ist jedoch bemerkenswert, daß sie sich deutlich hinsichtlich der Größe der Zellen, der -Assimilierbarkeit von Essigsäure, der Abwesenheit von Geißeln und der Oxydierbarkeit von Alkoholen von Acetobacter pasteurianus Subspecies paradoxus und von Acetobacter peroxidans unterscheiden, die im Buch »Bergey's Manual« als katalase-negative Acetobacter-Stämme angegeben sind. Im Hinblick auf diese Faktoren, haben die Erfinder beschlossen, daß diese drei Stämme zu einer neuen Species gehören und haben sie aus diesem Grunde »Acetobacter curtus« genannt Die Stämme Acetobacter curtus Nr. 4, Acetobacter curtus Nr. 10 und Acetobacter curtus Nr. 21 zeigen im wesentlichen die gleichen bakteriologischen Eigenschaften, und man

beobachtet lediglich, daß sie sich geringfügig hinsichtlich der Reduzierbarkeit von Nitraten, der Höhe der |

Urease-Aktivität und der Höhe der Erzeugung von Säuren aus Zuckern unterscheiden. Sie müssen demgemäß jj

als drei Stämme betrachtet werden, die zu einer Species gehören. i

Die Betrachtung der morphologischen und physiologischen Eigenschaften des Stammes FERM-P Nr. 2891 führt zu dem Ergebnis, daß dieser Stamm zur Gattung Corynebacterium gehört. Die Erfinder haben ihn deshalb »Corynebakterium S-13« genannt. Überraschenderweise wurde gefunden, daß Weinsäure selbst die Fähigkeit zur Induzierung des neuen Enzyms ähnlich der cis-Epoxybernsteinsäure besitzt.

Ein typisches Verfahren zur Herstellung der cis-Epoxybemsteinsäure-Hydrolase wird nachstehend beschrieben. Dieses Verfahren besteht darin, daß man einen der vorstehend genannten Mikroorganismen in einem Nährmedium züchtet, in das entweder Weinsäure oder deren Salze eingebracht worden sind, mit anschließendem Isolieren der derart erzeugten cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase aus dem Reaktionsgemisch.

Bei diesem Verfahren dienen die Weinsäure und deren Salze, die in das Nährmedium eingebracht worden sind, nicht bloß als Kohlenstoffquelle für die Mikroorganismen sondern auch zum Induzieren des Enzyms.

Die bei diesem Verfahren verwendbare Weinsäure ist die D-Weinsäure, die L-Weinsäure, die DL-Weinsäure, die Mesoweinsäure oder ein Gemisch derartiger Weinsäuren. Für den gleichen Zweck eignen sich Metall- und Nichtmetallsalze der betreffenden Weinsäuren. Die Metallanteile dürfen aber nicht das Wachstum dieser Mikroorganismen hemmen.

Geeignete Beispiele von Salzen der Weinsäure sind deshalb Natriumtartrat, Kaliumtartrat, Magnesiumtartrat, Natrium-Kaliumtartrai, Natriurnhydrogentartrat, Kaliurnhydrogentartrat, Calciumhydrogentartrat, Ämmoniumtartrat, Ammoniumhydrogentartrat und Ammoniumkaliumtartrat.

Es wird eine solche Menge Weinsäure oder deren Salze dem Nährmedium zugegeben, daß die Konzentration in dem Nährmedium gewöhnlich von 0,1 bis 10 Gewichtsprozent, vorzugsweise von 1,0 bis 5,0 Gewichtsprozent betragen.

Es kann jedes beliebige Nährmedium verwendet werden, das im allgemeinen zur Züchtung von Mikroorganismen verwendet wird.

Bei der Anzucht der Mikroorganismen liegt die Anzuchttemperatur gewöhnlich im Bereich von 20 bis 35°C, vorzugsweise im Bereich von 28 bis 31°C. Der pH-Wert des Nährmediums beträgt gewöhnlich 4,5 bis 7,5, vorzugsweise 5,5 bis 7,0. Die Anzucht erfolgt aerob. Das Wachstum der Mikroorganismen erreicht nach zwei bis fünf Tagen seine stationäre Phase. Wenn die Anzucht außerhalb des tolerierbaren Bereichs der Anzuchtbedingungen durchgeführt wird, wird kein ausreichendes Wachstum erhalten und im schlimmsten Fall findet eine vollständige Zerstörung statt. Wenn der pH-Wert des Nährmediums im Verlauf des allmählichen Verbrauchs von Weinsaure oder deren Salzen ansteigt, ist es erwünscht, die Anzucht fortzusetzen, während der pH-Wert durch Zugabc einer anorganischen Säure, wie Schwefelsäure oder Chlorwasserstoffsäure, oder einer organisehen Säure, wie Essigsäure, eingestellt wird.

Dieses Verfahren ist von sehr großer Wirtschaftlichkeit, da man die cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase mittels des Einsatzes von beispielsweise DL-Weinsäure erhalten kann, die als Nebenprodukt bei der chemischen Synthese der cis-Epoxybernsteinsäure auftritt, eben derjenigen Verbindung, die die Ausgangsverbindung für die cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase darstellt.

Als Ausgangsverbindungen im erfindungsgemäßen Verfahren können nicht nur die cis-Epoxybernsteinsäure, sondern auch deren Metallsalze oder deren Nichtmetallsalze oder Substrate verwendet werden, die diese Säure oder deren Salze enthalten. Beispiele von geeigneten Salzen der cis-Epoxybernsteinsäure sind das Dinatriumsalz, das Calciumsalz, das Natriumcalciumsalz, dasKaliumnatriumsalz, das saure Calciumsalz und das Ammoniumsalz der cis-Epoxybernsteinsäure.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens arbeitet man derart, daß man die enzymatische Hydrolyse mittels eines in Form einer Packungsschicht vorliegenden Gelpräparats durchführt, in welchem der Mikroorganismus in einer Konzentration im Bereich von 0,01 bis 50 Gewichtsprozent eingeschlossen ist, wobei das Gel durch Polymerisation eines Acrylsäureamids erhalten worden ist, und welches das Acryisaureamid in einer Konzentration im Bereich von 1 bis 30 Gewichtsprozent enthält, und daß man die enzymatische Hydrolyse mittels des Gelpräparats bei Temperaturen bis höchstens 7O⁰C bei pH-Werten von 4 bis 10 durchführt.

Die Behandlungsdauer liegt bei der Verfahrensweise zweckmäßig im Bereich von 0,01 bis 100 Stunden. Bevorzugt wird die Hydrolyse bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 50⁰C durchgeführt, während der pH-Wert 6 bis 9 beträgt.

Der betreffende Mikroorganismus kann für diese Ausführungsform in Form von lebenden oder getrockneten Zellen, als zellfreier Extrakt oder in Form einer Kulturflüssigkeit von Mikroorganismenzellen oder einem Gemisch davon verwendet werden.

Das Einschließen des Mikroorganismus in dem Gel erfolgt zweckmäßig durch Lösen von Acrylsaureamid in einem wäßrigen Medium, wie Wasser, einer isotonischen Salzlösung oder einer Pufferlösung, die im wesentlichen nicht die Aktivität des Mikroorganismus beeinträchtigt Dann wird der Mikroorganismus in der erhaltenen Lösung dispergiert und die Polymerisation des monomeren Acrylsäureamids durch Zugabe eines Polymerisationsinitiators und gegebenenfalls eines Polymerisationsbeschleunigers gestartet Die anschließende Polymerisation, überführt das Reaktionsgemisch im wesentlichen in seiner Gesamtheit in ein agarähnliches Gel.

Der Gehalt an Mikroorganismen im Reaktionsgemisch während der Polymerisation liegt vorzugsweise im Bereich von 0,05 bis 20 Gewichtsprozent

Das bei der vorgenannten Polymerisation eingesetzte Acrylsaureamid ist ein polymerisierbares Monomeres, das die Atomgruppierung der Formel

H₂C = C-II-C-N

Il \

besitzt ψ

Beispiele von Monomeren, die erfindungsgemäß mit Vorteil verwendet werden können, sind Acrylsäureamid, N.N'-Niederalkylen-di-Cccrylsäureamide), wie N,N'-Methylen-di-(acrylsäureamid), N,N'-Äthylen-di-(acrylsäureamid) oder N,N'-i"iOpylen-di-(acrylsäureamid), ferner N-(Hydroxyalkyl)-acrylsäureamide, wie N-Methy!olacrylsäureamid, weiterhin N-Alkyl-acrylsäureamide, wie Ν,Ν-Dimethyl-acrylsäureamid, sowie Di-(acrylsäureamid)-dialkyläther, wie l,l'-Di-(acrylsäureamid)-dimethyläther. Von diesen monomeren Acrylsäureamid-Verbin- <lungen sind besonders für den genannten Zweck geeignet Acrylsäureamid und N,N'-Niederalkylen-di-(acrylsäureamide).

Der Gehalt an Acrylsäureamid in den Gelen liegt aus wirtschaftlichen Erwägungen vorzugsweise im Bereich ίο von 5 bis 20 Gewichtsprozent

Als Polymerisationsinitiatoren können z. B. Salze von Persäuren, wie Ammoniumpersulfat, Nairiumpersulfat und Kaliumpersulfat, sowie organische Persäuren, wie Peroxyameisensäure und Peroxyessigsäure, verwendet werden, wobei deren Konzentration im allgemeinen 0,01 bis 1 Gewichtsprozent beträgt

Beispiele für gegebenenfalls mitzuverwendende Polymerisationsbeschleuniger sind/i-Dimethylamino-propionitril und Ν,Ν,Ν',Ν'-TetramethyI-äthylendiamin.

