DE2616673A1 - Verfahren zur herstellung von l(+)-weinsaeure und deren salzen - Google Patents
Verfahren zur herstellung von l(+)-weinsaeure und deren salzenInfo
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C51/00—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides
- C07C51/347—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides by reactions not involving formation of carboxyl groups
- C07C51/367—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides by reactions not involving formation of carboxyl groups by introduction of functional groups containing oxygen only in singly bound form
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Description
MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. Tokyo, Japan
"Verfahren zur Herstellung von L(+)-Weinsäure oder deren Salzen"
Beanspruchte
Prioritäten: 16. April 1975, Japan, Nr. 46030/75
15. Dezember 1975, Japan, Nr. 149394/75
2. Februar 197£, Japan, Nr. IO196/76
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L(+)-Weinsäure
oder deren Salzen, indem man eine neue Hydrolase auf cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze einwirken lässt und
dadurch spezifisch L(+)-Weinsäure oder deren Salze erzeugt und diese Verbindungen isoliert.
L(+)-Weinsäure wird in grossen Mengen als Zusatz zu Arzneimitteln
und Lebensmitteil sowie als industrielle Ausgangsverbindung in starkem Umfang verwendet.
Bisher hat man L(+)-Weinsäure an sich nach einem Verfahren herge-
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stellt, bei dem man als Ausgangsverb5.ndung rohen Weinstein
verwendet hat, der als Nebenprodukt bei der Erzeugung von Wein anfällt. Die für dieses Verfahren zur Verfügung stehende Menge
hat jedoch ihre Grenzen. Es wird die Ansicht vertr&ten, dass
die Lieferung dieser Verbindung im weltweiten Masstab laufend knapper wird als Ergebnis der kürzlichen Erhöhung der Nachfrage.
Unter diesen Umständen steigt der Preis der Verbindung laufend. Weinsäure, die auf synthetischem Wege in der Industrie erhalten
wird, fällt gewöhnlich als optisch inaktive DL-Weinsäure an. Diese DL-Weinsäure weist eine niedrigere Löslichkeit als
L(+)-Weinsäure auf und ist deshalb für wirtschaftliche Verwendungszwecke
nachteilig. Als Lebensmittelzusatz, wie zu Erfrischungsgetränken beispielsweise,ist sie zweifellos
wegen ihrer Gefahrlosigkeit, Schmackhaftigkeit und dergleichen, noch annehmbar. Bis jetzt ist noch kein wirtschaftlich vorteilhaftes
Verfahren zur Herstellung von L(+)-Weinsäure vorgeschlagen worden, mit Ausnahme des Verfahrens, bei dem als
Ausgangsverbindung roher Weinstein verwendet wird, der jedoch hinsichtlich seiner zur Verfügung stehenden Menge begrenzt ist.
Aufgabe vorliegender Erfindung ist daher ein Verfahren zur
Verfügung zu stellen, das die Herstellung von L( + )-VJe in säure oder deren Salzen, die als Ausgangsverbindungen für L(+)-Weinsäure
brauchbar sind, in einem wirtschaftlichen bzw. technischen Masstab gestattet. Die Erfindung löst diese Aufgabe.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von L(+)-Weinsäure und deren Salzen, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass man auf cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze
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— ~X _
und
unter Hydrolyse/Aufspaltung der Epoxygruppe ein Enzym einwirken lässt und anschliessend die erzeugte L(+)-Weinsäure oder deren Salze isoliert.
unter Hydrolyse/Aufspaltung der Epoxygruppe ein Enzym einwirken lässt und anschliessend die erzeugte L(+)-Weinsäure oder deren Salze isoliert.
Nach vorliegender Erfindung kann man L(+)-Weinsäure und deren Salze, die vom wirtschaftlichen Standpunkt aus betrachtet sehr
bedeutsam sind, in einfacher Weise in grossen Mengen und hohen Ausbeuten und mit hoher Selektivität erzeugen. Infolgedessen
weist die Erfindung einen ausserordentlich hohen wirtschaftlichen Wert auf.
Das erfindungsgemäss verwendete Enzym, das die Epoxygruppe der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze zu hydrolysieren vermag
- im folgenden kurz als "cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase"
bezeichnet - ist ein neues Enzym, das entdeckt worden ist. Es besitzt eine Aktivität, eine asymetrische Hydrolyse und eine
Ringspaltung an der Epoxygruppe der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salzen zu bewerkstelligen.
In der anliegenden Zeichnung zeigt die Fig. 1 in einer
graphischen Darstellung die enzymatische Aktivität der erfindungsgemäss
eingesetzten cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase als Punktion
des pH-Wertes, während Fig. 2 eine graphische Darstellung der enzymatischen Aktivität der erfindungsgemäss verwendeten cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase
als Funktion der Temperatur zeigt.
Die erfindungsgemäss eingesetzte cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase
besitzt die in der Tabelle I angegebenen Eigenschaften.
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Der Ursprung der Hydrolase ist beliebig. Die Form, in der das Enzym eingesetzt wird, ist nicht in irgendeiner Ueise begrenzt.
Gewöhnlich kann man sie jedoch in Form von Anzuchtflüssigkeiten, lsbenden Mikrobenzellen, getrockneten Mikrobsnzellen, sellfreien
Extrakten, raffinierten Zellflüssigkeiten, unbeweglichen Enzymen oder in Gel eingeschlossenen Mikroorganismen verwenden.
Tabelle I: Enzymatische Eigenschaften
1. Aktivität
2. Substrateigenheiten
3. pH-Wert
k. Messung der enzymatisehen
Aktivität
Verwandelt cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze in L(+)-Weinsäure oder deren Salze
aufgrund asymetrischer Hydrolyse und Ringspaltung
der Epoxygruppe der cis-Epoxybersteinsäure oder deren Salzen. Wirkt nicht auf trans-Epoxybernsteinsäure,
Maleinsäure, Fumarsäure oder deren Salze. Optimum bei pH 8, stabil bei pH 3 bis 11
(vgl. Fig. 1).
Erhalten durch Reagierenlassen des Enzyms bei pH 8 auf cis-Epoxybernsteinsäure oder
deren Salze, Bestimmen der erzeugten Menge L(+)-Weinsäure oder deren Salze, beispielsweise
durch Titrieren mit Perjodsäure und Angeben des Ergebnisses als Folge der
erzeugten Menge L(+)-Weinsäure oder deren Salze in mMol/Minuten/mg (ml) des verwendeten
Enzyms.
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-CT-
5. Bereich der zweckmässigen Arbei fcstempersr
türen
6. Inaktivierungstemperatur
7. Inhibitor
8. Reinigungsverfahren
9. Michaelis-Konstante
25 bis 55 C
(600C ist für eine Höchstdauer von 20 Minuten
tolerierbar).
Inaktivierung nach 2^stündigem Stehen bei 65°C
p-Chlorquecksilber-benzoesäure
Die Reinigung erfolgt durch Brechen der angezüchteten Zellen mittels eines Homogenisators,
Extrahieren des Homogenisats mittels Zentrifugieren, Fraktionieren des Extrakts mit Ammoniumsulfat in an sich bekannter
Weise, Dialysieren der Fraktion gegen eine getrennte rohe Enzymlösung und Raffinieren
dieser rohen Enzymlösung mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von entweder Diäthylaminoäthyl-cellulose
oder eines Dextrangels. 1,47 χ 10"2 Mol/Liter
Bestimmte Beispiele von Dextrangelen sind Diäthylaminoäthyl-"Sephadex"
und "Sephadex G-IOO" der Firma Pharmacia Fine Chemicals.
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Die bakteriologischen Eigenschaften von Acetobacter curtus Nr. h
(PERM-P Nr. 2879), Acetobacter curtus Nr. 10 (PERM-P Nr. 2880) und Acetobacter curtus Nr. 21 (FERM-P Nr. 2881), die sämtlich
neue Species sind, gehören zur Gattung Acetobacter, die erfindungsgemäss als typische Quellen für cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase
verwendet worden sind, wie aus Tabelle II ersichtlich ist. Ferner gehört das Corynebacterium S-13 (FERM-P Nr. 2891),
ebenfalls eine neue Species, zur Gattung Corynebacterium, das in gleicher Weise verwendet worden ist, wie aus Tabelle III
ersichtlich.
Tabelle II: Bakteriologische Eigenschaften
Hinterlegungsnummer:
FERM-P Nr.2879· FERM-P Nr.2880 PERM-P Nr.2881
!.Morphologische Eigens chaften
| 1.Gestalt der | kurze Stäbchen | dito | dito |
| Zellen | (0,3-0,Η)μπι χ | dito | (0,2-0,4)μπι χ |
| 2.Grosse der | (0,6-1,0)JiIiI | (0,6-0,8 )μτα | |
| Zellen | keine | dito | dito |
| 3.Beweglichkeit | Il | Il | Il |
| Jj.Geisselbildung | η | ti | It |
| 5. Sporenbildung | |||
| 6.metachromatische | π | Il | Il |
| Granula | negativ | Il | Il |
| 7.Gramfärbung | |||
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Hinterlegungsnummer:
8.säurefeste
Färbung (Ziehl-Neelsen-Färbung)
FERM-P Nr.'2879 FERM-P Nr.2880 FERM-P Nr.2
negativ
dito
dito
II«Wachstum auf ve rs chi e de ne η Nährböden
1.Bouillon-Agar kreisförmige Kolonien "
Plattenkultur
scharfe Grenzen "
glatte Oberfläche "
hemisphärisch n erhaben
glänzend "
undurchsichtig "
milchigweiss "
lineares Wachstum "
milchigweiss "
glänzend "
keine Änderung n im Medium
3.Agarstichkultur lineares Wachstum
nahe der , Ober- " fläche
4.Gelatinestick- lineares Wachstum nahe
kultur. der Oberfläche "
kultur. der Oberfläche "
ohne Verflüssigung
5.Nährflüssigkeit,gleichmässig, etwas "
stationär trübe
6.Lackmusmilch keine Änderung "
2.Schrägagar
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Hinterlegungsnummer: PERM-P Nr.2879 FERM-P Nr.2880 PERM-P Nr.2881
III.Physiologische Eigenschaften
1. Reduktion von
Nitrat + -
2· Denitrifikation
3. Methylrot-Reaktion -
1. Voges-Proskauer-
Reaktion - - '
5. Indolbildung -
6. Schwefelwasserstoffbildung
7. Stärkehydrolyse
8. Verwendung von Citronensäure
(durch jeweilige + ++ +
Verwendung von Koser- und Christensen-Medium
9. Verwendung von
anorganischen Stick- + + +
stoffquellen
(Nitrate und Ammoniumsalze)
10. Pigmentbildung * -
11. Urease + ++ +
12. Oxidase + + +
13. Katalase - - -
11. Phenylalanin-
desaminase -
15. Hydrolyse von
Sorbitan-monooleat- - - _
polyoxyäthylen
16. A)pH-Wert für das
Wachstum 3,7 - 7,5 dito dito
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261667
Hinterlegungsnummer:
FERM-P Nr.2879 PERM-P Nr.2880 PERM-P Nr.2881
B)pH-Optimum
für das Viachs- 5,5 - 6,5
turn
dito.
17.A)Wachstumstemperatur
15 - 36°C 5,0 - 6,5 dito
B)Temperatur-Optimum für das 30 - 3 C Wachstum
18.Sauerstoffbedarf aerob
19.0-F-Prüfung
mittels der
Hugh-Leifson-Methode
mittels der
Hugh-Leifson-Methode
l.L-Arabinose +
2.D-Xylose +
3.D-Glukose + ·
4.D-Mannose +
5.D-Pructose -
6.D-Galactose ++
7.Maltose -
8.Saccharose -
9.Lactose - +
lO.D-Trehalose -
11.D-Sorbit - -
12.D-Mannit -
13.Inosit -
1*1. Glycerin -
15.Stärke -
Bei den vorgenannten Kohlehydraten wird keine Gaserzeugung beobachtet.
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Hint e r le gun gs -
nummer: FERM-P Nr,2879 FERM-P Nr.2880 FERM-P Nr.2881
20.Assimilierbarkeit
von Alkoholen
von Alkoholen
1.Methanol - -
2,Äthanol + + +
3.Propanol -
iJ.Butanol -
5.1sobutanol -
21.Assimilierbarkeit
von organischen
Säuren
von organischen
Säuren
I.Essigsäure -
2.Milchsäure + + +
3.Benztraubensäure + + +
4.Buttersäure - -
5.Gluconsäure ++ ++ ++
6.L(+)-Weinsäure + + +
7.cis-Epoxybernstein-
säure + + +
22.Andere Eigenschaften
I.Oxydation von Äthanol
zu Essigsäure bei
pH 11,5 +(schwach) dito dito
zu Essigsäure bei
pH 11,5 +(schwach) dito dito
2.Oxydation von
: Milchsäure zu CO2 + + +
3.Erzeugung von Essigsäure aus Glukose + + +
4.Erzeugung von Ketogluconsäure aus Gluconsäure
5.Erzeugung von 5-Ketogluconsäure aus Glukose
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6673
Hinterlegungsnummer:
PERM-P Nr.2879 PERM-P Nr.2880 PERM-P Nr.2881
IV. Quelle der Isolierung
Boden
dito
dito
Tabelle III
Hinterlegungsnummer:
FERM-P Nr.2891
!.Morphologische Eigenschaften 1. Gestalt der Zellen
pleomorphe lange Stäbchen; vermutlich sind V-förmige,
Y-förmige oder Palisaden-Anordnungen möglich
| 2. Grosse der Zellen | (0,*l-0,7tym | χ (1,0-8, |
| 3. Beweglichkeit | keine | |
| 4. Geisselbildung | ti | |
| 5. Sporenbildung | It | |
| 6. metachromatische Granula | verschiedene | Granula |
| 7. Gramfärbung | positiv | |
| 8. säurefeste Färbung (Ziehl- | negativ |
Neelson-Färbung)
II. Wachstum auf verschiedenen Nährböden
1. Bouillon-Agar Plattenkultur
kreisförmige Kolonien
scharfe Grenzen
rauhe Oberfläche
scharfe Grenzen
rauhe Oberfläche
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Hinterlegungsnummer:
2. Schrägagar
3. Agarstichkultur
. Gelatinestichkultur
5. Nährflüssigkeit j stationär
6. Lackmusmilch
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FERM-P Nr. 2891
erhaben bei den Palten
erhaben bei den Palten
glänzend während des Anfangsstaciums der Anzucht, allmählicher
Verlust des Glanzes
undurchsichtig
schwach scharlachrotlineares Wachstum mit gelegentlicher Faltenbildung
schwach scharlachrotlineares Wachstum mit gelegentlicher Faltenbildung
lineares Wachstum nahe der Oberfläche
lineares Wachstum nahe der Oberfläche ohne Verflüssig
gung
schwache Bildung eines Oberflachenhautchens
schwache Trübung Sediment positiv schwach alkalisch
III. Physiologische Eigenschaften
1. Reduktion von Nitrat
2. Denitrifikation
3. Methylrot-Reaktion
Ί. Voges-Proskauer-Reaktion
5. Indolbildung
6. Schwefelwasserstoffbildung
7. Stärkehydrolyse
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- 13 - ?61 6673
Hinterlegungsnummer: PERM-P Nr. 2891
8. Verwendung von Citronensäure (durch .jeweilige Verwendung
von Koser- und Christensen-Medium
9. Verwendung von anorganischen Stickstoffquellen + (Nitrate und Ammoniumsalze)
10. Pigmentbildung
11. Urease
12. Oxidase
13· Katalyse +
I1I. Hydrolyse von Sorbitan- +
monooleat-polyoxyäthylen
15. A) pH-Wert für das Wachstum H,5 - 9,0
B) pH-Optimum für das Wachstum 5,5 - 7a0
16. A) Wachstumstemperatur 20 - 1IO0C
B) Temperaturoptimum für das 30 - 3°C Wachstum
17. Sauerstoffbedarf aerob
18. O-P-Prüfung mittels der
Hugh-Leifson-Methode
Hugh-Leifson-Methode
1. L-Arabinose
2. D-Xylose
3. D-Glukose + 1I. D-Mannose
5. D-Pructose +
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Hinterlegungsnummer: PERIi-P Nr. 2891
6. D-Galaotose
7. Maltose
8. Saccharose
9. Lactose
10. D-Trehalose
11. D-Sorbit +
12. D-Mannit +
13. Inosit
14. Glycerin +
15. Stärke
Bei den vorgenannten Kohlehydraten wird keine Gaserzeugung beobachtet.
