DE551930C

DE551930C - Verfahren zur Herstellung von Citronensaeure mittels Pilzen

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Publication number: DE551930C
Application number: DEF60482D
Authority: DE
Original assignee: Rowntree & Co Ltd
Current assignee: Rowntree & Co Ltd
Priority date: 1925-12-09
Filing date: 1925-12-09
Publication date: 1932-06-08

Description

Verfahren zur Herstellung von Citronensäure mittels Pilzen Bekanntlich verwandeln manche Pilze, wenn sie auf Zuckerlösungen, welche die erforderlichen anorganischen Nährstoffe enthalten, gewachsen sind, einen Teil des Zuckers in Citronensäure, und man hat bereits mehrere Verfahren zur Bildung von Citronensäure mit Hilfe von Pilzen vorgeschlagen. Der bisherige Stand der Arbeiten über die Citronensäuregärung mittels Pilzen erhellt aus dem im Journal of Biological Chemistry Vol. XXXI zg=7, Seite 15, veröffentlichten Aufsatz von J. N. Currie, wo der Verfasser einen Bericht über seine eigenen Versuche gibt und auch auf Arbeiten anderer Forscher, insbesondere von Wehmer und Zahorski, hinweist.
Bei dem Versuche, die Citronensäuregärung in einem technisch-wirtschaftlichen Maßstabe auszuführen, haben sich indessen verschiedene Schwierigkeiten ergeben, die vor allem darin bestehen, daß man die Lösung vor einer Verunreinigung durch metallische oder andere Beimengung schützen und die Medien vor einer Infizierung durch fremde, auf die Citronensäuregärung störend einwirkende Organismen bewahren muß. Beim laboratoriumsmäßigen Arbeiten lassen sich diese Schwierigkeiten leicht vermeiden, da die zu vergärende Flüssigkeit in dem gleichen Behälter, in dem sie vergoren wird, gewöhnlich einem kleinen Glasgefäß, durch Hitze sterilisiert werden kann.
Beim industriellen Arbeiten in großen Behältern dagegen ist die Sterilisierung der Flüssigkeit durch Hitze mit großen Übelständen verbunden, da die verwendeten Pilze schon gegen Spuren von metallischen oder sonstigen Verunreinigungen, die bei diesen Behältern kaum zu vermeiden sind, äußerst empfindlich sind und in ihrem Gärungswert bei der Anwesenheit solcher Verunreinigungen auf einen ganz niedrigen Betrag sinken. Abgesehen davon bleibt auf alle Fälle die Gefahr der Infizierung durch Mikroorganismen nach der Kühlung oder Impfung bestehen. Anderseits wird bei Verzicht auf die Sterilisierung das Wachstum der gewünschten Organismen fast immer durch die Entwicklung von fremden Organismen, wie Bakterien, Hefearten oder anderen Pilzen, gestört, die zur Zeit der Impfung vorhanden sind oder hernach in die Lösung gelangen.
Das Vorhandensein dieser Schwierigkeiten hat man natürlich erkannt, und J. N. Currie weist in dem eingangs erwähnten Aufsatz daher darauf hin, daß die Gefahr der Infizierung weitgehend verringert werden kann, wenn zu der Lösung eine kleine Menge Salzsäure zugegeben wird, wodurch eine vollständige Sterilisierung bei einmaliger, 30 Minuten dauernder Erhitzung in Dampf von Atmosphärendruck ermöglicht wird. J. N.Curriehataberdabeinurinkleinem Maßstabe gearbeitet, indem er nicht mehr als z 1 Lösung für jeden Versuch benutzt hat. Außerdem hat die Hitzesterilisierung auch beim Arbeiten mit kleinen Gefäßen den Nachteil, daß sie Hydrolyse hervorzurufen sucht. Nach der Erfindung wird nun, um die Erzeugung von Citronensäure mittels Pilzen, insbesondere Kolbenschimmelpilzen, aus einer die erforderlichen Nährstoffe enthaltenden Rohrzuckerlösung in einem technisch-industriellen Maßstäbe mit guter Ausbeute und günstigem Wirkungsgrad zu verwirklichen, der Schutz der zu behandelnden Medien vor der Gefahr der Infizierung in anderer Weise als durch Hitzesterilisierung bewirkt. Versuche haben gezeigt, daß Salzsäure, in verhältnismäßig großen Mengen zur Lösung zugegeben, die Hitzesterilisierung unnötig macht. Die zuzugebenden Salzsäuremengen, die in gewissem Grade von den anderen Bestandteilen der Lösung abhängen, werden erfindungsgemäß so bemessen, daß sie genügen, die Wasserstoffionenkonzentration auf einen pH-Wert im Bereiche von 1,a bis 2,5 zu bringen, bei dem nicht nur Bakterien, sondern auch Hefearten und eine große Mehrzahl anderer Pilze am Wachstum gehindert werden, die gewählten Organismen dagegen keine Hemmung erfahren. Durch diese Säurezugabe läßt sich auf einfache Weise die Hitzesterilisierung mit ihren Nachteilen im Großbetrieb vermeiden.
