DE2718281C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von L-Valin durch Züchten eines Mikroorganismus in einem Nährmedium unter aeroben Bedingungen und Gewinnen des gebildeten L-Valins aus der Kulturbrühe.

L-Valin ist eine für Mensch und Tier unentbehrliche Aminosäure, die deshalb in breitem Umfang zur Anreicherung von Nahrungsmitteln sowie in human- und veterinärmedizinischen Arzneimitteln eingesetzt werden kann. Für eine weitere Anwendung des L-Valins bedarf es aber einer Gewinnungsmöglichkeit mit geringem Aufwand und mit einem annehmbaren Reinheitsgrad.

Unter verschiedenen bekannten Verfahren der eingangs genannten Art zur Gewinnung von L-Valin durch Gärung wurden die besten Ergebnisse bisher mit Mutationsstämmen von Brevibacterium und Corynebacterium, die gegenüber Isoleuzin eine gewisse Auxotrophie aufweisen, erzielt. Kürzlich hat Ajinomoto ein Verfahren zur Bio-Gewinnung von L-Valin mit Hilfe von Mutationsstämmen von Brevibacterium und Corynebacterium beschrieben, die sich hauptsächlich dadurch auszeichnen, daß sie gegenüber Thiazolalanin widerstandsfähig sind. Die dabei erzielten Mengen an L-Valin sind allerdings gering und oftmals wird dabei das L-Valin in Anwesenheit von bedeutenden Mengen an weiteren Aminosäuren, beispielsweise L-Threonin gewonnen, so daß aufwendige Extraktions- und Reinigungsvorgänge erforderlich sind.

Der Erfindung liegt dei Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Art anzugeben, das eine gesteigerte Ausbeute an L-Valin bei einem gleichzeitig guten Reinheitsgrad liefert.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß man als Mikroorganismus den Stamm Corynebacterium glutamicum FERM-P 4035 züchtet.

Der im Rahmen der Erfindung eingesetzte Stamm Corynebacterium glutamicum FERM-P 4035 (nachfolgend auch "I-026" genannt) zeichnet sich dadurch aus, daß sein Wachstum durch eine Kombination von Cystein und L-Threonin oder von Cystein und L-Valin eine Hemmung erfährt. Der Stamm wird durch herkömmliche Mutationsvorgänge mit Hilfe von bekannten mutagenen Agenzien, ausgehend von L-Glutaminsäure liefernden Stämmen, erhalten. Unter dieser kombinierten Hemmung ist zu verstehen, daß der Mutationsstamm in Anwesenheit von Cystein und L-Valin oder von Cystein und L-Threonin praktisch kein Wachstum aufweist, während eine einzige Komponente, beispielsweise Cystein oder L-Valin oder L-Threonin auf das Wachstum des Stammes nur einen geringen hemmenden Einfluß hat, der anteilig dem auf den Mutterstamm ausgeübten Einfluß entspricht. Diese kombinierte Hemmung ist nachstehend in Verbindung mit dem Beispiel 1 näher erläutert.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß man als Stickstoffquelle Ammoniumazetat in einer Menge von mindestens 25 g je Liter Medium einsetzt. Hierdurch wird die Gewinnung des L-Valins sehr günstig im Sinne einer großen Ausbeute beeinflußt. Dieser günstige Einfluß ist nachstehend durch das Beispiel 3 dargelegt. Das Ammoniumazetat kann entweder allein oder in Verbindung mit anderen herkömmlichen Stickstoffquellen, wie beispielsweise anderen Ammoniumsalzen, Harnstoff, Melassen der Zuckerindustrie, Maismazerationslauge, Peptonen, Hefeextrakten, Fleischextrakten, verschiedenen Hydrolysaten oder dergleichen eingesetzt werden.

Der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Stamm Corynebacterium glutamicum wurde am 21. April 1977 unter der Nummer P 4035 beim Fermentation Research Institute, Agenency of Industrial Science and Technology, Japan hinterlegt.

Die Eigenschaften des Stammes I-026 sind in der Anlage Nr. 1 im Vergleich zu den Eigenschaften des Glutaminsäure liefernden Grundstammes angegeben. Ein kennzeichnender Unterschied zwischen den zwei Stämmen besteht darin, daß sie in dem Voges-Proskauer-Test verschiedene Ergebnisse geben.

Man kann als Kohlenstoffquelle Kohlenstoffhydrate, Glukose, Fruktose, Mannose, Galaktose, Rohrzucker, Melassen oder dergl. entweder allein oder in Verbindung einsetzen.

Die zugesetzten mineralischen Bestandteile umfassen die unentbehrlichen mineralischen Salze, wie z. B. Magnesiumsulfat, Monokaliumphosphat, Dikaliumphosphat, Eisensulfat, oder andere gewöhnlich verwendete Salze, wie z. B. Mangan, Kalzium oder dgl.

Insbesondere wenn das Kulturmedium ausschließlich synthetisch ist, müssen ebenfalls Vitamine zugesetzt werden.