19. Assimilierbarkeit von
cis-Epoxybersteinsäure +
IV. Quelle der Isolierung Boden
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Bemerkungen: In den Tabellen II und III bedeutet das Zeichen
"+" ein bestätigendes Ergebnis, und die Anzahl der
Pluszeichen steigt mit dem Anstieg der angezeigten Grosse, während das Zeichen "-" ein negatives
Ergebnis bedeutet. In der Tabelle II bedeutet das Zeichen I:-", dass das Ergebnis keine definitive
Bewertung weder im Sinne von + noch im Sinne von zulässt.
Das Studium der vorgenannten bakteriologischen Eigenschaften im Hinblick auf die Angaben in dem Buch "Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology", 8. Auflage, 197**» lässt erkennen,
dass die drei" Stämme PERM-P Nr. 2879, FERM-P Nr. 2880 und PERM-P Nr. 2881 miteinander praktisch gleiche bakteriologische
Eigenschaften besitzen. Sie sind gleichbleibend gramnegative, aerobe, kurzstabförmige Mikroorganismen. Es ist einleuchtend,
dass sie unter Teil 7 oder Teil 10 dieses Buches klassifiziert werden müssen. Weiterhin zeigt die Tatsache, dass bei allen drei
Stämmen keine Beweglichkeit, keine Sporenbildung, weiter ein negatives Ergebnis der Katalase-Prüfung, die Oxydation von
Äthanol zu Essigsäure und Milchsäure zu Kohlendioxid bei einem pH-Wert von 4,5, weiterhin die Tatsache, dass sie ein annehmbares
Wachstum bei pH 4,5 zeigen und dass sie praktisch keine Zucker abbauen können, vielmehr aus Zuckern Säure bilden, dass
diese Bakterien zur Gattung Acetobacter gehören. Es ist jedoch bemerkenswert, dass sie sich deutlich hinsichtlich der Grosse
der Zellen, der Assimilierbarkeit von Essigsäure, der Abwesenheit
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von Geissein, der Oxydierbarkeit von Alkoholen usw. von Acetobacter pasteurianus Subspecies paradoxus und von Acetobacter
peroxidans unterscheiden, die im Buch "Bergey's Manual" als
katalase-negative Acetobacter-Stämme angegeben sind. Im Hinblick auf diese Paktoren, haben die Erfinder beschlossen, dass diese
drei Stämme zu einer neuen Species gehören und haben sie aus diesem Grunde "Acetobacter eurtus" genannt. Die Stämme Acetobacter
curtus Nr. *i, Acetobacter eurtus Nr. 10 und Acetobacter
eurtus Nr. 21 zeigen im wesentlichen die gleichen bakteriologischen
Eigenschaften, und man beobachtet lediglich, dass sie sich geringfügig hinsichtlich der Reduzierbarkeit von Nitraten,
der Höhe der Urease-Aktivität, der Höhe der Erzeugung von Säuren aus Zuckern usw. unterscheiden. Sie müssen demgemäss als
drei Stämme betrachtet werden, die zu einer Species gehören.
Die Betrachtung der morphologischen und physiologischen Eigenschaften
des Stammes PERM-P Nr. 2891 führt zu dem Entschluss, dass dieser Stamm zur Gattung Corynebacterium gehört. Die
Erfinder haben ihn deshalb "Corynebakterium S-13" genannt.
Es wird gewöhnlich die Ansicht vertreten, dass die Erzeugung von cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase mittels einer Anzucht von
Mikroorganismen ein Züchten der Mikroorganismen in einem Nährmedium erfordert, in dem cis-Epoxybernsteinsäure oder deren
Salze enthalten sind (vgl. die JA-ASen 1^0683/75, 1^0684/75
und 1^5586/75).Es ist vorher angenommen worden, dass die Erzeugung
dieses Enzyms praktisch nicht gelingt, wenn die Anzucht in einem Nährmedium durchgeführt wird, das als Kohlenstoffquelle
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lediglich Substanzen wie Glukose, Saccharose, Alkohole und organische Säuren enthält, die im allgemeinen als v/irksame
Kohlenstoffquellen für Mikroorganismen dienen. Es ist die Tatsache gefunden worden, dass Weinsäure unerwarteterweise die
Fähigkeit zur Induzierung dieses Enzyms ähnlich der cis-Epoxybernsteinsäure
besitzt.
Ein typisches Verfahren zur Herstellung der eis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase
wird nachstehend beschrieben. Dieses Verfahren zur Herstellung der cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase besteht
darin, dass man einen Mikroorganismus züchtet, der cis-Epoxybernsteinsäure
oder deren Salze in einem Nährmedium assimilieren kann, in das entweder Weinsäure oder deren Salze eingebracht
worden sind, mit anschliessendem Isolieren der derart erzeugten cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase aus dem Reaktionsgemisch.
Bei diesem Verfahren dienen die Weinsäure und deren Salze, die in das Nährmedium eingebracht worden sind, nicht bloss als
Kohlenstoffquelle für die Mikroorganismen sondern auch zum
Induzieren des Enzyms.
Die bei diesem Verfahren verwendbare Weinsäure ist die D-Weinsäure,
die L-Weinsäure, die DL-Weinsäure, die Mesoweinsäure oder ein Gemisch derartiger Weinsäuren. Salze der
Weinsäure, die ebenfalls verwendbar sind, schliessen Metall- und Nichtmetallsalze von Säuren und solche Salze enthaltende
Substanzen ein. Die Metallanteile dürfen aber nicht das Wachs-
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turn dieser Mikroorganismen hemmen. Beispiele derartiger Metalle sind Alkalimetalle, wie Natrium und Kalium, Erdalkalimetalle,
wie Calcium und Magnesium usw.. Beispiele der basischen Anteile in den nichtmetallischen Salzen der Weinsäure sind Ammonium und
Amine usw.. Ammonium und Amin dienen zusätzlich als Stickstoffquelle.
Beispiele von Salzen der Weinsäure sind deshalb Natriumtartrat, Kaliunitartrat, Magnesiumtartrat, Natrium-Kaliumtartrat,
Natriumhydrügentartrat, Kalxumhydrogentartrat, Calciumhydrogentartrat,
Ammoniumtartrat, Ammoniumhydrogentartrat und Ammoniumkaliumtartrat.
Es wird eine solche Menge Weinsäure oder deren Salze dem Nährmedium
zugegeben, dass die Konzentrationen in dem Nährmedium gewöhnlich von 0,1 bis 10 Gewichtsprozent, vorzugsweise von
1,0 bis 5»0 Gewichtsprozent betragen. Wenn die Menge derart ist, dass die Konzentration nicht die untere Grenze von 0,1 Gewichtsprozent
erreicht, hat das Einbringen von Weinsäure oder deren Salzen praktisch keine Wirkung. Wenn die Menge aber derart ist,
dass die Konzentration die obere Grenze von 10 Gewichtsprozent übersteigt, hindert sie das Wachstum der Mikroorganismen. Die
Weinsäure oder deren Salze werden dem Nährmedium gleichzeitig bei der Herstellung des Nährmediums oder zu Beginn der
Züchtung zugegeben.
Als Nährmedium, in das die Weinsäure oder deren Salze eingebracht werden, kann jedes beliebige Nährmedium verwendet werden, das
im allgemeinen zur Züchtung von Mikroorganismen verwendet wird.
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~ 19 -
Beispielsweise kann das Nährmedium eine Kohlenstoffquelle, wie
Glukose, eine Stickstoffquelle, wie Aiwnoniumionen, Nitrationen
oder Harnstoff, eine PhosphorsäurequeHe, wie Kalium-dihydrogenphosphat,
eine Kaliumquelle, wie Kaliumchlorid, eine Magnesiumquelie,
wie Magnesiumsulfat, und Spuren von Metallionen enthalten, wie Eisen(II)-, Mangan(II)-, Kobalt(II)-, Molybdän(II)- oder
Kupfer(II)-ionen. Daa Nährmedium kann weiterhin organische
Mikronährstoffquellen, wie Hefeextrakt, Säurehydrolyseprodukte
von Casein, Pepton, Fleischextrakt,Vitamine oder Aminosäuren in einem gewöhnlich annehmbaren Anteil enthalten. Ferner kann das
Nährmedium Antischaummittel, grenzflächenaktive Verbindungen usw. aufweisen.
Bei der Anzucht der Mikroorganismen liegt die Anzuchttemperatur
gewöhnlich im Bereich von 20 bis 35°C, vorzugsweise im Bereich von 28 bis 31 C. Der pH-Wert des Nährmediums beträgt
gewöhnlich 4,5 bis 7,5, vorzugsweise 5,5 bis 7,0. Die Anzucht erfolgt aerob. Das Wachstum der Mikroorganismen erreicht
nach zwei bis fünf Tagen seine stationäre Phase. Wenn die Anzucht ausserhalb des tolerierbaren Bereichs der
Anzuchtbedingungen durchgeführt wird, wird kein ausreichendes Wachstum erhalten und im schlimmsten Fall findet eine vollständige
Zerstörung statt. Wenn der pH-Wert des Nährmediums im Verlauf des allmählichen Verbrauchs von Weinsäure oder
deren Salzen ansteigt, ist es erwünscht die Anzucht fortzusetzen, während der pH-Wert durch Zugabe einer anorganischen Säure, wie
Schwefelsäure oder .Chlorwasserstoffsäure, oder einer organischen
Säure, wie Essigsäure, eingestellt wird.
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■- 20 - .
Dieses Verfahren ist von sehr grosser Wirtschaftlichkeit, da man die cis-Epoxybernsteir.säure-Hydrolase mittels einer wirksamen
Verwendung von beispielsweise DL-Weinsäure erhalten kann, die als Nebenprodukt bei der chemischen Synthese der cis-Epoxybernsteinsäure
auftritt, eben derjenigen Verbindung> die die Ausgangsverbindung für die cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase
darstellt.
Die gewünschte Bildung des Enzyms kann auch durch Verwendung von Acetobacter curtus Nr. H, Acetobacter curtus Nr. 10,
Acetobacter curtus Nr. 21 oder Corynebacterium S-13 usw. unter
Einsatz von cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salzen als Substrat in gleicher Weise wie Weinsäure oder deren Salzen
erreicht werden.
Ein typisches Beispiel des Verfahrens, das an die Herstellung von L(+)-Weinsäure oder deren Salzen mittels einer enzymatischen
Reaktion, die die Verwendung dieser cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase einschliesst, angepasst ist, wird nachstehend beschrieben.
Als Ausgangsverbindungen können nicht nur die cis-Epoxybernsteinsäure,
sondern auch deren Metallsalze oder deren Nichtmetallsalze oder Substrate verwendet werden, die diese Säure
oder deren Salze enthalten. Beispiele der Metallanteile in diesen Metallsalzen der cis-Epoxybernsteinsäure sind Natrium,
Kalium, Calcium, Magnesium, Eisen,■Aluminium, Zink, Mangan und
Kobalt, die keine Hemmwirkung auf die üblichen Enzyme ausüben.
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Beispiele des Basenanteils in den nichtmetallischen Salzen
dieser Säure sind Ammonium- und Aminreste. Beispiele von
Salzen der cis-Epoxybernsteinsäure sind das Dinatriumsalz,
das Galciumsalz, das Natrium-calciumsalz, das Kaliumnatriumsalz, das saure Calciumsalz und das Ammoniumsalz der cis-Epoxybernsteinsäure.
dieser Säure sind Ammonium- und Aminreste. Beispiele von
Salzen der cis-Epoxybernsteinsäure sind das Dinatriumsalz,
das Galciumsalz, das Natrium-calciumsalz, das Kaliumnatriumsalz, das saure Calciumsalz und das Ammoniumsalz der cis-Epoxybernsteinsäure.
Es wird eine Probe der cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase zu
einer wässrigen Lösung der Ausgangsverbindung oder zu einer Suspension der Ausgangsverbindung gegeben und das erhaltene
Gemisch auf einen pH-Wert von M bis 10, vorzugsweise von
7,5 bis 8,5 eingestellt. Das Gemisch wird bei einer Temperatur unter 65 C, zweckmässigerweise im Bereich von 20 bis H5 C und vorzugsweise bei einer Temperatur um 380C schwach gerührt.
Als Folge hiervon erhält man ein enzymatisches Reaktionsgemisch.
7,5 bis 8,5 eingestellt. Das Gemisch wird bei einer Temperatur unter 65 C, zweckmässigerweise im Bereich von 20 bis H5 C und vorzugsweise bei einer Temperatur um 380C schwach gerührt.
Als Folge hiervon erhält man ein enzymatisches Reaktionsgemisch.
Das Fortschreiten der Reaktion kann durch Entnehmen von Proben aus dem Reaktionsgemisch zu den erwünschten Zeitpunkten und
Bestimmen der cis-Epoxybernsteinsäure-Konzentration verfolgt werden. Für die Bestimmung der cis-Epoxybernsteinsäure-Konzentration
kann man das Verfahren entsprechend anpassen, dass beispielsweise auf die Reaktion zwischen Chlorwasserstoffsäure
und Epoxygruppen angewendet wird.
Die Probe der cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase kann in geeigneter
Weise unter anderem aus der Nährflüssigkeit, der
lebenden Mikroorganismenzelle, der getrockneten Mikroorganismenzelle, der im Gel eingeschlossenen Mikroorganismen, aus einem
lebenden Mikroorganismenzelle, der getrockneten Mikroorganismenzelle, der im Gel eingeschlossenen Mikroorganismen, aus einem
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zellfreien Extrakt,aus einer rohen Enzymlösung, aus gereinigtem
Enzym oder aus unbeweglichem Enzym ausgewählt werden.
B?im Verfahren vorliegender Erfindung wird die Verwendung von
in Gel eingschlossenen Mikroorganismen empfohlen. Das Verfahren, das sich als vorteilhaft für ein Einschliessen der vorgenannten
Mikroorganismen erwiesen hat, besteht darin, dass man ein Acrylsäureamid in einer Flüssigkeit>
die den Mikroorganismus darin enthält, derart polymerisiert, dass noch die Möglichkeit
vorhanden ist, eine enzymatische Aktivität zur Erzeugung von L(+)-Weinsäure oder deren Salzen zu zeigen.
Die besondere Weise, in der dieses Verfahren durchgeführt wird, wird nachstehend beschrieben.
Der Mikroorganismus, der eine enzymatische Wirksamkeit zur Erzeugung von L(+)-Weinsäure oder deren Salzen besitzt, wird
nach einem an sich bekannten Verfahren gezüchtet. Obwohl die Form, in der der Mikroorganismus eingesetzt wird, der die
enzymatische Wirksamkeit zur Erzeugung von Lf+)-Weinsäure oder deren Salzen besitzt, nicht in besonderer Weise begrenzt ist,
kann dieser Mikroorganismus in Form von lebenden Mikroorganismenzellen, getrockneten Mikroorganismenzellen, einem zellfreien
Extrakt oder einer Kulturflüssigkeit von Mikroorganismenzellen oder einem Gemisch davon verwendet werden.
