DE1792403C - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L Lysin - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in Kohlenhydrate, Stickstoffsubstanzen, Mineralsalze und die Tür ihr Wachstum erforderlichen Aminosäuren enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-¹ erhältnissen.

Es ist bekannt, zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin verschiedene Mikroorganismen-Mutanten zu verwenden, die Homoserin, Threonin + Methionin, Threonin .+ Cystathionin oder Threonin + Homocystein für ihr Wachstum benötigen (USA.-Patent- 3c schrift 1979 439). In der deutschen Auslegeschrift 1 177 104 werden zur Herstellung von L-Lysin die Mikroorganismen Micrococcus glutamicus ATCC 13 286 oder Micrococcus glutamicus ATCC 13 287 gezüchtet, in der französischen Patentschrift 1 486 235 wird die beste Ausbeute an L-Lysin durch Züchten von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 19 350 erzielt.

Nachteilig bei den bisherigen Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin ist, daß die Ver-Wendung der genannten Mikroorganismen-Mutanten zu unbefriedigenden L-Lysinausbeuten führt, insbesondere hinsichtlich der im Ausgangsmaterial verwendeten Zuckermenge. Außerdem sind diese Verfahren in ihrer Durchführung relativ kostspielig, da verhältnismäßig große Mengen an Aminosäuren oder Nährsubstanzen, die Aminosäuren enthalten, zum Züchtungsmedium gegeben werden müssen.

Aufgabe der Erfindung war die Entwicklung eines Verfahrens zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin. mit welchem merklich höhere Ausbeuten zu erreichen sind und die Nachteile und Mängel der bekannten Verfahren überwunden werden.

Eriindungsgegenstand ist ein Verfahren zur biolecLiischen Herstellung von i.-Lysin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in Kohlenhydrate, Stickstoffsubstanzen, Mineralsalze und die für ihr Wachstum erforderlichen Aminosäuren enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Verhältnissen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum ATCC 21 253,—ATCC 21 254, —ATCC 21 255, — ATCC 21 299 oder — ATCC 21 300 einsetzt.

Nach Prüfung zahlreicher Mikroorganismen auf ihre Einsatzmöglichkeit zur Produktion von i.-Lysin wurde gefunden, daß Corynebactcrium glutamicum ATCC 13 287 und — ATCC 14 296 außerordentlich eut zur Produktion von L-Lysin mittels Fermentation eeeignet ist (USA.-Patentschrift 2 979 439). Diese Stämme, welche die Ausgangsstämme für die beim erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzenden Mikroorganismen darstellen, sind Mutanten mit Nährstoffbedürftigkeitseigenschaften für Homoserin, Threonin + Methionin, Threonin -t- Cystathionin oder Threonin + Homocystein für ihr Wachstum. Durch Bestrahlung dieser Ausgangsstämme mit UV-Strahlen ergab sich erfindungsgemäß, daG spezielle mutante Stämme erhalten werden, die sowohl die für die Ausgangsstämme beschriebenen Nährstoffbedürfnisse als auch weiterhin eine Nährstoffbedürftigkeit für Leucin. Histidin oder Isoleucin + Valin aufweisen. Diese neuen Mutanten besitzen nun überraschenderweise eine größere Fähigkeit zur Produzierung von L-Lysin ais die ursprünglichen Stämme. Speziell werden die Ausbeute, bezogen auf die Ausgangsmenge an Zucker, und die L-Lysin-Konzentration in der erhaltenen Kulturflüssigkeit durch Verwendung der neuartigen Mutanten bis zu etwa 10 bis 25% erhöht.

Die neuartigen, erfindungsgemäß einzusetzenden Mutanten sind:

Corynebacterium glutamicum ATCC 21 253,
Corynebacterium glutamicum AT<~C 21 254,
Corynebacterium glutamicum ATCC 21 255,
Corynebacterium glutamicum ATCC 21 299,
Corynebacterium glutamicum ATCC 21 300.

Wenn man in einem Vergleichsversuch (s. Beispiel 6) die erfindungsgemäß einzusetzenden Mikroorganismenstämme von Corynebacterium glutamicum einerseits und die Mikroorganismenstämme der deutschen Auslegeschrift 1177104 (Micrococcus glutaminus ATCC 13 286 und -13 287) bzw. Brevibacterium ammoniagenes ATCC 19 350 der französischen Patentschrift 1 486 235 unter gleichen Bedingungen züchtet, erbringen die erfindungsgemäß verwendeten Stämme wesentlich höhere Ausbeuten an L-Lysin.

In Tabelle 1 sind die Nährstoffbedürfnisse der Ausgangsstämme und der neuartigen erfindungsgemäß angewendeten Stämme zusammengefaßt.

