DE2329808A1

DE2329808A1 - Verfahren zur herstellung eines polysaccharides des alginat-typs

Info

Publication number: DE2329808A1
Application number: DE2329808A
Authority: DE
Inventors: Frazer Keith Elliott Imrie
Original assignee: Tate and Lyle PLC
Current assignee: Tate and Lyle PLC
Priority date: 1973-05-29
Filing date: 1973-06-12
Publication date: 1975-01-09
Also published as: DE2329808C3; US3856625A; CH591559A5; NL7308158A; DE2329808B2; FR2233397B1; FR2233397A1; JPS49102891A; JPS537519B2; BE800878A; CA986444A

Description

'Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharides des Alginat-Typs'

Anmelderin: Täte & LyIe Limited, London

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharides des Alginat-Typs durch Kultivierung von Bakterien der Spezies Azotobacter vinelandii.

Alginsäure, eine hydrophile colloidale Kohlenwasserstoffsäure, ist ein variables Blockcopolymeres, welches sich aus D-Mannuronsäure- und L-Guluronsäureeinheiten zusammensetzt. Obgleich Alginsäure selbst in Wasser praktisch unlöslich ist, so läßt sie sich doch leicht durch Neutralisation mit einem geeigneten Alkali löslich machen. Eine der ganz besonderen Eigenschaften von Alginatlösungen ist ihre hohe Viskosität bei sehr niedrigen Konzentrationen; wenn solchen Lösungen von Alginaten gewisse zweiwertige Ionen, beispielsweise Kalzium oder Magnesium hinzugefügt werden, wird eine Gelierung herbeigeführt. Die einzigartige physikalische Eigenschaft der Alginsäure und der Alginate gibt diesen Substanzen eine große Bedeutung zur industriellen Verwendung für Emulgatoren, Stabilisatoren und Verdickern. So ist z.B. in der Nahrungsmittelindustrie die weitverbreitete Anwendung als Emulsionsstabilisator für Eiscreme bekannt, weitere Anwendungen finden sich als Gelierungsmittel für Milchpudding und für Verdicker bei Saucen und auch als Schaumstabilisator für Bier; bei pharmazeutischen Präparaten können diese Substanzen auch als Emulgatoren und Verdicker\bei ärztlichen Seifen und Lotion verwendet werden, als Verteilungs- und Granulierungshilfsmittel bei der Tablettenherstellung, als Suspendierhilfsmittel für Salben und als absorbierbare Gele für medizinische Zubereitungen; in der Papier- und

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Textilverarbeitung können diese Substanzen verwendet werden als Beschichtungsmittel, als Finishing-Mittel, ebenso auch in Farbstoffen und in Druckpräparaten; in der Landwirtschaft können sie als Bodenverbesserungsmittel eingesetzt werden.

Bisher sind Alginsäure und die Alginate in industriellem Ausmaß nur durch Extraktion aus bestimmten Arten von Braunalgen, beispielsweise Laminar!a digitataund Ascophyllum nodosum gewonnen worden, bei denen sie einen großen Anteil der Zellwandsubstanz ausmachen. Der industrielle Herstellungsprozeß besteht darin, daß feuchte oder auch getrocknete Algen zunächst vermählen und gewaschen werden und dann zur Herstellung eines rohen Natriumalginate einer Behandlung mit Natriumcarbonat unterworfen werden. Kalziumchloridlösung wird anschließend zugesetzt und das ausgefällte Kalziumalginat mit Säure behandelt, um die Kalziumionen zu entfernen. Eine angenähert äguimolare Menge von Nariumcarbonat wird in festem Zustand hinzugefügt und die halbfeste Masse pulverisiert, bis eine Paste aus Natriumalginat gewonnen ist. Schließlich wird die Paste getrocknet und vermählen, um ein gepulvertes Produkt zu erhalten. Dieser Prozeß ist verhältnismäßig roh und erzeugt ein unreines Produkt; allerdings kann man auch ein reineres Produkt durch eine Alkoholausfällung erzielen. Die scharfen Bedingungen bei der Extraktion und der Weiterbehandlung führen zu Verfärbungen und auch zu Abbau des Produktes. Feste Verunreinigungen wie Zellwandüberbleibsel und sogar Sand werden nicht vollständig entfernt und ein gewisser Geruchsfaktor ist oft vorhanden.

Dieser übliche Herstellungsprozeß leidet unter dem Nachteil, von der Zufuhr des alginathaltigen Algenmaterials als Ausgangsmaterial abhängig zu sein. Die Durchführung ist auch wegen der großen Mengen an zu verarbeitenden Algen unangenehm; eine beträchtliche weitere Reinigungsoperation kann notwendig werden, insbesondere dann, wenn die Verwendung als Nahrungszusatz oder für pharmazeutische Zwecke

beabsichtigt ist. Diese Schwierigkeiten haben dazu geführt, die volle Ausnutzung der Alginate zu begrenzen.