Der die enzymatische Wirksamkeit zur Erzeugung von L(+)-Weinsäure
oder deren Salzen besitzende Mikroorganismus wird einge-
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schlossen, wie er mit der dreidimensionalen schwammskelettartigen
Struktur des Harzes umgeben ist. Noch ausführlicher wird das Einschliessen des Mikroorganismus durch Lösen von Acrylsäureamid
in einem wässrigen Medium, wie Wasser, einer isotonischen Salzlösung oder einer Pufferlösung, durchgeführt, die
im wesentlichen nicht die Aktivität des Mikroorganismus beeinträchtigt. Dann wird der Mikroorganismus in der erhaltenen
Lösung dispergiert und die Polymerisation des monomeren Acrylsäureamids
durch Zugabe eines Polymerisationsinitiators und gegebenenfalls eines Polymerisationsbeschleunigers gestartet.
Die anschliessende Polymerisation überführt das Reaktionsgemisch
im wesentlichen in seiner Gesamtheit in ein agarähnliches Gel. Der hier verwendete Ausdruck "in Gel eingeschlossene
Mikroorganismen" bedeutet ein derart erhaltenes agarähnliches Gel mit den darin eingeschlossenen Mikroorganismen
Der Gehalt an Mikroorganismen im Reaktionsgemisch während der Polymerisation liegt gewöhnlich, obwohl er in der Art der zu
verwendenden Mikroorganismen und der Form, in der sie verwendet werden, variieren kann, im Bereich von 0,01 bis 50
Gewichtsprozent, vorzugsweise im Bereich von 0,05 bis 20 Gewichtsprozent. Wenn der Gehalt die untere Grenze von 0,01 Gewichtsprozent
nicht erreicht, besteht die Möglichkeit, dass - wie nachstehend beschrieben wird - keine enzymatische
Reaktion in einem für die praktische Anwendung vorteilhaften Ausmass erhalten wird, obwohl bei der Herstellung von L(+)-Weinsäure
oder deren Salzen ein Mikroorganismen eingeschlossen enthaltendes Gel verwendet wird. Wenn der Gehalt die obere
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Grenze von 50 Gewichtsprozent übersteigt, kann sich der Nachteil ergeben, dass keine gleichmässige Gelierung stattfindet oder dass
ein Teil der Mikroorganisp.ensellen einem Einschließen mit dem
Gel entgehen und v:egfliessen Kann.
Das bei der vorgenannten Polymerisation eingesetzte Acrylsäureamid
ist ein polymerisierbares Monomeres, das die Atomgruppierung
der nachstehenden Formel HOC=CH-C-N<
besitzt.
Beispiele von Monomeren, die erfindungsgemäss mit Vorteil
verwendet werden können, sind Acrylsäureamid, N,N'-Niederalkylendi-(acrylsäureamide
), wie N,N'-Methylen-di-(acrylsäureamid),
N,N'-Äthylen-di-(acrylsäureamid) oder N,N'-Propylen-di-(acrylsäureamid),
ferner N-(Hydroxyalkyl)-acrylsäureamide, wie N-Methylolacrylsäureamid,
weiterhin N-Alkyl-acrylsäureamide, wie N,N-Dimethyl-acrylsäureamid,
sowie Di-(acrylsäureamid)-dialkylather,
wie 1,1'-Di-(acrylsäureamid)-dimethylather. Von diesen monomeren
Acrylsäureamid-Verbindungen sind besonders für den genannten Zweck geeignet Acrylsäureamid und N,N'-Niederalkylen-di-(acrylsäureamide).
Diese monomeren Acrylsäureamid-Verbindungen können entweder allein oder in Form von Gemischen aus zwei oder
mehreren Monomeren eingesetzt werden.
Obwohl die Konzentration des Acrylsäureamid-Monomeren im Reaktionsgemisch zur Zeit der Polymerisation je nach der
besonderen Art des eingesetzten Monomeren variieren kann, ist es lediglich erforderlich, dass zumindest das Reaktionsgemisch
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bei der Polymerisation geliert. Gewöhnlich liegt der Monomerenbereich
bei 1 bis 30 Gewichtsprozent und in wirtschaftlicher
Hinsicht vorzugsweise bei 5 bis 20 Gewichtsprozent.
Es können beliebige Polymerisationsinitiatoren eingesetzt werden, sofern sie die enzymatische Wirksamkeit der verwendeten
Mikroorganismen nicht hemmen. Beispiele derart verwendbarer bekannter Polymerisationsinitiatoren sind Salze
von Persäuren, wie Ammoniumpersulfat, Natriumpersulfat und Kaliumpersulfat, sowie organische Persäuren, wie Peroxyameisensäure
und Peroxyessigsäure.
Obwohl die Konzentration des Polymerisationsinitiators im
Reaktionsgemisch in einem weiten Bereich schwanken kann, verläuft die Gelierung vorteilhaft, wenn die Konzentration im
allgemeinen 0,01 bis 1 Gewichtsprozent beträgt.
Falls ein Polymerisationsbeschleuniger mitverwendet wird, muss
es eine solche Verbindung sein, die die enzymatische Wirksamkeit der Mikroorganismen nicht hemmt. Beispiele von bekannten Polymerisationsbeschleunigern
sind ß-Dimethylamino-propionitril und N,N,N',N'-Tetramethyl-äthylendiamin.
Der Konzentrationsbereich des Polymerisationsbeschleunigers im Reaktionsgemisch ist ähnlich demjenigen des Polymerisationsinitiators.
Die Polymerisation lässt man in Gegenwart eines antibakteriellen
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Mittels im Reaktionsgemisch ablaufen. Falls ein antibakterielles
Mittel verwendet wird, ist es nur erforderlich, dass es nicht die enzymatische Wirksamkeit der Mikroorganismen hemmt, jedoch
das Wachstum von Fremdbakterien unterdrückt. Besonders wünschenswerte Beispiele von antibakteriellen Mitteln sind
kationische grenzenflächenaktive Verbindungen, wie Dodecylpyridinium-halogenide,
Alkyl-benzyl-dimethyl-ammoniurn-halogenide
und Lauryl-dinethyl-ammonium-halcgenide, die nicht nur eine antibakterielle Wirksamkeit besitzen, sondern gleichzeitig auch
zur Steigerung der Durchlässigkeit der damit erhaltenen Gele mit eingeschlossenen Mikroorganismen dienen.
Die Konzentration des antibakteriellen Mittels im Reaktionsgemisch soll im allgemeinen, obwohl sie nicht im besonderen
begrenzt ist, im Bereich von nicht über 1000 Teile je Million, vorzugsweise im Bereich von 50 bis 500 Teilen je Million, liegen,
Wenn das antibakterielle Mittel in einer Menge verwendet wird, die einer Konzentration von über 1000 Teilen je Million entspricht,
resultiert daraus kein besonderer Vorteil. Umgekehrt kann möglicherweise ein Nachteil daraus entstehen,
dass während der Herstellung von L(+)-Weinsäure oder deren Salzen das antibakterielle Mittel herausgelöst wird,was die
Reinheit der Verbindung beeinträchtigt.
Die Polymerisation wird bei Temperaturen nicht über 700C,
vorzugsweise im Bereich von 20 bis 500C, durchgeführt. Die
Temperatur der Polymerisation soll nach Möglichkeit die obere Grenze von 700C nicht übersteigen, da die verwendeten Mikro-
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Organismen möglicherweise bei Temperaturen oberhalb dieser Grenze inaktiviert werden können. Gewöhnlich ist eine Dauer
von 10 bis 60 Minuten für die Polymerisation ausreichendj
obwohl sie je nach der Art des verwendeten Acrylsäureamidmonomeren,
des Polymerisationsinitiators und des Polymerisationsbeschleunigen,
sowie der entsprechenden Konzentrationen im Reaktiohsgemisch und der Polymerisationstemperatur variiert
werden kann. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches bei der Polymerisation liegt im Bereich von 4 bis 10, vorzugsweise von
6 bis 9. Wenn der pH-Bereich des Reaktionsgemisches unter 4 oder über 10 liegt, kann die Möglichkeit auftreten, dass der
verwendete Mikroorganismus seine enzymatische Wirksamkeit einbüssen
kann.
Das nach der vorbeschriebenen Weise erhaltene Gel mit den eingeschlossenen Mikroorganismen hat die Mikroorganismen
vollständig im polymerisierten Gel von Acrylsäureamid eingeschlossen.
Es kann deshalb eine lange Zeit ununterbrochen verwendet werden, ohne dass eine Zerstörung des Gelüberzugs auftritt,
was ein Ausfliessen der eingeschlossenen Mikroorganismen und einen Abbau der enzymatisehen Aktivität zur Folge hat.
Am allermeisten besitzt jedoch das derart hergestellte Gel mit den eingeschlossenen Mikroorganismen eine hohe enzymatische
Wirksamkeit zur Erzeugung von L(+)-Weinssäure oder deren Salzen.
Wenn dieses Gel mit den eingeschlossenen Mikroorganismen in zerkleinerter oder nicht-zerkleinerter Form mit einer wässrigen
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Lösung der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salzen in Berührung gebracht wird, setzt die enzymatische Reaktion ein,
und es werden L(+)-Weinsäure oder deren Salze erzeugt. Das Gel mit den eingeschlossenen Mikroorganismen soll nach
Möglichkeit eine Teilchendurchmesserverteilung in einem Bereich aufweisen, dass die Teilchen durch Siebe mit einer
Maschenzahl von 5 bis 100 Maschen gehen, gemessen nach dem Verfahren von JIS G 3555-196M. Beispiele von Salzen der cis-Epoxybernsteinsäure,
die als Ausgangsverbindungen bei der enzymatischen Reaktion brauchbar sind, sind Alkalimetallsalze,
wie das Dinatriumsalz, das Dikaliumsalz, das Mononatriummonokaliumsalz, Mononatriumsalze und Monokaliumsalze, ferner
Erdalkalimetallsalze, wie Magnesiumsalze, Calciumsalze und Bariumsalze, dann Stickstoff enthaltende Salze, wie das Diammoniumsalz,
weiter Monoammoniumsalze, Diaminsalze und Monoaminsalze. in wirtschaftlicher Hinsicht ist es erwünscht,
normale Salze einzusetzen, die eine verhältnismässig höhere Löslichkeit in Wasser besitzen, wie beispielsweise
das Dinatriumsalz, das Dikaliumsalz, das Mononatriummonokaliumsalz, ferner Magnesiumsalze, das Diammoniumsalζ und
Diaminsalze. Hinsichtlich einer Festlegung des Ursprungs der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze, die bei der enzymatischen
Reaktion eingesetzt werden, ist in keiner Weise irgendeine Grenze gesetzt. So können beispielsweise Derivate der
cis-Epoxybernsteinsäure, wie die Ester oder Säureamide, die leicht hydrolysierbar sind und cis-Epoxybernsteinsäure bilden,
in die entsprechende cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze umgewandelt werden und in dieser Form der enzymatischen Reaktion
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zugegeben werden. Das Reaktionsgemisch mit einem Gehalt an cis-Epoxybernsteinsäure
oder deren Salzen, die durch die Umsetzung von Wasserstoffperoxid mit Maleinsäure oder deren Salzen erhalten
worden ist, kann in gleicher Weise in unveränderter Form oder gegebenenfalls in verdünnter Form eingesetzt werden.
Bei der Erzeugung von L(+)-Weinsäure oder deren Salzen unter Verwendung des roher. Gemisches aus diesem Reaktionsgemisch,
das cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze enthält und durch die Umsetzung von Wasserstoffperoxid mit Maleinsäure oder
deren "Salzen erhalten worden ist, ist es wünschenswert, das Gel mit den eingeschlossenen Mikroorganismen zu verwenden, die
praktisch keine Katalase-Aktivität besitzen, wie z.B. Acetobacter
curtus Nr. 4, Acetobacter curtus Nr. 10 oder Acetobacter
curtus Nr. 21.
Falls in diesem Falle ein Katalase-Aktivität besitzender Mikroorganismus
eingesetzt wird, besteht die Möglichkeit, dass das restliche Wasserstoffperoxid im Reaktionsgemisch, das die cis-Epoxybernsteinsäure
oder deren Salze enthält, zersetzt wird und dass der aus der Zersetzung des Wasserstoffperoxids erhaltene
Sauerstoff die enzymatische Reaktion stört. Falls dieses Gel mit den eingeschlossenen Mikroorganismen in Form eines festangeordneten
Bettes verwendet wird, kann bereits die geringstmögliche Menge Sauerstoffperlchen möglicherweise die feinen
Poren des Gels mit den eingeschlossenen Mikroorganismen verstopfen
und demzufolge die Durchlässigkeit herabsetzen.
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Es ist keine besondere Grenze hinsichtlich der Konzentration der bei der enzymatischen Reaktion einzusetzenden cis-Epoxybernsfceinsäure
oder deren Salzen festgelegt. Es können sogar stark verdünnte wässrige Lösungen oaer übersättigte wässrige Lösungen
mit ähnlicher Wirksamkeit eingesetzt werden. Ausserdem kann die wässrige Lösung der cis-Epoxybemsteinsäure oder deren Salze in ·
Puffermittel eingearbeitet werden, so dass sie als Pufferlösung verwendet wird. Andererseits kann sie in Natriumchlorid oder andere
den osmotischen Druck einstellende ..Mittel eingearbeitet werden,
so dass sie als physiologische isotonische Lösung zum Einsatz gelangt. Das Weglassen von solchen Puffermitteln oder den
osmotischen Druck einstellenden Mitteln kann sich möglicherweise als ziemlich vorteilhaft herausstellen, je nach dem besonderen
Zweck, für den das Endprodukt verwendet wird. Die zweckmässige Zugabe von antibakteriellen Mitteln ähnlich denjenigen, die
zuvor bei der wässrigen Lösung der cis-Epoxybemsteinsäure oder deren Salzen erwähnt worden sind, ist insgesamt wirksamer, um
die enzymatische Reaktion durch Verwendung des Gels mit den· eingeschlossenen
Mikroorganismen zu erhalten. Die Konzentration, bei der die antibakteriellen Mittel verwendet werden, ist nicht in
besonderer Weise begrenzt, jedoch ist es erwünscht, dass sie
in
nicht/über 1000 Teilen je Million, vorzugsweise im Bereich von 50 bis 500 Teilen je Million, vorliegen. Wenn die antibakteriellen Mittel in einer Konzentration über der oberen Grenze von 1000 Teilen je Million eingesetzt werden, ergibt sich daraus kein besonderer Vorteil. Umgekehrt kann ein überschuss an antibakteriellen Mitteln die Reinheit der erzeugten L(O-Weinsäure oder deren Salze beeinträchtigen.
nicht/über 1000 Teilen je Million, vorzugsweise im Bereich von 50 bis 500 Teilen je Million, vorliegen. Wenn die antibakteriellen Mittel in einer Konzentration über der oberen Grenze von 1000 Teilen je Million eingesetzt werden, ergibt sich daraus kein besonderer Vorteil. Umgekehrt kann ein überschuss an antibakteriellen Mitteln die Reinheit der erzeugten L(O-Weinsäure oder deren Salze beeinträchtigen.
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Die wässrige Lösung der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze, die bei der enzymatischen Reaktion eingesetzt wird, kann gegebenenfalls
durch Erhitzen oder Filtrieren durch eine Membran vor dem unmittelbaren Einsatz bei dieser Reaktion sterilisiert werden.
