DE1792004A1

DE1792004A1 - Verfahren zur Gewinnung von Citronensaeure durch Fermentation

Info

Publication number: DE1792004A1
Application number: DE19681792004
Authority: DE
Inventors: Kazuo Kimura; Katsunobu Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1967-07-21
Filing date: 1968-07-11
Publication date: 1970-05-27
Also published as: BE718133A; FR1573655A; CH494277A; IT943049B; US3652396A; GB1187334A; DE1792004B2

Description

PATENTANWALTS

Dr. Andreiewski Essen, den 10. Juli 1968

Dr.-Ing. Honke (₃₀ 979/zi)

43 Essen, Kettwiger Str. 36

(AmHauptbahnbof Üchtbuig)

Telefon 225802/03 T /92 0 04

verfahren zur Gewinnung von, Citronensäure durch fermentation

Vorliegende Erfindung betrifft ein verfahren zur gewinnung von üitronensäure und deren balzen*

Die .fermentation von baccharid-haltlgen Materialien für die Gewinnung von Citronensäure ist bekannt. Jedoch sind, wenn billige baccharid-haltige materialien, wie z.u, Melasse, verwendet werden, gewagte Vorbehandlungen und komplizierte Gärungskontrollen erforderlich, uas kommt daher, daß große uengen anorganischer ötoffe, die in den xiohmaterialien enthalten sind, auf den li'ermentationsprozeß eine hemmende rfirkung ausüben.

jiirfindungsgemäß ist ein Verfahren zur gewinnung von citronensäure und deren oalzen vorgesehen, bei dem ein Pilz der Gattung ^spergillus oder Penicillium» der - wenn er in Gegenwart eines ivohlenwasserstoffs gezüchtet ist - imstande ist, Citronensäure oder deren balze zu produzieren, in einem entsprechenden Nährmedium gezüchtet wird, wobei Citronensäure oder eines ihrer balze gewonnen wird.

uohlenwasserstoffe sind eine billige C-v<uelle, und ihre verwendung bei der Fermentation ist untersucht worden. Eine relativ große Zahl von Pilzen ist imstande, in einem ivulturmediura zu wachsen, das als iiaupt-c-^uelle kohlenwasserstoffe enthält, und einige von ihnen besitzen die x-ähigkeit, daraus Citronensäure zu produzieren.

verfahren zur Gewinnung von citronensäure aus KV-stoffen als Haupt-C-v^uelle unter verwendung derartiger Pilze hat folgende vorteile:
(Ij billige C-^uelle.
(Z) lehlen von ^ ermentations-hemnn nden taktoren, wie i-ietallsalzen, Phosphaten u, dgl.

(3) Leichte kontrolle der Zusammensetzung dee Kulturmediums. (k) Leichte uückgewinnung der υ-quelle.

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,Leichte .itontrolle der .konzentration des Jvulturmediums, (6) leichter Transport der C-^uelle.

' (7^ Leichte Reinigung und Isolierung des Endproduktes aus der χ* ermehtationsbrühe.

Das fehlen dieser Faktoren verursacht große Schwierigkeiten beim Ausführen der üblichen Citronensäure-fermentation,

uas erfindungsgemäße verfahren, das den webrauch von AW-stof- _; ^s

M fen als üaupt-U-^uelle einschließt, ist besser als jenes ver- * fahren, welches saccharide als uaupt-O-^uelle verwendet, wenigstens in .bezug auf die genannten Faktoren» i-erner enthält das nach dem erf.gemäßen ν erf. erhaltene Produkt eine citronensäure, die nur durch unbedeutende i>iengen an Verunreinigungen verschmutzt ist, wie z..d, säuren, die als Neben- _tprodukte erzeugt sind und entweder in geringer Konzentration 1

vorhanden sein oder auch fehlen können, z,a, Gluconsäure, t Oxalsäure u, dgl», die oftmals in den Produkten der üblichen Citronensäure-Vergärung gefunden werden, nebenprodukte, wie ei -Keto-Glutarsäure, Glutaminsäure und andere organische t>äuren, welche in den üblichen Produkten, die aus .bakterien stammen, oft gefunden werden, sind in dem Produkt nach dem Verfahren der Erfindung nicht gefunden worden.

