DE2849393A1 - Verfahren zur herstellung von 2,5-diketogluconsaeure - Google Patents
Verfahren zur herstellung von 2,5-diketogluconsaeureInfo
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Description
DR. A. VAN DER WERTH DR. FRANZ LEDERER REINER F. MEYER
DlPL-ING. (ΐ934-ΐί74) DIPL-CHEM. DIPL.-ING.
8000 MÜNCHEN 80 LUCILE-GRAHN-STRASSE 22
TELEFON: (089) 472947 TELEX: 524624 LEDER D TELEGR.: LEDERERPATENT
29. September 1978 PC 5938
PFIZER INC.
235 East 42nd Street, New York, N.Y. 10017, USA
235 East 42nd Street, New York, N.Y. 10017, USA
Verfahren zur Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure
Die Erfindung betrifft die Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure,
von 2-Ketogulonsäure und 2-Ketogluconsäure.
2,5-Diketogluconsäure ist ein brauchbares Zwischenprodukt
bei der Synthese von Vitamin C. Bislang wurde 2,5-Diketogluconsäure
von mehreren unterschiedlichen Arten von Bakterien wie Acetobacter melanogenum, Acetobacter aurantium,
Glixconoacetobacter rubiginosus, Gluconoacetobacter liquifaciens
und Pseudomonan nesami gebildet. Die Verwendung dieser Mikroorganismen
ist jedoch vom technischen Standpunkt aus nicht
9098Ρ1/Π578
vollständig zufriedenstellend wegen der großeil Mengen an braunen
oder gelblich-braunen Pigmenten als Nebenprodukten der Kultivierung, wodurch die Reinheit der gleichzeitig gebildeten 2,5-Diketogluconsäure
vermindert wird.
In der US-Patentschrift 3 790 444- ist die Bildung von 2,5-Diketogluconsäure
ohne begleitendes, braunes Pigment durch eine neue Species, welche als Acetobacter fragum bezeichnet wird, beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure unter Verwendung
von leicht zugänglichen, öffentlich aufbewahrten Stämmen von Acetobacter cerinus. Zwei dieser Stämme , nämlich IFO 3265 und
3266,bilden 2,5-Diketogluconsäure in Ausbeuten von >
95 %> bezogen auf Glucose.
2,5-Diketogluconsäure ist als Zwischenprodukt zur Herstellung
von Ascorbinsäure brauchbar. Eine wäßrige Lösung von 2,5-Diketogluconsäure kann selektiv reduziert werden, um ein Gemisch von
2-Ketogulonat und 2-Ketogluconat zu bilden, welche zu Ascorbinsäure
und Erythrobinsäure (Isoascorbinsäure) umgewandelt werden
können*
2,5-Diketogluconsäure wird einfach durch die bakterielle Wirkung
auf Glucose gebildet, wobei gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren leicht zugängliche Stämme von Acetobacter cerinus
eingesetzt werden. Alle die aufgeführten, öffentlich gehaltenen Stämme von Acetobacter cerinus wurden untersucht und zeigten
bei dieser Untersuchung, daß sie Ketosäuren in einer Ausbeute von 50 bis 95 %» bezogen auf Glucose, bilden. Wenn Acetobacter
cerinus IFO 3263 oder 3266 verwendet wird, besteht die gebildete Ketosäure vollständig aus der gewünschten 2,5-Diketogluconsäure
in Ausbeuten von > 95 %» bezogen auf Glucose. Die zugänglichen,
öffentlich gehaltenen Stämme von Acetobacter cerinus sind wie folgt:
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28A9393
IiO 3262 (ATCC 12JOJ)
3263
3264
3265
3266
3267
3268
3263
3264
3265
3266
3267
3268
3269
Diese Stämme von Acetobacter cerinus werden in einem Medium
gezüchtet, dessen Hauptkohlenstoffquelle Glucose ist. Diese
Mikroorganismen erfordern keine kostspieligen Quellen für organischen Stickstoff wie Pepton oder Fleischextrakt. Wenn Harnstoff
und Quellen für anorganischen Stickstoff wie Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat oder Ammoniumphosphat verwendet werden,
wird Nikotinsäure als essentieller Wachstumsfaktor zugesetzt.
Die Glucosekonzentration in dem Medium variiert zwischen 2,5 und 20 %, vorzugsweise zwischen 10 und 12 %, um 2,5-Diketogluconsäure
in besonders wirtschaftlicher Weise zu erhalten. Die Fermentationstemperatur
liegt zwischen 20 0C und 35 °C und vorzugsweise
zwischen 25 und 30 0C, ganz besonders bevorzugt in der
Nähe von 28 0C. Der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums kann von
3,5 his 7i5 und vorzugsweise von 5 his 6 variieren. Im Verlauf
der Fermentation wird der pH-Wert bei etwa 5»5 durch Zugabe von Natriumhydroxidlösung gehalten. Calciumcarbonat kann zur pH-Steuerung
verwendet werden, und es wird in einem Ansatzmedium nach der Autoklavenbehandlung in einer Menge von 30 g pro 110 g
Glucose zugesetzt.
Nach dem Impfen wird das Fermentationsmedium mit einem mechanischen
Rührer bei etwa 1700 Upm gerührt, und es wird in einer
Rate von 0,5 bis 1 Volumen Luft pro Volumen der Brühe pro Minute belüftet.
