DE2849393A1 - Verfahren zur herstellung von 2,5-diketogluconsaeure - Google Patents

Description

DR. A. VAN DER WERTH DR. FRANZ LEDERER REINER F. MEYER

DlPL-ING. (ΐ934-ΐί74) DIPL-CHEM. DIPL.-ING.

8000 MÜNCHEN 80 LUCILE-GRAHN-STRASSE 22

TELEFON: (089) 472947 TELEX: 524624 LEDER D TELEGR.: LEDERERPATENT

29. September 1978 PC 5938

PFIZER INC.
235 East 42nd Street, New York, N.Y. 10017, USA

Verfahren zur Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure

Die Erfindung betrifft die Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure, von 2-Ketogulonsäure und 2-Ketogluconsäure.

2,5-Diketogluconsäure ist ein brauchbares Zwischenprodukt bei der Synthese von Vitamin C. Bislang wurde 2,5-Diketogluconsäure von mehreren unterschiedlichen Arten von Bakterien wie Acetobacter melanogenum, Acetobacter aurantium, Glixconoacetobacter rubiginosus, Gluconoacetobacter liquifaciens und Pseudomonan nesami gebildet. Die Verwendung dieser Mikroorganismen ist jedoch vom technischen Standpunkt aus nicht

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vollständig zufriedenstellend wegen der großeil Mengen an braunen oder gelblich-braunen Pigmenten als Nebenprodukten der Kultivierung, wodurch die Reinheit der gleichzeitig gebildeten 2,5-Diketogluconsäure vermindert wird.

In der US-Patentschrift 3 790 444- ist die Bildung von 2,5-Diketogluconsäure ohne begleitendes, braunes Pigment durch eine neue Species, welche als Acetobacter fragum bezeichnet wird, beschrieben.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure unter Verwendung von leicht zugänglichen, öffentlich aufbewahrten Stämmen von Acetobacter cerinus. Zwei dieser Stämme , nämlich IFO 3265 und 3266,bilden 2,5-Diketogluconsäure in Ausbeuten von > 95 %> bezogen auf Glucose.

2,5-Diketogluconsäure ist als Zwischenprodukt zur Herstellung von Ascorbinsäure brauchbar. Eine wäßrige Lösung von 2,5-Diketogluconsäure kann selektiv reduziert werden, um ein Gemisch von 2-Ketogulonat und 2-Ketogluconat zu bilden, welche zu Ascorbinsäure und Erythrobinsäure (Isoascorbinsäure) umgewandelt werden können*

2,5-Diketogluconsäure wird einfach durch die bakterielle Wirkung auf Glucose gebildet, wobei gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren leicht zugängliche Stämme von Acetobacter cerinus eingesetzt werden. Alle die aufgeführten, öffentlich gehaltenen Stämme von Acetobacter cerinus wurden untersucht und zeigten bei dieser Untersuchung, daß sie Ketosäuren in einer Ausbeute von 50 bis 95 %» bezogen auf Glucose, bilden. Wenn Acetobacter cerinus IFO 3263 oder 3266 verwendet wird, besteht die gebildete Ketosäure vollständig aus der gewünschten 2,5-Diketogluconsäure in Ausbeuten von > 95 %» bezogen auf Glucose. Die zugänglichen, öffentlich gehaltenen Stämme von Acetobacter cerinus sind wie folgt:

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IiO 3262 (ATCC 12JOJ)
3263
3264
3265
3266
3267
3268

3269

Diese Stämme von Acetobacter cerinus werden in einem Medium gezüchtet, dessen Hauptkohlenstoffquelle Glucose ist. Diese Mikroorganismen erfordern keine kostspieligen Quellen für organischen Stickstoff wie Pepton oder Fleischextrakt. Wenn Harnstoff und Quellen für anorganischen Stickstoff wie Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat oder Ammoniumphosphat verwendet werden, wird Nikotinsäure als essentieller Wachstumsfaktor zugesetzt.

Die Glucosekonzentration in dem Medium variiert zwischen 2,5 und 20 %, vorzugsweise zwischen 10 und 12 %, um 2,5-Diketogluconsäure in besonders wirtschaftlicher Weise zu erhalten. Die Fermentationstemperatur liegt zwischen 20 ⁰C und 35 °C und vorzugsweise zwischen 25 und 30 ⁰C, ganz besonders bevorzugt in der Nähe von 28 ⁰C. Der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums kann von 3,5 his 7i5 und vorzugsweise von 5 his 6 variieren. Im Verlauf der Fermentation wird der pH-Wert bei etwa 5»5 durch Zugabe von Natriumhydroxidlösung gehalten. Calciumcarbonat kann zur pH-Steuerung verwendet werden, und es wird in einem Ansatzmedium nach der Autoklavenbehandlung in einer Menge von 30 g pro 110 g Glucose zugesetzt.

Nach dem Impfen wird das Fermentationsmedium mit einem mechanischen Rührer bei etwa 1700 Upm gerührt, und es wird in einer Rate von 0,5 bis 1 Volumen Luft pro Volumen der Brühe pro Minute belüftet.

