DE1792004B2 - Verfahren zur biotechnischen herstellung von zitronensaeure und deren salzen - Google Patents
Verfahren zur biotechnischen herstellung von zitronensaeure und deren salzenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Zitronensäure und deren
Salzen durch aerobes Züchten von Pilzen der Gattung Aspergillus oder Penicillium in Kohlenstoff quellen
sowie übliche Stickstoff quellen und Nährstoffe enthaltenden Nährmedienbei hierfür üblichen Tempera-tur-
und pH-Bedingungen. Derartige Verfahren sind allgemein bekannt. ■
Bei bekannten Verfahren (vgl. deutsche Auslegeschriften 1 230 752, 1173 055, 1 086 653), werden als
Hauptkohlenstoffquellen zucker- bzw. stärkehaltige Materialien eingesetzt. Derartige Kohlenstoffquellen
stehen jedoch nicht immer und nicht in behebiger Menge und gewünschter Qualität zur Verfügung,
Es ist aber auch bereits bekannt, bei biotechnischen Prozessen auch Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoffquelle
einzusetzen. Zur Herstellung von Zitronensäure ist letzteres bisher nicht gelungen. .
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, zur biotechnischen Herstellung von Zitronensäure
Kohlenwasserstoffe als Hauptkohlenstoffquelle zu verwenden. .,:i!. ,
Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe besteht nun in einem Verfahren zur biotechnischen Herstellung
von Zitronensäure und deren Salzen durch aerobes Züchten von Pilzen der Gattung Aspergillus
oder Penicillium in Kohlenstoff quellen sowie übliche Stickstoffquellen und Nährstoffe enthaltenden Nährmedien
bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Bedingungen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß
| Menge an | |
| produzierter | |
| Stamm | Zitronen |
| säure in | |
| mg/ml | |
| Penicillium janthinellum ATCC 13 154 | 45 |
| Penicillium decumbens Thorn var. | |
| atro-virens Abe FAT 329 | 33 |
| Penicillium echinulo-nalgiovens Abe | |
| FAT*) 884 | 46 |
| Penicillium estinogenum Komatsu | |
| & Abe FAT*) 1196 | 30 |
| Penicillium restrictum ATCC 13 155 .. | 35 |
| Penicillium chermisinum Biourge | |
| FAT*) 1287 | 37 |
| Penicillium paraherquei Abe FAT 670 | 34 |
| Aspergillus elegans Gasperini ATCC | |
| 20108 ■..-,■.-..... | 10 |
Aspergillus elegans Gasperini ATCC 20 108, Penicillium janthinellum ATCC 13 154,
Penicillium decumbens Thorn var.atro-virens Abe FAT 329,
Penicillium echinulo-nalgiovens Abe FAT 884, Penicillium estinogenum Komatsu & Abe
FAT 1196,
Penicillium restrictum ATCC 13 155, Penicilhum chermisinum Biourge FAT 1287 oder
Penicillium paraherquei Abe FAT 670 *) FAT = hinterlegt bei der landwirtschaftlichen Fakultät
der Universität von Tokio.
Die Kohlenwasserstoffe, die für das erfindungsgemäße
Verfahren verwendet werden können, schließen z. B. ein Paraffin, ein Olefin, oder ein Isoparaffin mit
wechselnden Mengen an C-Atomen ein, ebenso Gasöl,
Leichtöl, Kerosin, Rohöl u. dgl., welche entweder allein oder in Mischung zu zweien oder mehreren
verwendet werden können.
Übliche Verbindungen, die bei der Vergärung Verwendung finden, können als anorganische Stickstoffquelle
verwendet werden, z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat oder Ammoniumphosphat,
obgleich Ammoniumnitrat vorzuziehen ist.
Die Zitronensäure-Vergärung kann, wie üblich, vorteilhaft bei einer Temperatur zwischen 20 und
40° C ausgeführt werden. Die bevorzugte Temperatur liegt bei etwa 28° C. Die aerobe Flüssig-Vergärung
unter Wasser kann vorteilhaft sein, aber es ist auch möglich, die Pilze in Oberflächenkulturen zu züchten.