Eine große Anzahl von Pilzen, die zu den Gattungen Aspergillus und Penicillium gehören, können für den erf.gemäßen Zweck verwendet werden. Gute Ergebnisse können z.ii. durch Verwendung der folgenden Pilze erhalten werden« Aspergillus auricomus (Genguen) baito, Asp, elejgana Gasperini (Ai¹CC 2D1O8), Asp, melleus Yukawa, Asp, ochraceus Wilhelum, Asp, repens (uorda) de üary, Asp, rtiaulosus Thorn ca Raper, Asp, usainii. Asp, ustus, Aap, ,tgrEicQj,ft Yar, aaierioans warchall 588, Penicilliim janthiililluai, Ρβϊχ* decumbeng, Pen, echinulo nalglovens. Pen, e s t inojrejnum, Pmu* restrict um (Ai¹CC 13155)» Pen, chermisinum Biöurg# und Pen^ paraherqüei Abe.

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Die folgende Tabelle 1 zeigt die Fähigkeit verschiedener Pilze, Citronensäure zu produzieren, die nach einem ähnlichen wie in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren bestimmt sind*

atamm menge an produzierter

Citronensäure in mg/ml

Penicillium .janthinellum JV8¹ 168-172-A-2 35

Pen. Jan.» 676 4l

Pen. Jan. i>8i J₁ATCO 1315^, ²O

Pen. Jan, ÜV3« - I68-I97 32

Pen, decumbens Thorn var. atro-virens Abe α>\αΤ 329 33

Pen, echinulo-nalgiovens ii.be a<AT^x 884 kb

Pen, estinogenum ivomatsu 00 Abe γα'γ 1196 3^υ

Pen, restrictum Zk 1 I₁ATCC 1 3133) 35

Pen, chermisinum liiourge i?"AT 1287 37

Pen, paraherquei Abe iai 670 3^

Aspergillus auricomus ^genguenj csaito 12

Asp, elegans irasperini 10

^Xi?'AT - hinterlegt bei der landwirtschaftlichen rakultät der Universität von lokio

Die K¥-stoffe, die für das erf.gemäße verf. verwendet werden können, schließen z.jü. ein Paraffin, ein Olefin, oder ein Xsoparaffin mit wechselnden Mengen an U-ütomen ein, ebenso txasöl, .Leichtöl, üerosin, KohÖl u. dgl., welche entweder allein oder in Mischung zu zweien oder mehreren verwendet werden können. Diese KW-stoffe können in flüssiger oder ü-asform verwendet werden.

Übliche Verbindungen, die bei der Vergärung Verwendung finden, können als anorganische otickstoffquelle verwendet werden, ζ.ϋ, anunoniumsulfat, ^unmoniumchlorid, Ammoniumnitrat oder Ammoniumphosphat, obgleich Ammoniumnitrat vorzuziehen ist.

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Die Citronensäure-Vergärung kann vorteilhaft bei einer Temperatur zwischen 20 und 40 C ausgeführt werden. Die bevorzugte Temperatur liegt bei ca. 28 C. Die aerobe j^lüssig-Vergärung unter Wasser kann vorteilhaft sein, aber es ist auch möglich, die Pilze in Überflächenkulturen zu züchten. Die Fermentation geht bei einem p„ von 1,0-8,0, bevorzugt aber beim p„ von ca, 5»^υ vor sich. Aus diesem Grunde ist es vorzuziehen, zwecks Einstellung des ρ -Wertes Galciumcarbonat

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zuzusetzen. Es ist jedoch möglich, eine geeignete Lösung eines Alkalis, wie z,i3. Natriumhydroxyd oder Calciumhydroxyd, entsprechend dem x· ort schreiten der vergärung zuzufügen.