Die Polymerisation läßt man zweckmäßig in Gegenwart eines antibakteriellen Mittels ablaufen, um das Wachstum von Fremdbakterien zu unterdrücken. Besonders geeignet hierfür sind kationische grenzflächenaktive Verbindungen, wie Dodecylpyridinium-halogenide, Alkyl-benzyl-dimethyl-ammonium-halogenide und Lauryl-dimethyl-ammonium-halogenide, die nicht nur eine antibakterielle Wirksamkeit besitzen sondern gleichzeitig auch zur Steigerung der Durchlässigkeit der damit erhaltenen Gele dienen.

Die Konzentration des antibakteriellen Mittels im Reaktionsgemisch liegt vorzugsweise im Bereich von 50 bis 500 Teilen je Million.

Die Polymerisation wird vorzugsweise im Temperaturbereich von 20 bis 50⁰C durchgeführt. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches bei der Polymerisation liegt vorzugsweise im Bereich von 6 bis 9.

Das nach der vorbeschriebenen Weise erhaltene Gel mit dem eingeschlc .senen Mikroorganismen kann eine lange Zeit ununterbrochen verwendet werden, ohne daß eine Zerstörung des Gelüberzugs auftritt, was ein Austreten der eingeschlossenen Mikroorganismen und einen Abbau der enzymatischen Aktivität zur Folge haben würde.

Wenn dieses Gel mit den eingeschlossenen Mikroorganismen in zerkleinerter oder nicht-zerkleinerter Form mit einer wäßrigen Lösung der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze in Berührung gebracht wird, setzt die enzymatische Reaktion ein, und es werden L(+ )-Weinsäure oder deren Salze erzeugt. Das Gel mit den eingeschlossenen Mikroorganismen soll nach Möglichkeit eine Teilchendurchmesserverteilung derart aufweisen, daß die Teilchen durch Siebe mit einer Maschenzahl von 5 bis 100 Maschen gehen, gemessen nach dem Verfahren von JIS G 3555-1964.

Als Ausgangsmaterial kann im erfindungsgemäßen Verfahren auch eine cis-Epoxybernsteinsäure, die durch die Umsetzung von Wasserstoffperoxid mit Maleinsäure erhalten worden ist, oder ein Salz derselben eingesetzt werden.

Bei Verwendung von Gel mit solchen eingeschlossenen Mikroorganismen, die praktisch keine Katalase-Aktivität besitzen, wie z. B. Acetobacter curtus Nr. 4, Acetobacter curtus Nr. 10 oder Acetobacter curtus Nr. 21 wird vermieden, daß Restanteile von Wasserstoffperoxid im Reaktionsgemisch zersetzt werden und daß der dabei gebildete Sauerstoff die enzymatische Reaktion stört, d. h. dadurch, daß Sauerstoffperlchen möglicherweise die feinen Poren des Gels mit den darin eingeschlossenen Mikroorganismen verstopfen und demzufolge die Durchlässigkeit herabsetzen.

Die wäßrige Lösung der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze, die bei der enzymatischen Reaktion gemäß der vorstehend beschriebenen Ausführungsform eingesetzt wird, kann gegebenenfalls durch Erhitzen oder Filtrieren durch eine Membran vor dem unmittelbaren Einsatz bei dieser Reaktion sterilisiert werden.

Die enzymatische Reaktion unter Einsatz eines Gels mit den eingeschlossenen Mikroorganismen kann absatzweise, kontinuierlich oder halbkontinuierlich durchgeführt werden.

Bei der absatzweisen Methode wird der Kontakt zwischen dem Gel und der wäßrigen Lösung der cU-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze zweckmäßig durch Schütteln oder Rühren des Gemisches intensiviert. Anschließend erfolgt ein Abtrennen des Gels mit den eingeschlossenen Mikroorganismen aus dem erhaltenen Gemisch mittls einer üblichen Fest-Flüssig-Trennungstechnik, wie Zentrifugieren oder Filtrieren.

Das derart abgetrennte und gewonnene Gel mit den eingeschlossenen Mikroorganismen kann im nächsten Ansatz der enzymatischen Reaktion wiederverwendet werden.

Beim kontinuierlichen Verfahren wird die sogenannte Festbettmethode angewendet, bei der man die wäßrige Lösung der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze durch eine Säule fließen läßt, die mit dem Gel mit den eingeschlossenen Mikroorganismen in Form einer Packungsschicht gefüllt ist.

Beim halbkontinuierlichen Verfahren kann die sogenannte Suspensionsbettmethode angewendet werden, bei der das Reaktionsgefäß kontinuierlich gleichzeitig mit dem Gel mit den eingeschlossenen Mikroorganismen und der wäßrigen Lösung der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salzen beschickt wird, während gleichzeitig ein Rühren des Ansatzes, Abziehen des Reaktionsgemisches aus dem Reaktionsgefäß in einer Menge, die der gesamten Beschickungsmenge entspricht, und Abtrennen und Gewinnen des Gels mit den eingeschlossenen Mikroorganismen aus dem abgezogenen Reaktionsgemisch, beispielsweise durch Dekantieren, erfolgt.

Somit kann in einfacher Weise das Produktgemisch oder die Produktlösung aus der enzymalischen Reaktion mit einem Gehalt an L( + )-Weinsäure oder deren Salzen erhalten werden. Der hier verwendete Ausdruck »Produktlösung der enzymatischen Reaktion« bedeutet das Eluat aus der Säule im Falle des kontinuierlichen Herstellungsverfahrens und andererseits die Lösung, die nach der Abtrennung des Gels mit den eingeschlossenen Mikroorganismen aus dem Reaktionsgemisch im Falle der absatzweisen oder halbkontinuierlichen Methode

verbleibt.

Beim kontinuierlichen Verfahren beträgt die Zuführgeschwindigkeit der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze zur Reaktionssäule zweckmäßig 0,1 bis 15 g/Stunde in Form der freien cis-Epoxybernsteinsäure je g des Mikroorganismus, der in diesem Gel eingeschlossen ist.

Die so erzeugte L(+)-Weinsäure oder deren Salze wird aus dem Produktgemisch der enzymatischen Reaktion oder der Produktlösurg zweckmäßig als ein schwer lösliches oder vollständig unlösliches Salz, wie als Calcium-L( + )-tartrat, ausgefällt Diese Salze werden abfiltriert, wieder in Wasser suspendiert und unter Rühren und Zusatz von wäßriger Schwefelsäure stellt man den pH-Wert der Suspension auf 1,8 ein. Die dabei ausfallenden schwerlöslichen oder vollständig unlöslichen Salze, wie Calciumsulfat, werden entfernt und schließlich wird der Wassergehalt aus der verbleibenden Flüssigkeit, beispielsweise durch Einengen unter vermindertem Druck, so weil verringert, daß man dann die rohen Kristalle von L(+)-Weinsäure erhält. Ein Raffinieren der rohen Kristalle erfolgt durch Lösen derselben in Wasser, Leiten der wäßrigen Lösung durch eine Säule, die mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz, wie z. B. »Amberlite IR 120« in der H+-Form, gefüllt ist, wodurch eine Adsorption der Säure an das Harz erfolgt, durch Eluieren der adsorbierten Säule mit Wasser, erneutes Leiten )

des Eluats durch eine Säule, die mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz, wie z. B. »Amberlite IRA 400« vom Ameisensäure-Typ gefüllt ist, und durch Eluieren der absorbierten Säure mit 9-n Ameisensäure. Die gereinigte L( + )-Weinsäure wird durch Einengen des erhaltenen Eluats erhalten.

Wenn ein Gel mit eingeschlossenen Mikroorganismen bei der enzymatischen Reaktion verwendet wird, wie vorstehend erläutert, so ist das erhaltene Reaktionsgemisch im wesentlichen frei von Fremdverunreinigungen, wie Enzymen, Mikroorganismen, Zellen und anderen eiweißhaltigen Substanzen. Durch eine einfache Nachbehandlung können deshalb L(+)-Weinsäure oder deren Salze mit einer hohen Reinheit in hohen Ausbeuten aus [der enzymatischen Reaktionslösung erhalten werden.

Die Reinheit der so gebildeten L( + )-Weinsäure wird auch dadurch begünstigt, daß kein Einbringen von Puffermitteln und/oder Mitteln zur Einstellung des osmotischen Drucks der wäßrigen Lösung der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salzen erforderlich ist

Die vorliegende Erfindung wird anhand der Beispiele unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen näher beschrieben. In den Beispielen 38 bis 42 ist der verwendete Mikroorganismus stets Acetobacter curtus Nr. 21. Wenn die gleichen Versuche unter Verwendung anderer Mikroorganismen als Acetobacter cprtus Nr. 21, ■nämlich unter Verwendung von Acetobacter custus Nr. 4 oder Acetobacter curtus Nr. 10 durchgeführt werden, ■ erhält man die gleichen Ergebnisse.

In den Beispielen 38 bis 42 werden die enzymatischen Aktivitäten der cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase nach dem folgenden Verfahren bestimmt: Eine vorbestimmte Menge einer gegebenen Substanz, die cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase enthält, wird einer wäßrigen Lösung zugegeben, die 1 Gewichtsprozent des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure enthält. Dann stellt man mittels Zugabe von Phosphatpufferlösung den | pH-Wert auf 8 ein und läßt die Lösung eine Stunde bei 34°C reagieren. Gegen Ende der Reaktion wird die " 35 | Reaktionslösung fünf Minuten zum Sieden erhitzt, um die Reaktion zu unterbrechen. Wenn die Reaktionslösung jj zufällig Mikroorganismenzellen oder anderes ähnliches unlösliches Material enthält, wird sie zentrifugiert, um die Verunreinigungen abzutrennen und um anschließend eine klare überstehende Lösung zu erhalten. Bei dieser überstehenden Lösung wird der Drehungswinkel bestimmt. Durch Vergleich des Meßwertes mit der zuvor erstellten Eichkurve, die den Gehalt an Dinatriu-n-L( + )-tartrat als Funktion des Drehungswinkels zeigt, wird die Menge des durch diese Reaktion erzeugten Dinatriumsalzes der L( + )-Weinsäure berechnet. Die enzymatische Aktivität des Enzyms wird durch die Menge des Dinatriumsalzes der L( + )-Weinsäure ausgedrückt, die je ml einer gegebenen Substanz mit einem Gehalt an cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase je Stunde erzeugt worden ist, und zwar als m Mol/Stunde/ml, wobei dieser Ausdruck als Einheit verwendet wird.