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Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand demgemäß in der Schaffung einer neuen einfachen Herstellungsmethode für Alginate auf industrieller Basis für ein Produkt von guter Reinheit aus billigem und leicht zugänglichem Ausgangsmaterial.

Es ist bereits bekannt, daß verschiedene Spezies von Azotobacter dazu fähig sind, Polysaccharide auf exozellularem Hege zu erzeugen, Insbesondere konnte gezeigt werden,daß Azotobacter vinelandii ein Polysaccharld hervorbringt, welches der Alginsäure, welche aus Algen gewinnbar ist« ahnlich ist, ausgenommen den Umstand, daß das Produkt teilweise acetyliert ist. Die Biosynthese dieses alginatähnlichen Polysaccharides ist beschrieben durch P.A.J. Gorin und J.F,T. Spencer in Canadian Journal of Chemistry, £4 (1966) 993-998 und durch B. Larsen und A. Haug in"Carbohydrate Research", IJ (1971) 287-296. Allerdings hat dieser Prozeß, obwohl die Herstellungsmöglichkeit dee Polysaccharides im Laboratoriumsmaßstab demonstriert worden ist« noch keinen Eingang in die gewerbliche Verwertung gefunden und solange man nicht einen Weg findet, um das Produkt mit annehmbar hohen Ausbeuten in industriellem Maßstäbe zu gewinnen, wird eich hieran auch nichts ändern können.

Es besteht also auch nach diesem Stand der Technik noch die zu lösende Aufgabe darin, einen neuen Heg zur Herstellung von alginat* artigem Polysaccharid aufzufinden, welcher einerseits den Nachteil der Benutzung' von Algen als Ausgangsmaterial vermeidet und anstelle dessen ein für industrielle Zwecke anwendbares und leicht zugängliches Ausgangsraaterial heranzieht, und es ermöglicht, in hohen Ausbeuten an Polysaccharid eine Kultivierung von Azotobacter vinelandii durchzuführen.

Es konnte aber nun gefunden werden, daß sich die Ausbeute des alginatartigen Polysaccharides wesentlich erhöhen läßt und eine Herstellung auf industrieller Basis ermöglicht, wenn man Azotobacter vinelandii unter ganz bestimmten Kulturbedingungen wachsen läßt, welche sich wesentlich von den Bedingungen unterscheiden, welche bisher^ianer für solche Mikroorganismen verwendet worden' sind. Es konnte nämlich herausgefunden werden, daß sich die

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Polysaccharidausbeute auf etwa das Vierfache steigern läßt, wenn die Phosphatkonzentration im Kulturmedium vermindert wird auf etwa ein Zehntel des üblicherweise benutzten Wertes und wenn man außerdem den pH-Wert des Mediums innerhalb eines gewissen Bereiches aufrecht erhält. Diese Befunde sind vollständig unerwartet gewesen und laufen den Lehren der bisherigen Kulturanweisungen zuwider.

Die Erfindung schafft demzufolge ein Herstellungsverfahren für ein aus einem teilweise acetylierten variablen Blockcopolymeren von l^<-4-verknüpften Resten der D-Mannuronsäure und; der L-Guluroneäure bestehendes Polysaccharid des Alginattyps durch eine aerobe Kultivierung eines Bakteriums der Spezies Azotobacter vinelandil in einem wässrigen Kulturmedium, welches als wesentliche Bestandteile mindestens ein Monosaccharid oder ein Disaccharid als Kohlenstoffquelle und außerdem Quellen für Phosphat, Molybden, Eisen, Magnesium, Kalium, Natrium, Kalzium und Sulfat enthält und welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Konzentration des Phosphats in dem Medium zwischen 0,1 bis 0,8 Millimolar und der pH-Wert des Mediums im Bereich von 7,0 bis 8,2 gehalten wird.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann jeder Stamm von Azotobacter vinelandii verwendet werden. Es hat sich jedoch herausgestellt, daß ganz besonders wertvolle Abkunftslinien solcher Stämme besonders hohe Ausbeuten von Polysaccharid ergeben und solche Stämme werden aufgehoben und der Kultursammlungsnummern NCIB 9068 und NCIB 8789. Ein anderer Stamm (strain) kann ebenfalls mit Vorteil benutzt werden, nämlich derjenige unter der Kultursammlungsnummer NCIB 8660. Diese Stämme sind ohne Vorbehalt erhältlich von der "National Collection of Industrial Bacteria", Torry Research Station, P.O. Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen, Scotland, Großbritannien; sie sind In dem Katalog der Sammlung näher beschrieben.

