DE1812710C3

DE1812710C3 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Zitronensäure und ihren Salzen durch Mikroorganismen

Info

Publication number: DE1812710C3
Application number: DE1812710A
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Iizuka; Kazumitsu Ishii; Yoshikazu Nakajima; Junichi Shimizu
Original assignee: Joh A Benckiser 6700 Ludwigshafen GmbH
Current assignee: Joh A Benckiser 6700 Ludwigshafen GmbH
Priority date: 1967-12-19
Filing date: 1968-12-04
Publication date: 1978-11-09
Also published as: FR1595297A; DE1812710B2; DE1812710A1; US3622455A; GB1218476A; BE724553A

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Zitronensäure durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus in einer zuckerhaltigen Kulturflüssigkeit.

Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Zitronensäure durch Mikroorganismen in zuckerhaltigen Nährsubstraten sind bereits bekannt (vgl. u.a. die deutsche Auslegeschrift 10 86 653).

Ferner wird in der deutschen Offenlegungsschrift 08 615 ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure mit Hilfe von Mikroorganismen vorgeschlagen. Nach diesem Verfahren wird u.a. ein Stamm der eo Gattung Candida unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen, Kohlehydrat enthaltenden Nährmedium kultiviert, bis sich eine Konzentration von mindestens etwa 1 g Zitronensäure/Liter Medium angesammelt hat, und die Zitronensäure gewonnen.

Die Zitronensäureausbeuten sind bei den erwähnten Verfahren aber verhältnismäßig gering und lassen noch zu wünschen übrig.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einmal einen neuen, weiteren Weg zur Herstellung von Zitronensäure mit Hilfe von Mikroorganismen zu schaffen und zum anderen die Zitronensäure in besseren Ausbeuten zu erhalten.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß man Candida oleophila ATCC 20 177 unter aeroben Bedingungen in einer Kulturflüssigkeit, die assimilierbare Kohlehydrate, eine übliche Menge einer Stickstoff quelle, anorganische Salze und Vitamine enthält, züchtet, und daß man die Kultivierung bei einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 8 durch anfängliche Zugabe oder gelegentliche Zugaben einer geeigneten Menge eines Neutralisierungsmittels ausführt

Überraschenderweise wurde gefunden, daß man nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Zitronensäure in hohen und verbesserten Ausbeuten erhält

Mit der vorliegenden Erfindung wird ferner ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung und Gewinnung von Zitronensäure zur Verfugung gestellt, das im Falle, daß ein bekannter Zitronensäure produzierender Mikroben-Stamm ausfällt — was nie ausgeschlossen werden kann —, die bisherigen Verfahren ersetzen kann. Die vorliegende Erfindung stellt schon insofern eine Bereicherung der Technik dar.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die Kultivierung bevorzugt bei einer Temperatur von 22—33° C durchgeführt

Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kultivierung in einem Fermentationsgefäß mit einer eingestellten Belüftungsgeschwindigkeit durchgeführt, die dem >/ebis 2fachen Flüssigkeitsvolumen/Minute entspricht.

Vorzugsweise wird beim erfindungsgemäßen Verfahren die Anfangskonzentration des assimilierbaren Stickstoffes in der Kühlflüssigkeit auf 0,5—1,0 g/Liter eingestellt, so daß das Populationsmaximum der kultivierten Zellen in der Flüssigkeit in einen Bereich von 8,0-10 · 10⁸ Zellen pro ml fällt

Die taxonomischen Charakteristika dieses neuen Mikroorganismus sind die folgenden:

1) Wachstum in Malzextrakt: Nach 3 Tagen bei 25° C ovale oder länglich ovale Zellen in der Größenordnung von (2,5 ~ 5,0) · (3,0 ~ 15,0) μ. Es bildet sich ein klebriger, ausgedehnter Ring oder Belag auf der Oberfläche des Kulturmediums aus. Dieser Ring oder Belag ist glatt oder runzlig und hellbräunlich cremefarben. Keine Ascosporen-, jedoch Pseudomycelbildung.

2) Aufstreichimpfung auf Malzagar: Nach 3 Tagen bei 25° C ist die Auf Streichimpfung glatt und hellbräunlich cremefarbig. Die Form der Zellen ist die gleiche wie im Falle des Malzextraktes. Keine Ascosporen-, jedoch Pseudomycelbildung.

3) Plattenkultur: Pseudomycel bildet sich gut auf Kartoffel-Agar.