Bei der Verwendung von Acetobacter cerinus IFO 3263 oder 3266 wird die Fermentation solange durchgeführt, bis eine Ausbeute

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von 2,5-Diketogluconsäure von wenigstens 90 %, bezogen auf Glucose, erhalten wird, wobei dies üblicherweise 36 bis 40 Stunden erfordert.

Papierchromatografisch wurde bestimmt, daß die Umwandlung von Glucose zu 2,5-Diketogluconsäure auf folgenden Wegen verläuft:

Glucose —>2-Ketogluconsäure —> 2,5-Diketogluconsäure Glucose —^5-Ketogluconsäure —> 2,5-Diketogluconsäure.

Als Chromatografierpapier wurde handelsübliches Filterpapier (Whatman No. 1 und No. 4) verwendet, als Lösungsmittelsystem Methyläthylketon:Aceton:Ameisensäure:Wasser (80:6:2:12). Die Flecken der Säure wurden durch Besprühen mit einer 0,2 %igen äthanolischen Lösung von o-Phenylendiamin, welche 1 % Salpetersäure enthielt, und Erwärmen auf etwa 70 ⁰C lokalisiert, wobei 5-Ketogluconsäure eine blaue Färbung, 2-Ketogluconsäure eine gelbe Färbung und 2,5-Diketogluconsäure eine grüne Färbung ergab. Zur Identifizierung kann ebenfalls die Hochdruckflüssigkeitschromatografie eingesetzt werden.

2,5-Diketogluconsäure kann aus der zum Schluß erhaltenen Fermentationsbrühe nach jeder beliebigen, dem Fachmann an sich bekannten, konventionellen Arbeitsweise abgetrennt und gewonnen werden. Die filtrierte Fermentationsbrühe kann als solche durch Behandlung mit einem Borhydrid weiterverarbeitet werden, und das erhaltene Gemisch von 2-Ketogluconsäure und 2-Ketogulonsäure kann unter Bildung von Ascorbinsäure und Erythorbinsäure hydrolysiert werden.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Das folgende wäßrige Impfmedium wurde hergestellt:

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Bestandteil g/l

Glucose 25 Maisquellwasser 5

KH₂PO₄ 0,5

K₂HPO₄ 0.5

MgSO₄.7H₂O 0,2

CaCO, 6,3

pH = 6,2

Eine Schüttelflasehe, welche 1 1 des Mediums enthielt, wurde 30 Minuten^bei 121 ⁰C im Autoklaven behandelt. Der pH-Wert des abgekühlten Mediums lag bei 5,0. Zellen von Acetobacter cerinus Ii¹O 3263 aus einer Nähragar/Schrägplatte (5 ml einer 20 ml sterilen, wäßrigen Suspension) wurden in die Flasche gegeben, die dann auf einem Drehschüttler bei etwa 28 ⁰C für etwa 24- Stunden geschüttelt wurde.

Eine Teilmenge der Kulturzüchtungsbrühe, welche zur Bereitstellung einer 5 Vol./Vol.-% Impfmenge ausreichte, wurde in einen 4—1-Fermentator gegeben» der 2 1 des folgenden Produktionsmediums enthielt:

Bestandteil g/l

Glucose 110

Maisquellwasser 0,5

(NH₄)₂HP0₄ 0,58

KH₂PO₄ 1,5

MgSO₄.7H₂O 0,5

Harnstoff 0,5

CuSO₄.5H₂O 1 mg

Nikotinsäure 300 ug pH = 6,0

Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von etwa 28 ⁰C unter Rühren bei I7OO Upm und Belüftung mit einer Rate von 0,75 Volumen

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pro Volumen der Brühe pro Minute durchgeführt. Nach einer Fermentationsperiode von etwa 20 Stunden wurde sterile Glucose (55 g/l) zugesetzt. Der pH-Wert wurde auf 5»5 durch Zugabe von ITatriumhydroxidlösung gehalten. Die Fermentation wurde fortgeführt, "bis eine Ausbeute von 2,5-Diketogluconsäure von * 95 %» bezogen auf Glucose, erreicht war.

Beispiel 2

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde mit vergleichbaren Ergebnissen wiederholt, wobei Acetobacter cerinus IFO 3266 eingesetzt wurde.

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Claims (4)

München, 29. Sept. 1978 PC 5938 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure, dadurch gekennzeichnet, daß Acetobacter cerinus in einem Glucosemedium aerob vermehrt wird und dann die erhaltene 2,5-Diketogluconsäure gewonnen wird oder die Fermentationsbrühe durch selektive Reduktion unter Bildung von 2-Ketogulonsäure und 2-Ketogluconsäure verarbeitet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

die Glucosekonzentration im Medium von 2,5 bis 20 % beträgt, die Fermentationstemperatur von 20 ⁰C bis 35 C ist, der anfängliche pH-Wert von 3»5 bis 7i5 beträgt und der pH-Wert während der Fermentation bei etwa 5i5 gehalten wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Acetobacter cerinus der Stamm XFO 3263 verwendet wird.

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4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Acetobacter cerinus der Stamm IEO 3266 verwendet wird.

5· 2,5-Diketogluconsäure, 2-Ketogulonsäure oder 2-Ketogluconsäure, hergestellt nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

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