Ein kritisches Merkmal für die Erreichung von hohen Ausbeuten an Polysaccharid bei den erfindungsgemäßen Verfahren liegt wie gesagt in der Phosphatkonzentration des Kulturmediums. Es konnte gefunden werden, daß die besten Ausbeuten an Polysaccharid erreichbar sind,

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wenn man bei einer Phosphatkonzentration von etwa 0,1 bis 0,8 Millimolar arbeitet, vorzugsweise bei etwa 0,2 bis 0,6 Millimolar, und zwar insbesondere bevorzugt bei etwa 0,4 Millimolar. Diese Konzentrationen stehen scharf im Gegensatz zu den Kulturmedien, welche bisher als optimal für die Wachstumsbedingungen von Azotobacter vinelandii gegolten haben, und welche bei einer Phosphatkonzentration von etwa 5 Millimolar oder darüber lagen. So ist beispielsweise von Gorin und Spencer gemäß der vorerwähnten Veröffentlichung über Azotobacter vinelandii als Kulturflüssigkeit Burk's-Medium verwendet worden, welches auch das am weitesten verbreitete überlicherweise verwendete Kulturmedium für solche Mikroorganismen ist und einen Phosphatspiegel von etwa 5 DiM aufweist. Ähnlich benutzen auch Larsen und Haug ein Grundlagemedium mit einer Phosphatkonzentration von etwa 6 mM. Die hohen Phosphatkonzentrationen dieser üblichen Medien führen aber nicht zu einer hohen Polysaccharidausbeute brauchbarer Größenordnung.

Das Phosphat kann dem Kulturmedium in üblicher Weise zugefügt werden, nämlich als lösliche Phosphatsalze wie beispielsweise K₃HPO₄ und KH₂PO₄.

Ein anderer kritischer Faktor für die erfolgreiche Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Aufrechterhaltung eines ganz genau festgelegten pH-Wertes für das Kulturmedium. Wenn nicht besondere Maßnahmen ergriffen werden, um den pH-Wert konstant zu halten, dann sinkt dieser Wert während des Fortschreitens der Mikroorganismenkultur als Folge der Entstehung der Polysaccharide und anderer saurer Produkte. Bisher ist der pH-Wert des Kulturmediums während der Kultivierung von Azotobacter vinelandii nicht kontrolliert worden: unter solchen Umständen sinkt der Wert für das pH bis zum Ende der Kultivation auf etwa 5,5, ausgehend von dem pH-Wert der üblicherweise verwendeten Burk¹S-Medien, welcher bei der Inokulation mit dem Mikroorganismus bei etwa 7,4 liegt. Es konnte herausgefunden werden, daß durch Aufrechte rhaltuhg des pH-Wertes des Kulturmediums im Bereich von etwa 7,0 bis etwa 8,2 während des gesamten Kultivationsvorganges

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die Auswertbarkeit des Kulturmediums, insbesondere diejenige der Kohlenstoffquellen, ganz wesentlich verbessert wird und erheblich bessere Ausbeuten an Polysaccharid gewährleistet. Der pH-Wert des Kulturmediums wird vorzugsweise im Bereich von etwa 7,3 bis etwa 7,9 gehalten und liegt optimal bei etwa 7,5.

Die Aufrechterhaltung des pH-Wertes des Kulturmediums kann durch irgendeine der üblichen Maßnahmen gewährleistet werden, soweit diese sich nicht schädlich gegen die Kultivierung des Mikroorganismus auswirken. So ist z.B. der Zusatz einer bemessenen Menge an einem alkalischen Reagenz wie Natriumhydroxidlösung möglich; dieser Zusatz kann dem Medium in gewissen Abständen je nach Bedarf zugefügt werden; es ist aber zweckmäßiger, den Zusatz automatisch mit Hilfe einer hierfür üblichen, von pH-Meßmitteln im Kulturmedium gesteuerten, Bemessungsvorrichtung vorzunehmen. Die Aufrechterhaltung des gewünschten pH-Wertes kann aber auch durch geeignete Pufferungsmittel im Medium gewährleistet werden, so z.B. durch Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer.

Die beigefügten Zeichnungen dienen zur Erläuterung der Wirkung der Phosphatkonzentration und des pH-Wertes auf die Polysaccharidproduktion. In den Zeichnungen zeigen:

Figur 1 ' eine graphische Darstellung der Wirkung der Phosphatkonzentration im Kulturmedium auf die Polysaccharidausbeute, und

Figur 2 eine Darstellung der Wirkung des pH-Wertes des Kulturmediums auf diese Polysaccharidausbeute.