Tabelle 1

Mikroorganismus

Corynebacterium
glutamicum

ATCC 13 287 (Ausgangsstamm)

Corynebacterium
glutamicum

ATCC 21 253

Corynebactcrium
glutamicum

ATCC 21 254

Coiynebacterium
glutamicum

ATCC 21 255

Nährsl -.flbedürfnisse

(Homoserin) oder

(Threonin

+ Methionin) oder

(Threonin

+ Cystathionin) oder

(Threonin

+ Homocystein)

Nährstoffbedürfnisse des Ausgangsstammes + Leucin

Nährstoffbedürfnissc des Ausgangsstammes + Histidin

Nährstoffbedürfnisse des Ausgangsstammes + Isoleucin + Valin

Fortsetzunii

Mikroorganismus

Corynebacterium
glutamicum

ATCC 14 296 (Ausgangsstamm)

Corynebacterium
glutamicum

ATCC 21 299

Corynebacterium
glutamicum

ATCC 21 300

Nährstoflbedürfnisse

Threonin

NährstofTbedürfnisse des Ausgangsstammes + Histidin

Nährstoffbedürfnisse des Ausgangsstammes + Leucin

Diese Mutanten sind neuartige, bisher unbekannte L-Lysin produzierende Mikroorganismen. Bei der Durchführung einer L-Lysin-Fermentation unter Verwendung der erfindungsgemäß einzusetzenden Mutanten sind die Zusammensetzung des Grundmediums und die Züchtungsbedingungen praktisch dieselben, wie sie üblicherweise angewendet werden und z. B. in der USA.-Patentschrift 2 979 439 beschrieben sind. So ist entweder ein natürliches oder ein synthetisches Nährmedium geeignet, solange es die für das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus notwendigen Nährstoffe enthält. Solche Nährstoffe sind in der Technik bekannt und umfassen Substanzen, wie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstof.quelle, anorganische Verbindungen u. dgl. in angemessenen Mengen, die von dem verwendeten Mikroorganismus ausgenutzt werden. So kommen als Kohlenstoffquellen beispielsweise Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen usw. oder jede andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie Glycerin. Sorbit, ferner organische Säuren, wie Essigsäure usw., in Frage. Diese Substanzen können entweder einzeln oder in Gemischen zweier oder mehrerer verwendet werden. Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Stickstoffverbindungen verwendet werden. wie z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat usw.. oder natürliche stickstoThaltige Substanzen, wie Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Caseinhydrolysate, Casaminosäure, Fischpreßsäfte, Reiskleie· extrakt usw. Auch diese Stoffe können einzeln oder in Gemischen zweier oder mehrerer verwendet werden. Anorganische Verbindungen, die zu dem Züchtungsmedium hinzugegeben werden können, sind

z. B. Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat. Kaliummonohydr^genphosphat, Eisensulfat. Mangansulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Calciumcarbcnat, Natriumchlorid usw. Wenn jedoch Rohmaterialien, wie z. B. Abfallmelassen, verwendet werden, die größere Mengen anorganischer Stoffe enthalten, kann die Züchtung ohne Zugabe zusätzlicher anorganischer Substanzen zu dem Medium durchgeführt werden.

Darüber hinaus ist es für die biotechnische Herstellung von L-Lysin gemäß der Erfindung natürlich notwendig, die entsprechenden, für das Wachstum der Mikroorganismen benötigten Aminosäuren als Nährsubstanzen zu dem Züchtungsmedium hinzuzufügen. Man kann die Aminosäuren als solche oder als Gemische verschiedener Arten von Aminosäuren, die aus natürlichen Substanzen gewonnen werden, verwenden. Vorzugsweise werden jedoch im allgemeinen verschiedene Proteinhydrolysate, mikrobielle Hydrolysate, Sojabohnenkuchenhydrolysate, Weizenglutenkuchenhydrolysate u. dgl. verwendet.

Wie man aus Tabelle 2 ersehen kann, sind die benötigten Mengen erheblich geringer als diejenigen, die bei Verwendung der Aussangsstämme notwendig sind. Dies ist ein überraschendes und unerwartetes Resultat und ein hervorstechendes Merkmal der Erfindung:

Nährsubstanz

	Tabelle 2	Produzierte Menge	an L-Lysin (mg/ml)	ATCC 21253
Zugegebene Menge		ATCC 21 255	ATCC 21 254	48,6
(g,v:i)	ATCC 13 287 (Ausgangsstamm)	48,6	50,9	52,1
2.0	37,4	52,1	49,5	49,9
3.0	40.3	49,9	47,9	48,7
4,0	44.1	48,7	47.5	50,4
5,0	43.4	51,4	49,2	45,2
1.5	38.5	48,1	46,0
2,0	42.4

Getrocknetes Weizenglutenkuchenhydrolysat

Proteinhydrolysat

Anmerkung I: Zusammensetzung des G rund medi ums: Melasse (als Glucose) 18 g/dl und Ammoniumsulfat 4 g/dl.