Übliche υermentationstechniken, z.i>. Zusatz von methanol, Kaliumferrocyanid u, dgl, können ohne irgendeine schädliche Wirkung in das erfindungsgemäße verfahren eingearbeitet werden,

Mikroorganismen können erf.gemäß auf folgende Weise gezüchtet werden, wobei auch gute Kesultate erhalten werden können:

bporen, die innerhalb von 3 xagen auf einem Malzextrakt-Agar bei 28 C gezüchtet worden sind, werden im Verhältnis von einer Öse voll auf 10 ml üaatmedium geimpft; letzteres wird innerhalb von 3 Tagen bei 28 C unter schütteln gezüchtet. Die baatkultur wird einem ^ermentationsmedium in einem Impfstoffverhältnis von 10 y> zugeführt, und die Vergärung wird unter Kühren bei 28°G ausgeführt.

Die nachfolgenden, jedoch nicht einschränkenden .Beispiele erläutern die &τfindung:

Beispiel 1

Eine Öse voll Penicillium janthinellum 581 (AJLOC 1315^, welche innerhalb von 3 -tagen bei 28 G auf einem malzextrakt-Agar gezüchtet worden ist, wurde auf ein c>aatmedium (,2O ml) geimpft, das 5 ¹P einer normalen Paraffinmischung ( bestehend aus einem gleich η Volumen einer Mischung einer homologen berie von Paraffin-KW-stoffen mit 12 bis lh G-Atomen ),

0,2 > NH₄NO₃, 0,03 -ρ MgSO₄.7 ty), 0,025 # KH₂PO₄, 0,025 ,12 H₂O, 0,ϋΟ1 ^b GaCl₂.2 HgO, 0,001 % MnSO₄,k Hg

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0,001 $> ZnSO, .7 H₀O, 0,5 mg/1 H„JdO_a, ü,1 ψ i-iaiswasser, 0,05 # wonion ßfS: 221 ( ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, das durch Nippon iushi iv.iv, , Japan zu erhalten ist), 10 .1-/1 £Ja₂wo0^.2 HgO, 10 y/± CuSO^.5 H₃O, 1O t-/l CoCl₂.2 H₃O, 10 mg/1 Jj'eSO^.7 HgO und 3 y> CaCO- enthält und ein p„ von 5 in einem 250 ml-Jvolfoen aufweist. Dieses Medium wurde 3 Tage lang bei 28°C unter schütteln gezüchtet. Die iveime würden in 2O ml eines «järmediums eingetragen, welches 10 ψ einer ähnlichen Paraffinmischung enthielt (bestehend aus einem gleichen Volumen von je einer homologen uerie von Paraffinen mit 12 bis Ik C-Atomen), ferner 0,1 > wH^NO-, 0,02 ■£ MgSO^.7 H,JL», 0,025 7b ^, 0,025 1° Na₂HPO^. 12 HgO, 0,001 f, CaCIg.2 H₃O, 0,001 γ> .k H₂O, 0,001 70 ünbO^.7 HgO, 0,5 mg/1 H₃IiO₃, 0,05 ¹P Maiswasser, O,O5 /o Nonion OT 221, Λογ/Χ wa₂i>io0^.2 HgO, 1Θ Wl CubO^.5 H₂O, ΛΟ/f/l. CoCl₂.2 H₃O, 3 mg/1 jjebO^.7 H₃O und 4 f> CaCO . Das i-iedium hatte ein p_ von 5 in einem ähnlichen Kolben bei einem Impf stoff verhältnis von 1ü>o. .uie Vergärung wurde innerhalb von \h Tagen unter Schütteln ( 220 r.p.m. ) bei 28 C ausgeführt und ergab .kristalle von Calciumcitrat, welche 40 mg/ml Citronensäure entsprachen.