Die Art und Weise, auf welche diese Messungen durchgeführt worden sind, ist in den nachfolgenden Beispielen geschildert. Die graphischen Darstellungen demonstrieren klar die Vorteile, welche sich aus den Maßnahmen der erfindungsgemäßen Lehre gegenüber dem Stand der Technik ergeben.

Die Kultivierung des Mikroorganismus wird unter aerobischen Bedingungen durchgeführt. Azotobacter vinelandii hat eine extrem

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hohe Respirationsgeschwindigkeit. Demzufolge ist jegliche Begrenzung der Sauerstoffzufuhr zu dem Kulturmedium von praktisch hoher Bedeutung, worauf bei der Auswahl der Fermentierungsbehälter und der zugehörigen Ausrüstung Bedacht genommen werden muß, und zwar in höherem Maße als bei üblichen Mikroorganismuszüchtungen. Es konnte gefunden werden, daß gute Resultate dann erreicht werden, wenn die Sauerstoffauflösungsgeschwindigkeit von etwa 5 bis etwa 50, vorzugsweise etwa 8 bis etwa 20 mM Sauerstoff pro Liter Medium pro Stunde eingehalten wird; allerdings können auch Belüftungsgeschwindigkeiten außerhalb dieses Bereiches anwendbar sein. Normalerweise wird Luft als Sauerstoffquelle herangezogen, weil Azotobacter vlnelandli ein stickstoffverwertender Mikroorganismus ist und deshalb auch den Stickstoffgehalt der Luft als Stickstoffquelle heranziehen kann. Sauerstoff/ Stickstoffgemische, welche nicht den Verhältnissen von Luft entsprechen, können auch nützlich sein; sogar reiner Sauerstoff oder Gasmischungen mit einem Sauerstoffgehalt ohne Stickstoff können für das Kulturmedium herangezogen werden, vorausgesetzt, daß das Kulturmedium andere Stickstoffquellen als Ausweichmöglichkeit enthält.

Ein oder mehrere Grundlagequellen für Stickstoff des konventionellen Typs, also beispielsweise Nitrate, Ammoniumsalze, Aminosäuren oder Peptonlösung, können gegebenenfalls dem Kulturmedium hinzugefügt werden, obwohl dies nicht unbedingt erforderlich ist, wenn gasförmiges Stickstoff neben dem Sauerstoff hinzugeführt .wird, also beispielsweise in Form von Luft oder ähnlichen stickstoffhaltigen Gasgemischen. Aus theoretischen Gründen kann erwartet werden, daß eine bessere Wachstumsrate erreichbar ist, wenn salzartig gebundene Stickstoffquellen vorhanden sind, weil die. von der Bakteriumszelle aufzuwendende Energie für die Stickbindung aus der Kohlenetoffquelle des Mediums gezogen werden muß. Immerhin ist aus praktischen und auch aus wirtschaftlichen Gründen im allgemeinen die Benutzung von Luft als Stickstoffquelle zu bevorzugen.

Als Kohlenstoffquelle kann wie bereits erwähnt ein Monosaccharid oder ein Disaccharid oder Gemisch davon im Kulturmedium benutzt

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werden. Z.B. ist Sucrose eine geeignete Kohlenstoffquelle, aber auch Glucose, insbesondere die durch Hydrolyse aus Stärke gebildete Glucose, sind brauchbar. Auch Zwischenprodukte, wie sie sich bei der Erarbeitung von Zucker bilden, so z.B. Melasse oder Invertzucker, können als Kohlenstoffquelle herangezogen werden, vorausgesetzt, daß sie ein oder mehrere Monosaccharide oder Disaccharide enthalten. Das Kulturmedium enthält vorzugsweise etwa 0,2 bis 3 g Sucrose oder eine äquivalente Menge an anderem Monosaccharid oder Disaccharid, und zwar pro 100 ml Wasser. Kohlenstoffquellenkonzentrationen von etwa 1 g oder mehr an Sucrose oder äquivalenten Mitteln pro 100 ml Wasser sind für Chargenprozesse in Abwesenheit eines gebunden Stickstoffmaterials geeignet. Jedoch können Konzentrationen außerhalb dieser Bereiche ebenso benutzt werden, falls gewünscht z.B. bis zu 10 g Sucrose oder äquivalente Mittel anderer Monosaccharide oder Disaccharide pro 100 ml Wasser.