4) Physiologisches Eigenschaften:

i) Optimale Wachstumsbedingungen: pH 5,2,

Temperatur 3O⁰C, aerob,
ii) Assimilation von Kaliumnitrat: keine,
iii) Koagulation von Milch: keine,
iv) Osmophile Eigenschaft (in 10%igem NaCl-Medium): keine.

v) Gelatineverflüssigung: keine,
vi) Vitaminbedürfnis: keines,
vii) Bildung von Karotinoidpigmenten: keine.

5) Assimilierbare Stickstoffquellen: Pepton, Ammoniumsulfat und Harnstoff.

6) Fermentation: keine.

7) Zuckerassimilation:

GJukose +
Galactose +
Sucrose +
Maltose —
Lactose —
Stärke -

8) Äthanol als einzige Kohlenstoffquelle: gutes Wachstum.

9) Kerosin als einzige Kohlenstoffquelle: gutes Wachstum.

10) Arbutinspaltung: keine.

11) Verteilung: Dieser Mikroorganismus verteilt sich in Heizpetroleumtanks u. dgL

Mit den oben angeführten taxonomischen Eigenschaften ist der Mikroben-Stamm der Gattung Candida oleophila ATCC 20177 eindeutig charakterisiert Candida oleophila ATCC 20 177 unterscheidet sich damit von anderen Mikroben-Stämmen der Gattung Candida und ist als neuer Stamm zu betrachten.

Eine Kultur des lebenden Mikroorganismus wurde am 13. November 1968 (ATCC-Registrierungs-Nr. 20 177) hinterlegt

Bei der üblichen industriellen Herstellung von Zitronensäure durch Mikroorganismen wurden bisher überwiegend Schimmelpilze verwendet und als Kulturmedium meistens die Oberflächenkultur verwendet. Jedoch gewinnt die submerse Züchtung immer mehr praktische Bedeutung. In der Submerskultur mit Schimmelpilzen sind jedoch wegen der Eigenschaften dieser Stämme, zu denen beispielsweise Aspergillus niger gehört, in höherem Maße störanfällige Techniken beim Fermentationsvorgang erforderlich.

Das ergibt sich aus folgendem:

1) Die Fähigkeit des Stammes, Zitronensäure herzustellen, ist ziemlich unsicher, und die Fermentationsbehandlung ist schwierig.

2) Es besteht die Neigung, andere Säuren als Zitronensäure herzustellen.

3) Der niedrige pH-Wert des Mediums bei der Zitronensäurefermentation erfordert einen säurefesten Fermenter.

4) Was die zu verwendenden Zucker anbetrifft so ist es unerläßlich — weil eine Zuckerlösung von höherer Reinheit gefordert wird —, die Nährmittelquelle unter Verwendung von Rohzucker, entsalzter Melasse oder verzuckertem Stärkesirup genau zu regulieren.

5) Die Fermentationsdauer neigt dazu, sich innerhalb weiter Grenzen zu verändern.

6) Um hohe Ausbeuten zu erhalten, ist es erforderlich, ίο die Fermentation unter Zusatz von Methanol,

Kaliumferrocyanid u. dgl. durchzuführen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die erwähnten Schwierigkeiten und die störanfälligen Fermentationseinrichtungen vermieden und die Gewinnung von Zitronensäure wird in sehr einfacher Weise erreicht

Die Kulturbedingungen der verwendeten Fermentation und auch die Bedingungen für die Gewinnung der Zitronensäure aus der Kulturflüssigkeit sind die

20 folgenden:

Das beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete flüssige Kulturmedium enthält außer Sacchariden eine übliche Menge einer Stickstoffquelle, anorganische Salze (Nährsalz), Vitamine u. dgl. Die in dem flüssigen Medium verwendeten Kohlehydrate sind beispielsweise Glukose, Fruktose, verzuckerter Stärkesirup und Melasse. Sogar schwarze Rohrzuckermelasse kann vorteilhaft in Zitronensäure nach dem erfindungsgemäßen Verfahren umgewandelt werden, und zwar ohne jede Behandlung, wie durch Zugabe von Kaliumferrocyanid oder Methanof.

Es ist bisher bei der Zitronensäurefermentation mit Schimmelpilzen festgestellt worden, daß Restzucker sich vermehrt und daß die Ausbeuten an Zitronensäure durch zusätzlichen Zucker vermindert werden, wenn die Konzentration der Saccharide im Medium höher als 150 g/Liter beträgt (Prescott und Dunn »Industriel Microbiology«, 3. Auflage [1959], Seite 535).