In den Beispielen I bis 55 bedeuten die Ausdrücke »Teile« und »Prozent« Gewichtsteile und Gewichtsprozent, wenn nicht anders angegeben. Die 0,1-m Phosphatpufferlösung vom pH 8, die 0,05-m Phosphatpufferiösung vom pH 8 und die 0,025-m Phosphatpufferlösung vom pH 8 in den Beispielen 43 bis 55 stellen Pufferlösungen dar, die durch Verdünnen mit Wasser auf das Doppelte, Vierfache bzw. Achtfache des ursprünglichen Volumens eines Gemisches aus 5,3 Volumenteilen einer wäßrigen 0,2-m Mononatriumdihydrogenphosphat-Lösung und 94,7 Volumenteilen einer wäßrigen 0,2-m Dinatrium-monohydrogen-phosphat-Lösung erhalten worden sind. Die in ,den Beispielen 43 bis 55 für den Teilchendurchmesser verwendete Maschengröße bezieht sich auf die Vorschrift JIS G 3555-1964.

Beispiel 1

In 100 ml eines Nährmediums mit einem an 0,5% Dikaliumphosphat, 0,2% Monokaliumphosphat, 0,3% Ammoniumsulfat, 0,05% Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,001% Eisen(II)-sulfatheptahydrat, 0,01% Hefeextrakt und 1,0% des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure und mit einer Einstellung auf einen pH-Wert von 6,5 wird der Stamm Acetobacter curtus Nr. 4 (FERM-P Nr. 2879) geimpft und 24 bis 48 Stunden bei 30⁰C gezüchtet. Das in der Nährlösung vorhandene Dinatriumsalz der cis-Epoxybernsteinsäure wird vollständig verbraucht. Man erhall 0,45 g Natrium-L( + )-tartrat (= 40prozentige Ausbeute, bezogen auf das Dinatriumsalz der eis-Epoxybernsteinsäure).

Das Reakiionsgemisch wird zentrifugiert, um die Mikroorganismenzellen abzutrennen und eine überstehende Lösung zu erhalten. Durch Zusatz von etwa 25 ml einer wäßrigen Calciumchloridlösung mit einer Konzentration von 0,1 Mol/L'iicr zu der überstehenden Lösung erhält man eine Ausfällung von Calcium-L( + )-tartrat. Der + Niederschlag wird abfillriert und in etwa 50 ml Wasser suspendiert. Während die Suspension gerührt wird, fügt man 0,1 -n Schwefelsäure hinzu, bis der pH-Wert der Suspension 1,8 beträgt. Der erzeugte Niederschlag von Calciumsulfat wird abfiltriert. Das Fillrat wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und liefert etwa 0,28 g L( + )-Wcinsäure in Kristallform. Die derart erhaltene L( + )-Weinsäure weist eine spezifische Dre-

hung von [λ]1° = +15,5° (c = 10%).

Ein Vergleich dieser Ergebnisse mit jenen einer L(+)-Weinsäure vom Reinheitsgrad pro analysi, wie sie auf dem Markt erhältlich ist, zeigt an,daß das erhaltene Produkt eine 1 OOprozentige optische Reinheit aufweist

5 Beispiel 2

Zu der in Beispiel 1 erhaltenen Kulturlösung werden !,0 g des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure zugegeben. Die Nährlösung wird auf pH 8,0 eingestellt und vier Stunden bei 35°C geschüüelt. Das neu zugegebene Substrat wird vollständig aufgebraucht, und die Nährlösung enthält 1,29 g Natrium-L( + )-tarlrat (Ausbeute = 59%, bezogen auf das eingesetzte Gesamtsubstrat, 78%, bezogen auf das neu eingesetzt Substrat). In dieser Weise werden l,0g-Anteile des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure nacheinander bis zu insgesamt 20,0 g zugegeben. Schließlich ist das nach und nach zugegebene Substrat völlig aufgebraucht, und die Nährlösung enthält 20,18 g Natrium-L(+)-tartrat (Ausbeute 89%, bezogen auf die Gesamtbeschickung). Die Nährlösung wird zentrifugiert und ergibt eine überstehende Lösung, zu der etwa 120 ml einer Caiciumchloridlösung mit einer Konzentration von 1 Mol/Liter gegeben wird. Man erhält einen Niederschlag von CaIcium-L(+)-tartrat. Der Niederschlag wird abfiltriert und in etwa 200 ml Wasser suspendiert Während die Suspension gerührt wird, wird 1-n Schwefelsäure bis zu pH-Wert der Suspension von 1,8 zugegeben. Der Nietlerschlag von Calciumsulfat wird abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und liefert 14,7 g L(+)-Weinsäure in Kristallform. Die derart erhaltenen rohen Kristalle werden in Wasser gelöst Die wäßrige Lösung wird durch eine Säule von 3 χ 80 cm geschickt, die mit »Amberlite IR 120« in der H +-Form gefüllt ist. Das Adsorbat wird mit etwa 1000 ml Wasser eluiert. Das erhaltene Eluat wird durch eine andere Säule von 3 χ 80 cm geleitet, die mit »Amberlite IRA 400« in der Ameisensäure-Form gefüllt ist Das Adsorbat wird mit etwa 1000 ml 9-n Ameisensäure eluiert. Das derart erhaltene Eluat wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und liefert 13,5 g reine Weinsäure. Die derart erhaltene L(+)-Weinsäure hat eine optische Reinheit

25 von 100%.

Beispiel 3

Die in gleicher Weise wie in Beispiel 1 erhaltene Nährlösung wird zentrifugiert, um Zellen abzutrennen. Die Zellen werden in 200 m! einer 0,05-m Phosphatpufferlösung, die vorher auf pH 7,0 eingestellt worden ist, suspendiert. Die Suspension wird wiederum zentrifugiert, um die Zellen zu reinigen. Diese Reinigung wird dreiniai wiederholt. Ein Anteil von 0,5 g der gereinigten Zellen wird zu 100 ml einer Lösung gegeben, die 1,0 g des Dihydrats des Monocalciumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure und 0,3 g Caiciumcarbonat als Substrat enthält. Das erhaltene Gemisch wird auf pH 8,0 eingestellt und vier Stunden bei 35°C geschüttelt. Das Substrat wird völlig aufgebraucht und im Reaktionsgemisch befindet sich Ca!cium-L( + )-tartrat in einer Menge von 1,09%, was einer Ausbeute von 98% entspricht. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird mit 1,0 g des Dihydrats des Monocalciumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure und 0,3 g Caiciumcarbonat versetzt und wiederum vier Stunden bei 35°C geschüttelt. Das im Reaktionsgemisch vorliegende Substrat wird vollständig aufgebraucht und in Calcium-L(-l-)-tartrat überführt. Die Menge beträgt 2,18 g entsprechend einer Ausbeute von 98% bezogen ä auf das eingesetzte Substrat. Auf diese Weise werden Anteile von 1,0 g des Dihydrats des Monocalciumsalzes

ti 40 der cis-Epoxybernsteinsäure und Anteile von 0,3 g Caiciumcarbonat gleichzeitig bis zu insgesamt 20,0 g bzw. 6,0 g zugegeben. Schließlich ist das nach und nach zugegebene Substrat vollständig aufgebraucht, und es liegt ein

Niederschlag von Ca!cium-L(+)-tartrat vor. Die derart erzeugte Menge beträgt 22,0 g, entsprechend einer Ausbeute von 99%. Das Calcium-L( + )-tartrat wird in etwa 200 m! Wasser suspendiert Während die Suspension gerührt wird, wird 1 -n Salzsäure zugegeben, bis sich der Niederschlag von Calcium-L( + )-tartrat gelöst hat. Die erhaltene Lösung wird zentrifugiert, um Mikroorganismenzellen daraus zu entfernen. Die verbleibende Lösung wird durch eine Säule von 3 χ 80 cm geleitet, die mit »Amberlite IR 120« in der H ⁺ -Form beschickt ist. Das Adsorbat wird mit Wasser eluiert. Durch Eindampfen des Eluats unter vermindertem Druck zur Trockne erhält man 15,7 gL( + )-Weinsäure in Kristallform. Die Ausbeute beträgt 89% und die optische Reinheit isl 100%.

50 B e i s ρ i e 1 4

In eine Nährlösung in einer Zusammensetzung ähnlich der des Beispiels 1, mit Ausnahme eines weiteren Zusatzes von 1,0% des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure und 1,0% Glukose als Kohlenstol'fquelle, wird der Stamm Acetobacter curtus Nr. 10 (FERM-P Nr. 2880) überimpft und 24 bis 48 Stunden bei 30"C gezüchtet. Aus der erhaltenen Anzuchtlösung werden die lebenden Mikroorganismenzellen durch Zentrifugieren entfernt. Die Zellen werden mit Phosphatpufferlösung einer Konzentration von 0,05 Mol/Liter und einem pH-Wert von 7,0 gewaschen, dann in Wasser suspendiert und gefriergetrocknet. Ein Anteil von 0,1 g der lyophilisierten Zellen wird vier Stunden bei 35⁰C in 100 ml einer Lösung schwach geschüttelt, die als Substrat 1,0 g des Dihydrats des twonocalciumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure enthält und einen pH-Wert aufweist, der mittels Natriumhydroxidlösung auf 8,0 eingestellt worden ist. Das Substrat wird vollständig aufgebraucht und man erhält Natrium-L( + )-tartrat und Calcium-L( + )-tartrat. Von diesem Punkt an wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 3 wiederholt. Die zellfreie Anzuchtlösung wird durch eine Säule geschickt, die mit einem Ionenaustauscherharz gefüllt ist. Das Eluat wird zur Trockne eingedampft und liefert 0,85 g L( +)-Weinsäure in einer Ausbeute von 96% und einer optischen Reinheit von 98%.