Wenn die enzymatische Reaktion unter Verwendung dieses Gels mit
den eingeschlossenen Mikroorganismen durchgeführt wird, sind die Bedingungen für die Reaktion etwas aufgelockerter im Vergleich zu
einer Reaktion, die unter Verwendung von cis-Epöxybernsteinsäure-Hydrolase
in irgendeiner anderen Form bewirkt wird. Insbesondere liegt die Temperatur der enzymatischen Reaktion im Bereich unter
700C, vorzugsweise im Bereich von 20 bis 500C. Wenn die Temperatur
die obere Grenze von 7O0C übersteigt, besteht die Möglichkeit,
dass das bei der enzymatischen Reaktion verwendete Gel mit den eingeschlossenen Mikroorganismen die enzymatische Aktivität einbüsst.
Der pH-Wert des Reaktionsgemisches bei der enzymatischen Reaktion soll im Bereich von H bis 10, vorzugsweise von 6 bis 9,
liegen. Wenn der pH-Bereich unter 1J oder über 10 liegt, dann kann
möglicherweise das bei der enzymatischen Reaktion eingesetzte Gel mit den eingeschlossenen Mikroorganismen seine enzymatische
Aktivität einbüssen. Die Berührungszeit zwischen den eingeschlossenen
Mikroorganismen und der wässrigen Lösung der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salzen während der enzymatischen
Reaktion liegt gewöhnlich im Bereich von 0,01 bis 100 Stunden, obwohl sie innerhalb der Temperatur, des pH-Bereichs, der
gewünschten Höhe an Ausbeute usw. variieren kann.
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Die enzymatische Reaktion, die der Einsatz dieses Gels mit den
eingeschlossenen Mikroox'ganismen zur Folge hat, kann absatzweise,
kontinuierlich oder halbkontinuierlich durchgeführt v/erden, je nach dem, weiches Verfahren sich gerade als vorteilhaft erweist.
Bei der absatzweisen Methode kann dac Reaktionsprodukt aus dem
enzymatischen Reaktionsgemisch mit dem Gehalt an L(+)-Weinsäure
oder deren Salzen durch Vermischen der wässrigen Lösung der cis-Epoxybernsteinsäure
oder deren Salzen mit dem Gel mit den eingeschlossenen Mikroorganismen, Schütteln oder Rühren des Gemisches
und
/ anschliessendes Abtrennen des Gels mit den eingeschlossenen Mikroorganismen aus dem erhaltenen Gemisch mittels einer üblichen Fest-Flüssig-Trennungstechnik, wie Zentrifugieren oder Filtrieren, erhalten werden.
/ anschliessendes Abtrennen des Gels mit den eingeschlossenen Mikroorganismen aus dem erhaltenen Gemisch mittels einer üblichen Fest-Flüssig-Trennungstechnik, wie Zentrifugieren oder Filtrieren, erhalten werden.
Das derart abgetrennte und gewonnene Gel mit den eingeschlossenen Mikroorganismen kann im nächsten Ansatz der enzymatischen
Reaktion wiederverwendet werden.
Beim kontinuierlichen Verfahren wird die sogenannte Festbettmefchode
angewendet, bei der man die wässrige Lösung der cis-Epoxybernsteinsäure öder deren Salze durch eine Säule fliessen
lässt, die mit dem Gel mit den eingeschlossenen Mikroorganismen: gefüllt ist.
Beim halbkontinuierlichen Verfahren kann die sogenannte Suspensionsbettmethode
genannt werden, bei der eine kontinuierliche Zufuhr des Gels mit den eingeschlossenen Mikroorganismen und der wässrigen
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Lösung der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salzen gleichzeitig zu einem Reaktionsgefäss, Rühren des Ansatzes, Abziehen des
Reaktionsgemisches aus dem Reaktionsgefäss in einer Menge, die der gemeinsamen Menge der Beschickung entspricht, und Abtrennen
und Gewinnen des Gels mit den eingeschlossenen Mikroorganismen
aus dem abgezogenen Reakticnsgemisch, beispielsweise durch
Dekantieren, erfolgt.
Somit kann in einfacher Weise das Produktgemisch der enzymatischen
Reaktion mit einem Gehalt an L(+)-Weinsäure oder deren Salzen erhalten werden. Der hier verwendete Ausdruck "Produktlösung der
enzymatischen Reaktion" bedeutet das Eluat aus der Säule im Falle des kontinuierlichen Herstellungsverfahrens und andererseits die
Lösung, die nach der Abtrennung des Gels mit den eingeschlossenen Mikroorganismen aus dem Reaktionsgemisch im Falle der absatzweisen
oder halbkontinuierlichen Methode verbleibt. Je nach den Rührbedingungen können die Einzelteilchen des Gels mit den
eingeschlossenen Mikroorganismen möglicherweise miteinander so heftig kollidieren, dass sie zerfallen. Im Hinblick auf diesen
Nachteil ist die Anwendung der Festbettmethode erwünscht.
Beim kontinuierlichen Verfahren beträgt die Zufuhrgeschwindigkeit
der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze zur Reaktionssäule 0,1 bis 15 g/Stunde in Form der freien cis-Epoxybernsteinsäure
je g des Mikroorganismus, der in diesem Gel mit den eingeschlossenen Mikroorganismen enthalten ist, obwohl die Geschwindigkeit
mit der enzymatischen Aktivität dieses Gels mit den eingeschlossenen
Mikroorganismen, variabel ist. Sie kann unter 0,1 g/Stunde und
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auch über 15 g/Stunde liegen. Wenn sie jedoch die untere Grenze
von 0,1 g/Stunde nicht erreicht, ist die Bildungsgeschwindigkeit
der L(+)-Weinsäure oder deren Salze zu niedrig für eine wirtschaftlich praktikable enzymatische Reaktion. Wenn die
Geschwindigkeit die obere Grenze von 15 g/Stunde übersteigt, ist die Konzentration der in der enzymatisehen Reaktionslosung zu
bildenden L(+)-Weinsäure oder deren Salzen zu niedrig im Vergleich
zu der mit unveränderter cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salzen, was möglicherweise die Raffinierung schwierig durchführbar
gestaltet.
Für die Isolierung der erzeugten L(+)-Weinsäure oder deren Salze
wendet man ein Verfahren an, das beispielsweise in der Zugabe einer wässrigen Lösung von Calciumchlorid zum Produktgemisch der
enzymatischen Reaktion oder gegebenenfalls zu der Lösung besteht, die durch Entfernen der verwendeten Enzymprobe aus diesem
Produktgemische der enzymatischen Reaktion erhalten wird, um
hierdurch die Ausfällung von schwer löslichen oder vollständig unlöslichen Salzen der L( + )-Weinsäure,'-wie das Calcium-L(+)-tartrat,
zu veranlassen, diese Salze abzufiltrieren, wieder in Wasser zu suspendieren und unter Rühren wässrige Schwefelsäure
usw. zuzusetzen, hierdurch den pH-Wert der Suspension auf 1,8 einzustellen, aus der Suspension die ausgefallenen schwerlöslichen
oder vollständig unlöslichen Salze, wie Calciumsulfat, zu entfernen und schüesslich den Wassergehalt aus der verbleibenden
Flüssigkeit, wie beispielsweise durch Einengen unter vermindertem Druck, zu entfernen, damit man dann die'rohen
Kristalle von L(+)-Weinsäure erhält. Ein erforderliches
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Raffinieren der rohen Kristalle erfolgt durch Lösen der rohen Kristalle in Wasser, Leiten der wässrigen Lösung durch eine Säule,
die mit einem stark sauren Ke.tionenaustauscherharz, wie z.B. 11 AmberJLite IR 120" in der H+-Form, gefüllt ist, wodurch eine
Adsorption der Säure an das Harz erfolgt, durch Eluieren der adsorbierten Säule mit Wasser, wiederum Leiten des Eluats durch
eine Säule, die mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz, wie z.B. "Amberlite IRA 400" vom Ameisensäure-Typ gefüllt
ist, und durch Eluieren der adsorbierten Säure mit 9~n Ameisensäure.
Die gereinigte L(+)-Weinsäure wird durch Einengen des erhaltenen Eluats erhalten.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren kann L(+)-Weinsäure oder deren Salze, die wichtige industrielle Substanzen darstellen, in
einfacher Weise in grossen Mengen und hohen Ausbeuten mit
hoher Selektivität erzeugt werden. Aus diesem Grunde besitzt die Erfindung einen ausserordentlich hohen wirtschaftlichen Wert.
Wenn das Gel mit den eingeschlossenen Mikroorganismen bei der enzymatischen Reaktion verwendet wird, ist das erhaltene Reaktionsgemisch im wesentlichen frei von Fremdverunreinigungen, wie
Enzymen, Mikroorganismen, Zellen und anderen eiweishaltigen Substanzen. Durch eine einfache Nachbehandlung können deshalb
L(+)-Weinsäure oder deren Salze mit einer hohen Reinheit in hohen Ausbeuten aus der enzymatischen Reaktionslösung erhalten
werden.
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Wenn die Reaktion die Verwendung eines Gels mit eingeschlossenen
Mikroorganismen einschliesst, kann die Erzeugung der L(+)-Weinsäure oder deren Salze eine lange Zeit kontinuierlich durchgeführt werden, ohne dass das Einbringen von Puffermitteln und/
oder Mitteln zur Einstellung des osmotischen Drucks der wässrigen Lösung der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salzen
erforderlich ist, die als Ausgangsmaterial für die enzymatische Reaktion verwendet werden. Die Reinheit der erzeugten L(+)-Weinsäure
oder deren Salze ist deshalb viel höher als sonst, wenn die enzymatische Reaktion ohne die Anwendung der Puffersubstanzen
und/oder der Substanzen zur Einstellung des osmotischen Drucks
durchgeführt wird.
Die vorliegende Erfindung wird jetzt anhand der Beispiele unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausfuhrungsformen näher beschrieben.
In den Beispielen 38 bis k2 ist der verwendete Mikroorganismus
stets Acetobacter curtus Nr. 21. Wenn die gleichen Versuche unter Verwendung -anderer Mikroorganismen als Acetobacter
curtus Nr. 21, nämlich unter Verwendung von Acetobacter curtus Nr. ^, Acetobacter curtus Nr. 10 usw.. durchgeführt werden,
erhält man die gleichen Ergebnisse.
In den Beispielen 38 bis k2 werden die enzymatischem Aktivitäten
der cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase nach dem folgenden
Verfahren bestimmt: Eine vorbestimmte "rMenge einer gegebenen
Substanz, die cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase enthält, wird
einer wässrigen Lösung zugegeben, die 1 Gewichtsprozent des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure enthält. Dann stellt
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man mittels Zugabe von Phosphatpufferlösung den pH-Wert auf 8 ein und lässt die Lesung eine Stunde bei 31J0C reagieren. Gegen
Ende der Reaktion wird die Reaktionslösung fünf Minuten zum
Sieden erhitzt, um die Reaktion zu unterbrechen. Wenn die ReaWionslösung
zufällig Mikroorganismenzellen oder anderes ähnliches unlösliches Material enthält, wird sie zentrifugiert, um die
Verunreinigungen abzutrennen und um anschliessend eine klare überstehende Lösung zu erhalten. Bei dieser überstehenden
Lösung wird der Drehungswinkel bestimmt. Durch Anwendung eines Grunddrehungswinkels auf die zuvor erstellte Eichkurve, die
den Gehalt an Dinatrium-L(+)-tartrat als Funktion des Drehungswinkels zeigt, wird die Menge des durch diese Reaktion erzeugten
Dinatriumsalzes der L(+)-Weinsäure berechnet. Die enzymatische Aktivität des Enzyms wird durch die Menge des Dinatriumsalzes
der L(+)-Weinsäure ausgedrückt, die je ml einer gegebenen Substanz mit einem Gehalt an cis-Epoxybernsteinsäure-Hydrolase je
Stunde erzeugt worden ist, und zwar als mMol/Stunde/ml, das als
Einheit verwendet wird.
In den Beispielen 1 bis 55 bedeuten die Ausdrücke "Teile" und "Prozent" Gewichtsteile und Gewichtsprozent, wenn nicht anders
angegeben. Die 0,1-m Phosphatpufferlösung vom pH 8, die 0,05-m
Phosphatpufferlösung vom pH 8 und die O,O25-m Phosphatpufferlösung
vom pH 8 in den Beispielen 43 bis 55 bedeuten Pufferlösungen,
die durch Verdünnen mit Wasser auf das Doppelte, Vierfache bzw. Achtfache des ursprünglichen Volumens eines Gemisches
aus 5,3 Volumenteilen einer wässrigen 0,2-m Mononatriumdihydrogenphosphat-Lösung
mit 9*1,7 Volumenteilen einer wässrigen
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0,2-m Dinatrium-monohydrogen-phosphat-Lösung erhalten worden
sind. Der in den Beispielen 43 bis 55 verwendete Maschenmasstab
bezieht sich auf die Teilchendurchmesser· gemäss der Vorschrift
JIS G 3555-1964.
In 100 ml eines Nährmediums mit einem Gehalt an 0,5 % Dikaliumphosphat,
0,2 % Monokaliumphosphat, 0,3 % Ammoniumsulfat, 0,05 % Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,001 5SEisen(II)-sulfatheptahydrat,
0,01 % Hefeextrakt und 1,0 % des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure und mit einer Einstellung auf einen
pH-Wert von 6,5 wird der Stamm Acetobacter curtus Nr. 4 (PERM-P Nr. 2879) geimpft und 24 bis 48 Stunden bei 300C gezüchtet.
Das in der Nährlösung vorhandene Dinatriumsalz der cis-Epoxybernsteinsäure wird vollständig verbraucht. Man erhält
0,45 g Natrium-L(+)-tartrat (= 40prozentige Ausbeute, bezogen auf das Dinatriumsalz der cis-Epoxybernsteinsäure).
Das Reaktionsgemisch wird zentrifugiert, um die Mikroorganismen zellen
abzutrennen und eine überstehende Lösung zu erhalten. Durch Zusatz von etwa 25 ml einer wässrigen Calciumchlorxdlösung
mit einer Konzentration von 0,1 Mol/Liter zu der überstehenden Lösung erhält man eine Ausfällung von Calcium-LC+J-tartrat. Der
Niederschlag wird abfiltriert und in etwa 50 ml Wasser suspendiert Während die Suspension gerührt wird, fügt man 0,1-n Schwefelsäure
hinzu, bis der pH-Wert der Suspension 1,8 beträgt. Der erzeugte Niederschlag von Calciumsulfat wird abfiltriert. Das
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Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und liefert etwa 0,28 g L(+)-Weinsäure in Kristallform. Die derart
erhaltene L(+)-Weinsäure weist eine spezifische Drehung von
Ä7° 5° (c = 10 %)'
Ein Vergleich dieser Ergebnisse mit jenen einer L(+)-Weinsäure
sie
vom Reinheitsgrad pro analysi, wie/auf dem Markt erhältlich ist, zeigt an, dass das erhaltene Produkt eine lOOprozentige optische Reinheit aufweist.
vom Reinheitsgrad pro analysi, wie/auf dem Markt erhältlich ist, zeigt an, dass das erhaltene Produkt eine lOOprozentige optische Reinheit aufweist.