Zu der so erhaltenen u'ermentbrühe, die kristallines calciumcitrat enthielt, wurde eine 2 η iriCl-Lösung so zugefügt, daß die .kristalle vollständig gelöst wurden· Die 1¹ ermentbrühe wurde filtriert, um liikrokörper zu entfernen, danach wurde das FiI-trat langsam mit 1 η H₂SOr-.Lösung versetzt, bis keine rrübung mehr beobachtet wurde, und zum Schluß zwecke Entfernung von Caoü.-Niederschlägen filtriert. i)as jj'iltrat wurde dann konzentriert und unter kühlen stehengelassen, um Citronensäure auszukristallisieren. uie lvristalle wurden auf dem filter gesammelt, mit kaltem nasser gewaschen und mehrmals konzentriert. Durch Umkristallisieren aus wässriger Lösung erhielt man das iionohydrat der Citronensäure in kristalliner iorm ( o,62 si Reinheit: 96 ^lfo ).

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üeiapiel 2

.Eine baatkultur von Penicillium echinulo-nalgiobens Abe ~ Jj¹AT 884, wie sie in der landwirtschaftlichen Fakultät der Universität Tokio in Japan hinterlegt und in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten ist, wurde auf ein 2O ml χ¹ ermentationsmedium übertragen, welches eine ähnliche Zusammensetzung wie im Beispiel 1 beschrieben aufwies, jedoch mit der .ausnähme, daß methanol ( 2 >■) in einem 5üü ml-üolben zugefügt wurde. Die Züchtung wurde in i4 Tagen unter ochütteln ( 110 r.p.m. ; bei 28°C ausgeführt und ergab in der xermentationsbrühe kristalle von calciumcitrat, entsprechend 55 mg/ml citronensäure, w

Zum Vergleich wurde eine ähnliche .arbeit vorgenommen, jedoch ohne Methanolzusatz, und man erhielt üalciumcitrat, das 4o mg/ml citronensäure entsprach.

üeispiel J

Eine Saatkultir von Penicillium reatriotum 241 (AtCC 13 155) wurde unter Schütteln in einem 200 ml Saatmedium, das eine ähnliche Zusammensetzung wie im öeispiel I beschrieben aufwies, in einem Sti Z Liter-Erlenmeyerkolben gezüchtet. Sie wurde dann auf 3 1 eines ähnlichen Fermentationsmediums wie im Beispiel 1 beschrieben ( jedoch mit der Ausnahme, daß 20 % Kerosin anstelle einer normalen Paraffinmiachung zugesetzt wurde und daß CaCO- weggelassen war ) in einem 5 1-Fermentor geimpft· Die Züchtung wurde unter belüften { 1 l/raia.) in 10 Tagen unter Schütteln ( 600 r.p.m. ) durchgeführt. Um ein P_H von 5 zu halten und zu verhindern, daß es abfällt, wurde eine wischlösung aus 3 η waOH und 3 η Ca(OH)- (til) verwendet, »an erhielt in der Fermentbrühe ein Gemisch aus Citronensäure und Calciumcitrat, welches 68 mg/ml Citronensäure entsprach»

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iJeispiel k

11 mg/ml Citronensäure wurden in r'orm von Oalciumcitrat erhalten durch behandlung von Aspergillus elegans uasperini (AjlOO nr« 20108j in ähnlicher Weise wie in ueispiel 1 beschrieben.

üis wurde zu der erhaltenen nährlösung eine 1 η HCl-Lösung zugefügt, bis die urühe ein saures ρ aufwies, wobei Kriialle von Calciumcitrat vollständig gelöst wurden. Zwecks entfernung von jiikrobenkörpern wurde die urühe filtriert. Das i'iltrat wurde konzentriert und durch Zusatz von 1 η naOli neutralisiert. Dann setzte man dem .tiltrat eine 20 wässrige Oaulp-Lösung zu, bis keine rrübung im riltrat mehr beobachtet wurde, auf dem .filter sammelte man das Calciumcitrat und wusch mit Wasser nach. Das .«aschen und n.onzeutrieren wiederholte man mehrmals, wan erhielt durch Umkristallisieren aus wässriger Jbüsung lvristalle von Calciumcitrat ^ 0,15 £.· Keinlieit 97 ^. ) .