Beispiel 5

Gereinigte Mikroorganismenzellen, die in gleicher Weise wie in Beispiel 3 erhalten worden sind, werden in 100 ml einer wäßrigen Lösung eingebracht, die als Substrat 1,0 g cis-Epoxybernsteinsäure enthält und einen

pH-Wert aufweist, der mittels wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 8,0 eingestellt worden ist Die Lösung wird vier Stunden bei 35°C gerührt. Das Substrat wird vollständig aufgebraucht, und man erhall 1.40 g Natrium L( + )-tartrat, entsprechend einer Ausbeute von 95%. Das Reaktionsgemisch wird anschließend wie im Verfahren des Beispiels 2 behandelt. Die schließlich erhaltene L( + )-Weinsäure weist eine optische Reinheit von 100% auf.

Beispiel 6

Das Verfahren des Beispiels 5 wird wiederholt jedoch mit der Ausnahme, daß 1,0 g des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure als Substrat verwendet werden. Das Substrat wird vollständig aufgebraucht, und man to erhält Dinatrium-L(+)-tartrat in einer Menge von 1,08 g, entsprechend einer Ausbeute von 98%. Die durch ein anschließendes gleiches Verfahren wie in Beispiel 2 erhaltene L(+)-Weinsäure weist eine optische Reinheit von 100% auf.

Beispiel 7

Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß der Stamm Acetobacter curtus Nr. 21 (FERM-P Nr. 2881) anstelle des Stamms Acetobacter curtus Nr. 4 eingesetzt wird. Aus der Anzuchtlösung werden gereinigte Mikroorganismenzellen entsprechend dem Verfahren des Beispiels 3 erhalten. Die gereinigten Zellen werden in etwa 30 ml Aceton suspendiert und dann zentrifugiert Diese Reinigung der Zellen mit Aceton wird insgesamt dreimal wiederholt Die gereinigten Zellen werden bei einer Temperatur von nicht über 30⁰C unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält acetongetrocknete Mikroorganismenzellen. Das Behandlungsverfahren des Beispiels 5 wird wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß 0,1 g acetongetrocknete Zellen und 1,0 g Natrium-calcium-cis-epoxysuccinat als Substrat verwendet werden. Das Substrat wird in dem Gemisch vollständig aufgebraucht, und man erhält 0,49 g Natrium-L( + )-tartrat und 0,48 g Calcium-L( + )-tartrat, entsprechend einer Gesamlausbeute von 97%. Die entsprechend dem Verfahren des Beispiels 3 erhaltene L( + )-Weinsäure weist eine optische Reinheit von 100% auf.

Beispiel 8

Ein Anieil von 0,5 g gereinigter Zellen von A.cetobacter curtus Nr. 21 (FERM-P Nr. 2881), der nach dem Verfahren des Beispiels 7 erhalten worden ist, wird vier Stunden bei 35°C in einer Lösung schwach geschüttelt, die als Substrat 1,0 g des Diammoniumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure enthält und vorher mittels wäßrigem Ammoniak auf einen pH von 8,0 eingestellt worden ist. Das Substrat in dem Reaktionsgemisch wird vollständig aufgebraucht, und man erhält 1,05 g Ammoniumtartrat, entsprechend einer Ausbeute von 95%. Das Reaktionsgemisch wird zentrifugiert, um Mikroorganismenzellen daraus zu entfernen. Die verbleibende Lösung wird mit 0,6 g Calciumcarbonat versetzt, worauf ein Niederschlag von Calcium-L( + )-tartrat gebildet wird. Der Niederschlag wird abfiltricrl und der gleichen Behandlung wie in Beispiel 1 unterworfen. Die danach erhaltene L( + )-Weinsäure weist eine optische Reinheit von 100% auf.

Beispiel 9

Gereinigte Mikroorganismenzellen von Acetobacter curtus Nr. 4 (FERM-P Nr. 2879), die nach dem Verfahren des Beispiels 3 erhalten worden sind, werden in 100 ml einer 0,05-m Phosphatpufferlösung vom pH 7,0 suspendicrt. Die Suspension wird mittels eines Zellzertrümmerers durch Vibration behandelt, um ein homogenes Produkt zu erhalten. Durch Zentrifugieren des erhaltenen homogenen Produktes fällt eine lösliche Fraktion an, die gegen Leitungswasser dialysiert wird. Die innerhalb des Dialysators erhaltene Flüssigkeit wird auf 50 ml eingeengt, die als zellfreier Extrakt eingesetzt werden. Dieser zellfreie Extrakt wird auf einen pH 8,0 eingestellt, indem 1,0 g Telrahydrat des Calciumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure zugegeben werden. Dann wird das Ganze mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml verdünnt. Das derart erhaltene Gemisch wird vier Stunden bei 35°C geschüttelt. Das Substrat in dem Reaktionsgemisch wird vollständig aufgebraucht, und man erhält 0,77 g Calcium-L( + )-tartrat, entsprechend einer Ausbeute von 99%. Das Calcium-L( + )-tartrat wird abfiltrierl und dann gemäß dem Verfahren des Beispiels 1 behandelt. Man erhält L( + )-Weinsäure mit einer optischen Reinheit von 100%.

Beispiel 10

Gereinigte Mikroorganismenzellen von Acetobacter curtus Nr. 10 (FERM-P Nr. 2880), die nach dem Verfahren des Beispiels 4 erhalten worden sind, werden in der gleichen Weise wie in Beispiel 9 beschrieben homogenisiert. Man erhält ein lösliches Dialysat, das mit Ammoniumsulfat fraktioniert wird. Die Fraktion einer Sättigung von 0 bis 0,5 wird gesammelt. Diese Ammoniumsulfatfraktion wird gegen eine 0,05-m Phosphatpufferlösung vom \: pH 7,0 dialysiert. Die innerhalb des Dialysators erhaltene Flüssigkeit wird auf 30 ml eingeengt. Sie wird als rohe

Enzymflüssigkeit verwendet. Zu dieser rohen Enzymflüssigkeit wird eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt an 1,0 g des Dihydrats des Monocalciumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure und 0,3 g Calciumcarbonat als Substrat zugegeben. Das erhaltene Gemisch wird auf pH 8,0 eingestellt und dann mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml verdünnt. Das derart erhaltene Gemisch wird vier Stunden bei 35⁰C geschüttelt. Das Substrat in dem Reaktionsgemisch wird vollständig aufgebraucht. Man erhält 1,09 g Calcium-L( + )-tartrat, entsprechend einer Ausbeute von 98%. Die nach dem Verfahren des Beispiels 1 erhaltene L( + )-Weinsäure weist eine optische Reinheit von 100% auf.

i π

Beispiel 11

In 100 ml einer Lösung, die als Substrat 5,0 g des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure enthält, wird ein Anteil von 0,5 g gereinigte Zellen von Acetobacter curtus Nr. 10 (FERM-P Nr. 2880) eingebracht, die nach dem Verfahren des Beispiels 4 hergestellt worden sind. Die Lösung wird 15 Stunden bei 35° C und einem pH von 8,0 geschüttelt. Das Substrat in der Lösung wird vollständig aufgebraucht. Man erhält 5,4 g Natrium-L(-t-)-tartrat, entsprechend einer Ausbeute von 98%. Die nach dem gleichen Verfahren des Beispiels 1 erhaltene L( + )-Weinsäure weist eine optische Reinheit von 100% auf.

Beispiel 12

In einen Anteil von 200 ml einer Kulturlösung der gleichen Zusammensetzung wie im Beispiel 1 wird der Stamm Acetobacter curtus Nr. 21 (FERM-P Nr. 2881) überimpft und dann nach dem Verfahren des Beispiels 7 behandelt. Man erhält gereinigte Mikroorganismenzellen. In 100 ml einer Lösung mit einem Gehalt an 5,0 g des Tetrahydrats des Calciumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure als Substrat werden die gereinigten Zellen 8 Stunden bei 35⁰C bei pH 8,0 geschüttelt. Das Substrat in dem Reaktionsgemisch wird vollständig aufgebraucht, und man erhält 0,75 g Calcium-L( + )-tartrat, entsprechend einer Ausbeute von 97%. Die nach dem gleichen Verfahren des Beispiels 1 erhaltene L( + )-Weinsäure weist eine optische Reinheit von 100% auf.

20 Beispiel 13

Das Verfahren des Beispiels 12 wird wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß das Volumen der Kulturflüssigkeit auf 400 ml erhöht wird. In 100 ml der wäßrigen Lösung, die als Substrat 20,0 g des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure enthält und auf pH 8,0 eingestellt ist, werden die derart bereiteten gereinigten Zellen 18 Stunden bei 35°C geschüttelt Das Substrat in dem Reaktionsgemisch wird vollständig aufgebraucht Man erhält 20,9 g Natrium-L( + )-tartrat, entsprechend einer Ausbeute von 95%. Die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 erhaltene L( + )-Weinsäure weist eine optische Reinheit von 100% auf.

Beispiel 14

Das Verfahren des Beispiels 13 wird wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß als Substrat 20,0 g des Natrium-ammonium-cis-epoxysuccinats verwendet werden. Die enzymatische Reaktion wird insgesamt 18 Stunden durchgeführt. Das Substrat in dem Reaktionsgemisch wird vollständig aufgebraucht. Man erhält 20,8 g Natriumammonium-L( + )-tartrat, entsprechend einer Ausbeute von 94%. Die nach dem Verfahren des Beispiels 8 erhaltene L( +)-Weinsäure weist eine optische Reinheit von 100% auf.