Zu der in Beispiel 1 erhaltenen Kulturlösung werden 1,0 g des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure zugegeben. Die Nährlösung
wird auf pH 8,0 eingestellt und vier Stunden bei 35°C geschüttelt. Das neu zugegebene Substrat wird vollständig aufgebraucht,
und die Nährlösung enthält 1,29 g Natrium-L(+)-tartrat (Ausbeute = 59 %» bezogen auf das eingesetzte Gesamtsubstrat,
78 %, bezogen auf das neu eingesetzte Substrat). In dieser Weise
werden 1,0 g-Anteile des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure
nacheinander bis zu insgesamt 20,0 g zugegeben. Schliesslich ist das nach und nach zugegebene Substrat völlig aufgebraucht,
und die Nährlösung enthält 20,18 g Natrium-L(+)-tartrat (Ausbeute 89 %, bezogen auf die Gesamtbeschickung). Die Nährlösung wird
zentrifugiert und ergibt eine überstehende Lösung, zu der etwa 120 ml einer Calciumchloridlösung mit einer Konzentration von
1 Mol/Liter gegeben wird. Man erhält einen Niederschlag von Calcium-L(+)-tartrat. Der Niederschlag wird abfiltriert und in
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etwa 200 ml Wasser suspendiert. Während die Suspension gerührt
wird, wird 1-n Schwefelsäure bis zu pH-Wert der Suspension von 1,8 zugegeben. Der Niederschlag von Calciumsulfat wird abfiltriert.
Das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und liefert 14,7 g !·( + )-Weinsäure in Kirstallform.
Die derart erhaltenen rohen Kristalle werden in V/asser gelöst. Die wässrige Lösung wird durch eine Säule von 3 x 80 cm ge schiel-;
die mit "Amberlite IR 120" in der H+-Fsrm gefüllt ist. Das Adsorbat
wird mit etwa 1000 ml Wasser eluiert. Das erhaltene Elua*
wird durch eine andere Säule von 3 x 80 cm geleitet, die mit "Amberlite IRA 400" in der Ameisensäure-Form gefüllt ist. Das
Adsorbat wird mit etwa 1000 ml 9-n Ameisensäure eluiert. Das derart erhaltene Eluat wird unter vermindertem Druck zur Trockne
eingedampft und liefert 13»5 g reine Weinsäure. Die derart erhaltene
L(+)-Weinsäure hat eine optische Reinheit von 100 %.
Die in gleicher Weise wie in Beispiel 1 erhaltene Nährlösung wird zentrifugiert, um Zellen abzutrennen. Die Zellen werden in
200 ml einer 0,05-m Phosphatpufferlösung, die vorher auf pH 75C
eingestellt worden ist, suspendiert. Die Suspension wird wiederum zentrifugiert, um die Zellen zu reinigen. Diese Reinigung
wird dreimal wiederholt. Ein Anteil von 0,5 g-der gereinigten Zellen wird zu 100 ml einer Lösung gegeben, die 1,0 g des
Dihydrats des Monocalciumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure und 0,3 g Calciumcarbonat als Substrat enthält. Das erhaltene
Gemisch wird auf pH 8,0 eingestellt und vier Stunden bei 35 C geschüttelt. Das Substrat wird völlig aufgebraucht und im
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Reaktionsgemisch befindet sich Calcium-L(+)-tartrat in einer
Menge von 1,09 %t was einer Ausbeute von 98 % entspricht. Das
erhaltene Reaktionsgemisch wird mit 1,0 g des Dihydrate des Monocalciumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure und 0,3 g Calciumcarbonat
versetzt und wiederum vier Stunden bei 35 C geschüttelt. Das im Reaktionsgemisch vorliegende Substrat wird vollständig
aufgebraucht und in Calcium-L(+)-tartrat überführt. Die Menge beträgt 2,18 g entsprechend einer Ausbeute von 98 % bezogen auf
das eingesetzte Substrat. Auf diese Weise werden Anteile von 1,0 g des Dihydrats des Monocalciumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure
und Anteile von 0,3 g Calciumcarbonat gleichzeitig bis zu insgesamt 20,0 g bzw. 6,0 g zugegeben. Schliesslich ist das
nach und nach zugegebene Substrat vollständig aufgebraucht, und
es liegt ein Niederschlag von Calcium-L(+)-tartrat vor. Die derart erzeugte Menge beträgt 22,0 g, entsprechend einer Ausbeute
von 99 %. Das Calcium-L(+)-tartrat wird in etwa 200 ml Wasser
suspendiert. Während die Suspension gerührt wird, wird 1-n Salzsäure
zugegeben, bis sich der Niederschlag von Calcium-L(+)-tartrat gelöst hat. Die erhaltene Lösung wird zentrifugiert, um
Mikroorganismenzellen 'daraus zu entfernen. Die verbleibende Lösung wird durch eine Säule von-3 x 80 cm geleitet, die mit
"Amberlite IR 120" in der H+-Porm beschickt ist. Das Adsorbat
wird mit Wasser eluiert. Durch Eindampfen des Eluats unter vermindertem Druck zur Trockne erhält man 15,7 g L(+)-Weinsäure in
Kristallform. Die Ausbeute beträgt 89 % und die optische Reinheit ist 100 %.
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Beispiel 4
In eine Nährlösung in einer Zusammensetzung ähnlich der des Beispiels 1, mit Ausnahme eines weiteren Zusatzes von 1,0 % des
Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure und 1,0 % Glukose
als Kohlenstoffquelle, wird der Stamm Acetobacter curtus Nr. 10
(FERM-P Nr. 2880) überimpft und 24 bis 48 Stunden bei 30°C gezüchtet. Aus der erhaltenen Anzuchtlösung werden die lebenden
Mikroorganismenzellen durch Zentrifugieren entfernt. Die Zellen werden mit Phosphatpufferlösung einer Konzentration von 0,05 Mol/
Liter und einem pH-Wert von 730 gewaschen, dann in Wasser suspendiert
und gefriergetrocknet. Ein Anteil von 0,1 g der lyophilisierten Zellen wird vier Stunden bei 35°C in 100 ml einer Lösung
schwach geschüttelt, die als Substrat 1,0 g des Dihydrate des Monocalciumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure enthält und einen
pH-Wert aufweist, der mittels Natriumhydroxidlösung auf 8,0 eingestellt worden ist. Das-Substrat wird vollständig aufgebraucht
und man erhält Natrium-LC+)-tartrat und Calcium-L(+)-tartrat.
Von diesem Punkt an wird das gleiche"Verfahren wie in
Beispiel 3 wiederholt. Die zellfreie Anzuchtlösung wird durch eine Säule geschickt, die mit einem Ionenaustauscherharz gefüllt
ist. Das Eluat wird zur Trockne eingedampft und liefert 0,85 g
L(+)-Weinsäure in einer Ausbeute von 96 % und einer optischen
Reinheit von 98 %.
Beispiel 5
Gereinigte Mikroorganismenzellen, die in gleicher Weise wie in Beispiel 3 erhalten worden sind, werden in 100 ml einer
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- I13 -
wässrigen Lösung eingebracht, die als Substrat 1,0 g cis-Epoxybernsteinsäure
enthält und einen pH-Wert aufweist, der mittels wässriger Natrxumhydroxidlosung auf 8,0 eingestellt worden ist.
Die Lösung wird vier Stunden bei 35 C gerührt. Das Substrat wird vollständig aufgebraucht, und man erhält 1,40 g Natrium-L(+)-tartrat,
entsprechend einer Ausbeute von 95 %> Das Reaktionsgemisch wird anschliessend wie im Verfahren des Beispiels 2
behandelt. Die schliesslich erhaltene L(+)-Weinsäure weist eine optische Reinheit von 100 % auf.
Das Verfahren des Beispiels 5 wird wiederholt jedoch mit der Ausnahme,
dass 1,0 g des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure als Substrat verwendet werden. Das Substrat wird vollständig
aufgebraucht, und man erhält Dinatrium-L(+)-tartrat in einer Menge von 1,08 g, entsprechend einer Ausbeute von 98 %. Die durch
in ein anschliessendes gleiches Verfahren wie/Beispiel 2 erhaltene
L(+)-Weinsäure weist eine optische Reinheit von 100 % auf.
Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, dass der Stamm Acetobacter curtus Nr. 21 (FERM-P
Nr. 2881) anstelle des Stamms Acetobacter curtus Nr. H eingesetzt
wird. Aus der Anzuchtlösung werden gereinigte Mikroorganismenzellen
entsprechend dem Verfahren des Beispiels 3 erhalten. Die gereinigten Zellen werden in etwa 30 ml Aceton
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suspendiert und dann zentrifugiert. Diese Reinigung der Zellen mit Aceton wird insgesamt dreimal wiederholt. Die gereinigten
Zellen werden bei einer Temperatur von nicht über 30 C unter
vermindertem Druck getrocknet. Man erhält acetongetrocknete Mikroorganismenzellen. Das Behandlungsverfahren des Beispiels 5
wird wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, dass 0,1 g acetongetrocknete Zellen und 1,0 g Natrium-calcium-cis-epoxysuccinat
als Substrat verwendet werden. Das Substrat wird in dem Gemisch vollständig aufgebraucht, und man erhält 0,49 g Natrium-L(+)-tartrat
und 0,48 g Calcium-L(+)-tartrat, entsprechend einer Gesamtausbeute von 97 %. Die entsprechend dem Verfahren des
Beispiels 3 erhaltene L(+)-Weinsäure weist eine optische Reinheit von 100 % auf.
Ein Anteil von 0,5 g gereinigter Zellen von Acetobacter curtus Nr. 21 (PERM-P Nr. 2881), der nach dem Verfahren des Beispiels 7
erhalten worden ist, wird vier Stunden bei 35 C in einer Lösung schwach geschüttelt, die als Substrat 1,0 g des Diammoniumsalzes
der cis-Epoxybernsteinsäure enthält und vorher mittels wässrigem Ammoniak auf einen pH von 8,0 eingestellt worden ist. Das
Substrat in dem Reaktionsgemisch wird vollständig aufgebraucht,
und man erhält 1,05 g Ammoniumtartrat, entsprechend einer Ausbeute
von 95 %· Das Reaktionsgemisch wird zentrifugiert, um
Mikroorganismenzellen daraus zu entfernen. Die verbleibende Lösung wird mit 0,6 g Calciumcarbonat versetzt, worauf ein
Niederschlag von Calcium-L(+)-tartrat gebildet wird. Der Nieder-
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-J15-
schlag wird abfiltriert und der gleichen Behandlung wie in Beispiel
1 unterworfen. Die danach erhaltene L(+)-Weinsäure weist eine optische Reinheit von 100 % auf.
Gereinigte Mikroorganismenzellen von Acetobacter curtus Nr. 4
(FERM-P Nr. 2879) , die nach dem Verfahren des Beispiels 3 erhalten
worden sind, werden in 100 ml einer 0,05-m Phosphatpufferlösung vom pH 7,0 suspendiert. Die Suspension wird mittels
eines Zellzertrümmerers durch Vibration behandelt, um ein h.omogenes Produkt zu erhalten. Durch Zentrifugieren des erhaltenen
homogenen Produktes fällt eine lösliche Fraktion an, die gegen Leitungswasser dialysiert wird. Die innerhalb des Dialysators
erhaltene Flüssigkeit wird auf 50 ml eingeengt, die als zellfreier
Extrakt eingesetzt werden. Dieser zellfreie Extrakt wird auf einen pH 8,0 eingestellt, indem 1,0 g Tetrahydrat des
Calciumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure zugegeben werden. Dann wird das Ganze mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml
verdünnt. Das derart erhaltene Gemisch wird vier Stunden bei 35°C geschüttelt. Das Substrat in dem Reaktionsgemisch wird vollständig
aufgebraucht, und man erhält 0,77 g Calcium-L(+)-tartrat, entsprechend
einer Ausbeute von 99 %· Das Calcium-L(+)-tartrat wird
abfiltriert und dann gemäss dem Verfahren des Beispiels 1 behandelt.
Man erhält L(+)-Weinsäure mit einer optischen Reinheit von 100 %.
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Beispiel 10
Gereinigte Mikroorganismenzellen von Acetobacter curtus Nr. (FERM-P Nr. 2880), die nach dem Verfahren des Beispiels 4 erhalten
worden sind, werden in der gleichen Weise wie in Beispiel 9 beschrieben homogenisiert. Man erhält ein lösliches
Dialysat, das mit Ammoniumsulfat fraktioniert wird. Die Fraktion einer Sättigung von 0 bis 0,5 wird gesammelt. Diese Ammoniumsulfatfraktion
wird gegen eine 0,05-m Phosphatpufferlösung vom pH 7jO dialysiert. Die innerhalb des Dialysators erhaltene
Flüssigkeit wird auf 30 ml eingeengt. Sie wird als rohe Enzymflüssigkeit verwendet. Zu dieser rohen Enzymflüssigkeit wird
eine wässrige Lösung mit einem Gehalt an 1,0 g des Dihydrats des Monocalciumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure und 0,3 g
Calciumcarbonat als Substrat zugegeben. Das erhaltene Gemisch wird auf pH 8,0 eingestellt und dann mit Wasser auf ein Gesamtvolumen
von 100 ml verdünnt. Das derart erhaltene Gemisch wird vier Stunden bei 35 C geschüttelt. Das Substrat in dem Reaktionsgemisch wird vollständig aufgebraucht. Man erhält 1,09 g Calcium-L(+)-tartrat,
entsprechend einer Ausbeute von 98 %* Die nach dem
Verfahren des Beispiels 1 erhaltene L(+)-Weinsäure weist eine optische Reinheit von 100 % auf.
In '100 ml einer Lösung, die als Substrat 5,0 g des Dinatriumsalzes
der cis-Epoxybernsteinsäure enthält, wird ein Anteil von 0»5 g gereinigte Zellen von Acetobacter curtus Nr. 10 (FERIi-P
Nr. 2880) eingebracht, die nach dem Verfahren des Beispiels k
hergestellt worden sind. Die Lösung wird 15 Stunden bei 35°C
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und einem pH von 8,0 geschüttelt. Das Substrat in der Lösung
wird vollständig aufgebraucht. Man erhält 5,4 g Natrium-L(+)-tartrat,,
entsprechend einer Ausbeute von 98 %. Die nach dem
gleichen Verfahren des Beispiels 1 erhaltene LO)-Weinsäure
weist eine optische Reinheit von 100 % auf.
In einen Anteil von 200 ml einer Kulturlösung der gleichen Zusammensetzung
wie im Beispiel 1 wird der Stamm Acetobacter curtus Nr. 21 (FERM-P Nr. 288l) überimpft und dann nach dem Verfahren
des Beispiels 7 behandelt. Man erhält gereinigte Mikroorganismenzellen. In 100 ml einer Lösung mit einem Gehalt an 5,0 g des
Tetrahydrats des Calciumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure als Substrat werden die gereinigten Zellen 8 Stunden bei 35°C bei
pH 8,0 geschüttelt. Das Substrat in dem Reaktionsgemisch wird vollständig aufgebraucht, und man erhält 0,75 g Calcium-L(+)-tartrat,
entsprechend einer Ausbeute von 97 %» Die nach dem
gleichen Verfahren des Beispiels 1 erhaltene L(+)-Weinsäure weist eine optische Reinheit von 100 % auf.
Das Verfahren des Beispiels 12 wird wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, dass das Volumen der Kulturflüssigkeit auf 400 ml
erhöht wird. In 100 ml der wässrigen Lösung, die als Substrat 20,0 g des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure enthält
und auf pH 8,0 eingestellt ist, werden die derart bereiteten
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gereinigten Zellen 18 Stunden bei 35°C geschüttelt. Das Substrat in dem Reaktionsgemisch wird vollständig aufgebraucht.
Man erhält 20,9 g Natrium-L(+)-tartrat, entsprechend einer
Ausbeute von 95 %· Die nach dem gleichen Verfahren wie in
Beispiel 1 erhaltene L(+)-Weinsäure weist eine optische Reinheit von 100 % auf.
