AT392799B

AT392799B - Verfahren zur fermentativen herstellung von zitronensaeure aus kohlehydraten

Info

Publication number: AT392799B
Application number: AT2461/89A
Authority: AT
Inventors: August Dipl Ing Kirkovits; Helga Edlauer
Original assignee: Jungbunzlauer Ag
Priority date: 1989-10-25
Filing date: 1989-10-25
Publication date: 1991-06-10
Also published as: US5081025A; FR2653446B1; DE4028726A1; FR2653446A1; ATA246189A

Description

AT 392 799 B

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Zitronensäure aus Kohlehydraten mittels eines Mikroorganismus der Gattung Aspergillus niger in einem Zink und Hexacyanoferrat enthaltenden Substrat.

Bei der submersen Zitronensäuregärung unter Einsatz von Aspergillus niger aus relativ unreinem Kohlehydratmaterial ist der schädliche Einfluß von Eisenionen im Substrat schon lange bekannt. Während beim Einsatz von hochreinen Kohlehydraten ein Gehalt von 2,0 ppm Fe im Substrat noch ohne weiteres tolerierbar ist, können bei relativ unreinen Kohlehydraten bereits 0,2 ppm Fe zuviel sein und es bilden sich große Mengen an nichtsäurebildendem Aspergillus niger-Myzel, während die Zitronensäurebildung drastisch abfällt. Man führt diesen Umstand auf das Vorliegen sogenannter "Eisenpotentiatoren" im Substrat zurück, die von den unreinen Kohlehydraten her stammen, z. B. Aminosäuren, und die negative Wirkung des Eisens in Richtung der Bildung des nichtsäurebildenden Myzels vervielfachen.

Man hat daher für Verfahren, die relativ unreine Kohlehydrate anwenden, nach Eisen-Antagonisten gesucht, und die US-PS 2 970 084 beschreibt den Einsatz von bis zu 500 ppm Cu im Substrat, um die Wirkung der Eisenpotentiatoren auszuschalten. Diese an sich wirkungsvolle Vorgehensweise ergibt aber als sehr unangenehme Nebenerscheinung die Anreicherang großer Mengen hochgiftiger Cu-Salze im Klärschlamm.

In der US-PS 2 492 673 ist ein anderer Fe-Antagonist beschrieben, nämlich Zink. Gemäß dieser Druckschrift wird zur Zitronensäuregärung von Invertmelasse mit Aspergillus niger die Invertmelasse mit einem Kationentauscher (H-Form) entkationisiert, wobei der Fe-Gehalt auf etwa 2-4 ppm gedrückt wird, und dann werden 10 - 30 Massenteile Zn pro Massenteil Fe zugesetzt, wobei der Gesamtzinkgehalt 150 ppm nicht überschreiten soll. Auch Zn-Salze sind jedoch kein besonders erwünschter Bestandteil der Klärschlämme, obwohl besser tolerierbar als Cu.

Aus der CH-PS 342 191 ist ein Vergleich von Cu und Zn als Fe-Antagonisten zu entnehmen, wobei angegeben ist, daß bei relativ unreinen Kohlehydraten, insbesondere bei nicht entkationisierten, der Einsatz von Zn gegenüber dem von Cu nachteilig ist Grundsätzlich wird bei Zuckereinsatz das Cu dem Zn vorgezogen.

Die Erfindung geht aus von einem Substrat, das sowohl Zn-Ionen als auch Hexacyanofenat-Ionen enthält

Hexacyanoferrate, z. B. Kn[Fe(CN)g].3H20, sind bekannte Myzelwachstums-Inhibitoren bei der fermentativen Zitronensäureherstellung mit Hilfe von Aspergillus niger und werden bevorzugt in Mengen von < 10 ppm zugesetzt, siehe z. B. die AT-PS 295 448 und 296 194.

In der AT-PS 307 346 ist ein Zitronensäurefermentationsmedium beschrieben, das 1,5 ppm ZnSO^T^O und < 10 ppm K^CFeiCNjg] enthält.