3 4
E)ie Fermentation - geht, wie üblich, bei einem pH beobachtet wurde, und zum. Schluß zwecks Entvon'1,0
bis 8,0, bevorzugt aber beim pH von 5,0, fernung von CaSO^Niederschlägen .filtriert. Das
.vor sich. Aus diesem Grunde ist es vorzuziehen, zwecks Filtrat würde dann konzentriert und unter Kühlen
Einstellung des pH-Wertes Calciumcarbonat zuzu- stehengelassen, um Zitronensäure äuszukristallisieren.
setzen. Es ist jedoch möglich, eine geeignete Lösung :5 Die Kristalle wurden auf dem Filter gesammelt, mit
eines Alkalis, wie z.B. Natriumhydroxyd oder kaltem Wasser gewaschen und mehrmals konzentriert.
Calciumhydroxyd, entsprechend dem Fortschreiten Durch Umkristallisieren aus wäßriger Lösung erhielt
der Vergärung zuzufügen. man das Monohydrat der Zitronensäure in kristalliner
Übliche Fermentationstechniken, z. B. Zusatz von Form (0,62 g mit einer Reinheit von 96 %)·
Methanol, Kaliumferrocyanid u. dgl. können ohne io Wählt man in diesem Fall als Kohlenstoff quelle irgendeine schädliche Wirkung in das erfindungsge- einen Kohlenwasserstoff mit 15 C-Atomen, so werden mäße Verfahren eingearbeitet werden. Ausbeuten zwischen 105 bis 118 % erreicht. Aber auch
Methanol, Kaliumferrocyanid u. dgl. können ohne io Wählt man in diesem Fall als Kohlenstoff quelle irgendeine schädliche Wirkung in das erfindungsge- einen Kohlenwasserstoff mit 15 C-Atomen, so werden mäße Verfahren eingearbeitet werden. Ausbeuten zwischen 105 bis 118 % erreicht. Aber auch
Die erfindungsgemäß einsetzbaren Mikroorganismen die C13-C18-Fraktion liefert ähnlich gute Ergebnisse,
können auch auf folgende Weise gezüchtet werden,
wobei ebenfalls gute Resultate erhalten werden: 15 Beispiel 2
wobei ebenfalls gute Resultate erhalten werden: 15 Beispiel 2
Sporen, die innerhalb von 3 Tagen auf einem
Malzextrakt-Agar bei 28° C gezüchtet worden sind, Eine Saatkultur von Penicillium echinulo-nalgiovens
werden im Verhältnis von einer Öse pro 10 ml Saat- Abe FAT 884, wie sie in der landwirtschaftlichen
medium geimpft; letzteres wird innerhalb von 3 Tagen Fakultät der Universität Tokio in Japan hinterlegt
bei 28° C unter Schütteln gezüchtet. Die Saatkultur 20 und in gleicher Weise wie im Beispiel 1 beschrieben
wird einem Fermentationsmedium in einem Impfstoff- erhalten ist, wurde auf ein 20 ml Fermentationsmedium
Verhältnis von 10% zugeführt, und die Vergärung übertragen, welches eine ähnliche, wie im Beispiel 1
wird unter Rühren bei 28° C ausgeführt. beschriebene Zusammensetzung aufwies, jedoch mit
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. der Ausnahme, daß Methanol (2 %) in einem 500-ml-
25 Kolben zugefügt wurde. Die Züchtung wurde in
Beispiel 1 14 Tagen unter Schütteln (110 UpM) bei 28° C aus
geführt und ergab in der Fermentationsbrühe Kristalle
Eine Öse voll Penicillium j anthinellum ATCC13 154, von Calciumcitrat, entsprechend 55 mg/ml Zitronenweiche innerhalb von 3 Tagen bei 28° C auf einem säure.