Das Verfahren des Beispiels 13 wird wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, dass als Substrat 20,0 g des Natrium-ammonium-cisepoxysuccinats
verwendet werden. Die enzymatische Reaktion wird insgesamt 18 Stunden durchgeführt. Das Substrat in dem Reaktionsgemisch wird vollständig aufgebraucht. Man erhält 20,8 g Natriumammonium-L(+)-tartrat,
entsprechend einer Ausbeute von 9U %. Die nach dem Verfahren des Beispiels 8 erhaltene L(+)-Weinsäure
weist eine optische Reinheit von 100 % auf.
Unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 13, jedoch mit der Ausnahme, dass gereinigte Zellen verwendet werden, die in
einem Liter der Kulturflüssigkeit gezüchtet worden sind, wird die enzymatische Reaktion 6 Stunden lang durchgeführt. In dem
Reaktionsgemisch werden die als Substrat eingesetzten 20,0 g des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure vollständig
aufgebraucht. Man erhält 21,1I g Natrium-L(+)-tartrat, entsprechend
einer Ausbeute von 97 %. Die nach dem Verfahren des Beispiels
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1 B673
erhaltene L(+)-Weinsäure weist eine optische Reinheit von 100
auf.
Beispiel 16
In aOO ml einer Kulturflüssigkeit, die 0,3 % Dikaliumphosphat,
0,1 % Monokaliumphosphat, 0,1 % Ammoniumnitrat, 0,05 %
Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,001 % Eisen(II)-sulfat-heptahydrat,
0,01 % Hefeextrakt und 1,0 % des oinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure
enthält und auf einen pH-Wert von 7»0 eingestellt worden ist, wird der Stamm Corynebacterium S-13 (FERM-P Nr. 2891)
überimpft und 24 bis 48 Stunden bei 300C gezüchtet. Das Substrat
wird in der Kulturlösung völlig aufgebraucht. In der Kulturlösung sind etwa 0,04 g erzeugtes Natrium-L(+)-tartrat enthalten. Die
Ausbeute beträgt 3 %.
Beispiele 17 bis 20
Gereinigte Mikroorganismenzellen von Acetobacter curtus Nr. 4 (FERM-P Nr, 2879) werden nach dem Verfahren des Beispiels 3 erhalten.
Entsprechende Anteile von jeweils 0,5 g dieser gereinigten Zellen werden zu jeweils 100 ml einer wässrigen Lösung
gegeben, die als Substrat 1,0 g cis-Epoxybernsteinsäure enthält und auf verschiedene pH-Werte mittels Natriumhydroxidlösung eingestellt
worden ist. Die Lösungen werden bei 35 C unterschiedlich lange geschüttelt. In jedem Reaktionsgemisch wird das Substrat
vollständig aufgebraucht. Man erhält Natrium-L(+)-tartrat in den
Ausbeuten, wie sie in Tabelle IV zusammen mit den Reaktionsbe-
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dingungen angegeben worden sind. Bei jedem Ansatz weist die nach dem gleichen Verfahren des Beispiels 1 erhaltene L(+)-Weinsäure
eine optische Reinheit von 100 % auf. -
Beispiel pH Reaktions- Natrium-L(+)-tartrat optische Reinheit
N " zeit, Std. der L( + )-Wein-
erzeugte Ausbeute, säure, % Menge, g %
100 100 100 100 100
| 17 | 6,0 | 8,0 | 1,32 | 90 |
| 18 | 7,0 | 5,0 | 1,37 | 93 |
| 19 | 9,0 | 5,0 | 1,35 | 92 |
| 20 | 10,0 | 8,0 | 1,30 | 89 |
| 5 | 8,0 | 4,0 | 1,40 | 95 |
Beispiele 21 bis 24
Gereinigte Mikroorganismenzellen werden nach dem Verfahren des Beispiels 7 erhalten, jedoch mit der Ausnahme, dass Acetobacter
curtus Nr. 21 (PERM-P Nr. 2881) anstelle von Acetobacter curtus Nr. 4 (PERM-P Nr. 2879) verwendet wird. Jeweils Anteile von 0,5 g
dieser gereinigten Zellen werden zu je 100 ml einer wässrigen Lösung gegeben, die als Substrat 1,0 g des Dinatriumsalzes der
cis-Epoxybernsteinsäure enthält und auf einen pH 8,0 mittels Natriumhydroxid eingestellt worden ist. Die Lösungen werden bei
verschiedenen Temperaturen unterschiedlich lange geschüttelt. In jedem Reaktionsgemisch wird Natrium-L(+)-tartrat erzeugt.
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Die Mengen an derart erzeugtem Natrium-L( + ·)—tartrat und die
entsprechenden Ausbeuten sind in der Tabelle V in Verbindung mit
den Reaktionsbedingungen (Temperaturen und Zeiten) angegeben. Bei jedem Ansatz weist die nach dem gleichen Verfahren des
Beispiels 1 erhaltene L(+)-Weinsäure eine optische Reinheit von 100 % auf.
Bei- Tempe- Reaktions- Natrium-L(+)-tartrat optische Reinheit spiel ratur, zeit, Std. der L(+)-Wein-
| Nr. | 0C | 10,o | erzeugte Menge, g . |
Ausbeute, % |
säure, % |
| 21 | 18 | 7,0 | 1,06 | 96 | 100 |
| 22 | 2k | 6,0 | 1,05 | 95 | 100 |
| 23 | 29 | H9O | 1,02 | 93 | 100 |
| 24 | 39 | Ü,0 | Pi98 | 89 | 100 |
| 6 | 35 | . 1,08 | 98 | 100 | |
Zu 100 ml einer Lösung, die 1,0 g cis-Epoxybernsteinsäure und
1,^3 g einer 33prozentigen wässrigen Methylaminlösung enthält
und auf pH 8,0 eingestellt worden ist, wird ein Anteil von 0,5 g gereinigten Mikroorganismenzellen von Acetobacter curtus Nr.
(PERM-P Nr. 2880) gegeben, die nach dem Verfahren des Beispiels k
hergestellt worden sind. Die Lösung wird sechs Stunden bei 300C
geschüttelt. Das Reaktionsgemisch enthält 1,32 g des Dimethylamine
salzes der L(+)-Weinsäure, entsprechend einer Ausbeute von 90 %.
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Dieses Salz wird durch Zugabe einer Lösung von Calciumchlorid in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 in das Calcium-LC-O-tartrat
umgewandelt, aus dem man L(+)-Weinsäure erhält, die eine optische Reinheit von 100 % aufweist.
Das Verfahren des Beispiels 5 wird in gleicher Weise durchgeführt,
jedoch mit der Ausnahme, dass eine wässrige Lösung von Käliumhydroxid anstelle einer wässrigen Lösung von Natriumhydroxid
verwendet wird. Das Substrat in dem Reaktionsgemisch wird vollständig aufgebraucht. Man erhält 1,61 g Kalium-L(+)-tartrat
entsprechend einer Ausbeute von Sk %. In gleicher Weise wie
das Natrium-L(+)-tartrat· des Beispiels 1 wird das Kalium-L(+)-tartrat behandelt und liefert L(+)-Weinsäure von einer
optischen Reiheit von 100 %.
verwendet wird. Das Substrat in dem Reaktionsgemisch wird vollständig aufgebraucht. Man erhält 1,61 g Kalium-L(+)-tartrat
entsprechend einer Ausbeute von Sk %. In gleicher Weise wie
das Natrium-L(+)-tartrat· des Beispiels 1 wird das Kalium-L(+)-tartrat behandelt und liefert L(+)-Weinsäure von einer
optischen Reiheit von 100 %.
In 100 ml einer wässrigen Lösung, die 1,0 g cis-Epoxybernsteinsäure
und 0,1I1I g Magnesiumhydroxid enthält und auf pH 8,0 eingestellt
worden ist, wird ein Anteil von O35 g gereinigter Mikroorganismenzellen
von Acetobacter curtus Nr. 1J (PERM-P Nr. 2879) gegeben, die nach dem Verfahren des Beispiels 3 erhalten worden
sind. Die Lösung wird fünf Stunden bei 35°C geschüttelt. In dem Reaktionsgemisch bilden sich 1,19 g Magne.sium-L( + )-tartrat,
entsprechend einer Ausbeute von 91 %. Durch Behandeln dieses
Salzes an einer Säule, die in gleicher Weise wie in Beispiel 3
mit "Amberlite IR 120" in der H -Form beschickt ist, erhält man
entsprechend einer Ausbeute von 91 %. Durch Behandeln dieses
Salzes an einer Säule, die in gleicher Weise wie in Beispiel 3
mit "Amberlite IR 120" in der H -Form beschickt ist, erhält man
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L(+)-Weinsäure mit einer optischen Reinheit von 100 %.
Beispiele 28 bis 36
Aliquote Anteile von jeweils 0,5 g gereinigter Mikroorganismenzellen
von Acetobacter curtus Nr. 4 (PERM-P Nr. 2879), die nach
dem Verfahren des Beispiels 3 hergestellt worden sind, werden jeweils zu 100 ml einer Lösung gegeben, die 1,0 g cis-Epoxybernsteinsäure
sowie verschiedener Metallhydroxide, Metalloxide oder -carbonate enthält. Die Lösungen werden bei verschiedenen
Temperaturen unterschiedlich lange geschüttelt. In jedem Reaktionsgemisch erhält man das entsprechend der verwendeten Metallverbindung
gebildete Metallsalz der L(+)-Weinsäure. Die Mengen an erzeugten Salzen und ihre entsprechenden Ausbeuten sind
in der Tabelle VI in Verbindung mit den entsprechenden Reaktionsbedingungen angegeben. Aus jedem Metallsalz der L(+)-Weinsäure
erhält man nach dem Verfahren des Beispiels 27 Produkte mit der in der Tabelle angegebenen optischen Reinheit.
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Tabelle VI
| Bei | Metallhydroxid,-carbonat usw. | Gewicht, | ■ pH | Tempe- | Re ak- 4· A />yi a ■» |
Reaktionsprodukt | 98 | optische Pfti nhoi f Hot* |
CD |
| spiel Nr. |
Verbindung | 0,56 | 7,5 | X Ct U UX y | u JL UIlO zeit, Std. |
93 | rvt? XIlXiUXi/ UwX säure, % |
CD ■ CD |
|
| 28 | Calciumhydroxid | 1,50 | 7,0 | 35 | 4 | Verbindung erzeugte Ausbeute Menge, g % |
90 | 100 | |
| 29 | Bariumcarbonat | 0,75 | 6,0 | 35· | 6 | Calcium-L(+)~ 1,40 tartrat |
89 | 100 | |
| 30 | Zinkhydroxid | 0,5-4 | 6,,0 | 35 | 12 | Barium-L(+)- 2,01 tartrat |
91 | 100 | |
| 31 | Eisenhydroxid | 0,39 | 6,0 | 35 | 18 | Zink-L(+)- 1.45 tartrat |
97 | 98 | |
| 32 | Aluminiumhydroxid | 0,80 | 8,0 | 35 | 10 | Eisen-L(+)- 1,25 tartrat |
97 | 100 -P | |
| 33 | Natriumcarbonat | 1,05 | 8,5 | 32 | 5 | Aluminium- 1,15 L(+)-tartrat |
96 | 100 | |
| 34 | Kaliumcarbonat | 0,43 | 8,0 | 34 | 5 | Natrium-L(+)- 1,43 tartrat |
92 | 100 | |
| 35 | Calciumoxid | 0,31 | 8,0 | 35 | 4 | Kalium-L(+)- 1,66 tartrat |
100 | ||
| 36 | Magnesiumoxid | 35 | 5 | Calcium-L(+)- 1,37 tartrat |
100 | ||||
| Magnesium- 1,20 L(+)-tartrat |
|||||||||
Beispiel 37
Das Verfahren des Beispiels 25 wird wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, dass 1,53 g Triäthylamin anstelle der 33pi'ozentigen
Methylaminlosung verwendet werden. Im Reaktionsgemisch bilden sich
1»73 g des Di-(triäthylamin)-L(+)-tartrats, entsprechend einer
Ausbeute von 91 %. Die optische Reinheit der nach dem Verfahren des Beispiels 25 erhaltenen L(+)-Weinsäure beträgt 100 %.
In Leitungswasser werden 2 g Dinatrium-DL-tartrat, 0,2 g
KH2PO14, 0,1 g K2HPO11, 0,3 g NH11NO3, 0,05 g MgSO^^O, 0,05 g
Hefeextrakt, 0,002 g FeSO11^H3O und 0,01 g MnCl2^H3O zu einem
Gesamtvolumen von 100 ml gelöst, die als Nährmedium verwendet werden. In diesem Medium wird der Stamm Acetobacter curtus Nr.
(PERM-P Nr. 2881) vier Tage lang bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Der Anfangs-pH-Wert der Kulturflüssigkeit beträgt 6,2.
Am Ende der Züchtung wird die Kulturlösung auf die enzymatische Aktivität geprüft. Sie beträgt 2k /lMol/Stunde/ml.
Vergleichsbeispiel 1
Das Verfahren des Beispiels 38 wird .wiederholt, jedoch mit der Ausnahme,
dass 2 g Glukose anstelle von 2 g Dinatrium-DL-tartrat verwendet werden. Auf dieser Anzuchtlösung wird der Stamm Acetobacter
curtus Nr. 21 (FERM-P Nr. 2881) gezüchtet. Wenn die Kultur-'lösung
auf die enzymatische Aktivität geprüft wird, ist sie praktisch Null.
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Beispiel 39
Es wird der Stamm Acetobacter curtus Nr. 21 (FERM-P Nr. 288i) nach dem Verfahren des Beispiels 38 gezüchtet, jedoch mit der
Ausnahme, dass 2 g Calcium-DL-tartrat anstelle von 2 g Dinatrium-DL-tartrat
verwendet werden. Der Anfangs-pH-Wert der Kulturlösung in diesem Falle beträgt 6,0. Am Ende der Züchtung wird die
Xulturlösung mit niedriger Geschwindigkeit bei 500 g zentrifugiert. Man erhält ein Gemisch mit einem Gehalt an Mikroorganismen
zellen, das frei von unlöslichen Calciumsalzen ist. Dieses Gemisch wird auf die enzymatische Aktivität geprüft, die sich mit 11 uMol/
Stunde/ml ergibt.
Beispiel ^O Mittels Leitungswasser werden 20 g Dinatrium-DL-tartrat, 2 g
PO14, 1 g K2HPO4', 3 g NH11NO3, 0,5 g MgSO11.7H3O, 0,5 g Hefeextcakt,
0,02 g FeSO11^H2O und 0,01 g MaCl3.i»H 0 bis zu einem Gesamtvolumen
von 1000 ml gelöst, das als Anzuchtflüssigkeit verwendet wird. In dieser Anzuchtflüssigkeit wird der Stamm Acetobacter
curtus Nr. 21 (FERM-P Nr. 288l) aerob unter Verwendung eines Schüttelfermentors gezüchtet. Das in die Anzuchtlösung eingeleitete
Luftvolumen beträgt 0,5 WM; die Temperatur wird auf 300C
gehalten. Der pH-Wert während der Anzucht wird durch Verwendung einer wässrigen lOvolumenprozentigen Schwefelsäure auf 6,3 gehalten.
Die Bebrütung dauert drei Tage. Danach wird die so erhaltene Anzuchtlösung auf die enzymatische Aktivität geprüft,
die sich zu 38 ^JiMol/Stunde/ml ergibt. Ein Anteil von 3OO ml dieser
Anzuchtlösung wird zentrifugiert, um die Mikroorganismenzellen
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daraus abzutrennen. Die Zellen werden in 50 ml Wasser dispergiert.