Bei Verwendung von Candida oleophila ATCC 20 177 erhöht sich aber die Ausbeute der Zitronensäure bei bedeutend höheren Anfangszuckerkonzentrationen (200 g Zucker/Liter Medium), wie aus der folgenden Tabelle 1 zu ersehen ist.

Tabelle 1

Anfangszuckerkonzentration

Kultur
Tage

Temperatur
("C)

Verbrauchter Zucker Ausbeute an Zitronensäure (%),
bezogen auf

eingesetzten
Zucker

verbrauchten
Zucker

28
28

99,0 98,6 56,0
64,9

56,6
65,8

Die Ergebnisse in Tabelle 1 wurden unter folgenden Hefeextrakt

Bedingungen erhalten: Malzextrakt

Der Impfstoff wurde durch Übertragung von Candida H2O

oleophila ATCC 20 177 auf Hefe-Malz-Agar-Medium und auf ein flüssiges Hefe-Malz-Medium hergestellt. 2,5-ml-Anteile des erhaltenen Impfstoffes wurden jeweils in eine 500-ml-Schüttelflasche eingeimpft, von der jede 25 ml des folgenden Fermentationsmediums enthielt:

aufgefüllt auf

3g
3g
1 Liter

Glukose
Pepton

HOgoder 220 g
5g

Nach Zugabe von Calciumcarbonat in einer Menge von 1,5 g (im Falle, daß die Konzentration an Glukose in der Flasche 100 g/Liter beträgt) oder 3,0 g (im Falle, daß die Konzentration an Glukose 200 g/Liter in der Flasche beträgt) wird die Fermentation bei einer Temperatur von 28⁰C und 135 Schüttelungen/Min, mit einer Amplitude von 5 cm durchgeführt.

Für das erfindungsgemäße Medium verwendbare

Stickstoffquellen sind beispielsweise anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniak, Harnstoff, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat oder Ammoniumacetat, Peptone, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maiseinweichwässer, Fischmehl und dessen Verarbeitungsprodukte, Sojabohnenkuchen und seine Verarbeitungsprodukte u. dgl.

Diese können einzeln oder im Gemisch von zwei oder mehreren Produkten verwendet werden.

Bei der beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Zitronensäurefermentation gibt es ein Optimum bezüglich der Stickstoffhöhe von etwa 0,5 bis 1,0 g assimilierbaren Stickstoff pro Liter Medium in Verbindung mit der Menge der assimilierbaren Stickstoff aufweisenden Quelle und der Ausbeute an Zitronensäure, wie aus der folgenden Tabelle II ersichtlich ist

Um die Stickstoffhöhe des Mediums in der Submerskultur zu kontrollieren, kann die Erhaltung der maximalen Anzahl von Zellen des Organismus im Medium auf etwa 8 - 10⁸ bis ~ 1 · 10⁹ Zellen/ml dienen.

Tabelle II

Wirkung der Konzentration der Stickstoffquelle auf die Zitronensäureausbeute

N-Konz.*)
(mg/1)

Restzucker
(g/l)

Zitronensäureausbeute

(g/1)

465	65,4	104
697	1,6	120
930	1,6	116
2200	2,0	88

*) Konzentration an assimilierbarem Stickstoff.

Die Ergebnisse in Tabelle II wyrden unter folgenden Bedingungen erhalten:

Die Versuche wurden mit SOO-ml-Schüttelflaschen durchgeführt, von denen jede 25 ml des folgenden Fermentationsmediums enthielt:

Glukose
KH₂PO₄
MgSO₄ · 7 H₂O
MnSO₄ · /JH₂O
Thiamin-HCI
Nicotinsäure

200 g 0,2 g 0,2 g 0,2 g 2 mg 0,2 mg

Harnstoff wurde zugefügt, um die in Tabelle II angegebene Stickstoffkonzentration zu erhalten, und mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.

Der Impfstoff Candida oleophila ATCC 20 177 wurde in jede Flasche eingeimpft und dann nach Zugabe von jeweils 2,5 g Calciumcarbonat die Schüttelkultur bei einer Temperatur von 28° C sieben Tage 135 Schüttelungen pro Minute bei einer Amplitude von 5 cm ausgesetzt. Tabelle Il zeigt die erhaltenen Ergebnisse.

Als organische Salze, die dem flüssigen Medium zugesetzt werden können, kann man Phosphate und Magnesiumsalze verwenden, die für das Wachstum des Mikroorganismus erforderlich sind.