Beispiel 15

Unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 13, jedoch mit der Ausnahme, daß gereinigte Zellen verwendet werden, die in einem Liter der Kulturflüssigkeit gezüchtet worden sind, wird die enzymatische Reaktion 6 Stunden lang durchgeführt. In dem Reaktionsgemisch werden die als Substrat eingesetzten 20,0 g des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure vollständig aufgebraucht Man erhält 21,4 g Natrium-L(+)-tartrat, entsprechend einer Ausbeute von 97%. Die nach dem Verfahren des Beispiels 1 erhaltene L( +)-Weinsäure weist eine optische Reinheit von 100% auf.

Beispiel 16

In 100 ml einer Kulturflüssigkeit, die 0,3% Dikaliumphosphat, 0,1% Monokaliumphosphat, 0,1 % Ammoniumnitrat, 0,05% Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,001% Eisen(II)-sulfat-heptahydrat, 0,01 % Hefeextrakt und 1,0% des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure enthält und auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt worden ist, wird der Stamm Corynebacterium S-13 (FERM-P Nr. 2891) überimpft und 24 bis 48 Stunden bei 30° C gezüchtet. Das Substrat wird in der Kulturlösung völlig aufgebraucht In der Kulturiösung sind etwa 0,04 g erzeugtes Natrium-L( + )-tartrat enthalten. Die Ausbeute beträgt 3%.

53 Beispiele 17 bis 20

Gereinigte Mikroorganismenzellen von Acetobacter curtus Nr. 4 (FERM-P Nr. 2879) werden nach dem Verfahren des Beispiels 3 erhalten. Entsprechende Anteile von jeweils 0,5 g dieser gereinigten Zellen werden zu jeweils 100 ml einer wäßrigen Lösung gegeben, die als Substrat 1,0 g cis-Epoxybernsteinsäure enthält und auf verschiedene pH-Werte mittels Natriumhydroxidlösung eingestellt worden ist Die Lösungen werden bei 35°C unterschiedlich lange geschüttelt In jedem Reaktionsgemisch wird das Substrat vollständig aufgebraucht. Man erhält Nairium-L(-f )-tartrat in den Ausbeuten, wie sie in Tabelle IV zusammen mit den Reaktionsbedingungen angegeben worden sind. Bei jedem Ansatz weist die nach dem gleichen Verfahren des Beispiels 1 erhaltene L(+)-Weinsäure eine optische Reinheit von 100% auf.

Tabelle IV

Beispiel Nr. pH Reaktionszeit, Natrium-L( + )-tartrat optische Reinheit

Std. erzeugte Menge, Ausbeute, der L( + )-Weinsäurc, % g %

17 6,0 8,0 1,32 90 100

18 7,0 5,0 1,37 93 100

19 9,0 5,0 1,35 92 100

20 10,0 8,0 1,30 89 100 5 8,0 4,0 1,40 95 100

Beispiele 21 bis24

Gereinigte Mikroorganismenzellen werden nach dem Verfahren des Beispiels 7 erhalten, jedoch mit der Ausnahme, daß Acelobacler curtus Nr. 21 (FERM-P Nr. 2881) anstelle von Acetobacter curtus Nr. 4 (FERM-P Nr. 2879) verwendet wird. Jeweils Anteile von 0,5 g dieser gereinigten Zellen werden zu je 100 ml einer wäßrigen Lösung gegeben, die als Substrat 1,0 g des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure enthält und auf einen pH 8,0 mittels Natriumhydroxid eingestellt worden ist. Die Lösungen werden bei verschiedenen Temperaturen unterschiedlich lange geschüttelt. In jedem Reaktionsgemisch wird Natrium-L( + )-tartrat erzeugt.

Die Mengen an derart erzeugtem Natrium-L( + )-tartrat und die entsprechenden Ausbeuten sind in der Tabelle V in Verbindung mit den Reaktionsbedingungen (Temperaturen und Zeiten) angegeben. Bei jedem Ansatz weist die nach dem gleichen Verfahren des Beispiels 1 erhaltene L( + )-Weinsäure eine optische Reinheit von 100% auf.

Tabelle V

Beispiel Temperatur. Reaktionszeit, Natrium-L( + )-tartrat optische Reinheit

Nr. "C Sld. erzeugte Menge, Ausbeute, der L( + )-Weinsäure,

21 18 10,0 1,06 96 100

22 24 7,0 1,05 95 100

23 29 6,0 1,02 93 100

24 39 4,0 0,98 89 100 6 35 4,0 1,08 98 100

Beispiel 25

Zu 100 ml einer Lösung, die 1,0 g cis-Epoxybernsteinsäure und 1,43 g einer 33prozentigen wäßrigen Methyluminlösung enthält und auf pH 8,0 eingestellt worden ist, wird ein Anteil von 0,5 g gereinigten Mikroorganismenzellen von Acclobacter curtus Nr. 10 (FERM-P Nr. 2880) gegeben, die nach dem Verfahren des Beispiels 4 hergestellt worden sind. Die Lösung wird sechs Stunden bei 30⁰C geschüttelt. Das Reaktionsgemisch enthält 1,32 g des Dimethylaminsalzes der L( + )-Weinsäure, entsprechend einer Ausbeute von 90%.

Dieses Salz wird durch Zugabe einer Lösung von Calciumchlorid in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 in das Calcium-L( + )-iartral umgewandelt, aus dem man L( + )-Weinsäure erhält, die eine optische Reinheit von 100% aufweist.

Beispiel 26

Das Verfahren des Beispiels 5 wird in gleicher Weise durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß eine wäßrige Lösung von Kaliumhydroxid anstelle einer wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid verwendet wird. Das Substrat in dem Reaktionsgemisch wird vollständig aufgebraucht. Man erhält 1,61 g K.alium-L( + )-tartrat entsprechend einer Ausbeute von 94%. In gleicher Weise wie das Natrium-L( + )-tartrat des Beispiels 1 wird das Kalium-L( + )-tarlrul behandelt und liefert L(-t-)-Weinsäure von einer optischen Reinheit von 100%.

Beispiel 27

In 100 ml einer wäßrigen Lösung, die 1,0 g cis-Epoxybernsteinsäure und 0,44 g Magnesiumhydroxid enthält und auf pH 8,0 eingestellt worden ist, wird ein Anteil von 0,5 g gereinigter Mikroorganismenzellen von Acetob- eo ader curtus Nr.4 (FERM-P Nr. 2879) gegeben, die nach dem Verfahren des Beispiels 3 erhalten worden sind. Die Lösung wird fünf Stunden bei 35°C geschüttelt. In dem Reaktionsgemisch bilden sich 1,19 g Magnesium-L( + )-tarlrat, entsprechend einer Ausbeute von 91%. Durch Behandeln dieses Salzes an einer Säule, die in gleicher Weise wie in Beispiel 3 mit»Amberlite IR 120« in der H+-Form beschicktist, erhält man L( + )-Weinsäure mit einer optischen Reinheit von 100%.

B e i s ρ i e 1 e 28 bis 36

Aliquote Anteile von jeweils 0,5 g gereinigter Mikroorganismenzellen von Acetobacter curtus Nr. 4 (FERM-P Nr. 2879), die nach dem Verfahren des Beispiels 3 hergestellt worden sind, werden jeweils zu 100 ml einer Lösung gegeben, die 1,0 g cis-Epoxybernsteinsäure sowie verschiedener Metallhydroxide, Metalloxide oder -carbonate enthält. Die Lösungen werden bei verschiedenen Temperaturen unterschiedlich lange geschüttelt. In jedem Reaktionsgemisch erhält man das entsprechend der verwendeten Metallverbindung gebildete Metallsalz der L(-t-)-Weinsäure. Die Mengen an erzeugten Salzen und ihre entsprechenden Ausbeuten sind in derTabelle Vl in Verbindung mit den entsprechenden Reaktionsbedingungen angegeben. Aus jedem Metallsalz der !,( + ^Weinsäure erhält man nach dem Verfahren des Beispiels 27 Produkte mit der in der Tabelle angegebenen optischen Reinheit.

14

Tabelle VI	Metallhydroxid, -carbonat usw.	Gewicht, g	ph	Temperatur,	Reaktions	Verbindung	erzeugte	Atisbeute	optische Reinheit
Beispiel	Verbindung	0,56		0C	zeit, Std.	Calcium-L( + )-tartrat	Menge, g	o/o	der H + )-Weinsäure,
Nr.	Calciumhydroxid	1,50	7,5	35	4	Bärium-L(+)-tartrat	1,40	98	100
28	Bariumcarbonat	0,75	7,0	35	6	Zink-L( + )-tartrat	2,01	93	100
29	Zinkhydroxid	0,54	6,0	35	12	Eisen-L( + )-tartrat	1,45	90	100
30	Eisenhydroxid	0,39	6,0	35	18	Aluminium-L( + )-tartrat	1,25	89	98
31	Aluminiumhydroxid	0,80	6,0	35	10	Natrium-L(+)-tartrat	1,15	91	100
32	Natriumcarbonat	1,05	8,0	32	5	Kalium-L( + )-tartrat	1,43	97	100
33	Kaliumcarbonat	0,43	8,5	34	5	Calcium-L( + )-tartrat	1,66	97	100
34	Calciumoxid	0,31	8,0	35	4	Magnesium-!/+ Vtartrat	1,37	96	100
35	Magnesium		8,0	35	5		1,20	92	100
36

io

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Beispiel 37

Das Verfahren des Beispiels 25 wird wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß 1,53 g Triäthylamin anstelle der 33prozemigen Methylaminlösung verwendet werden. Im Reaktionsgemisch bilden sich 1,73 g des Di-(triäthylamin)-L( +)-tartrats, entsprechend einer Ausbeute von 91%. Die optische Reinheit der nach dem Verfahren des Beispiels 25 erhaltenen L(+)-Weinsäure beträgt 100%.