Malzextrakt-Agar gezüchtet worden ist, wurde auf ein 30 Zum Vergleich wurde eine ähnliche Arbeit vor-Saatmedium
(20 ml) geimpft, das 5 % einer normalen genommen, jedoch ohne Methanolzusatz, und man
Paraffinmischung (bestehend aus einem gleichen VoIu- erhielt Calciumcitrat, das 40 mg/ml Zitronensäure
men einer Mischung einer homologen Serie von entsprach.
Paraffin-KW-Stoffen mit 12 bis 14 C-Atomen), 0,2% Wählt man in diesem Fall als Kohlenstoff quelle
NH4NO3, 0,03% MgSO4-7H2O, 0,025% KH2PO4, 35 einen Kohlenwasserstoff mit 15 C-Atomen, so werden
0,025% Na2HPO4 · 12H2O, 0,001% CaCl2-2H2O, Ausbeuten zwischen 105 bis 118% erreicht. Aber
0,001% MnSO4-4 H2O, 0,001% ZnSO4 · 7 H2O, auch die C13-C18-Fraktion liefert ähnlich gute Ergeb-0,5
mg/1 H3BO3, 0,1 % Maisquellwasser, 0,05 % Poly- nisse.
äthylen-Sorbitmonooleat (ein nichtionisches ober- Beispiel 3
flächenaktives Mittel), 10 y/1 Na2MoO4 · 2H2O, 10 y/1 40
CuSO4 · 5 H2O, 10 γ β CoCl2 · 2 H2O, 10 mg/1 FeSO4 · Eine Saatkultur von Penicillium restrictum ATCC
7H2O und 3% CaCO3 enthält und ein pH von 5 in 13 155 wurde unter Schütteln in einem 200 ml Saateinem
250-ml-Kolben aufweist. medium, das eine ähnliche, wie im Beispiel 1 be-
Dieses Medium wurde 3 Tage lang bei 28° C unter schriebene Zusammensetzung aufwies, in einem 2-1-Schütteln
gezüchtet. Die Keime wurden in 20 ml 45 Erlenmeyerkolben gezüchtet. Sie wurde dann auf 3 1
eines Gärmediums eingetragen, welches 10% einer eines ähnlichen Fermentationsmediums wie im Beiähnlichen
Paraffinmischung (bestehend aus einem spiel 1 beschrieben (jedoch mit der Ausnahme, daß
gleichen Volumen von je einer homologen Serie von 20% Kerosin an Stelle einer normalen Paraffin-Paraffinen
mit 12 bis 14 C-Atomen sowie 0,1% mischung zugesetzt wurden und daß CaCO3 wegge-NH4NO3,
0,02% MgSO4-7H2O, 0,025% KH2PO4, 50 lassen war) in einem 5-1-Fermentor geimpft. Die
0,025 % Na2HPO4 · 12H2O, 0,001 % CaCl2 · 2H2O, Züchtung wurde unter Belüften (1 l/Min.) in 10 Tagen
0,001% MnSO4-4 H2O, 0,001% ZnSO4 · 7 H2O, unter Schütteln (600 UpM) durchgeführt. Um ein pH
0,5 mg/1 H3BO3, 0,05% Maisquellwasser, 0,05% des von 5 zu erhalten und zu verhindern, daß es abfällt,
obengenannten oberflächenaktiven Mittels, 10 γβ wurde eine Mischlösung aus 3 n-NaOH und 3 n-Ca
Na2MoO4 · 2H20,10 γβ CuSO4 · 5H20,10 γβ CoCl2 · 55 (OH)2 (1:1) verwendet. Man erhielt in der Ferment-2H2O,
3 mg/1 FeSO4 · 7H2Q und 4% CaCO3 enthielt. brühe ein Gemisch aus Zitronensäure und Calcium-Das
Medium hatte ein pH von 5 in einem ähnlichen citrat, welches 68 mg/ml Zitronensäure entsprach.