Die Gegenwart von Kalzium in dem Kulturmedium ist als weiterer wichtiger Faktor für die Gewährleistung von guten Ausbeuten an Polysacchariden anzusehen. Es konnte gefunden werden, daß ohne Kalziumzusatz sehr wenige Zellen des Mikroorganismus erzeugt werden, obwohl die Ausbeute an Polysaccharid pro Zelle hoch ist. Es ist jedoch möglich, auch ein gutes Wachstum des Mikroorganismus selbst zu erzielen, welcher diese hohen Ausbeuten an Polysaccharid ergibt, wenn man eine Kalzium-quelle in solcher Weise hinzusetzt, daß sie in dem Kulturmedium eine Konzentration von etwa 0,02 bid 0,6 mM gewährleistet. Größere oder auch kleinere Mengen an Kalzium können verwendet werden} jedoch ist im allgemeinen keine weitere Verbesserung erreichbar, wenn die Konzentrationen höher als etwa 0,6 mM liegen. Das Kalzium kann in jeglicher geeigneten Form, welche mit dem Medium verträglich und für das Wachstum -unterstützend ist, dargereicht werden. So ist z.B. etwa 0,01 bis 0,25 Kalziumchlorid oder eine äquivalente Menge eines anderen Kalziumsalzes pro 1000 ml des Mediums geeignet.

Das Kulturmedium muß auch Quellen für Kalium, Natrium, Eisen, Molybden, Magnesium und Sulfat enthalten, welche für das richtige Wachstum der Mikroorganismen erforderlich sind. Die Art, auf welche diese Elemente dem Kulturmedium zugefügt werden, ist in

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der Technik gut bekannt und diese Grundstoffe sind auch in dem konventionellen Kulturmedium für Azotobacter vinelandii wie Burk¹s-Medium enthalten. Typisch ist, daß diese Grundstoffe der Kultur als solche Salze zugesetzt v/erden können wie Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Natriummolybdat und Eisensulfat.

Die Kultivation der Mikroorganismen kann unter üblichen Bedingungen durchgeführt werden. Die Temperatur ist normalerweise zwischen 25 bis 3O°C einzustellen. Höhere oder niedrigere Temperaturen sind möglich, jedoch oberhalb 34°C sinkt die Ausbeute an Polysacchariden im allgemeinen ab. Die Fermentation kann ausgeführt werden entweder im Chargenbetrieb oder auch in einem kontinuierlichen Prozeß unter submersen Bedingungen in einem geeigneten Fermentierungsapparat. Wenn der Prozeß als Chargenprozeß durchgeführt wird, ist die Fermentation normalerweise in etwa 96 Stunden oder weniger beendet, wenn verschiedene Parameter richtig eingestellt sind, obwohl auch längere Zeitdauer für diese Fälle erforderlich sein können.

Die Zellen von Azotobacter vinelandii, welche zur Impfung der Kultur benutzt werden, können durch irgendeine der bekannten Techniken hergestellt werden. So kann z.B. ein geeignetes Impfmaterial hergestellt werden durch Inkubation des Bakteriums -während 48 Stunden auf Agarflächen, gefolgt von 24-stündigem Schütteln in Schüttelflaschen. Die Inokulation wird zweckmäßig bewirkt mit 1 bis 20 Volumen-% des Fermentiererinhaltes. Vor der Inokulation mit Mikroorganismen wird das Kulturmedium und die Fermentierungsapparatur sterilisiert, und zwar in üblicher Weise.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Polysaccharid in industriellem Maßstab wird die.. Kultivierung des Mikroorganismus in einem Fermentierungsapparat von großem Fassungsvermögen ausgeführt, beispielsweise bei 1000 1. Die entsprechend großen Mengen des benötigten Impfmaterials für solch einen Fermentierungsapparat kann nicht

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leicht mit Hilfe von Schüttelflaschenkulturen hergestellt werden und eine oder mehrere Saatfermentierer werden hierfür benötigt. So wird z.B. ein erster Aussaat fermentierer mit etwa 5 1 Fassungsvermögen von Bakterien geimpft, welche auf festem Medium oder in einer Schüttelflaschenkultur entwickelt worden sind nach einer geeigneten Inkubationsperiode, der Inhalt des ersten Aussaatfermentierers wird benutzt zur Impfung eines zweiten Aussaatfermentierers von etwa 100 1 Fassungsvermögen; nach einer weiteren geeigneten Zeitdauer der Inkubation wird der Inhalt des zweiten Aussaatfermentierers benutzt, um eine Impfung des eigentlichen Fermentierungsgefäßes mit einem Fassungsvermögen von 1000 1 zu bewirken; die Kultivierung wird in dem Hauptfermentierer fortgesetzt, bis die optimale Ausbeute an Polysaccharid erreicht ist. Die Kulturbedingungen und die Zusammensetzung des benutzten Mediums für die einleitenden Fermentierungsschritte können in gleicher Weise eingestellt sein, wie es bereits für den Haupt fermentierer beschrieben ist. Es ist aber auch möglich, diese Einleitungsfermentierungsschritte unter üblichen Bedingungen der bisherigen Art der Kultivierung von Azotobacter vinelandii durchzuführen, da es nicht nötig ist, die Polysaccharidproduktion in diesen Aussaatfermentierern besonders stark auf das Maximum zu steigern. Trotzdem ist es vorteilhaft, alle Fermentierungsschritte einschließlich der Aussaatfermentierungen in Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen Forderungen auszuführen, so daß das Impfmaterial für das Hauptkulturmedium bereits eine unerwünscht hohe Phosphatkonzentration und ein unerwünscht niedriges pH vermeidet.