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Claims

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Patentansprüche

1. Verfahren zur Gewinnung von Citronensäure und deren balzen, dadurch gekennzeichnet, daß der Pils des Genus Aspergillus oder Penicillium, der imstande ist, Citronensäure oder deren Salze in Gegenwart von Kohlenwasserstoffen durch Züchten zu produzieren, in einem entsprechenden Nährraediura in Gegenwart wenigstens eines Kohlenwasserstoffe unter Bildung von Citronensäure oder eines ihrer Salze gezüchtet wird.

2, Verf. nach Anspr. 1, dad. gek., daß der Pils de· Genus Aspergillus oder Penicillium ausgewählt wird aus auricobus (Genguen) Saito, Asp« elegans Gasperini (ATCC 20108), App. melleus Yukawa, Asp, ochraoeus Wilhelm, Aep. reoena (Cor da) de bary, abd. rugulosus Thorn <k Raper, Ajff, iflfff fflifljj - Asp. uatus. Asp, terricola vwt« araerie^ri# warohai 388. P<>»]ioA3 Sjl»»| XanthineHum. Pen, deoumbens. Pen, echimtlo nalglftvpna. Pen, estinogenum. Pen, restrictum. Pen. Gh^Yy^fi^am, sowie Pen« paraherquei.

3« Verf. nach den Anspr. 1 oder 2, dad. gek., daß der Pilz einer aeroben Unterwasserkultur unterworfen wird«

4« Verf. nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dad, gek., daß der Kohlenwasserstoff ein Paraffin, ein Olefin oder ein Isoparaffin einschließt.

5· verf. nach einem der Anspr. 1 bis 3» dad« gek., daß der Kohlenwasserstoff ein Gasöl, Leichtöl, Kerosin oder Rohöl einschließt.

6· Verf. na6h einem der vorhergehenden Ansprüche, dad. gek., daß der Pilz bei einer Temperatur zwischen 2O und 4ö°C gezüchtet wird.

7« Verf. nach Anspr. 6, dad. gek., daß die Temperatur ca. 28°C beträgt.

8· Verf. nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dad, gek., daß das Mährmedium eine anorganische btickstoffquelle enthält. -

9, Verf. nach Anspr. 8, dad. gek., daß die anorganische Stickstoff quelle ein Ammoniumsulfat, AmmoniuMchlorid, Ammoniumnitrat

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oder Ammoniumphosphat besteht«

10« Verf. nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dad» gek., daß das ρ des nährmediums während der Züchtung zwischen
1,0 und 8,0 liegt.

11. verf. nach Anspr. 10, dad. gek., daß das p„ des ^ährmediums ca. 5»0 beträgt.

12. Verf. nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dad. gek.* daß das p„ des währmedlums durch Zusatz von Calciumcarbonat
eingestellt wird.

13· Verf. nach einem der Anspr. 1-11. dad. gek., daß das p_H
des iJährmediums durch Zusatz der Lösung eines Alkalis eingestellt wird.

l4, Verf. nach Anspr. 13» dad, gek., daß das Alkali aus
Natriumhydroxyd oder Calciumhydroxyd besteht.

15· Verf. nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dad. gek., daß das i<ährmedium ^ethanol oder ivaliumferrocyanid enthält.

16. Verf. nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dad. gek., daß der Pilz des Genus Aspergillus oder i^enicillium vorher auf einem walzextrakt-Agar gezüchtet wird,

17. Verf. nach ^nspr. 16, dad. gek., daß das züchten bei
einer Temperatur von ca. 28 C ausgeführt wird,

18. Verf. nach den Anspr, Λ6 oder 17» dad. gek,, daß das
Züchten in ca, 3 -tagen durchgeführt wird,

19· Verf. nach einem der vorhergehenden Einsprüche, dad, gek., daß der Pilz in das währmedium in einem verhältnis von ca, 10 % eingeimpft wird.

20. Verf. nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dad. gek., daß das entstehende balz der Citronensäure üalciumcitrat ist,

21. Citronensäure und deren salze, gekennzeichnet durch die
.herstellung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche.

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