Bei der Verwendung von Acetobacter cerinus IFO 3263 oder 3266 wird die Fermentation solange durchgeführt, bis eine Ausbeute
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von 2,5-Diketogluconsäure von wenigstens 90 %, bezogen auf
Glucose, erhalten wird, wobei dies üblicherweise 36 bis 40 Stunden
erfordert.
Papierchromatografisch wurde bestimmt, daß die Umwandlung von Glucose zu 2,5-Diketogluconsäure auf folgenden Wegen verläuft:
Glucose —>2-Ketogluconsäure —>
2,5-Diketogluconsäure Glucose —^5-Ketogluconsäure —>
2,5-Diketogluconsäure.
Als Chromatografierpapier wurde handelsübliches Filterpapier (Whatman No. 1 und No. 4) verwendet, als Lösungsmittelsystem
Methyläthylketon:Aceton:Ameisensäure:Wasser (80:6:2:12). Die Flecken der Säure wurden durch Besprühen mit einer 0,2 %igen
äthanolischen Lösung von o-Phenylendiamin, welche 1 % Salpetersäure
enthielt, und Erwärmen auf etwa 70 0C lokalisiert, wobei
5-Ketogluconsäure eine blaue Färbung, 2-Ketogluconsäure eine
gelbe Färbung und 2,5-Diketogluconsäure eine grüne Färbung ergab.
Zur Identifizierung kann ebenfalls die Hochdruckflüssigkeitschromatografie
eingesetzt werden.
2,5-Diketogluconsäure kann aus der zum Schluß erhaltenen Fermentationsbrühe
nach jeder beliebigen, dem Fachmann an sich bekannten, konventionellen Arbeitsweise abgetrennt und gewonnen werden.
Die filtrierte Fermentationsbrühe kann als solche durch Behandlung mit einem Borhydrid weiterverarbeitet werden, und das erhaltene
Gemisch von 2-Ketogluconsäure und 2-Ketogulonsäure kann unter Bildung von Ascorbinsäure und Erythorbinsäure hydrolysiert
werden.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Das folgende wäßrige Impfmedium wurde hergestellt:
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Bestandteil g/l
Glucose 25 Maisquellwasser 5
KH2PO4 0,5
K2HPO4 0.5
MgSO4.7H2O 0,2
CaCO, 6,3
pH = 6,2
Eine Schüttelflasehe, welche 1 1 des Mediums enthielt, wurde
30 Minuten^bei 121 0C im Autoklaven behandelt. Der pH-Wert
des abgekühlten Mediums lag bei 5,0. Zellen von Acetobacter cerinus Ii1O 3263 aus einer Nähragar/Schrägplatte (5 ml einer
20 ml sterilen, wäßrigen Suspension) wurden in die Flasche gegeben, die dann auf einem Drehschüttler bei etwa 28 0C für
etwa 24- Stunden geschüttelt wurde.
Eine Teilmenge der Kulturzüchtungsbrühe, welche zur Bereitstellung
einer 5 Vol./Vol.-% Impfmenge ausreichte, wurde in einen
4—1-Fermentator gegeben» der 2 1 des folgenden Produktionsmediums
enthielt:
Bestandteil g/l
Glucose 110
Maisquellwasser 0,5
(NH4)2HP04 0,58
KH2PO4 1,5
MgSO4.7H2O 0,5
Harnstoff 0,5
CuSO4.5H2O 1 mg
Nikotinsäure 300 ug pH = 6,0
Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von etwa 28 0C unter
Rühren bei I7OO Upm und Belüftung mit einer Rate von 0,75 Volumen
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pro Volumen der Brühe pro Minute durchgeführt. Nach einer
Fermentationsperiode von etwa 20 Stunden wurde sterile Glucose (55 g/l) zugesetzt. Der pH-Wert wurde auf 5»5 durch Zugabe von
ITatriumhydroxidlösung gehalten. Die Fermentation wurde fortgeführt,
"bis eine Ausbeute von 2,5-Diketogluconsäure von
* 95 %» bezogen auf Glucose, erreicht war.
Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde mit vergleichbaren Ergebnissen
wiederholt, wobei Acetobacter cerinus IFO 3266 eingesetzt wurde.
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Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure,
dadurch gekennzeichnet, daß Acetobacter cerinus in einem Glucosemedium aerob vermehrt wird und
dann die erhaltene 2,5-Diketogluconsäure gewonnen wird
oder die Fermentationsbrühe durch selektive Reduktion unter Bildung von 2-Ketogulonsäure und 2-Ketogluconsäure
verarbeitet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Glucosekonzentration im Medium von 2,5 bis 20 % beträgt,
die Fermentationstemperatur von 20 0C bis 35 C ist, der
anfängliche pH-Wert von 3»5 bis 7i5 beträgt und der pH-Wert
während der Fermentation bei etwa 5i5 gehalten wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Acetobacter cerinus der Stamm XFO 3263 verwendet
wird.
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7849393
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß als Acetobacter cerinus der Stamm IEO 3266 verwendet
wird.
5· 2,5-Diketogluconsäure, 2-Ketogulonsäure oder 2-Ketogluconsäure,
hergestellt nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
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