Anmerkung 2: Züchtungsverfahren: 3 I des Züchtungsmediums werden in einen 5-l-Jarfermenter eingebracht und sterilisiert. Die oben angegebenen Stämme werden eingeimpft und bei einem pH-Wert von 7.0. einer Temperatur von 30⁰C, einer Belüftung mit 3 l/Min, und einer Rührgeschwindigkeit von 4(Xl Upm 70Slunden lang gezüchtet.

Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen, wie z. B. aeroben Schütteln der Kultur oder durch Rühren einer Submerskultur, bei einer Temperatur von etwa 24 bis 37° C, vorzugsweise etwa 30" C, und einem pH-Wert von etwa 5 bis 8,5, vorzugsweise etwa 7,0. durchgerührt. Nach 2- bis 5tägigcr Züchtung werden unter diesen Bedingungen wesentliche Mengen an i.-Lysin in der erhaltenen Kühlflüssigkeit gefunden.

Nach Abschluß der Züchtung kann das i.-Lysin aus der Fermentationsflüssigkeit mit den üblichen Methoden, wie z. B. durch Behandlung mit einem loncnaustauschcrharz, Extraktion mit Lösungsmitteln. Ausfüllung mit Metallsalzen. Chromatoeranhie

od. dgl. abgetrennt werden. Ein wesentliches Merkmal der Erfindung besteht darin daß fast kein i.-Valin als Nebenprodukt entsteht, womit eines der Probleme ausgeschaltet wird, welche bei Verwendung der Ausgangsstämme zur Produzierung von ι -Lysin auftreten. Dieser Vorteil zeigt sich besonders bei Verwendung von Corynebacterium glutamicum ATCC 21 253 und Corynebacterium glutamicum ATCC 21 255. Das Reinigungsverfahren wird auf diese Weise wesentlich vereinfacht. ;o

Die folgenden Beispie'e sollen die Erfindung erläutern. Falls nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro Liter Wasser.

Beispiel 1

Eine Impfkulturtii'.asigkeit wird hergestellt, indem man 200 ml einr., Züchtungsmediums, enthaltend 5 g dl Abfallmehssen (als Glucose). ύ.ΰ5 g di Kaliumhydrogenphosphat. 0.05 g dl Dikaliumhydr.)gcnpnosphat, 0.3 g dl Harnstoff und 4 g dl Sojabohnen-Proteinhydrolysat. in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben gibt. Corynebacterium glutamicum ATCC 21 255 wird in den Kolben eingeimpft. Die Züchtung wird dann unter aeroben Schütteln 24 Stunden lang bei 30C durchgeführt. 2s

3 1 eines Züchtungsmediums, enthaltend 18 g dl Abfallmelassen (als Glucose). 4 g dl Ammoniumsulfat und 1,5 g dl Sojabohnen-Proteinhydrolysat. werden in einen 5-1-Jarfermenter eingebracht und sterilisiert. Anschließend werden 500 ml des obigen Inoculums in das Fermentationsmedium eingeimpft und die Züchtung begonnen. Während der Züchtung werden eine Belüftung mit etwa 3 1 min und eine Rührgeschwint'igkeit von etwa 400 Upm sowie eine Temperatur von 30 C aufrechterhalten. Der pH-Wert wird mit Ammoniakwasser auf etwa 6,8 bis 7.0 eingestellt. Nach 70 Stunden der Züchtung beträgt die Konzentration an 1.-Lysin in der erhaltenen KulturflüsSigkeit 48.7 mg/ml (als Hydrochlorid) und die Ausbeute, bezogen auf die Zuckermenge. 27.0%. Die Konzentration des als Nebenprodukt erzeugten 1.-Valin beträgt weniger als 0.3 mg ml. Wenn man die Züchtung in derselben Weise, jedoch unter Verwendung des Ausgangsstammes Corynebacterium glutamicum ATCC 13 287 als Kontrollversuch durchführt, betragen die Konzentrationen an produziertem i.-Lysin bzw. 1-Valin 37.2 bzw. 1,8 mg, ml.

Nach Abschluß der Züchtung wird die Kulturfiüssigkeit filtriert und mit einem stark sauren Ionenaustauscherharz nach üblichen Arbeitsweisen behandelt. Anschließend wird das Eluat auf einen pH-Wert von 5.0 eingestellt und konzentriert, um die Kristallisation zu bewirken. Als Ergebnis werden 120 g rohe Kristalle von 1 -Lysinhydrochlorid erhalten.