Beispiel 38

In Leitungswasser werden 2 g Dinatrium-DL-tartrat, 0,2 g KH₂PO₄, 0,1 g K₂HPO₄, 0,3 g NH₄NO₃, 0,05 g MgSO₄ ■ 7 H₂0,0,05 g Hefeextrakt, 0,002 g FeSO₄ · 7 H₂O und 0,01 g MnCl₂ · 4 H₂O zu einem Gesamtvolumen von 100 ml gelöst, die als Nährmedium verwendet werden. In diesem Medium wird der Stamm Acetobacter curtus Nr. 21 (FERM-P Nr. 2881) vier Tage lang bei 30⁰C unter Schütteln gezüchtet Der Anfangs-pH-Wert der Kulturflüssigkeit beträgt 6,2. Am Ende der Züchtung wird die Kulturlösung auf die enzymatische Aktivität geprüft Sie beträgt 24 μΜοΙ/Stunde/ml.

Vergleichsbeispiel 1

Das Verfahren des Beispiels 38 wird wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß 2 g Glukose anstelle von 2 g Dinatrium-DL-tartrat verwendet werden. Auf dieser Anzuchtlösung wird der Stamm Acetobacter curtus Nr. 21 (FERM-P Nr. 2881) gezüchtet. Wenn die Kulturlösung auf die enzymatische Aktivität geprüft wird, ist sie praktisch Null.

Beispiel 39

Es wird der Stamm Acetobacter curtus Nr. 21 (FERM-P Nr. 2881) nach dem Verfahren des Beispiels 38 gezüchtet, jedoch mit der Ausnahme, daß 2 g Calcium-DL-tartrat anstelle von 2 g Dinatrium-DL-tartrat verwendet werden. Der Anfangs-pH-Wert der Kulturlösung in diesem Falle beträgt 6,0. Am Ende der Züchtung wird die Kulturlösung mit niedriger Geschwindigkeit bei 500 g zentrifugiert. Man erhält ein Gemisch mit einem Gehalt an Mikroorganismenzellen, das frei von unlöslichen Calciumsalzen ist. Dieses Gemisch wird auf die enzymatische Aktivität geprüft, die sich mit 11 μΜοΙ/Stunde/ml ergibt.

Beispiel 40

Mittels Leitungswasser werden 20g Dinatrium-DL-tartrat, 2 g KH₂PO₄, 1 g K₂HPO₄, 3 g NH₄NO₄, 0,5 g MgSO₄ · 7 H₂O, 0,5 g Hefeextrakt, 0,02 g FeSO₄ ■ 7 H₂O und 0,01 g MnCl₂ · 4 H₂O bis zu einem Gesamtvolumen von 1000 ml gelöst, das als Anzuchtflüssigkeit verwendet wird. In dieser Anzuchtflüssigkeit wild der Stamm Acetobacter curtus Nr. 21 (FERM-P Nr. 2881) aerob unter Verwendung eines Schüttelfermentors gezüchtet. Das in die Anzuchtlösung eingeleitete Luftvolumen beträgt 0,5 VVM; die Temperatur wird auf 30"C gehalten. Der pH-Wert während der Anzucht wird durch Verwendung einer wäßrigen !Ovolumenprozentigen Schwefelsäure auf 6,3 gehalten. Die Bebrütung dauert drei Tage. Danach wird die so erhaltene Anzuchtlösung auf die enzymatische Aktivität geprüft, die sich zu 38 μΜοΙ/Stunde/ml ergibt. Ein Anteil von 300 ml dieser Anzuchtlösung wird zentrifugiert, um die Mikroorganismenzellen daraus abzutrennen. Die Zellen werden in 50 ml Wasser dispergiert. Die erhaltene Dispersion wird mit 50 ml einer wäßrigen 20prozentigen Lösung des Dinalriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure mit einem pH von 8,0 vermischt. Das erhaltene Gemisch wird zehn Stunden auf 34°C gehalten, um eine Hydrolyse des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure zu bewirken. Am Ende der Reaktion wird das Reaktionsgemisch zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird zur Trockne eingedampft und raffiniert. Man erhält 11,3 g Dinatrium-L( + )-tartrat-dihydrat in Kristallform. Die optische Reinheit der Krislalle beträgt 97%, bezogen auf die optische Reinheit eines im Handel befindlichen Dinatrium-L( + )-tartrat-dihydrats von Analysenreinheit. Das Röntgenbeugungsdiagramm und das IR-Spektrum, die mit diesen Kristallen erhalten worden sind, stehen in vollständiger Übereinstimmung mit den entsprechenden Spektren des vorgenannten Dinatrium-L( + )-tartrat-dihydrats von Analysenreinheit.

Beispiel 41

Mit Leitungswasser werden 30 g Dinatrium-L( + )-tartrat, 5 g Glukose, 2 g KH₂PO₄, Ig K₂HPO₄, 3 g (NH₄J₂SO₄ und 0,5 g MgSO₄ · 7 H₂O bis zum Gesamtvolumen von 1000 ml gelöst, die als Anzuchtlösung verwendet werden. In dieser Anzuchtlösung wird der Stamm Acetobacter curtus Nr. 21 (FERM-P Nr. 2881) nach dem Verfahren des Beispiels 40 gezüchtet. Die Anzuchtlösung hat eine enzymatische Aktivität von 56 μΜοΙ/ Stunde/ml.

Beispiel 42

Mit Leitungswasser werden 20 g Diammonium-DL-tartrat, 2 g KH₂PO₄, 1 g K₂HPO₄, 0.5 g MgSO₄ · 7 H₂O und 0,5 g Hefeextrakt bis zum Gesamtvolumen von 1000 ml gelöst, die als Anzuchtlösung verwendet werden. In dieser Anzuchtlösung wird der Stamm Acetobacter curtus Nr. 21 (FERM-P Nr. 2881) aerob unter Verwendung eines Schüttelfermentors gezüchtet, wobei das Volumen der zugeführten Luft auf 0,5 VVM festgelegt worden ist, die Temperatur auf 30°C gehalten wird und der pH-Wert während der Züchtung durch Verwendung einer

iwimiiiimca

wäßrigen lOvolumenprozemigen Schwefelsäure auf pH 3 eingestellt wird. Nach dreitägiger Züchtung wird die Kulturlösung auf ihre enzymatische Aktivität geprüft, die sich mit 40 μΜοΙ/Stunde/ml ergibt

Beispiel 43

In 100 Teile eines flüssigen Kulturmediums, das 0,2% KH₂PO₄, 0,5% K₂HPO₄, 0,3% (NH₄)₂SO₄, 0,05% |

MgSO₄ · 7 H₂O, 0,001% FeSO₄ · 7 H₂O, 0,01% Hefeextrakt und 1,0% des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybern- |

stsinsäure enthält und auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt worden ist, wird der Stamm Acetobacter curtus Nr. 21 (FERM-P Nr. 2881) überimpft und 48 Stunden bei 30⁰C gezüchtet. Die erhaltene Anzuchtlösung wird zentrifugiert, um daraus Mikroorganismenzellen abzutrennen. Die abgetrennten Zellen werden in einer 0,1-m Phosphatpufferlösung von pH 7,0 suspendiert und wiederum zentrifugiert, um die Zellen zu waschen. Diese 0,1 -m Phosphalpufferlösung vom pH 7,0 wird erhalten durch Verdünnen mit Wasser auf das Doppelte der. ursprünglichen Volumens eines Gemisches von einer wäßrigen 0,2-m Mononatrium-dihydrogen-phosphat-Lösung mit einer wäßrigen 0,2-m Dinatrium-monohydrogen-phosphat-Lösung mit einem Volumenverhältnis von 39:61. -15

Zu 1 Teil der Zellsuspension mit einem Gehalt von 1,5% Zellen werden 6 Teile einer 0,1-m Phosphatpufferlösung vom pH 8,0, 0,75 Teile Acrylsäureamid, 0,04 Teile N,N'-Methylen-di-(acrylsäureamid), 0,5 Teile einer wäßrigen 2,5prozentigen Kaliumpersulfatlösung und 0,5 Teile einer wäßrigen 5prozentigen ^-Dimethylaminopropionitril-Lösung zugegeben. Man läßt die Lösung 30 Minuten bei 3O⁰C polymerisieren. Das danach erhaltene Polymergel wird zerkleinert. Ein Teil der zerkleinerten Gelteilchen, die einen Teilchendurchmesser aufweisen, -der durch Siebe von 60 bis 20 Maschen geht und die 90 Gewichtsprozent des gesamten Gels ausmachen, werden mit 0,1-m Phosphatpufferlösung vom pH 8,0 gewaschen. Man erhält 9 Teile eines Gels mit darin eingeschlosse- * nen Mikroorganismen.

9 Teile dieses Gels mit den eingeschlossenen Mikroorganismen werden mit 10 Teilen einer wäßrigen 2prozentigen Lösung des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure vermischt und unter Rühren zwei Stunden bei 30°C gehalten, damit die Mikroorganismen auf das Salz einwirken können. Am Ende dieser Reaktion wird das enzymatische Reaktionsgemisch filtriert, um das Gel mit den eingeschlossenen Mikroorganismen abzutrennen. Das Filtrat wird hinsichtlich der Drehung untersucht, um die Menge des sich bei der Reaktion gebildeten Dinatrium-L(+)-tartrals zu bestimmen.

