DE1792004B2

DE1792004B2 - Verfahren zur biotechnischen herstellung von zitronensaeure und deren salzen

Info

Publication number: DE1792004B2
Application number: DE19681792004
Authority: DE
Inventors: Katsunobu; Kimura Kazuo; Machida Tanaka (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1967-07-21
Filing date: 1968-07-11
Publication date: 1973-01-25
Also published as: FR1573655A; CH494277A; GB1187334A; BE718133A; IT943049B; US3652396A; DE1792004A1

Description

Tabelle

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Zitronensäure und deren Salzen durch aerobes Züchten von Pilzen der Gattung Aspergillus oder Penicillium in Kohlenstoff quellen sowie übliche Stickstoff quellen und Nährstoffe enthaltenden Nährmedienbei hierfür üblichen Tempera-tur- und pH-Bedingungen. Derartige Verfahren sind allgemein bekannt. ■

Bei bekannten Verfahren (vgl. deutsche Auslegeschriften 1 230 752, 1173 055, 1 086 653), werden als Hauptkohlenstoffquellen zucker- bzw. stärkehaltige Materialien eingesetzt. Derartige Kohlenstoffquellen stehen jedoch nicht immer und nicht in behebiger Menge und gewünschter Qualität zur Verfügung,

Es ist aber auch bereits bekannt, bei biotechnischen Prozessen auch Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoffquelle einzusetzen. Zur Herstellung von Zitronensäure ist letzteres bisher nicht gelungen. .

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, zur biotechnischen Herstellung von Zitronensäure Kohlenwasserstoffe als Hauptkohlenstoffquelle zu verwenden. .,_:i!. ,

Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe besteht nun in einem Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Zitronensäure und deren Salzen durch aerobes Züchten von Pilzen der Gattung Aspergillus oder Penicillium in Kohlenstoff quellen sowie übliche Stickstoffquellen und Nährstoffe enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Bedingungen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß

	Menge an
	produzierter
Stamm	Zitronen
	säure in
	mg/ml
Penicillium janthinellum ATCC 13 154	45
Penicillium decumbens Thorn var.
atro-virens Abe FAT 329	33
Penicillium echinulo-nalgiovens Abe
FAT*) 884	46
Penicillium estinogenum Komatsu
& Abe FAT*) 1196	30
Penicillium restrictum ATCC 13 155 ..	35
Penicillium chermisinum Biourge
FAT*) 1287	37
Penicillium paraherquei Abe FAT 670	34
Aspergillus elegans Gasperini ATCC
20108 ■..-,■.-.....	10

Aspergillus elegans Gasperini ATCC 20 108, Penicillium janthinellum ATCC 13 154, Penicillium decumbens Thorn var.atro-virens Abe FAT 329,

Penicillium echinulo-nalgiovens Abe FAT 884, Penicillium estinogenum Komatsu & Abe FAT 1196,

Penicillium restrictum ATCC 13 155, Penicilhum chermisinum Biourge FAT 1287 oder Penicillium paraherquei Abe FAT 670 *) FAT = hinterlegt bei der landwirtschaftlichen Fakultät der Universität von Tokio.

Die Kohlenwasserstoffe, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden können, schließen z. B. ein Paraffin, ein Olefin, oder ein Isoparaffin mit wechselnden Mengen an C-Atomen ein, ebenso Gasöl, Leichtöl, Kerosin, Rohöl u. dgl., welche entweder allein oder in Mischung zu zweien oder mehreren verwendet werden können.

Übliche Verbindungen, die bei der Vergärung Verwendung finden, können als anorganische Stickstoffquelle verwendet werden, z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat oder Ammoniumphosphat, obgleich Ammoniumnitrat vorzuziehen ist.

Die Zitronensäure-Vergärung kann, wie üblich, vorteilhaft bei einer Temperatur zwischen 20 und 40° C ausgeführt werden. Die bevorzugte Temperatur liegt bei etwa 28° C. Die aerobe Flüssig-Vergärung unter Wasser kann vorteilhaft sein, aber es ist auch möglich, die Pilze in Oberflächenkulturen zu züchten.

3 4

E)ie Fermentation - geht, wie üblich, bei einem pH beobachtet wurde, und zum. Schluß zwecks Entvon'1,0 bis 8,0, bevorzugt aber beim pH von 5,0, fernung von CaSO^Niederschlägen .filtriert. Das .vor sich. Aus diesem Grunde ist es vorzuziehen, zwecks Filtrat würde dann konzentriert und unter Kühlen Einstellung des pH-Wertes Calciumcarbonat zuzu- stehengelassen, um Zitronensäure äuszukristallisieren. setzen. Es ist jedoch möglich, eine geeignete Lösung :5 Die Kristalle wurden auf dem Filter gesammelt, mit eines Alkalis, wie z.B. Natriumhydroxyd oder kaltem Wasser gewaschen und mehrmals konzentriert. Calciumhydroxyd, entsprechend dem Fortschreiten Durch Umkristallisieren aus wäßriger Lösung erhielt der Vergärung zuzufügen. man das Monohydrat der Zitronensäure in kristalliner