Diese den gemeinsamen Einsatz von Hexacyanoferraten und Zn-Ionen betreffenden AT-PS betreffen die Verwendung von zumindest teilweise (entkationisiert) vorgereinigten Zuckerlösungen, in denen Zink als Wachstumsförderer wirkt, während das Hexacyanoferrat als Inhibitor die Mycelentwicldung beeinflußt.

Nunmehr wurde überraschenderweise gefunden, daß man nicht vorbehandelte Kohlehydratlösungen, also solche ohne Klärung durch Fällung und ohne Ionentauscherbehandlung, in einem Hexacyanoferrate und Zn-Ionen enthaltenden Substrat günstig verarbeiten kann, wenn man ein Substrat verarbeitet, das zwischen 30 und 250 ppm Zn und zwischen 100 und 500 ppm Hexacyanoferrat enthält

Dabei sind äußerst vorteilhafte Zitronensäureausbeuten bei einem problemlosen Verfahrensablauf ohne Notwendigkeit einer Prozeßüberwachung und ohne chemische bzw. physikalische Steuerungsmaßnahmen (z. B. ohne laufende pH-Regelung) erzielbar. Weiterhin ergibt sich auch bei hohen Salzkonzentrationen im Substrat ein tolerierbarer Klärschlamm.

Vorzugsweise werden Zn und Hexacyanoferrat jeweils in Mengen von etwa 100 ppm eingesetzt

Insbesondere werden dem Substrat mindestens soviel Zn-Ionen und Hexacyanofenat-Ionen zugesetzt, daß sich ein Fällungsprodukt bildet. Dieses Fällungsprodukt wird nicht abgetrennt

Als unbehandelte Kohlehydrate werden vorzugsweise Mono- und/oder Disaccharide, insbesondere Glukose, eingesetzt; der Einsatz anderer Kohlenhydratquellen, z. B. von Rohr- oder Rübenmelassen, ist möglich.

Mit ein Kennzeichen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß alle für die wirtschaftliche Produktion von Zitronensäure notwendigen Manipulationen zu Beginn der Fermentation vorgenommen werden können. Eine andauernde Überwachung der Gärung und Eingriffe auf Grund besonderer chemischer oder physikalischer Parameter wie pH-Wert und Myzelform sind nicht notwendig.

Die so entstandene Zitronensäure kann nach einem der üblichen bekannten Verfahren isoliert und weiterverarbeitet werden.

Folgende Beispiele dienen der näheren Erläuterung der Erfindung. Sie wurden mit dem Mikroorganismus Aspergillus niger 6074 durchgeführt, welcher entsprechend dem Budapester Abkommen bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen am 16. August 1989 hinterlegt wurde und die Nr. DSM 5484 erhalten hat, sowie durch folgende Merkmale gekennzeichnet ist: - das vielfach septierte, mehrkemige Mycel weist eine große Anzahl von Konidienträgem auf. - es ist typische Köpfchenbildung infolge blasenförmig erweiterter Hyphen zu beobachten, an deren Oberfläche sich Sterigmen mit perlschnurförmig angeordneten schwarzen bis schwarzbraunen Konidien befinden. -2-

AT 392 799 B - Morphologie der Kolonien: Anfangs weiß bis gelblich, von watteartiger Konsistenz; nach einigen Tagen infolge von Konidienbildung schwarz bis braunschwarz. - Durchmesser der Hyphen: 2-8μπι Länge der Konidienträger: bis 6 μιη Konidiendurchmessen 4 - 6 μπι mit zerklüfteter Oberfläche

Unter geeigneten Anzuchtbedingungen weist der eingesetzte Mikroorganismus Aspergillus niger DSM 5484 ein überraschend hohes Sporengewicht von 1 - 3 .1010 Einzelsporen/g auf, das bei anderen Vertretern dieser Gattung in der Größenordnung von 8 -11.10^ Einzelsporen/g liegt.