Zu Verglcichszwecken wird 1 Teil der gleichen zuvor beschriebenen Zellsuspension mit 10 Teilen einer wäßrigen 2prozentigen Lösung des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure vom pH 8,0 zwei Stunden bei 30"C gerührt, um eine Reaktion zu bewirken. Am Ende dieser Reaktion wird das Reaktionsgemisch wie zuvor beschrieben untersucht, um die Menge des im Anschluß an die Reaktion gebildeten Dinatrium-L( + )-tartrats zu bestimmen.

Aus den vorstehend -erhaltenen Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Aktivitätsausbeute des Gels mit den eingeschlossenen Mikroorganismen 74% beträgt. Die vorstehend erwähnte Aktivitätsausbeute wird nachstehend wie folgt definiert:

Menge des durch das Gel mit den eingeschlossenen

AkIiVi₁UlSaUSbCUtC, % - _{χ [QQ 4Q}

Menge des durch den gleichen, jedoch nicht in einem Gel eingeschlossenen Mikroorganismus gebildeten Dinatrium-L(+)-tartrats

B e i s ρ i e 1 44

Zu 20 Teilen einer nach dem Verfahren des Beispiels 43 erhaltenen Zellsuspension werden 3,75 Teile Acrylsäureamid, 0,2 Teile N,N'-Methylen-di-(acrylsäureamid), 2,5 Teile einer wäßrigen 2,5prozentigen Kaliumpersulfatlösung, 2,5 Teile einer wäßrigen 5prozentigen /f-Dimethylamino-propionitril-Lösung und 15 Teile einer 0,1-m Phosphatpuffcrlösung vom pH 8,0 gegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur polymerisieren gelassen. Das derart erzeugte polymer Gel wird zerkleinert. Ein Teil der zerkleinerten Gclluilchen, die leilchcndurchmes.ser aufweisen, die durch Siebe mit 6 bis 20 Maschen fallen, und die 90% des gesamten Gels ausmachen, wird mit 0,1-m Phosphatpufferlösung vom pH 8,0 gewaschen und liefert 45,6 Teile eines Gels mit darin eingeschlossenen Mikroorganismen.

Bei 30°C werden 45,6 Teile dieses Gels mit eingeschlossenen Mikroorganismen mit 200 Teilen einer wäßrigen lprozentigen Lösung des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure vom pH 7,9 verrührt, um eine Reaktion zu bewirken. Danach wird das Reaklionsgemisch filtriert, um eine enzymatische Reaktionslösung zu erhalten. Die Umwandlung in das Dinairium-L( + )-tartrat variiert mit der Reaktionsdauer, wie dies während der vorstehend beschriebenen Reaktion beobachtet worden ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle VlI enthalten.

Die Umwandlung in das hierin erwähnte Dinatrium-L( + )-tartrat wird nachstehend durch die folgende Formel definiert:

Anzahl der Mole des durch die enzymatische Reaktion

Umwandlung in _ gebildeten Dinatrium-L(+)-tartrats χ 100

ninalrium-L( +Kartrat Anzahl der Mole des in das enzymatische Reaktions- '

system eingearbeiteten Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure

Tabelle VII

Reaktionszeit, Umwandlungen DinatriumL(+)-

Std. tartrat,%

1 34

2 64

3 87

4 100 10 5 100

Beispiel 45

Zu 6 Teilen einer in gleicher Weise wie in Beispiel 43 erhaltenen Zellsuspension werden 4,5 Teile Acrylsäureamid, 0,24 Teile N.N'-Methylen-di^acrylsäureamid), 3 Teile einer wäßrigen 2,5prozentigen Kaliumpersulfatlösung, 3 Teile einer wäßrigen 5prozentigen /f-Dimethylamino-propionitril-Lösung und 24 Teile einer 0,1-m Phosphatpufferlösung vom pH 8,0 gegeben und 30 Minuten bei 30° C polymerisieren gelassen. Das danach erha'iene polymere Gel wird zerkleinert. Ein Teil der zerkleinerten Gelteilchen, die hinsichtlich ihres Teilchendurchmesserbereichs durch Siebe von 6 bis 20 Maschen hindurchgehen und 90% des gesamten Gels ausmachen, wird mit einer wäßrigen O.lprozentigen cis-Epoxybernsteinsäure-Lösung gewaschen und liefert 41,8 Teile eines Gels mit darin eingeschlossenen Mikroorganismen.

Eine ummantelte Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm und einer Länge von 1000 mm wird mit 41,8 Teilen des Gels mit den eingeschlossenen Mikroorganismen gefüllt. Bei 30°C wird eine wäßrige 5prozentige Lösung des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure vom pH 8,1 kontinuierlich durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 Teilen je Stunde durchlaufen gelassen, um ein Eluat aus der Säule zu erhallen.

Wenn dieses gaschromatographisch analysiert wird, wird ein Maximum entsprechend der Weinsäure beobachtet. Andererseits werden 6,5 Teile kristallisiertes Dinatrium-L( + )-tartrat-dihydrat durch Eindampfen von 100 Teilen des Eluats unter vermindertem Druck bis zur Trockne erhalten (Gesamtausbeute = 99%). Mit Wasser werden 10 Teile der Kristalle auf 50 Volumenteile gelöst und dann hinsichtlich der spezifischen Drehung geprüft: [txfiS = +27,5°. Dieses Ergebnis steht in vollständiger Übereinstimmung mit demjenigen, das mii einem auf dem Markt erhältlichen Dinatrium-L)+)-tartrat von Analysenreinheit erhalten worden ist. Dies bedculet, daß die optische Reinheit des Produkts 100% beträgt.

Beispiel 46

Eine ummantelte Kolonne von 10 mm Innendurchmesser und 500 mm Länge wird mit 21,9 Teilen eines Gels mit darin eingeschlossenen Mikroorganismen gefüllt, das in gleicher Weise gemäß Beispiel 45 erhallen worden ist. Bei 3O⁰C wird eine wäßrige 2gewichtsprozentige Lösung des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure vom pH 8,0 kontinuierlich durch die Säule mit unterschiedlichen Fließgeschwindigkeiten durchlaufen gelassen. Die Umwandlung in Dinatrium-L( + )-tartrat, die Umwandlungsgeschwindigkeit und die Konzentralion im Eluat sind hinsichtlich der Fließgeschwindigkeit des Ansatzes verschieden, wie aus Tabelle VIII ersichtlich ist.

Eine ummantelte Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm und einer Länge von 500 mm wird mit 18 Teilen eines Gels mit eingeschlossenen Mikroorganismen gefüllt, wie es in gleicher Weise gemäß Beispiel 44 „

erhalten worden ist. Eine Substratlösung vom pH 8,0, die durch Auflösen von 1,57 Teilen des Dinatriumsalzcsdcr ]

cis-Epoxybernsteinsäure und von 0,01 Teil Dodecyl-trimethylammonium-chlqrid in 100 Teilen einer 0,1-m Phosphatlösung vom pH 8,0 erhalten worden ist, wird kontinuierlich 336 Stunden lang bei 20⁰C durch die Säule laufen gelassen. Die festgelegte Fließgeschwindigkeit beträgt 12,5 Teile/Stunde. Während der gesamten Betriebsdauer beträgt die Umwandlung in das Dinatrium-L( + )-tartrat97,5%. „

i

18

Tabelle VIII	Dinatrium-L( + )-tartral	Umwandlungsgeschwindig	Konzentration
Fließgeschwindigkeit,	Umwandlung	keit als Dihydrat,	als Dihydnil im
Teile/Stunde		Teile/Stunde	SäulcneluiU,%
		0,0278	2,42
	92,6	0,0360	1,57
2,3	59,9	0,0328	0,55
4,6	21.1	0,0424	0,40
11,9	15,3	0,0465	0,29
21,2	11,2	Beispiel 47
31,8

Beispiel 48

Das Verfahren des Beispiels 44 wird wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß das Waschen des zerkleinerten Polymerisatgels unter Verwendung einer wäßrigen O,lprozentigen Lösung des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure anstelle der Phosphatpufforlösung erfolgt und dadurch 18 Teile eines Gels mit eingeschlossenen Mikroorganismen liefert. Eine ummantelte Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm und einer Länge von 500 mm wird mit diesem Gel mit eingeschlossenen Mikroorganismen gefüllt Dann wird kontinuierlich eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt von 1,72% des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure und 100 Teile je Million Dodecyl-trimethyl-ammoniumchlorid vom pH 8,0 336 Stunden bei 30⁰C durch die Säule lauien gelassen. Die Fließgeschwindigkeit ist auf 11 Teile je Stunde festgelegt Während der Gesamtdauer des Betriebs beträgt die Umwandlung in das Dinatrium-L(+)-tartrat 100%.

Wenn das Eluat gaschromatographisch analysiert wird, wird ein Maximum entsprechend der Weinsäure beobachtet Wenn 100 Teile des Eluats unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft werden, erhält man 2,2 Teile Dinatrium-L(+)-iartrat-dihydrat in Kristalllform (Gesamtausbeute = 99%). Die Kristalle besitzen eine optische Reinheit von 100%.

Beispiel 49

Wenn das Verfahren des Beispiels 43 unter Verwendung von N-Methylol-acrylsäureamid, Ammoniumpersulfat und Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethyl-äthylendiamin anstelle von Acrylsäureamid, Kaliumpersulfat und ,if-Dimethylamino-propionitril wiederholt wird, erhält man in gleicher Weise ein Gel mit darin eingeschlossenen Mokroorganismen. Die Aktivitätsausbeute des Gels mit den eingeschlossenen Mikroorganismen beträgt 30,9%.

Beispiel 50

Das Verfahren des Beispiels 43 wird wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß die Polymerisationstemperatur von 30⁰C auf 20⁰C oder 40°C geändert wird, um ein Gel mit eingeschlossenen Mikroorganismen herzustellen. Die Aktivitätsausbeute des derart erhaltenen Gels mit eingeschlossenen Mikroorganismen ist in Tabelle IX angegeben.