Es ist bekannt, daß Pilze am besten in Flüssigkeiten mit saurer Reaktion gedeihen. Auch hat schon J. N. Currie festgestellt, daß Kolbenschimmelpilze Citronensäure in einem sauren Medium erzeugen, und gibt hierfür in dem mehrfach angeführten Aufsatz eine schwache Acidität mit einem PH von 3,5 bis 3,4 an. Ferner beschreibt Butkewitsch in der Biochemischen Zeitschrift 1924, Seite 177 bis igo, Versuche über Citrönensäureherstellung mittels Pilzen in saurem Medium, bei denen die schwachen, durch das Wachsen der Pilze hervorgerufenen natürlichen Aciditäten ausgenutzt werden, womit die von diesem Forscher erzielten geringen Ausbeuten an Citronensäure in Übereinstimmung stehen. Die erfindungsgemäß erforderliche und angewendete Acidität 'st ganz erheblich größer und wird durch eine den Schutz der Kulturen vor fremden Organismen gewährleistende Salzsäuremenge erreicht. Der dadurch mögliche Fortfall der Hitzesterilisierung hat die günstige Folge, daß der Pilz zuerst am Rohrzucker und nachher am Invertzucker wirkt, was zu den besten Ausbeuten an Citronensäure führt.
Zweckmäßig ist es, die Zugabe der Salzsäure ;u den vergärenden Flüssigkeiten nach der Erfindung vor der Impfung vorzunehmen. Vorteil-Jaft hat es sich ferner erwiesen, die angesäuerte Lösung mit den Sporen von ausgewählten A,spergillusarten und ähnlichen Pilzen, zu.impfen, lie günstige Fähigkeiten für die Citronenäureerzeugüng besitzen und auf neutralem 3ährboden gezüchtet sind. Wenn auch erindungsgemäß eine Hitzesterilisierung nicht nötig ist, kann man unter Umständen bei dem neuen Verfahren auch eine Wärmezufuhr anwenden, die aber dann nicht so kräftig sein darf, daß sie eine Verunreinigung der Flüssigkeit durch etwaige, vom Kessel stammende Verunreinigungen oder eine schädliche Hydrolyse des Zuckers hervorruft.
Um das Verfahren nach der Erfindung in ganz oder teilweise kontinuierlichem Arbeitsgang bis zur Erschöpfung der Pilze durchzuführen, kann man während des Verlaufes der Gärung eine Zugabe von weiterem Zucker zur Lösung vornehmen. Durch diesen Zusatz, der absatzweise oder dauernd und mit oder ohne entsprechende Abführung von Citronensäureflüssigkeit erfolgen kann, ergibt sich eine Erhöhung der in Prozenten auf den verwendeten Zucker berechneten Ausbeute an Citroneilsäure. Die Steigerung der Ausbeute wird auch dadurch begünstigt, daß die zugegebene frische Zucker-' lösung, da erfindungsgemäß eine Hitzesterilisierung unnötig ist, nicht sterilisiert und daher nicht invertiert ist und der Schimmelpilz besser auf nicht invertierten Zucker einwirkt. Auf gleiche Weise wie Zucker können auch frische Nährstoffe allein oder zusammen mit Zucker während der Gärung der Lösung zugegeben werden, um die Leistungsfähigkeit des Verfahrens zu erhöhen.
Da weiterhin bei der erfindungsgemäß ermöglichten Citronensäureherstellung im technischen Großbetrieb in der Regel verhältnismäßig tiefe Behälter Verwendung finden und der Citronensäure erzeugende Pilz nur in der obersten Schicht der Lösung wächst, empfiehlt es sich, die Gesamtheit der Lösung durch Flüssigkeitsbewegung mit. den Pilzen in Berührung zu bringen und auch die tiefer liegenden Schichten der Lösung nutzbar zu machen. Diese Flüssigkeitsbewegung kann auf verschiedene Weise erreicht werden, indem man z. B. Temperaturunterschiede an gegenüberliegenden Seiten des Behälters hervorruft-oder die Flüssigkeit durch Pumpenwirkung im Kreislauf führt oder einfach unterhalb der Pilze umrührt oder auch den die Flüssigkeit enthaltenden Kessel in Umdrehung versetzt.