Dieses Merkmal wird durch den Konidiendurchmesser, der bei üblicherweise zur Zitronensäureproduktion eingesetzten Stämmen 3,7 - 4,7 mm beträgt, erklärbar. Dabei ist hervorzuheben, daß Sporengewicht und Durchmesser vorzugsweise durch Anzucht auf Medien erfolgt, deren Kohlenhydratquelle aus reinen Rohstoffen, wie beispielsweise Glucose oder Saccharose, besteht und nicht durch die Zugabe komplexer Wuchsstoffe, wie etwa Melasse, erreicht wird.

Im Gegensatz zu dem in der USP 2492667 beschriebenen Organismus Aspergillus niger ATCC 1015 ist der Einsatz des Stammes DSM 5484 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht von der Einhaltung eines Übertragungszyklus von beispielsweise 5 bis 7 Tagen abhängig, sondern kann in beliebigen Zeitintervallen erfolgen.

Vorzugsweise hat die Anzucht der Sporen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls auf Medien zu erfolgen, deren Kohlenhydratquelle aus reinen Rohstoffen, wie beispielsweise Glucose oder Saccharose, besteht

Beispiele 1 - 3:

Einer mit Medium 1 bezeichneten Nährlösung wurden Sporen des Pilzes Aspergillus niger in einer Konzentration von 10^ Sporen pro Liter Kulturflüssigkeit zugesetzt was etwa einer Menge von 10 - 15 g Sporen pro m^ entspricht. Die Inkubation der so beimpften Brühe erfolgte bei für Zitronensäureproduktion üblicherweise bekannten und allgemein beschriebenen Bedingungen wie Lufteintrag und Temperaturkontrolle.

Medium_l:

Dextrose 150 g (NH^SC^ 1,5 g

MgS04 0,6 g KH2P04 0,12 g pro Liter Leitungswasser

Bei Beispiel 1 wurden weder Zink noch Hexacyanoferrat zugesetzt bei Beispiel 2 wurden 100 ppm Zn^+ in Form von ZnS04.7Η20 zugegeben, bei Beispiel 3 wurden 100 ppm Kaliumhexacyanoferrat II zugefügt

Die Ergebnisse aus diesen Versuchen sind in Tabelle 1, ausgedrückt als Prozent Ausbeute an Zitronensäure bezogen auf eingesetzte Glucose, aufgelistet:

Tabelle 1: Ausbeute an Zitronensäure -3-

AT 392 799 B

Wie aus den Beispielen hervorgeht, ist unter den gewählten Bedingungen eine wirtschaftliche Zitronensäureproduktion ohne oder mit nur einem der beiden Zusatzstoffe Zink und Hexacyanoferrat nicht möglich.

Beispiele 4-16:

Wie in den Beispielen 1-3 erläutert, wurden der Nährlösung Medium 1 Zink und Hexacyanoferrat in folgenden Konzentrationen zugesetzt:

Zn2+ [K4Fe(CN)^] [ppm] [ppm] Beispiel 4 30 100 Beispiel 5 50 100 Beispiel 6 50 150 Beispiel 7 100 100 Beispiel 8 100 150 Beispiel 9 100 200 Beispiel 10 150 100 Beispiel 11 150 150 Beispiel 12 150 300 Beispiel 13 200 100 Beispiel 14 200 400 Beispiel 15 250 100 Beispiel 16 250 500

Die Fermentation wurde unter den gleichen Bedingungen wie in den vorherigen Beispielen durchgeführt. Die dabei erzielten Zitronensäureausbeuten sind wie folgt: ^^^FfeCCNJgl |ppm] Zn2+ [poml 100 150 200 300 400 500 30 69% 50 82% 79% 100 86% 77% 72% 150 79% 71% 75% 200 63% 63% 250 57% 65%

Wie ersichtlich, sind bei Zusatz von 100 ppm Zn2+ und 100 ppm [K4Fe(CN)6] wirtschaftlich sehr interessante Ausbeuten erzielbar.