Am Ende des Fermentierungsprozesses erhält man eine Kulturflüssigkeit, welche das Polysaccharid gelöst enthält. Für einige Anwendungsformen des Polysaccharides ist es nicht notwendig, die Zellen von Azotobacter vinelandii zu beseitigen. In solchen Fällen wird die viskose Flüssigkeit aus dem Fermentierer entweder so benutzt wie sie ist, oder sie kann auch sprühgetrocknet werden zu einem hellen enthaltenden Pulver. Andererseits können die Zellen falls^Ngewünscht auch mit den üblichen Mitteln entfernt werden. So kann z.B. in einer Feststoffzentrifuge oder einer

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Filterpresse gearbeitet werden und die erhaltene zellenfreie Polysaccharidlösung kann der Sprühtrocknung unterworfen werden oder auch so benutzt werden, wie sie ist. Ein reineres Produkt erhält man durch Ausfällung des Polysaccharides aus der Lösung mit einem Alkohol wie beispielsweise Isopropanol. Andererseits kann auch ein unlösliches Salz der Polysaccharidlösung entzogen werden durch Hinzufügung eines geeigneten Reagenz, beispielsweise von Kalziumsalzlösung, etwa durch Hinzufügung einer Lösung von Kalziumchlorid; die freie Säure kann dann aus dem Salz durch Hinzufügung einer stärkeren Säure wieder freigesetzt werden. Andere Salze, einschließlich löslichen Salzen wie Natriumsalz, können in der üblichen Heise hergestellt werden. Die Polysaccharidprodukte, welche durch den erfindungsgemäßen Prozeß hergestellt werden, sind teilweise acetyllierte variable Blockcopolymere aus 1-4-verknüpften Einheiten von D-Mannuronsäure und L-Guluronsäure, wobei der Grad der Acetyliierung normalerweise bei etwa 20% liegt. Abgesehen von diesen Acetylgruppen ist das Produkt chemisch ähnlich wie die Alginsäure, welche aus Algen extrahierbar ist. Das bakterielle Produkt und seine Derivate entsprechen, den Standardbedingungen für Alginsäure und Alginate und sie können benutzt werden in den gleichen Anwendungsbereichen, also als Zusätze zu Mahrungsmitteln, Pharmazeutika, Papier-und Textilverarbeitung.

Die Erfindung anhand der folgenden Beispiele näher erläutert. Beispiel 1

Dieses Beispiel erläutert die Wirkung der verschiedenen Phosphatkonzentrationen im Kulturmedium auf die Ausbeute an Polysaccharid.

Zunächst wurde Azotobacter vlnelandii NCIB 9068 in Schüttelflaschen entwickelt in einem wässrigen Kulturmedium, welches die in der Tabelle 1 gezeigte Zusammensetzung hatte.

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Tabelle 1 Zusammensetzung des Kulturmediums

Konzentrationen

Bestandteil

Sucrose KH₂PO₄ K₂HPO₄ MgSO₄.7H₂O NaCl

CaCl₂.6H₂O Na₂MoO₄ FeSO₄.7H₂O

Gramm pro Liter	Millimol pro Liter
20	58
variiert	variiert
variiert	variiert
0,20	1,01
0,20	3,4
0,064	0,15
0,001	0,004
0,003	0,011

Die Phosphatkonzentration in dem benutzten Medium in verschiedenen Schüttelflaschen wurde variiert von 0,005 bis 5,0 mM, und zwar durch geeignete Variation der zugesetzten Mengen an KH₂PO₄ und K₂HPO₄. Nachdem das Medium mit dem Mikroorganismus geimpft war, welches auf Agarflachen während 48 Stunden vorentwickelt war, wurden die Flaschen während 96 Stunden bei 30°C inkubiert, wobei mit 200 r.p.m. auf einem Schüttelapparat bewegt wurde. Während der Kultivierung wurde das Medium bei einem pH-Wert von 7,5 durch Hinzufügung von Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer aufrecht erhalten.