Die Gärung wird unter den normalen Aerobenbedingungen z. B. durch Umrühren mit Einführung von steriler Luft, bei einer Temperatur von 25°-37°C, vorzugsweise 25°-33°C durchgeführt. Der pH-Wert wird zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 7 und 8,5 aufrecht­ erhalten. Im Laufe der Entwicklung der Kultur neigt der pH-Wert dazu, sich zu verringern und wird z. B. durch einen Zusatz von Salmiak richtig eingestellt.

Die Kultur wird im allgemeinen während zwei bis fünf Tagen fortgesetzt. Während dieser Zeit sammelt sich in der Gärbrühe eine wesentliche Menge von L-Valin. Man kann ebenfalls andere Aminosäuren finden, die im Vergleich zu der gewonnenen Menge von L-Valin aber vernachlässigt werden können.

Beispiel 1

Die Wachstumsvergleichteste des Mutterstammes und des Mutationsstammes I-026 werden in einem Probierröhrchen, das 5 ml Medium enthält, durchgeführt. Für die Aussaat dient eine Suspension des Stammes, die einmal in einer salzigen Lösung gespült wird.

Man kultiviert 24 Std. bei einer Temperatur von 30°C auf einem drehenden Rührwerk. Die optischen Dichten werden nach 1/10tel Verdünnung bei 650 nm auf einem Spektralphotometer (UV 24 - Wanne von 10 mm) abgelesen.

Zusammensetzung der minimalen Medien

Zinksulfat  8,8 g Eisenchlorid970 mg Kupfersulfat393 mg Natriumborat 88 mg Manganchlorid 72 mg Ammoniummolybdat 37 mg Wasser  1 l.

Ergebnisse des Wachstumsvergleichstestes

Beispiel 2 Gewinnung von L-Valin im Labor Eingesetzte Kohlenstoffquelle: Zuckermelasse

Der Stamm I-026, der in einem Nähr-Agar in einem geneigten Röhrchen während 24 Std. bei 30°C gezüchtet wird, wird in diesem Fall eingesetzt. Nach Ablauf der Inkubationszeit wird folgende Vorkultur durchgeführt:
Melasse30 g Zucker entsprechend Ammoniumsulfat5 g Dikaliumphosphat1 g Magnesiumsulfat0,25 g Biotin10 µg Thiamin100 µg Wasser1000 ml eingesetztes Volumen50 ml in einem Erlenmeyer-Kolben von 500 ml Inhalt pH vor der Sterilisierung7 Sterilisierung20 Min. pH nach der Sterilisierung6,7

Nach einer Inkubationszeit von 8 Std. bei 30°C auf einem Rührwerk mit einer Drehgeschwindigkeit von 200 U/Min. wird das folgende Gewinnungsmedium beimpft: (Aussaatrate 6%)

Melasse90 g Zucker entsprechend Ammoniumazetat30 g Ammoniumphosphat0,5 g Dikaliumphosphat0,5 g Magnesiumsulfat0,25 g Mangansulfat0,010 g Eisensulfat0,010 g Biotin30 µg Thiamin100µg Kalziumkarbonat30 g Milchsäure5 g Wasser1000 ml Eingesetztes Volumen20 ml in einem Erlenmeyer-Kolben von 500 ml Inhalt pH vor der Sterilisierung7,5 Sterilisierung20 Min. pH nach der Sterilisierung7,2

Nach einer Gärzeit von 72 Stunden auf einem Rührwerk mit einer Drehgeschwindigkeit von 200 U/Min. bei einer Temperatur von 30°C wurden 18,5 g L-Valin je Liter erzielt.

Beispiel 3 Einfluß der eingesetzten N-Quelle auf die Gewinnung von L-Valin

In diesem Fall dient auch der Stamm I-026. Bis zur Vorkultur wird wie im Beispiel 2 vorgegangen. Bezüglich der Phase der Gewinnung dienen die im Beispiel 2 erwähnten Bedingungen, wobei das eingesetzte Medium mit Ausnahme der Stickstoffquelle, deren Einfluß auf die Gewinnung bzw. Erzeugung von L-Valin untersucht wird, identisch ist.

Die nach einer Gärungszeit von 72 Stunden erzielten Mengen von L-Valin sind in Abhängigkeit von der eingesetzten Stickstoffquelle in der folgenden Tabelle angegeben.

Beispiel 4

Die Versuchsbedingungen sind jenen des Beispiels Nr. 2 ähnlich. Jedoch wird in diesem Fall als Stickstoffquelle eine Mischung von Ammoniumsalzen, und zwar von Ammoniumazetat und Ammoniumsulfat eingesetzt.

In der folgenden Tabelle sind die Mengen von L-Valin, die in Abhängigkeit von den jeweiligen eingesetzten Azetat- und Sulfatmengen erzielt werden, angegeben, wobei der Ammoniumgehalt konstant bleibt.