Anhand von zwei Versuchen soll der Einfluß der entstehenden Ausfällung demonstriert weiden.

Beispiele 17 und 18:

Bei Beispiel 17 wurden dem Medium 1 entsprechend Beispiel 5 50 ppm Zn2+ und 100 ppm Kaliumhexacyanoferrat II, bei Beispiel 18 entsprechend Beispiel 7 100 ppm Zn2+ und 100 ppm Kaliumhexacyanoferrat Π zugegeben. Der auftretende Niederschlag wurde aber im Gegensatz zu den Beispielen 5 -4-

Claims

AT 392 799 B und 7 mittels Zentrifuge entfernt und die verbleibende blanke Lösung in bereits beschriebener Weise mit Sporen beimpft und dem Fermentationsprozeß unterworfen. Ergebnisse: Beispiel 17:46 % Ausbeute Zitronensäure Beispiel 18:57 % Ausbeute Zitronensäure Verglichen mit den Ergebnissen aus den Beispielen 5 und 7, bei denen die Trübstoffe nicht entfernt wurden und deren Ausbeuten 82 % und 86 % betrugen, kann über die Bedeutung der Ausfüllungen für die Pioduktbildung im beschriebenen System kein Zweifel bestdien. Abschließend soll in Beispiel 19 ein Verfahren detailliert beschrieben werden, bei dem die Impfgutanzucht auf Grund besonderer technisch»' Gegebenheiten in einem anderen als dem Produktionsfermenter erfolgte. Beispiel 19: Die schon in den vorherigen Beispielen aufgelisteten Nährsalze wurden, in Leitungswasser gelöst, bei einem Λ . pH-Wert von 3,0 während 30 Minuten bei 121 °C sterilisiert, nach dem Abkühlen jeweils 100 ppm Zn·" in Form von ZnSO^ . 7^0 sowie 100 ppm K^[Fe(CN)g] zugesetzt und mit Sporen entsprechend einer Konzentration von 10^ Sporen pro Liter beimpft. Die Kulturbedingungen wurden mit einer Temperaturregelung auf 30 °C, einer pH-Korrektur auf 3,0 mittels Ammoniak und einem Lufteintrag von 2 wm bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit des Scheibenrührwerks von 200 rpm so gewählt, daß nach 20 - 30 Stunden genügend Impfgut ausgebildet war, um einen Produktionsfermenter zu beimpfen. Als Inokulumsmenge wurden für den beschriebenen Versuch 3 % gewählt Das Nährmedium des Produktionsfermenters wurde in gleicher Weise zubereitet wie oben angeführt, die Temperatur konstant gehalten sowie Luft- und Rühreintrag entsprechend der Viskosität des Mediums geregelt. Bei diesem Versuch konnte unter Berücksichtigung der gesamt eingesetzten Kohlehydrate eine Ausbeute von 70 % Zitronensäure erzielt werden. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von Zitronensäure aus Kohlehydraten mittels eines Mikroorganismus der Gattung Aspergillus niger in einem Zinkionen und Hexacyanoferrationen enthaltenden Substrat, dadurch gekennzeichnet, daß nicht vorgereinigte Kohlehydrate eingesetzt werden und der Zn-Gehalt des Substrats auf 30 bis 250 ppm und der Hexacyanoferrat-Gehalt des Substrats auf 100 bis 500 ppm eingestellt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Zn-Gehalt und der Hexacyanoferrat-Gehalt jeweils auf etwa 100 ppm eingestellt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß dem Substrat mindestens soviel Zn-Ionen und Hexacyanoferrat-Ionen zugesetzt werden, daß sich ein Fällungspiodukt bildet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlehydrate Mono-und/oder Disaccharide, insbesondere Glukose, eingesetzt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Aspergillus niger-Stamm 6074 (DSM Nr. 5484 vom 16. August 1989) eingesetzt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Gärung submers geführt wird.
7. Aspergillus niger-Stamm 6074 (DSM Nr. 5484 vom 16. August 1989). -5-