Das Verfahren nach der Erfindung kann bei jeder Art von Rohrzucker, die aus Zuckerrohr oder einem anderen Ausgangsmaterial gewonnen ist, Anwendung finden. Auch ist es nicht allein für den industriellen Großbetrieb, sondern auch für einen Laboratoriumsbetrieb oder sonstwie für einen kleineren Maßstab geeignet. Im einzelnen kann zur Durchführung des Verfahrens beispielsweise nach folgenden Gesichtspunkten vorgegangen werden i. Wahl der zu verwendenden Pilze Als Pilze werden vorzugsweise einige der dunkelgefärbten Aspergilli oder Kolbenschimmelpilze benutzt, deren reife Konidien braun, bräunlichschwarz, purpurschwarz oder ganz schwarz sein können und die in der Natur weit verbreitet sind. Diese Pilze, die sich z. B. an Kaffeebohnen und im Innern von gewissen Pflanzengalläpfeln finden, geben gewöhnlich die beste Ausbeute an Citronensäure aus Rohrzucker, erzeugen aber auch erhebliche Mengen an anderen Stoffen, wie z. B. Invertzucker, Glukose, Laevulose, Maltose und Glycerin, während aus Laktose noch keine nennenswerten Mengen von Citronensäure gewonnen worden sind. Man erkennt die in erster Linie anzuwendenden Kolbenschimmelpilze mit dunkelgefärbten Konidien daran, daß sie in Zuckerlösungen mit geeigneten Nährstoffen und verhältnismäßig hohen Salzsäurekonzentrationen zu keimen vermögen und Citronensäure aus Rohrzucker in Mengen bis zu 65 °/o des verwendeten Zuckers, berechnet als kristallinische Citronensäure, bilden können. Sie erzeugen unter den gleichen Verhältnissen zu vernachlässigende Spuren von anderen Säuren.
2. Auswahl und Züchtung der Sporen Eine Anzahl von in der angegebenen Weise erhaltenen Kolbenschimmelpilzen oder Aspergilli werden in Reinkultur isoliert und z. B. auf einem das dichte Wachstum von Sporen begünstigenden Nährboden, beispielsweise einem an Stärke reichen Medium, gezüchtet. Dann werden kleine Mengen einer--mit Salzsäure angesäuerten und die gebräuchlichen Nährsalze für Pilze enthaltenden Zuckerlösung mit den Sporen geimpft und bei 30' C bis zur Erschöpfung der Zuckermasse ausgebrütet. Von einer Anzahl solcher Kulturen werden hierauf die besonderen Arten ausgewählt, welche die größte Fähigkeit für die Citronensäureerzeugung erkennen lassen und keine anderen Säuren unter diesen Verhältnissen hervorbringen oder ansammeln. Nunmehr werden von den Mutterkulturen, von denen die ausgewählten Kulturen herstammen, eine Anzahl von Unterkulturen gebildet, und zwar wiederum auf neutralem, die Sporenerzeugung begünstigendem Medium, um genügend Sporen für die Impfung größerer Massen Zuckerlösung für die Herstellung von Citronensäure entstehen zu lassen. Diese Kulturen werden dann bei geeigneter Temperatur, etwa zwischen io ° und q:0 ° C, ausgebrütet. Die verwendeten Aspergilli liefern ohne Züchtung aus Saat auf saurem Medium gute Ergebnisse, doch kann auch solch ein saures Medium Verwendung finden.
3. Bereitung und Impfung der Lösung Es wird eine Rohrzuckerlösung mit einer Ausgangsstärke von io bis 2o°/o Zucker hergestellt, und dieser Lösung werden die erforderlichen Nährstoffe, wie z. B. Ammoniumnitrat, Kaliumphosphat und Magnesiumsulfat, zusummen mit einer Salzsäuremenge zugegeben, die genügt, die Wasserstoffionenkonzentration auf einen pH-Wert im Bereich von 1,2 bis 2,5 zu bringen. Diese verhältnismäßig große Salzsäurezugabe, die sich nach den jeweiligen Betriebsbedingungen ändert, hemmt, wie - sich gezeigt hat, das Wachstum der ausgewählten Aspergilli nicht und bewirkt auch keine Verminderung der Ausbeute an Citronensäure, während nur wenige andere Organismen in einer solchen Lösung gedeihen können. Die Lösung wird dann bei einer Temperatur von io ° bis 40'C ausgebrütet, bis der Zustand, bei dem der Citronensäuregehalt der Lösung nicht weitersteigt, erreicht ist. Im allgemeinen nimmt die erforderliche Brutdauer mit der Erhöhung der Temperatur ab, aber bei höheren Temperaturen kann die Ausbeute leiden. Wenn die Inversion des Rohrzuckers schrittweise hauptsächlich durch die Wirkung der Pilze und nicht vorher durch andere Agenzien hervorgerufen wird, ergibt sich eine Verbesserung der Ausbeute. Nach vollständiger Beendigung der Bildung von Citronensäure kann die Flüssigkeit abgeschieden und z. B. mit Kalk oder Kreide neutralisiert werden, während das Calcium- oder sonstige $alz der Citronensäure ausgefällt und die Säure durch Zersetzung in üblicher Weise wiedergewonnen werden kann. Die Flüssigkeit kann auch unmittelbar als Citronensäurelösung Verwendung finden oder zur Erzielung von Citronensäurekristallen, die gegebenenfalls weiter gereinigt werden können, durch Verdampfung eingeengt werden.