Kolben bei einem Impfstoffverhältnis von 10 %· Die
Kolben bei einem Impfstoffverhältnis von 10 %· Die
Vergärung wurde innerhalb von 14Tagen unter Beispiel 4
Schütteln (220 UpM) bei 28° C ausgeführt und ergab 60
Kristalle von Calciumcitrat, welche 40 mg/ml Zitronen- 11 mg/ml Zitronensäure wurden in Form von CaI-
säure entsprachen. ciumcitrat erhalten unter Einsatz von Aspergillus
Zu der so erhaltenen Fermentbrühe, die kristallines elegans Gasperini ATCC 20 108 in ähnlicher Weise
Calciumcitrat enthielt, wurde eine 2 n-HCl-Lösung so wie im Beispiel 1 beschrieben. Es wurde zu der erhalzugefügt,
daß die Kristalle vollständig gelöst wurden. 65 tenen Fermentbrühe eine 1 n-HCl-Lösung zugefügt,
Die Fermentbrühe wurde filtriert, um Mikrokörper bis die Brühe ein saures pH aufwies, wobei Kristalle
zu entfernen. Danach wurde das Filtrat langsam mit von Calciumcitrat vollständig gelöst wurden. Zwecks
1 n-H2SO4-Lösung versetzt, bis keine Trübung mehr Entfernung von Mikrobenkörpern wurde die Brühe
filtriert. Das Filtrat wurde konzentriert und durch Zusatz von 1 n-NaOH-Lösung neutralisiert. Dann
setzte man dem Filtrat eine 20%ige wäßrige CaCl2-Losung
zu, bis keine Trübung im Filtrat mehr beobachtet wurde. Auf dem Filter sammelte man das Calcium-
citrat und wusch mit Wasser nach. Das Waschen und Konzentrieren wiederholte man mehrmals. Man
erhielt durch Umkristallisieren aus wäßriger Lösung Kristalle von Calciumcitrat (0,15 g mit einer Reinheit
5 von 97%).
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Zitronensäure und deren Salzen durch aerobes Züchten von Pilzen der Gattung Aspergillus oder Penicillium in Kohlenstoffquellen sowie übliche Stickstoff quellen und Nährstoffe enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß manAspergillus elegans Gasperini ATGC 20 108, Penicillium janthinellum ATCC 13 154, ; Penicillium decumbens Thorn var.atro-virens Abe FAT 329,Penicillium echinulo-nalgiovens Abe FAT 884, Penicillium estinogenum Komatsu & AbeFAT 1196, υPenicillium restrictum ATCC 13 155, Penicillium chermisinum Biourge FAT 1287oder
Penicillium paraherquei Abe FAT 670in Gegenwart wenigstens eines Kohlenwasserstoffes als Hauptkohlenstoffquelle einsetzt.in Gegenwart wenigstens eines Kohlenwasserstoffes als Hauptkohlenstoff quelle einsetzt. -Mit den angegebenen Pilzen können Kohlenwasserstoffe einzeln oder in Mischung als billige Kohlenstoffquelle bei der Herstellung von Zitronensäure eingesetzt werden. Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Verfahren einfach und bezüglich der pH-Werte und der Temperaturbedingungen leicht steuerbar. Fermentationshemmende Faktoren wurden nicht beobachtet. Bei den Verfahren gemäß »Japan Agricultural and Biological Chemistry Society«, 1970, S. 34, werden bei Einsatz von η-Paraffin und von nicht näher bezeichneten Stämmen von Penicillium janthinellum und Penicillium echinulo-nalgiovens Abe Zitronensäureausbeuten von 105 bis 118% erhalten. Es hat sich gezeigt, daß mit den erfindungsgemäß einsetzbaren Stämmen dieser beiden Penicilliumarten entsprechend hohen Zitronensäureausbeuten.,erzielt werden (vgl. die nachfolgenden Beispiele 1 und 2).Die folgende Tabelle 1 zeigt die Fähigkeit verschiedener Pilze, Zitronensäure zu produzieren, die nach einem ähnlichen wie im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren bestimmt wird.
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