Übliche Fermentationstechniken, z. B. Zusatz von Form (0,62 g mit einer Reinheit von 96 %)·
Methanol, Kaliumferrocyanid u. dgl. können ohne io Wählt man in diesem Fall als Kohlenstoff quelle irgendeine schädliche Wirkung in das erfindungsge- einen Kohlenwasserstoff mit 15 C-Atomen, so werden mäße Verfahren eingearbeitet werden. Ausbeuten zwischen 105 bis 118 % erreicht. Aber auch

Die erfindungsgemäß einsetzbaren Mikroorganismen die C₁₃-C₁₈-Fraktion liefert ähnlich gute Ergebnisse, können auch auf folgende Weise gezüchtet werden,
wobei ebenfalls gute Resultate erhalten werden: 15 Beispiel 2

Sporen, die innerhalb von 3 Tagen auf einem

Malzextrakt-Agar bei 28° C gezüchtet worden sind, Eine Saatkultur von Penicillium echinulo-nalgiovens

werden im Verhältnis von einer Öse pro 10 ml Saat- Abe FAT 884, wie sie in der landwirtschaftlichen medium geimpft; letzteres wird innerhalb von 3 Tagen Fakultät der Universität Tokio in Japan hinterlegt bei 28° C unter Schütteln gezüchtet. Die Saatkultur 20 und in gleicher Weise wie im Beispiel 1 beschrieben wird einem Fermentationsmedium in einem Impfstoff- erhalten ist, wurde auf ein 20 ml Fermentationsmedium Verhältnis von 10% zugeführt, und die Vergärung übertragen, welches eine ähnliche, wie im Beispiel 1 wird unter Rühren bei 28° C ausgeführt. beschriebene Zusammensetzung aufwies, jedoch mit

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. der Ausnahme, daß Methanol (2 %) in einem 500-ml-

25 Kolben zugefügt wurde. Die Züchtung wurde in

Beispiel 1 14 Tagen unter Schütteln (110 UpM) bei 28° C aus

geführt und ergab in der Fermentationsbrühe Kristalle

Eine Öse voll Penicillium j anthinellum ATCC13 154, von Calciumcitrat, entsprechend 55 mg/ml Zitronenweiche innerhalb von 3 Tagen bei 28° C auf einem säure.

Malzextrakt-Agar gezüchtet worden ist, wurde auf ein 30 Zum Vergleich wurde eine ähnliche Arbeit vor-Saatmedium (20 ml) geimpft, das 5 % einer normalen genommen, jedoch ohne Methanolzusatz, und man Paraffinmischung (bestehend aus einem gleichen VoIu- erhielt Calciumcitrat, das 40 mg/ml Zitronensäure men einer Mischung einer homologen Serie von entsprach.

Paraffin-KW-Stoffen mit 12 bis 14 C-Atomen), 0,2% Wählt man in diesem Fall als Kohlenstoff quelle

NH₄NO₃, 0,03% MgSO₄-7H₂O, 0,025% KH₂PO₄, 35 einen Kohlenwasserstoff mit 15 C-Atomen, so werden 0,025% Na₂HPO₄ · 12H₂O, 0,001% CaCl₂-2H₂O, Ausbeuten zwischen 105 bis 118% erreicht. Aber 0,001% MnSO₄-4 H₂O, 0,001% ZnSO₄ · 7 H₂O, auch die C₁₃-C₁₈-Fraktion liefert ähnlich gute Ergeb-0,5 mg/1 H₃BO₃, 0,1 % Maisquellwasser, 0,05 % Poly- nisse.

äthylen-Sorbitmonooleat (ein nichtionisches ober- Beispiel 3

flächenaktives Mittel), 10 y/1 Na₂MoO₄ · 2H₂O, 10 y/1 40

CuSO₄ · 5 H₂O, 10 γ β CoCl₂ · 2 H₂O, 10 mg/1 FeSO₄ · Eine Saatkultur von Penicillium restrictum ATCC

7H₂O und 3% CaCO₃ enthält und ein pH von 5 in 13 155 wurde unter Schütteln in einem 200 ml Saateinem 250-ml-Kolben aufweist. medium, das eine ähnliche, wie im Beispiel 1 be-