An Ende der 96-stündlgen Kultivierungsperiode wurde die Polysaccharidausbeute in jeder Flasche gemessen durch Isopropanolausfällung aus dem Filtrat der Kulturflüssigkeit, gefolgt durch Trockengewichtsbestimmung .

Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle 2 aufgeführt und in der graphischen Darstellung der Fig. 1 der beigefügten Zeichnungen

wiedergegeben.

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Tabelle 2	Polysaccharidausbeute
Wirkunq der Phosphatkonzentration im Kulturmedium auf	(mg/ml)
die Polysaccharidausbeute	0,60
Phosphatspiegel	1,45
(mM POp	2,00
0,005	2,70
0,025	3,05
0,100	3,45
0,125	3,50
0,200	2,40
0,250	2,05
0,500	1,50
0,750	1,15
0,850	0,80
1,000	0,80
1,250
2,500
5,000

Aus Tabelle 2 und der beigefügten Fig. 1 ist zu ersehen, daß bei Phosphatkonzentrationen von etwa 0,1 bis 0,8 mM eine sprunghafte Steigerung der Polysaccharidausbeute zu finden ist. Die Polysaccharidausbeute wird bei Arbeitsweise außerhalb dieser Grenzen außerordentlich stark herabgesetzt, so daß eine Kultur mit einem Phosphatgehalt von 5,0 mM zu wesentlich schlechteren Ergebnissen führt. Das letztgenannte Medium entspricht der Zusammensetzung des Burk's-Medium, welches üblicherweise bisher für die Kultivierung von Azotobacter vinelandii herangezogen worden ist.

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Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt die Wirkung von Kultivierung bei verschiedenen konstantgehaltenen pH-Werten auf die Polysaccharldausbeute,

Azotobacter vinelandil NCIB 9068 wurde in 4 Liter-Flaschen in wässrigem Kulturmedium gezüchtet, welche die in Tabelle 3 gezeigte Zusammensetzung hatte; die Züchtung wurde in einem gerührten Tankfermentierer durchgeführt.

Tabelle 3 Zusammensetzung des Kulturmediums

Konzentration Bestandteile

Sucrose

KH₃PO₄

K₂HPO₄

MgSO₄.7H₂O NaCl

CaCI₂.6H₂O Na₂MoO₄ FeSO₄.7H₂O

Der Permentierer war mit einem automatischen pH-Meßgerät zur Bemessung der Zugabe von 1 M NaOH ausgerüstet, um den pH-Wert des Mediums bei einem gewählten Wert aufrecht zu erhalten; das Gerät arbeitete mit einer Sauerstoffelektrode. Der Fermentierer wurde in üblicher Weise vor der Hinzufügung des Mediums sterilisiert.

Dem Medium in dem Fermentierer wurde ein Impfstoff in einer Menge von 10 Volumen-% an Mikroorganismus hinzugefügt, welcher zuvor während 48 Stunden auf Agarflächen angewachsen und dann während 24 Stunden in Schüttelflaschen inkubiert worden war. Die Fermentierung wurde während 60 Stunden bei 30°C durchgeführt. Das Medium wurde bei 400 Umdrehungen pro Minute qerührt und Luft . 409882/0995

Gramm pro Liter	Millimol pro Liter
20	58
0,008	0,06
0,032	0,18
0,20	1,01
0,20	3,4
0,064	0,15
0,001	O,OO4
0,003	0,011

wurde durch dieses Medium hindurchgeblasen mit einer Geschwindigkeit von 1,4 Liter pro Minute. Der pH-Wert des Mediums wurde während der gesamten Kultivierung konstant gehalten, und zwar mit Hilfe der automatischen Hinzufügung von 1 M NaOH-Lösung, je nach Bedarf.

Die verschiedenen Fermentierungsversuche wurden ausgeführt bei pH-Werten des Kulturmediums von: 6, 6,5, 7, 7,3, 7,5, 7,75 und 8. Am Ende jedes Versuchs wurde das produzierte Polysaccharid gemessen durch Ausfällung mit Isopropanol, gefolgt durch Trockengewich tsbestimmung .

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt und graphisch in Fig. 2 der beigefügten Zeichnungen wiedergegeben.