Die erhaltene Dispersion wird mit 50 ml einer wässrigen 20prozentigen
Lösung des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybcmsteinsäure
mit einem pH von 8,0 vermischt. Das erhaltene Gemisch wird zehn Stunden auf 34°C gehalten, um eine Hydrolyse des Dinatriumsalzes
der cis-Epoxybernsteinsäure zu bewirken. Am Ende der Reaktion wird das Reaktionsgemisch zentrifugiert. Die überstehende Lösung
wird zur Trockne eingedampft und raffiniert. Man erhält 11,3 g
Dinatrium-L(+)-tartrat-dihydrat in Kristallform. Die optische Reinheit der Kristalle beträgt 97 %» bezogen auf die optische
Reinheit eines im Handel befindlichen Dinatrium-L(+)-tartratdihydrats
von Analysenreinheit. Das Röntgenbeugungsdiagramm und das IR-Spektrum, die mit diesen Kristallen erhalten worden sinds
stehen in vollständiger Übereinstimmung mit den entsprechenden Spektren des vorgenannten Dinatrium-L(+)-tartrat-dihydrats von
Analysenreinheit.
Mit Leitungswasser werden 30 g Dinatrium-L(+)-tartrat, 5 g
Glukose, 2 g KH2PO11, 1 g K2HPO11, 3 g (NH1J)2SO11 und 0,5 g MgSO4.
7HpO bis zum Gesamtvolumen von 1000 ml gelöst, die als Anzuchtlösung
verwendet werden. In dieser Anzuchtlösung wird der Stamm Acetobacter curtus Nr. 21 (PERM-P Nr. 2881) nach dem Verfahren
des Beispiels 40 gezüchtet. Die Anzuchtlösung hat eine enzymatis Aktivität von 56 ^Mol/Stunde/ml.
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Beispiel 42
Mit Leitungswasser werdsn 20 g Diammoni.um-DL-tartrat, 2 g KHpPO4,
1 g K2HPO4, 0,5 g MgSO1J.7HpO und 0,5 g Hefeextrakt bis zum Gesamtvolumen
von 1000 ml gelöst-, die als Anzuchtlösung verwendet werden. In dieser Anzuchtlösung wird der Stamm Aeetobacter curtus Nr. 21
(FERM-P Nr. 2881) aerob unter Verwendung eines Schüttelfermentors gezüchtet, wobei das Volumen der zugeführten Luft auf 0,5 VVM
festgelegt worden ist, die Temperatur auf 30 C gehalten wird und
aer pH-Wert während der Züchtung durch Verwendung einer wässrigen lOvolumenprozentigen Schwefelsäure auf pH 3 eingestellt wird.
Nach dreitägiger Züchtung wird die Kulturlösung auf ihre enzymatische
Aktivität geprüft, die sich mit 40 uMol/Stunde/ml ergibt.
Beispiel 43
In 100 Teile eines flüssigen Kulturmediums, das 0,2 % 221
In 100 Teile eines flüssigen Kulturmediums, das 0,2 % 221
C,5 % K2HPO4, 0,3 % (NH^)2SO11,0,05 % MgSO4.7H2O, 0,001 ■% PeSO4.7H2
/0,01 % Hefeextrakt
-— 7 und 1,0 % des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure
enthält und auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt worden ist, wird
v.er Stamm Aeetobacter curtus Nr. 21 (FERM-P Nr. 288I) überimpft
and 48 Stunden bei 3O0C gezüchtet. Die erhaltene Anzuchtlösung
wird zentrifugiert, um daraus Mikroorganismenzellen abzutrennen. Die abgetrennten Zellen werden in einer 0,1-m Phosphatpufferlösung
vom pH 7jO suspendiert und wiederum zentrifugiert, um die
Zellen zu waschen. Diese 0,1-m Phosphatpufferlösung vom pH 7>0 wird erhalten durch Verdünnen mit Wasser auf das Doppelte des
ursprünglichen Volumens eines Gemisches von einer wässrigen 0,2-m Mononatriuin-dihydrogen-phosphat-Lösung mit einer wässrigen 0,2-m
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Dinatrium-monohydrogen-phosphat-Lösung mit einem Volumenverhältnis
von 39:61.
Zu 1 Teil der Zeil-Suspension mit einem Gehalt von 1,5 % Zellen
werden 6 Teile einer 0,1-m Phosphatpufferlösung vom pH 8,0,
0,75 Teile Acrylsäureamid, 0,01» Teile N,N'-Methylen-di-(acrylsäureamid),
0,5 Teile einer wässrigen 2,5prozentigen Kaliumpersulfatlösung und 0,5 Teile einer wässrigen 5prozentigen ß-Dimethylamino-pi-opionitril-Lösung
zugegeben. Man lässt die Lösung 30 Minuten bei 300C polymerisieren. Das danach erhaltene Polymergel
wird zerkleinert. Ein Teil der zerkleinerten Gelteilchen, die einen Teilchendurchmesser aufweisen, der durch Siebe von 60 bis
20 Maschen geht und die 90 Gewichtsprozent des gesamten Gels
ausmachen, werden mit O^l-m Phosphatpufferlösung vom pH 8,0
gewaschen. Man erhält 9 Teile eines Gels mit darin eingeschlossenen
Mikroorganismen.
9 Teile dieses Gels mit den eingeschlossenen Mikroorganismen
werden mit 10 Teilen einer- wässrigen 2prozentigen Lösung des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure vermischt und unter
Rühren zwei Stunden bei 30°C gehalten, damit die Mikroorganismen auf das Salz einwirken können. Am Ende dieser Reaktion wird das
enzymatische Reaktionsgemisch filtriert, um das Gel mit den
eingeschlossenen Mikroorgansimen abzutrennen. Das Piltrat wird hinsichtlich der Drehung untersucht, um die Menge des sich bei
der Reaktion gebildeten Dinatrium-L(+)-tartrats zu bestimmen.
Zu Vergleichszwecken wird 1 Teil der gleichen zuvor beschriebenen
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Zellsuspension mit 10 Teilen einer wässrigen 2prozentigen Lösung des D!natriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure vom pH 8,0
zwei Stunden bei 30 C gerührt, um eine Reaktion zu bewirken. Am Ende dieser Reaktion wird das Reaktionsgemisch wie zuvor beschrieben
untersucht, um die Menge des im Anschluss an die Reaktion gebildeten Dinatrium-L(+)-tartrats zu bestimmen.
Aus den vorstehend erhaltenen Ergebnissen ist ersichtlich, dass die Aktivitätsausbeute des Gels mit den eingeschlossenen Mikroorganismen
Ik % beträgt. Die vorstehend erwähnte Aktivitätsausbeute wird nachstehend wie folgt definiert:
Menge des durch das Gel mit den eingeschlossenen Mikroorganismen gebildeten
Aktivitäts- _ Dinatrium-L(+)-tartrats v
% ~ ~~-~ ———————————— X
, * Menge des durch den gleichen, jedoch
nicht in einem Gel eingeschlossenen Mikroorganismus gebildeten Dinatrium-L(+)-tartrats
Zu 20 Teilen einer nach dem Verfahren des Beispiels kj>
erhaltenen" Zellsuspension werden 3,75 Teile Acrylsäureamid, 0,2 Teile N,N'-Methylen-di-(acrylsäureamid), 2,5 Teile einer
wässrigen 2,5prozentigen Kaliumpersulfatlösung, 2,5 Teile einer wässrigen 5prozentigen ß-Dimethylamino-propionitril-Lösung und
15 Teile einer 0,1-m Phosphatpufferlösung vom pH 8,0 gegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur polymerisieren gelassen. Das derart
erzeugte polymer Gel wird zerkleinert. Ein Teil der zerkleinerten Gelteilchen, die Teilchendurchmesser aufweisen, die durch Siebe
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mit 6 bis 20 Maschen fallen, und die 90 % des gesamten Gels ausmachen,
wird mit 0,1-m .Phosphatpufferlösung vom pH 8,0 gewaschen
und liefert 45,6 Teile eines Gels mit darin eingeschlossenen
Mikroorganismen.
Bei 30 C werden 45 »6 Teile dieses Gels mit eingeschlossenen Mikroorganismen
mit 200 Teilen einer wässrigen lprozentigen Lösung des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure vom pH 7,9 verrührt,
um eine Reaktion zu bewirken. Danach wird das Reaktionsgemisch filtriert, um eine enzymatische Reaktionslösung zu erhalten. Die
Umwandlung in das Dinatrium-L(+)-tartrat variiert mit der Reaktionsdauer, wie dies während der vorstehend beschriebenen
Reaktion beobachtet worden ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle Vl] enthalten.
Die Umwandlung in das hierin erwähnte Dinatrium-L( + )-tartrat. wird
nachstehend durch die folgende Formel definiert:
'Anzahl der Mole"des durch die enzymatische
Reaktion gebildeten Dinatrium-
Umwandlung in ^ L( + )-tartrats
Dinatrium-L( + )- =" χ .100
tartrat Anzahl der Mole des in das enzymatische Reaktionssystem eingearbeiteten
Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure
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Tabelle VII
Reaktions- Umwandlung in Dinatrium-
zeit, Std. L(+)-tartrat, %
1 34
2 64
3 87
4 100
5 100
Beispiel 45
Zu 6 Teilen einer in gleicher Weise wie in Beispiel 43 erhaltenen
Zellsuspension werden 4,5 Teile Acrylsäureamid, 0,24
Teile N,N1-Methylen-di-(acrylsäureamid), 3 Teile einer wässrigen
2,5prozentigen Kaliumpersulfatlösung, 3 Teile einer wässrigen
5prozentigen ß-Dimethylamino-propionitril-Lösung und 24 Teile
einer 0,1-m Phosphatpufferlösung vom pH 8,0 gegeben und 30
Minuten bei 300C polymerisieren gelassen. Das danach erhaltene
polymere Gel wird zerkleinert. Ein Teil der zerkleinerten GeI-teilchen,
die hinsichtlich ihres Teilchendurchmesserbereichs durch Siebe von 6 bis 20 Maschen hindurchgehen und 90 % des
gesamten Gels ausmachen, wird mit einer wässrigen O,lprozentigen
cis-Epoxybernsteinsäure-Lösung gewaschen und liefert 4l38 Teile
eines Gels mit darin eingeschlossenen Mikroorganismen.
Eine ummantelte Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm und einer Länge von 1000 mm wird mit 4l,8 Teilen des Gels mit den
eingeschlossenen Mikroorganismen gefüllt. Bei 30 C wird eine
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wässrige 5prozentige Lösung des Dinatriumsalzec der cis-Epoxybernsteinsäure
vom pH 8,1 kontinuierlich durch die Säule mit einer Fliessgeschwindigkeit von 5 Teilen je Stunde durchlaufen
gelassen, um ein Eluat aus der Säule zu erhalten.
Wenn dieses Eluat gaschromatographisch analysiert wird, wird ein
Maximum entsprechend der Weinsäure beobachtet. Andererseits werden 6,5 Teile kristallisiertes Dinatrium-L(+)-tartrat-dihydrat
durch Eindampfen von 100 Teilen des Eluats unter vermindertem Druck bis zur Trockne erhalten(Gesamtausbeute = 99 %). Mit Wasser
werden 10 Teile der Kristalle auf 50 Volumenteile gelöst und dann hinsichtlich der spezifischen Drehung geprüft: £°ΰτ) ~ +27,5°.
Dieses Ergebnis steht in vollständiger Übereinstimmung mit demjenigen, das mit einem auf dem Markt erhältlichen Dinatrium-L(+)-tartrat
von Änalysenreinheit erhalten worden ist. Dies bedeutet, dass die optische Reinheit des Produkts 100 % beträgt.
Eine ummantelte Kolonne von 10 mm Innendurchmesser und 500 mm Länge wird mit 21^,9 Teilen eines Gels mit darin eingeschlossenen
Mikroorganismen gefüllt, das in gleicher Weise gemäss Beispiel H5 erhalten worden ist. Bei 30° C wird eine wässrige 2gewichtsprozentige
Lösung des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure
vom pH 8,0 kontinuierlich durch die Säule mit unterschiedlichen Fliessgeschwindigkeiten durchlaufen gelassen. Die Umwandlung in
Dinatrium-L(+)-tartrat, die Umwandlungsgeschwindigkeit und die
Konzentration im Eluat sind hinsichtlich der Fliessgeschwindigkeit
des Ansatzes verschieden, wie aus Tabelle VIII ersichtlich
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Tabelle VIII
| Fliessge- schwindig- keit, Teile/ Stunde |
Umwandlung | Dinatmum-L (+) -tartrat | Konzentration als Dihydrat im Säuleneluatj %' |
| 2,3 | 92,6 | Umwandlungsgeschwindig keit als Dihydrat, Teile/Stunde |
2,42 |
| 4,6 | 59,9 | 0,0278 | 1,57 |
| 11,9 | 21,1 | 0,0360 | 0,55 |
| 21,2 | 15,3 | 0,0328 | 0,40 |
| 31,8 | 11,2 | 0,0424 | 0,29 |
| 0,0465 | |||
Eine ummantelte Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm und
einer Länge von 500 mm wird mit 18 Teilen eines Gels mit eingeschlossenen
Mikroorganismen gefüllt, wie es in gleicher Weise gemäss Beispiel 44 erhalten worden ist. Eine Substratlösung vom
pH 8,0, die durch· Auflösen von 1,57 Teilen des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure und von 0,01 Teilen Dodecyl-trimethylammonium-Chlorid
in 100 Teilen einer 0,1-m Phosphatlösung vom pH 8,0 erhalten worden ist, wird kontinuierlich 336 Stunden lang
bei 200C durch die Säule laufen gelassen. Die festgelegte Fliessgeschwindigkeit
beträgt 12,5 Teile/Stunde. Während der gesamten Betriebsdauer beträgt die Umwandlung in das Dinatrium-L(+)-tartrat
97,5 %.
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Beispiel 48
Das Verfahren des Beispiels 44 wird wiederholt, jedoch mit der
Ausnahme, dass das Waschen des zerkleinerten Polymerisatgels unte:s
Verwendung einer wässrigen O,lprozentigen Lösung des Dinatriumsalzes
der cis-Epoxybernsteinsäure anstelle der Phosphatpufferlösung erfolgt und dadurch 18 Teile eines Gels mit eingeschlossenen
Mikroorganismen liefert. Eine ummantelte Säule mit einem
Innendurchmesser von 10 mm und einer Länge von 500 mm wird mit
diesem Gel mit eingeschlossenen Mikroorganismen gefüllt. Dann wird kontinuierlich eine wässrige Lösung mit einem Gehalt von
1,72 % des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure und 100
Teile je Million Dodecyl-trimethyl-ammoniumchlorid vom pH 8,0 336 Stunden bei 300C durch die Säule laufen gelassen. Die Fliessgeschwindigkeit
ist auf 11 Teile je Stunde .festgelegt. Während der Gesamtdauer des Betriebs beträgt die Umwandlung in das
Dinatrium-L(+)-tartrat 100 %.
Wenn das Eluat gaschromatographisch analysiert wird, wird ein
Maximum entsprechend der Weinsäure beobachtet. Wenn 100 Teile das Eluats unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft werden,
erhält man 2,2 Teile Dinatrium-L(+)-tartrat-dihydrat in Kristallform (Gesamtausbeute = 99 ^). Die Kristalle besitzen eine optisch*
Reinheit von 100 %.
Beispiel 49
Wenn das Verfahren des Beispiels 43 unter Verwendung von N-Methylol-acrylsäureamid,
Ammoniumpersulfat und N9N,N9,NT-Tetra-
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26Ί6673
methyl-äthylendiamin anstelle von Acrylsäureamid, Kaliumpersulfat
und ß-Dimethylamino-propionitril wiederholt wird, erhält man in
gleicher Weise ein Gel mit darin eingeschlossenen Mikroorganismen. Die Aktivitätsausbeute des Gels mit den eingeschlossenen Mikroorganismen
beträgt 30,9 %.