Dieses Medium wurde 3 Tage lang bei 28° C unter schriebene Zusammensetzung aufwies, in einem 2-1-Schütteln gezüchtet. Die Keime wurden in 20 ml 45 Erlenmeyerkolben gezüchtet. Sie wurde dann auf 3 1 eines Gärmediums eingetragen, welches 10% einer eines ähnlichen Fermentationsmediums wie im Beiähnlichen Paraffinmischung (bestehend aus einem spiel 1 beschrieben (jedoch mit der Ausnahme, daß gleichen Volumen von je einer homologen Serie von 20% Kerosin an Stelle einer normalen Paraffin-Paraffinen mit 12 bis 14 C-Atomen sowie 0,1% mischung zugesetzt wurden und daß CaCO₃ wegge-NH₄NO₃, 0,02% MgSO₄-7H₂O, 0,025% KH₂PO₄, 50 lassen war) in einem 5-1-Fermentor geimpft. Die 0,025 % Na₂HPO₄ · 12H₂O, 0,001 % CaCl₂ · 2H₂O, Züchtung wurde unter Belüften (1 l/Min.) in 10 Tagen 0,001% MnSO₄-4 H₂O, 0,001% ZnSO₄ · 7 H₂O, unter Schütteln (600 UpM) durchgeführt. Um ein pH 0,5 mg/1 H₃BO₃, 0,05% Maisquellwasser, 0,05% des von 5 zu erhalten und zu verhindern, daß es abfällt, obengenannten oberflächenaktiven Mittels, 10 γβ wurde eine Mischlösung aus 3 n-NaOH und 3 n-Ca Na₂MoO₄ · 2H₂0,10 γβ CuSO₄ · 5H₂0,10 γβ CoCl₂ · 55 (OH)₂ (1:1) verwendet. Man erhielt in der Ferment-2H₂O, 3 mg/1 FeSO₄ · 7H₂Q und 4% CaCO₃ enthielt. brühe ein Gemisch aus Zitronensäure und Calcium-Das Medium hatte ein pH von 5 in einem ähnlichen citrat, welches 68 mg/ml Zitronensäure entsprach.
Kolben bei einem Impfstoffverhältnis von 10 %· Die

Vergärung wurde innerhalb von 14Tagen unter Beispiel 4

Schütteln (220 UpM) bei 28° C ausgeführt und ergab 60

Kristalle von Calciumcitrat, welche 40 mg/ml Zitronen- 11 mg/ml Zitronensäure wurden in Form von CaI-

säure entsprachen. ciumcitrat erhalten unter Einsatz von Aspergillus

Zu der so erhaltenen Fermentbrühe, die kristallines elegans Gasperini ATCC 20 108 in ähnlicher Weise Calciumcitrat enthielt, wurde eine 2 n-HCl-Lösung so wie im Beispiel 1 beschrieben. Es wurde zu der erhalzugefügt, daß die Kristalle vollständig gelöst wurden. 65 tenen Fermentbrühe eine 1 n-HCl-Lösung zugefügt, Die Fermentbrühe wurde filtriert, um Mikrokörper bis die Brühe ein saures pH aufwies, wobei Kristalle zu entfernen. Danach wurde das Filtrat langsam mit von Calciumcitrat vollständig gelöst wurden. Zwecks 1 n-H₂SO₄-Lösung versetzt, bis keine Trübung mehr Entfernung von Mikrobenkörpern wurde die Brühe

filtriert. Das Filtrat wurde konzentriert und durch Zusatz von 1 n-NaOH-Lösung neutralisiert. Dann setzte man dem Filtrat eine 20%ige wäßrige CaCl₂-Losung zu, bis keine Trübung im Filtrat mehr beobachtet wurde. Auf dem Filter sammelte man das Calcium-

citrat und wusch mit Wasser nach. Das Waschen und Konzentrieren wiederholte man mehrmals. Man erhielt durch Umkristallisieren aus wäßriger Lösung Kristalle von Calciumcitrat (0,15 g mit einer Reinheit 5 von 97%).

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Zitronensäure und deren Salzen durch aerobes Züchten von Pilzen der Gattung Aspergillus oder Penicillium in Kohlenstoffquellen sowie übliche Stickstoff quellen und Nährstoffe enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man

Aspergillus elegans Gasperini ATGC 20 108, Penicillium janthinellum ATCC 13 154, ^; Penicillium decumbens Thorn var.atro-virens Abe FAT 329,

Penicillium echinulo-nalgiovens Abe FAT 884, Penicillium estinogenum Komatsu & Abe

FAT 1196, ^υ

Penicillium restrictum ATCC 13 155, Penicillium chermisinum Biourge FAT 1287

oder
Penicillium paraherquei Abe FAT 670

in Gegenwart wenigstens eines Kohlenwasserstoffes als Hauptkohlenstoffquelle einsetzt.

in Gegenwart wenigstens eines Kohlenwasserstoffes als Hauptkohlenstoff quelle einsetzt. -

Mit den angegebenen Pilzen können Kohlenwasserstoffe einzeln oder in Mischung als billige Kohlenstoffquelle bei der Herstellung von Zitronensäure eingesetzt werden. Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Verfahren einfach und bezüglich der pH-Werte und der Temperaturbedingungen leicht steuerbar. Fermentationshemmende Faktoren wurden nicht beobachtet. Bei den Verfahren gemäß »Japan Agricultural and Biological Chemistry Society«, 1970, S. 34, werden bei Einsatz von η-Paraffin und von nicht näher bezeichneten Stämmen von Penicillium janthinellum und Penicillium echinulo-nalgiovens Abe Zitronensäureausbeuten von 105 bis 118% erhalten. Es hat sich gezeigt, daß mit den erfindungsgemäß einsetzbaren Stämmen dieser beiden Penicilliumarten entsprechend hohen Zitronensäureausbeuten.,erzielt werden (vgl. die nachfolgenden Beispiele 1 und 2).

Die folgende Tabelle 1 zeigt die Fähigkeit verschiedener Pilze, Zitronensäure zu produzieren, die nach einem ähnlichen wie im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren bestimmt wird.