Tabelle 4

Wirkung der pH-Werte	auf die Polysaccharidausbeute
Kulturmedium pH	Polysaccharidausbeute (mg/ml)
6,0	0 (kein Wachstum)
6,5	0,8
7,0	1,3
■ 7,3	2,3
7,5	2,7
7,75	2,6
8,0	2,1

Die Tabelle 4 und die beigefügte Zeichnung 2 zeigen die Verbesserung der Polyeaccharidausbeute, welche dann erzielt wird, wenn der pH-Wert der Kultur auf Werten von 7,0 und etwa darüber gehalten wird, entsprechend dem einen Merkmal der Erfindung. Wenn das pH des Mediums auch nur auf 6,0 absinkt, findet kein Wachstum des Mikroorganismus statt.

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Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt die verbesserte Ausbeute, welche bei einer Arbeitsweise unter den erfindungsgemäßen Bedingungen im Vergleich zur früheren Kultivierungsmethode erzielt werden.

Drei Versuche wurden ausgeführt, und zwar unter Benutzung des gleichen Apparates, des gleichen Mikroorganismus, des gleichen Kulturmediums und auch der gleichen Verfahrensweise gemäß Beispiel 2, ausgenommen der folgenden variierten Bedingungen:

Vergleichsversuch A, in Übereinstimmung mit der.Erfindung wurde der Versuch in einem Medium ausgeführt, welches eine Phosphatkonzentration von 0,25 mM aufwies und auf einem pH-Wert von 7,4 konstant gehalten wurde;

Versuch B wurde zu Vergleichszwecken in einem Kulturmedium einer Phosphatkonzentration von 5,00 mM bei einem pH-Wert von 7,4 durchgeführt;

Versuch C wurde zu Vergleichszwecken in einem Kulturmedium mit einer Phosphatkonzentration von 5,00 mM, jedoch bei pH unkontrollierter Höhe durchgeführt, wobei der pH-Wert von dem ursprünglichen Wert von 7,4 nach 24 Stunden auf einem Wert von 6,4 stand und nach weiteren 48 Stunden bis auf 6,05 abgesunken war.

In allen drei Versuchen wurde die Polysaccharidausbeute nach Stunden und nach 48 Stunden wie im Beispiel 2 angegeben, gemessen.

Folgende Ergebnisse wurden festgestellt:

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	Tabelle 5	Phosphat gehalt	Polysaccharidausbeute (mg/ml)	48 Stunden
Versuch	Kulturmedium pH	(mM POj)	24 Stunden	3,06
		0,25	2,00	1.1O
A	konstant:7,4	5,00	0,40	0,65
B	konstant:7,4	5,00	0,41
c-	variiert:7,4 - 6,05

Aus diesem Resultaten ergibt sich klar die wesentliche Erhöhung der Polysaccharidausbeute, die unter den erfindungsgemäßen Bedingungen der Phosphatkonzentration und pH-Wert-Kontrolle gegenüber der üblichen Verfahrensweise erzielt wird.

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Claims

DR. EYSENBACH

FATnNTANWALT

Telegramme: PATENTEYSENBACH, PULLACH-ISARTAL Telefon München (0811): 7930391

WAen^n*:JWa5ML5-P_J 2 3_ 792)

Datum : 12. Juni 1973

Anmelderin: Täte ft LyIe Limited, London

Patentansprüche

(ί). Verfahren zur Herstellung eines aus teilweise acetyliertem variablen Blockcopolymeren von Säureresten der jy-Mannuronsäure und L-Guluronsäure bestehenden Polysaccharides des Alginat-Typs durch aerobische Kultivierung eines Bakteriums der Spezies Azotobacter vinelandii in einem wässrigen Kulturmedium, welches als wesentliche Bestandteile mindestens ein Monosaccharid oder Disaccharid als Kohlenstoffquelle und außerdem Quellen für Phosphat, Molybden, Eisen, Magnesium, Kalium, Natrium, Kalzium und Sulfat enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Phosphatkonzentration in der Kulturflüssigkeit im Bereich von 0,1 bis 0,8 Millimolar gehalten wird und während der Kultivation der pH-Wert des Mediums innerhalb des Bereiches von 7,0 bis 8,2 aufrecht erhalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g.ekennzei c h -net, daß die Konzentration des Phosphats in dem Medium zwischen 0,2 bis 0,6 Millimolar eingestellt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß während der Kultivation der pH-Wert des Mediums im Bereich von 7,3 bis 7,9 gehalten wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß das kultivierte Bakterium zum Stamm (strain) NCIB 8660, NCIB 8789 oder NCIB 9068 gehört.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche," dadurch

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ORIGINAL INSPECTED

gekennzeichnet, daß die Konzentration des Kalziums in dem Medium im Bereich von O;O2 bis 0,6 Millimolar eingestellt wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß Kohlenstoffquelle Sucrose, Glucose, Invertzucker oder Molasse ist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß die Kultivation bei einer Temperatur im Bereich von 25°C bis 3O°C durchgeführt wird.

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