Beispiel 5

Bis zur Vorkultur sind die Versuchsbedingungen den Bedingungen des Beispiels 2 ähnlich. Die Gewinnung wird ebenfalls wie im Beispiel 2 jedoch mit einem Medium mit folgender Zusammensetzung durchgeführt:
Saccharose90 g Sprühgetrocknete Maismazerationslauge10 g Ammoniumazetat30g Monokaliumphosphat0,5 g Dikaliumphosphat0,5 g Magnesiumsulfat0,25 g Mangansulfat0,010 g Eisensulfat0,010 g Biotin30 µg Thiamin100 µg Kalziumcarbonat30 g Milchsäure5 g Wasser1000 ml

Nach 72 Stunden wurden 13 L-Valin g/l erzielt.

Beispiel 6 Halbindustrielle Produktion von L-Valin 1. Vorbereitung der Ausgangskultur

Der Stamm I-026 wird in einem geneigten Probierröhrchen während 24 Stunden bei einer Temperatur von 30°C in einem Nähr-Agar gezüchtet. In einem Membran-Erlenmeyer-Kolben mit einem Inhaltsvermögen von 6 Litern werden mit Hilfe von 2 Agar-Agar-Röhrchen 1,5 l eines Mediums, das die folgende Zusammensetzung aufweist, beimpft:

Für einen Liter enthärtetes Wasser:

Melasse (in Zuckergehalt angegeben)30 g Ammoniumsulfat5 g Dikaliumphosphat1 g Magnesiumsulfat0,25 Biotin10 µg Thiamin-Chlorhydrat100 µg Hefeextrakt3 g

Die Bebrütungszeit beträgt 18 Stunden bei einer Temperatur von 30°C auf einem drehenden Rührwerk.

2. Vorkultur

In einem Bottich mit einem Inhaltsvermögen von 10 l, der 4 l enthärtetes Wasser enthält, werden die folgenden Bestandteile gelöst bzw. suspendiert:

Für einen Liter enthärtetes Wasser:

Melasse (in Zuckergehalt angegeben)30 g Ammoniumsulfat5 g Magnesiumsulfat0,25 Dikaliumphosphat1 g Biotin30 µg Thiamin-Chlorhydrat0,1 mg Silikone0,5 g

In einem Dampfsterilisiergerät wird das Medium während 30 Minuten bei einer Temperatur von 125°C sterilisiert. Der pH-Wert nach der Sterilisierung beträgt 5,70 und wird auf 7,80 mit Hilfe von Salmiaksalz eingestellt. Dann werden die 4 l enthärteten Wassers mit 320 ml der Ausgangskultur beimpft. Der pH-Wert beträgt zu diesem Zeitpunkt 7. Man läßt dann etwa 14 Stunden unter ständigem Rühren mit einer Drehgeschwindigkeit von 600 Umdrehungen/Minute und unter Belüftung gären. Am Ende der Inkubationszeit errreicht der pH-Wert 5,40.

3. Gewinnung

Das Gewinnungsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Für einen Liter enthärteten Wassers:

Melasse (in Zuckergehalt angegeben)90 g Ammoniumazetat30 g Magnesiumsulfat0,25 Mangansulfat0,01 g Eisensulfat0,01 g Biotin30 µg Thiamin100 µg Dikaliumphosphat0,5 g Monokaliumphosphat0,5 g

Bei dieser Stufe des Versuches wird ein kleines Gärgerät mit einem Inhaltsvermögen von 14 l eingesetzt. Die entsprechenden Bestandteile werden in 7 l Wasser verdünnt und der pH-Wert beträgt dann 7,20. Die Sterilisierung in einem Dampfsterilisiergerät wird während 30 Min. bei einer Temperatur von 123°C durchgeführt, wobei der pH-Wert nach der Sterilisierung 6,75 beträgt. Die 7 l Medium werden mit 700 ml der Vorkultur beimpft. Dann steigt der pH-Wert wieder auf 7,30. Man läßt während 64 Stunden bei 30°C gären. Die Rührgeschwindigkeit beträgt 600 Umdrehungen/Minute. Der pH-Wert erhöht sich spontan von 7,30 auf 8 und wird auf den letztgenannten Wert dauerhaft eingestellt. Im Laufe der Inkubationszeit wird die Melasse zugegeben, damit ein restlicher Gehalt an Zucker von 3% aufrechterhalten wird. Der Zuzsatz an Melasse wird dann unterbrochen, damit der restliche Zuckergehalt am Ende der Gärungsphase geringer als 1% ist. Ein Mittel zur Verhinderung der Schaumbildung auf der Basis von Silikonen wird in erforderlicher Menge zugesetzt.

Nach 64 Stunden erzielt man 373 g L-Valin, das heißt 36,4 g L-Valin je Boillonliter. Die erzielte Zuckerausbeute beträgt etwa 19%. Die Anwesenheit von geringen Mengen an Leuzin und Isoleuzin, und zwar 3,76 g des Gemisches je Bouillonliter, wobei 50% dieser Menge auf die Zuckermelasse zurückzuführen ist, kann festgestellt werden.

Anlage Nr. 1

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung von L-Valin durch Züchten eines Mikroorganismus in einem Nährmedium unter aeroben Bedingungen und Gewinnen des gebildeten L-Valins aus der Kulturbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den Stamm Corynebacterium glutamicum FERM-P 4035 züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Stickstoffquelle Ammoniumazetat in einer Menge von mindestens 25 g je Liter Medium einsetzt.