Das Verfahren des Beispiels 43 wird wiederholt, jedo.ch mit der
Ausnahme, dass die Polymerisationstemperatur von 300C auf 200C
oder 40 C geändert wird, um ein Gel mit eingeschlossenen Mikroorganismen
herzustellen. Die Aktivitätsausbeute des derart erhaltenen Gels mit eingeschlossenen Mikroorganismen ist in Tabelle IX
angegeben.
Polymerisations- Aktivitätsausbeute, temperatur, C %
20 56,7
40 59,7
Das Verfahren des Beispiels 48 wird wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, dass die Verwendung von Dodecyl-trimethyl-ammoniumchlorid
weggelassen wird. Die Arbeitsweise wird eine lange Zeit fortgesetzt, um Dinatrium-L(+)-tartrat zu erzeugen. Die Umwandlung
in Dinatrium-L(+)-tartrat ändert sich mit der Betriebsweise und dem Aussehen des Eluats, wie aus Tabelle X ersichtlich ist.
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Nach 72 Betriebsstunden beginnt die Umwandlung allmählich abzunehmen.
Nach Verlauf von 144 Bet.riebsstunden wird das Eluat schwach trübe, was auf sine Vermehrung von Premdmikroorganismen hindeutet.
Da keine Aussicht besteht, länger hochreines Dinatrium-L(+)-tartrat
zu erhalten, wird der Versuch nach insgesamt 192 Betriebsstunden abgebrochen. Das Dinatrium-L(+)-dihydrat, das nach dem Verfahren
des Beispiels k5 aus dem nach KB Stunden ununterbrochenen Betriebs
gesammelten Eluat erhalten worden ist, weist eine optische Reinheit
von 100 % auf.
Betriebsdauer, Std,
Umwandlung in Dinatrium- L(+)-tartrat, %
"Aussehen des Säuleneluats
72
96
120
168
I92
I92
100 100 96 88 76 61 44 25
klar
schwach trübe
Das Verfahren von Beispiel 43 wird wiederholt, jedoch mit der
Ausnahme, dass die Menge der 0,1-m Phosphatpufferlösung vom pH 8,0
während der Polymerisation von 6 Teilen auf 4 Teile geändert wird.
Dann werden 7 Teile des danach erhaltenen Gels mit eingeschlossenen
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Mikroorganismen mit 10 Teilen einer wässrigen 2prozentigen Lösung des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure vom pH 8,0 vermischt
und bei unterschiedlichen Temperaturen 2 Stunden lang gerührt, um die Reaktion zur Erzeugung von Dinatrium-L(+)-tartrat
zu bewirken. Die relative Umwandlung in Dinatrium-L(+)-tartrat bei unterschiedlichen Temperaturen der enzymatischen Reaktion ist
in Tabelle XI angegeben. Die aus Tabelle XI ersichtliche relative Umwandlung in Dinatrium-L(+)-tartrat wird durch die folgende
Gleichung definiert:
relative Umwandlung =
Umwandlung in Dinatrium-L(+)-tartrat bei gegebener Temperatur
Umwandlung in Dinatrium-L(+)-tartrat bei 35°C
χ 100
Tabelle XI
Reaktionstemperatur, C
relative Umwandlung in Dinatrium-L(+)-tartrat
| 20 | Kl |
| 30 V | 76 |
| 35 | 100 |
| 40 | 82 |
| 50 | 36 |
Beispiel 53 Jeweils 7 Teile eines Gels mit eingeschlossenen Mikroorganismen,
das nach dem Verfahren des Beispiels 47 erhalten worden ist,
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werden mit Lösungen versetzt, die durch Auflösen von 0,2 Teilen des
Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure in 10 Teilen einer 0,1-m Fhosphatpufferlösung vcn unterschiedlichen pH-Werten erhalten
worden ist. Die Lösungen werden zwei Stunden bei 30 C gerührt,
um die Reaktion zu bewirken und Dinatrium-L(+)-tartrat zu bilden*
In diesem Falle werden die 0,1-m Phosphatpufferlösungen vom pH 6,0,
vom pH 7,2 und vom pH 9,0 durch Verdünnen mit Wasser auf das Doppelte des ursprünglichen Volumens eines Lösungsgemisches aus
einer wässrigen 0,2-m Mononatrium-dihydrogen-phosphatlösung und
einer wässrigen 0,2-m Dinatrium-monohydrogen-phosphat-Lösung von Volumenverhältnissen von 877/123, 28/72 und56/944 erhalten. Die
Beziehung zwischen dem pH-Wert der verwendeten Pufferlösung und der relativen Umwandlung, in Dinatrium-L(+)-tartr"at, wie es bei
diesem Beispiel beobachtet wird, ist in Tabelle XII zu sehen. Die relative Umwandlung in die in Tabelle XII angegebene L(+)-Weinsäure
wird durch die folgende Formel ausgedrückt:
Umwandlung in Dinatrium-L(+)-
tartrat bei gegebenem pH-Wert relative Umwandlung in _ inn
Dinatrium-L(t)-tartrat Umwandlung in Dinatrium-L(+)-
tartrat bei pH 7,2
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Tabelle XII
| pH-Wert der Pufferlösung |
relative Umwandlung in Dinatrium-L(+)-tartrat |
| 6»0 | 33 |
| 7,2 | 100 |
| 8,0 | 90 |
| 9,0 | 55 |
Beispiel 54
Eine ummantelte Säule mit Innendurchmesser von 10 mm und einer Länge von 500 mm wird mit 18 Teilen eines Gels mit eingeschlossenen
Mikroorganismen gefüllt, das nach dem Verfahren des Beispiels erhalten worden ist. Eine Substratlösung vom pH .8,0, die durch
Auflösen von 1,8 Teilen des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure und 0,01 Teilen von Dodecyl-trimethyl-ammoniumehlorid
in 100 Teilen einer 0,05-m Phosphatpufferlösung vom pH 8,0 erhalten worden ist, wird kontinuierlich 336 Stunden bei 300C durch die
Säule laufen gelassen. Die Fliessgeschwindigkeit ist mit 10 Teilen
je Stunde festgelegt. Während der gesamten Betriebsdauer beträgt die Umwandlung in das Dinatrium-L(+)-tartrat 100 %.
Drei ummantelte Kolonnen mit einem Innendurchmesser von 10 mm und einer Länge von 1000 mm werden jeweils mit 36 Teilen eines Gels
mit eingeschlossenen Mikroorganismen gefüllt, das nach dem Verfahren des Beispiels 44 erhalten worden ist. Dann werden die
Lösung "A" vom pH 8,0, die durch Auflösen von 10 Teilen des Dinatriumsalzes
der cis-Epoxybernsteinsäure und 0,01 Teilen Dodecyl-
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trimethyl-ammoniumchlorid in 100 Teilen Wasser hergestellt worden
ist, die Lösung "B" vom pH 8,0, die durch Auflösen des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure und 0,01 Teilen Dodecyltrimethyl-ainmoniumchlorid
in 100 Teilen einer 0,025-m Phosphatpufferlösung vom pH 8,0 erhalten worden ist, und die Lösung "C"
vom pH 8,0, die durch Auflösen von 10 Teilen des Dinatriumsalzes der cis-Epoxybernsteinsäure und 0,01 Teilen Dodecyl-trimethylammoniumchlorid
in 100 Teilen einer 0,025-m tris-Pufferlösung vom pH 8,0 erhalten worden ist, kontinuierlich als Substrat lösungen
durch diese Säulen bei 300C laufen gelassen, wobei die Fliessgeschwindigkeit
auf 6 Teile je Stunde festgelegt worden ist.
Es werden jeweils 1 kg des Eluats aufgenommen und, während es unter Rühren bei Normaltemperatur gehalten wird, mit einer
wässrigen 20prozentigen Calciumchloridlosung tropfenweise versetzt,
bis sich kein weiterer Niederschlag mehr bildet. Dann wird das Rühren weitere zwei Stunden fortgesetzt. Das derart
erhaltene Gemisch wird 20 Minuten zentrifugiert, um den Niederschlag
abzutrennen. Der derart erhaltene Niederschlag wird in 150 ml Wasser dispergiert. Die Dispersion wird 20 Minuten zentrifugiert.
Die erhaltene überstehende Lösung wird verworfen. Die Waschbehandlung wird zweimal wiederholt. Der gereinigte Niederschlag
wird in 50 ml Wasser dispergiert, und, während er bei
20 C unter Rühren erhalten wird, tropfenweise mit konzentrierter Schwefelsäure versetzt, bis der pH-Wert 1,8 beträgt. Das erhaltene
Gemisch wird 20 Minuten zentrifugiert. Man erhält eine
überstehende Lösung, die eingedampft wird. Danach erhält man kristalline L(+)-Weinsäure. Die Ergebnisse sind in Tabelle XIII
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?61 6673
enthalten.
Tabelle XIII
| Substrat | Ausbeute, | L(+)-Weins äure | , Verunreinigungen, % | Stickstoffgehalt |
| lösung | % | Reinheit | Phosphationen | unter 0,00001 unter 0,00001 0,0003 |
| 94,0 93,5 93,7 |
% | unter 0,00001 0,68 unter 0,00001 |
||
| - iiAit "B" "C" |
99,7 98,9 99,6 |
|||
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Claims (23)
1.' Verfahren zur Herstellung von L( + )-Weinsäure und deren Salzen,
dadurch gekennzeichnet, dass man auf cis-Epoxybernsteinsäure
oder deren Salze unter Hydrolyse und Aufspaltung der Epoxygruppe ein Enzym einwirken lässt und anschliessend
die erzeugte L(+)-Weinsäure oder deren Salze isoliert
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Enzym verwendet, das aus einem Mikroorganismus erhalten wird,
der zur Gattung Acetobacter oder zur Gattung Corynebacterium gehört und die Fähigkeit besitzt, die Hydrolyse .und Ringaufspaltung
der Epoxygruppe der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salzen durchzuführen.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man
ein Enzym von einem Mikroorganismus verwendet, der zur Gattung Acetobacter gehört, wobei das Enzym von Acetobacter curtus Nr. 4,
Acetobacter curtus Nr. 10 oder Acetobacter curtus Nr. 21 stammt.
M. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man
ein Enzym von einem Mikroorganismus verwendet, der zur Gattung Corynebacterium gehört, wobei das Enzym von Corynebacterium S-13
stammt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Salz der cis-Epoxybernsteinsäure das Dinatriumsalz, das Di-
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kaliumsalz, das Natrium-kaliumsalz, das Calciumsalz, das Natriumcalciumsalz,
das Magnesiumsalz, das Eisensalz, das Aluminiumsalz, das Zinksalz, das Mangansalz, das Ammoniumsalz, das Natriumammoniums
als, das Methylaminsalz oder das Triäthylaminsalz verwendet .
6. Verfahren nach Anspruch I9 dadurch gekennzeichnet, das? man
das Enzym, das die Hydrolyse und die Ringspaltung der Epoxygr-uppe der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze bewirkt, auf die
cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze bei pH 4 bis 10 einwirken
lässt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man
das Enzym, das die Hydrolyse und die Ringspaltung der Epoxygruppe der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze bewirkt, auf die
cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze bei Temperaturen von nicht über 65 C einwirken lässt.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Enzym, das die Hydrolyse und Ringspaltung der Epoxygruppe
lor cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze bewirkt,
ein solches verwendet, das man durch Züchten eines MikroorganismuSj
der cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze assimilieren kann, in einem Medium mit einem Gehalt an Weinsäure oder deren Salzen
erhalten und aus der Anzuchtflüssigkeit ein Enzym isolieren kann, das die Hydrolyse und Ringspaltung der Epoxygruppe der cis-Epoxybernsteinsäure
oder deren Salze bewirkt-
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9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch 'gekennzeichnet, dass man als
Salze der Weinsäure Alkalimetallsalze, Erdalkalimetallsalze, Ammoniumsalze oder Aminsalze verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Anzuchtmedium mit einer Konzentration an Weinsäure oder
deren Salzen im Bereich von 0,1 bis 10 Gewichtsprozent verwendet .
11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Mikroorganismen, die die cis-Epoxybernsteinsäure oder deren
Salze assimilieren, bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 35°C züchtet.
12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Mikroorganismen, die die cis-Epoxybernsteinsäure oder deren
Salze assimilieren, bei pH-Werten von 4,5 bis 7»5 züchtet.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Enzym verwendet, das von Mikroorganismen stammt, die in
einem Gel eingeschlossen sind, welch letzteres durch Polymerisieren eines Acrylsäureamids in Gegenwart oder in Abwesenheit
von Polymerisationsbeschleunigern und/oder Polymerisationsinitiatoren in einem Reaktionsmedium mit einem Gehalt an den
Mikroorganismen erhalten wird, die mittels eines Enzyms, das die Hydrolyse und die Ringspaltung der Epoxygruppe der cis-Epoxybernsteinsäure
oder deren Salzen bewirken kann, L(+)-Weinsäure oder deren Salze erzeugen.
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14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man
die Mikroorganismen, die die L(+)-Weinsäure erzeugen können, in dem Polyirerisationsgeriisch in einer Konzentration im Bereich von
OjOl bis 50 Gewichtsprozent verwendet.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man als Acrylsäureamide N,N'-Niederalkylen-di-(acrylsäureamide),
N-Hydroxyalkyl-acrylsäureanride, N-Alkyl-acrylsäureamide oder
Di-(acrylsäureamid)-dialkyläther verwendet.
16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man die Acrylsäureamide in dem Polymerisationsgemisch in einer
Konzentration im Bereich von 1 bis 30 Gewichtsprozent verwendet.
17. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man als Polymerisationsinitiator Ammoniumpersulfat, Natriumpersulfat,
Kaliumpersulfat, Peroxyameisensäure oder Peroxyessigsäure verwendet.
18. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man als Polymerisationsbeschleuniger ß-Dimethylaminopropionitril
oder N,N,Nf,Nf-Tetramethyl-äthylendiamin verwendet.
19. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Polymerisation eine grenzflächenaktive Verbindung
als antibakterielles Mittel mitverwendet.
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" 77 " 7616673
20. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man die Polymerisation bei einer Temperatur von nicht über 70"C
durchführt.
21. Verfahren nach Anspruch.13» dadurch gekennzeichnet, dass
man die Polymerisation bei pH-Werten von H bis 10 durchführt.
22. Verfahren nach Anspruch 13S dadurch gekennzeichnet, dass man
das Gel mit den darin eingeschlossenen Mikroorganismen in Form einer Packungsschicht, vorzugsweise in einer Säule, verwendet.
23. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die enzymatische Reaktion bei Temperaturen von nicht über 700C
bei pH-Werten von 1J bis 10 mittels Enzymen durchführt, die von
Organismen stammen, die in einem Gel eingeschlossen sind, wobei das Enzym die Hydrolyse und die Ringspaltung der Epoxygruppe der
cis-Epoxybernsteinsäure oder deren Salze bewirkt.
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|---|---|---|---|
| JP50046030A JPS51121593A (en) | 1975-04-16 | 1975-04-16 | Process for preparing l(+)-tartaric acid or its salts |
| JP50149394A JPS5272878A (en) | 1975-12-15 | 1975-12-15 | Preparation of cis-epoxy succinic acid hydrolase |
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| DE19762616673 Expired DE2616673C2 (de) | 1975-04-16 | 1976-04-15 | Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von L(+)-Weinsäure und deren Salzen |
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| GB (1) | GB1525665A (de) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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1976
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Non-Patent Citations (1)
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Also Published As
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