Außer den obenerwähnten Bestandteilen können Maiseinweichwässer, Hefeexlrakte und Vitamine, wie beispielsweise Thiamin und Nikotinsäure, dem Medium zugesetzt werden. Auch kann man Calciumcarbonat verwenden, um die erhaltene Säure zu neutralisieren.

Die Züchtung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von etwa 22 bis 33° C und bei pH-Werten von etwa 4 bis 8 während einer Dauer von 3 bis 7 Tagen durchgeführt Was die aerobe Züchtung anbetrifft so kann eine Oberflächen-, Schütte!- oder submerse Züchtung angewandt werden, jedoch ist die submerse Züchtung unter Rühren und Belüftung bevorzugt
Die Belüftungsmenge beträgt etwa das '/g- bis 2fache

ίο des Volumens des Mediums pro Minute und die Behälterzüchtung kann bei atmosphärischem oder erhöhtem Druck durchgeführt werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren fällt die erhaltene Zitronensäure am Ende der Fermentation in Form von Calciumzitrat (bei der Zugabe von Calciumcarbonat) in dem Kulturmedium an.

Um die Zitronensäure aus der Kulturflüssigkeit zu gewinnen, ist es üblich, das Calciumzitrat und die in dem Kulturmedium suspendierten Hefezellen gleichzeitig durch Filtration zu sammeln. Nach dem Waschen wird dem Filterkuchen eine geeignete Menge Schwefelsäure zugefügt um die Zitronensäure in Freiheit zu setzen und aufzulösen, und anschließend wird das unlösliche, aus Calciumsulfat und Hefezellen bestehende Material durch Filtration abgetrennt

Nach Behandlung mit Entfärbungskohle oder lonenaustauscherharzen wird das Filtrat konzentriert und die ausgeschiedene Zitronensäure gesammelt. Nach einem wahlweise anwendbaren Verfahren werden Calciumzitrat und Hefezellen aus dem Medium gleichzeitig durch Filtration abgetrennt. Nach Waschen wird der Filterkuchen in Wasser suspendiert und zur Suspension eine gewisse Menge Chlorwasserstoffsäure gegeben, um Zitronensäure in Freiheit zu setzen, und dann werden die Hefezellen durch Filtration abgetrennt. Nach Entfärbung und Aktivkohle oder mit zur Entfärbung geeignetem Ionenaustauscherharz wird das Filtrat mit konzentriertem wäßrigem Ammoniak versetzt so daß die Reaktionslösung schwach alkalisch reagiert, dann zum Sieden erhitzt und schließlich das ausgefällte Calciumzitrat gesammelt.

In der erhaltenen Fermentationsflüssigkeit bildet sich kaum Oxalsäure und auch die Erzeugung von anderen organischen Säuren als Zitronensäure wurde praktisch nicht beobachtet.

Die mit der vorliegenden Erfindung erzielbaren technischen Fortschritte und Wirkungen lassen sich wie folgt zusammenfassen:

1) Der beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Mikroorganismus Candida oleophila ATCC 20177 hat eine in hohem Maße beständige Fähigkeit, Zitronensäure herzustellen, und die Behandlung der Mikroorganismen ist sehr einfach.

2) Beim effindungsgemäßen Verfahren können Anfangszuckerkonzentrationen von etwa 170 g/l angewendet werden und die Fermentation kann innerhalb von etwa 96 Stunden beendet sein.

3) Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann die Fermentation zufriedenstellende bei einem pH-Wert von etwa 6 erreicht werden.

4) Der Kulturflüssigkeit zugesetzte Zucker können Glukose, Fruktose, verzuckerter Stärkesirup, Melassen, schwarze Rübenzuckermelassen, schwarze Rohrzuckermelassen allein oder im Gemisch von 2 oder mehreren verwendet werden.

5) Wenn beim erfindungsgemäßen Verfahren ein Oligosaccharid, wie beispielsweise Melassen, schwarze Zuckerrübenmelassen und Rohzucker, in

dem Medium verwendet wird, können sowohl Inversions- als auch Sterilisationsbehandlungen gleichzeitig mit einer starken Säure oder mit einer Entkationisierungsbehandlung bei einer Temperatur von oberhalb 80⁰C durchgeführt werden. ^r>

6) Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann man schwarze Rohrzuckermelassen ohne Durchführung von Reinigungsbehandlungen, wie Entsalzung, Behandlung mit Kaliumferrocyanid oder Methanol, verwenden, um in zufriedenstellender Weise Zitronensäure zu erhalten.

7) Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden andere Säuren als Zitronensäure praktisch nicht erzeugt.

8) Das erfindungsgemäße Verfahren kann diskontinu- is ierlich oder kontinuierlich durchgeführt werden.

9) Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man Zitronensäure oder deren Salze in wirtschaftlicher Weise, d. h. in guten Ausbeuten, erhalten.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Der Impfstoff wird durch Inkubation von Candida oleophila ATCC 20 177 bei 28°C in 24 Stunden mittels einer Schüttelkultur in 500-ml-Schüttelflaschen hergestellt, von denen jede 100 ml der mit Dampf sterilisierten und die folgende Zusammensetzung aufweisende Kulturflüssigkeit enthielt:

Glukose
Harnstoff
KH₂PO₄
MgSO₄ · 7 H₂O
MnSO₄ · η H₂O
Hefeextrakte
pH 6,0

Gew.-/Vol.-%

0,2

0.02

0,02

0,025

0,5

Der Zitronensäure- und Zuckergehalt in der Flüssigkeit während der Fermentation ist in Tabelle III angegeben.

Tabelle HI

30

35

400 ml des oben erhaltenen Impfstoffes werden für die Beimpfung des Fermentationsmediums verwendet.

Das Fermentationsmedium wurde durch Auflösen von 2400 g Glukose, 2,4 g KH₂PO₄, 2,4 g MgSO₄ · 7 H₂O und 3,0 g MnSO₄ · η H₂O in etwa 9 Liter Wasser, Sterilisieren der erhaltenen Lösung mit Dampf bei 120°C während 15 Minuten in einem 30 Liter Fermentationsgefäß und nach Abkühlung auf 28⁰C durch Zugabe von 10 g Harnstoff, 60 g Maiseinweichwasser und 1300 g CaCO3 bereitet. Jede dieser drei Substanzen wurde vor der Zugabe zu der Lösung sterilisiert. Schließlich wurde mit Wasser auf 11,6 Liter aufgefüllt und dann das Gemisch gerührt, um so viel wie möglich in Lösung zu bringen. Das so erhaltene Kulturmedium wird mit dem oben erhaltenen Impfstoff beimpft

In der Hauptfermentationsstufe beträgt dann die Anfangszuckerkonzentration 20 Gew.-Tefle pro VoL-%. Der anfängliche pH-Wert der Flüssigkeit liegt bei 6£.

Alsbald nach der Beimpfung beginnt die Fermentation unter einer Belüftungsgeschwindigkeit von 4 ΙΛτη und einer Rührgeschwindigkeit von 400UpM bei 28°C Diese Bedingungen werden bis zur Vervollständigung der Fermentation aufrechterhalten.

Nach 24stündiger Kultivierung erreicht die Mikroorganismenbewachsung das Maximum von 1 - HO⁹ ZeI- len/mL Danach sammelt sich die Zitronensäare in dier Kulturflüssigkeit schnell als Calciumsalz und die Fermentation ist nach einer Gesamtdauer von 96 Stunden beendet

Kultivie	Restzucker	Zitronen	Ausbeute in °/o,
rungszeil		säure	auf dem ver
			brauchten
			Zucker
(Sid.)	(g/l)	(g/i)	beruhend

0
24
48
72
96

200

175

105

38

8,7

59,5

121,8

152,7

35
62,6
75,2
77,5

Nach Abtrennung des so erhaltenen Calciumzitrats, der Hefezellen und des überschüssigen Calciumcarbonates durch Filtration und anschließendem Waschen wird die Zitronensäure aus dem Filterkuchen durch Zugabe von Schwefelsäure in Freiheit gesetzt und dann die Hefezellen und das. ausgefällte Calciumsulfat abfiltriert. Nach der Neutralisierung mit Kalkmilch wird das Filtrat zum Sieden erhitzt, um Calciumzitrat auszufällen.