Tabelle IX

Polymerisationstemperatur, Aktivitätsausbeute,

⁰C %

20 56,7

40 59,7

Beispiel 51

Das Verfahren des Beispiels 48 wird wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß die Verwendung von Dodecyltrimeihyl-ammoniumchlorid weggelassen wird. Die Arbeitsweise wird eine lange Zeit fortgesetzt, um Dinatrium-L( + )-lartrat zu erzeugen. Die Umwandlung in Dinatrium-L( + )-tartrat ändert sich mit der Betriebsweise und dem Aussehen des Eluats, wie aus Tabelle X ersichtlich ist.

Nach 72 Bctriebsstunden beginnt die Umwandlung allmählich abzunehmen. Nach Verlauf von 144 Betriebsstunden wird das Eluat schwach trübe, was auf eine Vermehrung von Fremdmikroorganismen hindeutet Da keine Aussicht besteht, langer hochreines Dinatrium-L(+)-tartrat zu erhalten, wird der Versuch nach insgesamt 192 Betriebsstunden abgebrochen. Das Dinatrium-L( + )-dihydrat, das nach dem Verfahren des Beispiels 45 aus dem nach 48 Stunden ununterbrochenen Betriebs gesammelten Eluat erhalten worden ist, weist eine optische Reinheit von 100% auf.

Tabelle X	Umwandlung in	Aussehen
Betriebsdauer,	Dinatrium-	desSäuleneluats
Std.	L( + )-tartrat, %
	100	klar
24	100	klar
48	96	klar
72	88	klar
96	76	klar
120	61	schwach trübe
144	44	schwach !rübe
Ifi8	2ri	schwach !rübe
142

Beispiel 52

Das Verfahren von Beispiel 43 wird wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß die Menge der 0,1 -m Phosphatpufferlösung vom pH 8,0 während der Polymerisation von 6 Teilen auf 4 Teile geändert wird. Dünn werden 7 Teile des danach erhaltenen Gels mit eingeschlossenen Mikroorganismen mit 10 Teilen einer wäßrigen 2prozentigen Lösung des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure vom pH 8,0 vermischt und bei unterschiedlichen Temperaturen 2 Stunden lang gerührt, um die Reaktion zur Erzeugung von Dinatrium-L(-(-)-tartrat zu bewirken. Die relative Umwandlung in Dinatrium-L(+)-tartrat bei unterschiedlichen Temperaturen der enzymatischen Reaktion ist in Tabelle XI angegeben. Die aus Tabelle XI ersichtliche relative Umwandlung in Dinatrium-L( + )-tartrat wird durch die folgende Gleichung definiert:

Relative Umwandlung = ^Umwandlung ⁱⁿ Dinatrium-L(+)-tartrat bei gegebener Temperatur _{χ ]0()}

Umwandlung in Dinatrium-L(+)-tartrat bei 35°C

Tabelle XI

Reaktionstemperatur,	° C relative Umwandlung in
	Dinatrium-L( + )-tartrat
20	41
30	76
35	100
40	82
50	36
	Beispiel 53

Jeweils 7 Teile eines Gels mit eingeschlossenen Mikroorganismen, das nach dem Verfahren des Beispiels 47 erhalten worden ist, werden mit Lösungen versetzt, die durch Auflösen von 0,2 Teilen des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure in 10 Teilen einer 0,1-m Phosphatpufferlösung von unterschiedlichen pH-Werten erhalten worden ist. Die Lösungen werden zwei Stunden bei 30⁰C gerührt, um die Reaktion zu bewirken und Dinatrium-L(+)-tartrat zu bilden. In diesem Falle werden die 0,1-m Phosphatpufferlösungen vom pH 6,0, vom pH 7,2 und vom pH 9,0 durch Verdünnen mit Wasser auf das Doppelte des ursprünglichen Volumens eines Lösungsgemisches aus einer wäßrigen 0,2-m Mononatrium-dihydrogen-phosphatlösung und einer wäßrigen 0,2-m Dinatrium-monohydrogen-phosphat-Lösung von Volumenverhältnissen von 877/123, 28/72 und 56/944 erhalten. Die Beziehung zwischen dem pH-Wert der verwendeten Pufferlösung und der relativen Umwandlung in Dinatrium-L(+)-tartrat, wie es bei diesem Beispiel beobachtet wird, ist in Tabelle XII zu sehen. Die relative Umwandlung in die in Tabelle XII angegebene L( + )-Weinsäure wird durch die folgende Formel ausgedrückt:

Umwandlung in Dinatriurn-L(+)-tartrat bei gegebenem pH-Wert

Relative Umwandlung in _

Dinatrium-L(+)-tartrat Umwandlung in Dinatrium-L(+)-tartrat bei pH 7,2

Tabelle XII

pH-Wert

der Pufferlösung

relative Umwandlung in Dinatrium-L( + )-tarlrat

6,0 7,2 8,0 9,0

100

Beispiel 54

Eine ummantelte Säule mit Innendurchmesser von 10 mm und einer Lange von 500 mm wird mit 18 Teilen eines Gels mit eingeschlossenen Mikroorganismen gefüllt, das nach dem Verfahren des Beispiels 44 erhalten worden ist Eine Substratlösung vom pH 8,0, die durch Auflösen von 1,8 Teilen des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure und 0,01 Teil von Dodecyl-trimethyl-ammoniumchlorid in 100 Teilen einer 0,05-m Phosphatpufferiösung vom pH 8,0 erhalten worden ist, wird kontinuierlich 336 Stunden bei 30⁰C durch die Säule laufen gelassen. Die Fließgeschwindigkeit ist mit 10 Teilen je Stunde festgelegt Während der gesamten Betriebsdauer beträgt die Umwandlung in das Dinatrium-L(+)-tartrat 100%.

20

Beispiel 55

Drei ummantelte Kolonnen mit einem Innendurchmesser von 10 mm und einer Länge von 1000 mm werden jeweils mit 36 Teilen eines Gels mit eingeschlossenen Mikroorganismen gefüllt, das nach dem Verfahren des Beispiels 44 erhalten worden ist. Dann werden die Lösung »A« vom pH 8,0, die durch Auflösen von 10 Teilen des Dinatriumsalx.es der cis-Epoxybernsteinsäure und 0,01 Teil Dodecyl-trimethyl-ammoniumchlorid in 100 Teilen Wasser hergestellt worden ist, die Lösung »B« vom pH 8,0, die durch Auflösen des Dinatriumsalzes der β

cis-Epoxybernsteinsäure und 0,01 Teil Dodecyl-trimethyl-ammoniumchlorid in 100 Teilen einer 0,025-m ·

Phosphatpufferlösung vom pH 8,0 erhalten worden ist, und die Lösung »C« vom pH 8,0, die durch Auflösen von 10 Teilen des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure und 0,01 Teil Dodecyl-trimethyl-ammoniumchlorid in 100 Teilen einer 0,025-m tris-Pufferlösung vom pH 8,0 erhalten worden ist, kontinuierlich als Substratlösungen durch diese Säulen bei 30°C laufen gelassen, wobei die Fließgeschwindigkeit auf 6 Teile je Stunde festgelegt worden ist.

Es werden jeweils 1 kg des Eluats aufgenommen und, während es unter Rühren bei Normaltemperatur gehalten wird, mil einer wäßrigen 20prozentigen Calciumchloridlösung tropfenweise versetzt, bis sich kein

.« weiterer Niederschlag mehr bildet, Dann wird das Rühren weitere zwei Stunden fortgesetzt. Das derart erhalte-

'! ne Gemisch wird 20 Minuten zentrifugiert, um den Niederschlag abzutrennen. Der derart erhaltene Niederschlag wird in 150 ml Wasser dispergiert. Die Dispersion wird 20 Minuten zentrifugiert. Die erhaltene überstehende Lösung wird verworfen. Die Waschbehandlung wird zweimal wiederholt. Der gereinigte Niederschlag | wird in 50 ml Wasser dispergiert, und, während er bei 20°C unter Rühren erhalten wird, tropfenweise mit 20 \ konzentrierter Schwefelsäure versetzt, bis der pH-Wert 1,8 beträgt. Das erhaltene Gemisch wird 20 Minuten

ta zentrifugiert. Man erhält eine überstehende Lösung, die eingedampft wird. Danach erhält man kristalline

ί^} L( + )-Weinsäure. Die Ergebnisse sind in Tabelle Xl 11 enthalten.

Tabelle XlIl

Substrallösung L( + )-Weinsäure

Ausbeute, Reinheit, Verunreinigungen, %

% % Phosphationen Stickstoffgehalt

»A« 94,0 99,7 unter 0,00001 unter 0,00001

»B« 93,5 98,9 0,68 unter 0,00001

»C« 93,7 99,6 unter 0,00001 0,0003

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von L{+)-Weinsäure und deren Salze, dadurch gekennzeichnet, daß man cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze mit dem Enzym eines der Mikroorganismen Acetobacter curtus Nr. 4, Nr. 10 oder Nr. 21 bzw. Corynebacterium S-13 hydrolysiert, ausgenommen die Ausführungsform, daß der enzymerzeugende Mikroorganismus direkt in Anwesenheit von Calciumcis-epoxysuccinat als Substrat bebrütet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymatische Hydrolyse mittels eines in Form einer Packungsschicht vorliegenden Gelpräparates, das durch Polymerisieren eines Acrylsäureamids erhalten worden ist und Acrylsäureamid in einer Konzentration von 1 bis 30 Gewichtsprozent enthält, in dem ein Mikroorganismus in einer Konzentration von 0,01 bis 50 Gewichtsprozent eingeschlossen ist, bei einer Temperatur bis höchstens 70°C und einem pH-Wert von 4 bis 10 durchführt.