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Beispiel 2

3 1 eines Züchtungsmediums, enthaltend 16 g/dl Saccharose, 0.15 g/dl Kaliumhydrogenphosphat. 0,05 g/dl Dikaliumhydrogcnphosphat. 4 g/dl Ammo- fio niumsulfat. 0.05 g/dl Magnesiumsulfat. 0,002 g.-dl Mangansulfat, 0,002 g/'.ί! Eiscnsnlfat, 30 rj.g/1 Biotin. 120 [ig/ml Methionin. 300 [/.g/ml Threonin, 500 (ig/ml Leucin und 100 μg ml Cystin, werden in einen 5-1-Jarfermenter eingebracht ,/nd sterilisiert. 500 ml des (15 Inoculums von Corynebacterium glutamicum ATCC 21 253, das zuvor durch Züchtung in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 erhalten worden ist. werden in das Züchtungsmedium eingeimpft. Die Züchtung wird dann unter denselben Bedingungen wie im Beispiel I durchgeführt.

Nach 70stündiger Züchtung beträgt die Konzentration an i.-Lysin in der erhaltenen kulturflüssigkeit 54.6 mg ml (als Hydrochlorid). Die Ausbeute, bezogen auf die Zuckermenge, beträgt 34.2"«. Die Menge an ! -Valin, die als Nebenprodukt in dem Medium produziert worden .ist. beträgt weniger als 0.5 mg ml. Wenn man die Züchtung bei einem Kontrollversuch in derselben Weise wie es oben beschrieben worden ist. jedoch mit d:r Abwandlung, daß der Ausgangsstamm Corynebacterium glutamicum ATCC 13 287 als Mikroorganismus verwende» wird, und daß in dem Ausgangsfermentationsmedium kein Leucin enthalten ist. durchführt, beträgt die erhaltene Konzentration an 1-Lysin 42.1 mg ml. ⁿie Menge des beim Kontrollversuch als Nebenproduh' erzeugten i.-Valins beträgt 1.7 mg ml.

Beispiel 3

Die Züchtung wird in derselben Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt, mit der Abwandlung, daß Corynebacterium glutamicum ATCC 21 254 als Impfstamm verwendet wird. Als Ergebnis wird eine Kulturflüssigkeit erhalten, die 50.7 mg,ml 1-Lysin (als Hydrochlorid) enthält. Die Ausbeute beträgt 28.1%. bezogen auf die eingesetzte Zuckermenge.

Beispiel 4

Die Züchtung wird in derselben Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt, mit der Abwandlung, daß Corynebacterium glutamicum ATCC 21 299 als Impl'sUimm verwendet wird. Als Ergebnis wird eine Kulturflüssigkeit erhalten, die 53.2 mg ml i.-Lysin (als Hydrochlorid) enthält.

Beispiel 5

Die Züchtung wird in derselben Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt, mit der Abwandlung, daß Corynebacterium glutamicum ATCC 21 300 als !mpfstamm verwendet wird. Als Ergebnis wird eine Kulturflüssigkeit erhalten, die 51,6 mg ml 1.-Lysin (als Hydrochlorid) enthält.

Beispiel 6

In diesem Beispiel werden zu Vcrgleichszwecken die Versuchsstämme Micrococcus glutamicus ATCC '3 2^:i6 und ATCC' 13 287 der deutschen Auslegeschrift 1 177 104 sowie der Mikroorganismenstamm Brevibaclcriurn ammoniagcnes ATCC '9 350 (französische Patentschrift 1 486 235) gezüchtet.

Die Züchtung erfolgte innerhalb 70 Stunden in der gleichen Weise wie im Beispiel f. Es wurden die foliienden Ergebnisse erhalten:

Tabl lic 3

Mikroorganismenstamm

Micrococcus glutamicus

ATCC 13 286

ATCC 13 287

Brevibacterium ammoniagcnes
ATCC 19 350

i.-Lysin-Ausbcutc
(mg ml)

37.0
37.2

27.0

Forlsetzung

Mikroorganismenstamm

Corynebacterium glutamicum

ATCC 21 253

ATCC 21 254

ATCC 21 255

ATCC 21 299

-Lysin-Ausbeulc (mg/ml)

54,6 50.7 48,7 53,2

Fortsetzung
Mikroorganismenstamm
ATCC 21 300

I -I.ysin-Ausbeutc (mg mil

51.6 """

Aus den Ergebnissen wird ersichtlich, daß dk ι -Lysin-Ausbcutcn mit den crlindungsgcmäß einzusetzenden Mikroorganismenstämmen bedeutend höher sind als mit Mikroorganismenstämmen, deren Einsatz von der Technik bereits vorgeschlagen worden ist.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur biotechnischen Herstellung v_Dn t-Lysin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in Kohlenhydrate, Stickstoffsubstanzen, Mineralsalze und die für ihr Wachstum erforder-Bchen Aminosäuren enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Vcrtältnissen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Corynebacterium flutamicum ATCC 21 253, — ATCC 21 254 — ATCC 21 255, — ATCC 21 299 oder — ATCC 21 300 einsetzt.

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