Die Ausbeute an Calciumzitrat ist wie folgt:

Rohes Calciumzitrat 2530 g

Reinheit (als wasserfreie
Zitronensäure berechnet) 65,8%

Ausbeute, auf den zugefügten
Zucker bezogen (als wasserfreie Zitronensäure) 69,5%

Beispiel 2

Schwarze Philippinenrohrzuckermelassen (Gesamtzucker 58,4%, Asche 8,68%, assimilierbarer Stickstoff 0,097%) werden mit Wasser auf das zweifache Volumen verdünnt und dann mit Schwefelsäure bis zur Erreichung eines pH-Wertes von 1,5 versetzt Nach der Inversion und Sterilisierung bei einer Temperatur von etwa 85°C während 40 Minuten wird die Lösung durch Zugabe von Kalkmilch auf einen pH-Wert von 6,8 gebracht. Nach Abfiltrieren des ausgefallenen Calciumsulfates wird das Filtrat als Zuckerquelle für die Fermentation verwendet. Es werden 400 ml des analog Beispiel 1 inkubierten Impfstoffes verwendet. Die

so 2400 g Zucker (berechnet als Glukose) enthaltende Menge der schwarzen Rohrzuckermelassen wird in ein 30 Liter fassendes Fermentationsgefäß überführt, welches zuvor mit Dampf sterilisiert und auf 28° C abgekühlt worden war. Man fügt vorher sterilisierte 12 g Harnstoff und 1240 g Galciumcarbonat und dann sterilisiertes Wasser hinzu, so daß das Gesamtvolumen 11,6 Liter beträgt, worauf die Beimpfung mit dem Impfstoff erfolgt Die Anfangszuckerkonzentration des Mediums beträgt 20 Gew.-Teile pro VoL-%.

Nach der Beimpfung wurde die Fermentation mit einer Belüftungsgeschwindigkeit von 4 Liter/Min, und einer Rührgeschwindigkeit von 400 UpM bei 28°C durchgefühlt.

Nach 24stündiger Kultivierung erreichte die Anzahl

der Zellen das Maximum von 8 - 10^s Zellen pro ml und die Zitronensäure sammele sich in dem Medium schnell als Calciumsalz an. Nach 96stündiger Inkubation ist die Fermentation beendet

809W5/44

Die Untersuchungen während der Kultivierung sind in der nachstehenden Tabelle IV dargelegt:

Tabelle IV	Restzucker	Zitronen	Ausbeute in %,
Kultivie		säure	auf den ver
rungszeit			brauchten
			Zucker
	(g/l)	(g/l)	bezogen
(Std.)	200
0	182	4,0	22,2
24	145	26,1	47,5
48	48	89,2	58,7
72	13	121.5	65.0
96

Nach Abtrennung des Calciumzitrats, der Hefezellen und des überschüssigen Calciumcarbonates (in der Kulturlösung) durch Filtration und nach Waschen wird die Zitronensäure aus dem Filterkuchen durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure in Freiheit gesetzt und nach Abfiltrieren der Hefezellen wird das Filtrat mit konzentriertem Ammoniak neutralisiert, und anschließend zum Sieden erhitzt, um das Calciunizitrat auszufällen. Die Ausbeute an Caleiumzitrat ist wie folgt:

Rohes Caleiumzitrat 2100g

Reinheit (berechnet als

wasserfreie Zitronensäure) 65,4%

Ausbeute, auf den zugefügten

Zucker bezogen (berechnet als

Zitronensäure) 57,1%

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Zitronensäure durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus in einer zuckerhaltigen Kulturflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man Candida oleophila ATCC 20177 unter aeroben Bedingungen in einer Kulturflüssigkeit, die assimilierbare Kohlehydrate, eine übliche Menge einer Stickstoffquelle, anorganische Salze und Vitamine enthält, züchtet, und daß man die Kultivierung bei einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 8 durch anfängliche Zugabe oder gelegentliche Zugaben einer geeigneten Menge eines Neutralisieningsmittels ausführt

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einer Temperatur von 22—33° C durchgeführt wird.

3. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung in einem Fermentationsgefäß mit einer eingestellten Belüftungsgeschwindigkeit durchgeführt wird, die dem •/β- bis 2fachen Flüssigkeitsvolumen pro Minute entspricht

4. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Anfangszuckerkonzentration in der Kühlflüssigkeit oberhalb 100 g/l, insbesondere oberhalb 170 g/l, berechnet als Glucose, liegt

5. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Anfangskonzentration des assimilierbaren Stickstoffes in der Kühlflüssigkeit auf eine geeignete Höhe im Bereich von 0,5 bis 1,0 g/l eingestellt wird, so daß das Populationsmaximum der kultivierten Zellen in der Flüssigkeit in einen Bereich von 8,0 bis 10 · 10⁸ Zellen/ml fällt

6. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Neutralisationsmittel Calciumcarbonat verwendet und die Zitronensaure in Form von Calciumcitrat isoliert