Nach der Beendigung des Verfahrens bleibt gewöhnlich ein kleiner Zuckerrückstand, und in der Lösung wird bei der Durchführung des Verfahrens Stärke gebildet. Der Rückstand kann nach geeigneter Behandlung der Lösung mittels Hefe oder hefeartiger Organismen vergoren und die Stärke zuerst durch Hydrolyse in geeigneter Weise in eine einfachere Form übergeführt oder reduziert und dann ohne nennenswerten Säureverlust vergoren werden. Wenn gewünscht, können die flüchtigen Produkte hierauf durch Kochen entfernt werden. Eine beträchtliche weitere Menge von Citronensäure kann aus dem Pilz wiedergewonnen und einfach dadurch, daß man sie in Wasser diffundieren läßt oder in sonst geeigneter Weise extrahiert werden.
q.: Zahlenbeispiel 15 kg von feinem Rohrzucker werden in Wasser mit einer geringen Menge von etwa 400 g eines üblichen Nährsalzgemisches, z. B. Ammoniumnitrat, Kaliumphosphat und Magnesiumsulfat, aufgelöst. Die handelsüblich reinen Salze liefern, wie sich gezeigt hat, befriedigende Ergebnisse. Die Lösung wird mit einem Volumen von Zoo 1 hergestellt und genügend reine Salzsäure zugegeben, um die Acidität der endgültigen Lösung auf pH = i,8 zu bringen. Dann werden Sporen einer reifen Kultur von Aspergillus niger, die in der angegebenen Weise ausgewählt und gezüchtet sind, zu der Lösung zugesetzt, die umgerührt wird, um eine gleichmäßige Verteilung der Einsaat auf der Oberfläche zu erzielen.
Die Kultur wird bei 3o bis 35'C =o Tage lang ausgebrütet und dabei die Flüssigkeit unter den Pilzen dauernd umgerührt. Hierauf läßt man die Gärflüssigkeit ablaufen. Das Mycelium wird abgeschieden, gepreßt und gewaschen, was nötigenfalls wiederholt geschehen kann, um die darin enthaltene Säure zu gewinnen, und diese wird zu der zuerst abgelassenen Flüssigkeit zugegeben. Die vereinigten Flüssigkeiten werden nunmehr heiß mit Kalkmilch neutralisiert, und die Citronensäure wird in üblicher Weise durch Zerlegung des ausgefällten Calciumsalzes wiedererhalten. Die gebildete Citronensäure stellt etwa 65 % des Gewichtes des verwendeten Zuckers dar.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur Herstellung von Citronensäure mittels Pilzen, insbesondere KolbenschimmeIpilzen, aus einer die erforderlichen Nährstoffe enthaltenden, mit Salzsäure versetzten Rohrzuckerlösung, dadurch gekennzeichnet, daß der Lösung Salzsäure in einer Menge zugegeben wird, die genügend ist, die Wasserstoffionenkonzentration auf einen pH-Wert im Bereich von 1,2 bis 2,5 zu bringen, bei dem die ausgewählten Organismen unter wirksamem Ausschluß störender Organismen wachsen können, wodurch die Hitzesterilisierung der Lösung unnötig gemacht wird.
2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß die angesäuerte Lösung mit den Sporen von ausgewählten Aspergillusarten, die auf neutralem Nährboden gezüchtet sind, geimpft wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche i und 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zugabe von weiterem Zucker oder weiterem Nährstoff oder von beiden Stoffen zur Lösung während des Verlaufes der Gährung absatzweise oder dauernd und mit oder ohne entsprechende Abführung von Citronensäureflüssigkeit vorgenommen wird. q., Verfahren nach einem der Ansprüche i bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtheit der Lösung durch Flüssigkeitsbewegung, die durch Temperaturunterschiede, Pumpenwirkung, Rühren oder sonstwie hervorgerufen werden kann, mit den Pilzen in Berührung gebracht wird.