DE2108404B2 - Verfahren zur Erzeugung von L-Arginin durch Mikroorganismen - Google Patents
Verfahren zur Erzeugung von L-Arginin durch MikroorganismenInfo
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Description
L-Arginin ist eine wichtige Aminosäure und ist als Lebensmittelzusatzstoff, in der Medizin und als Tierfuttermittelzusatzstoff
angewendet worden.
L-Arginin ist in technischem Umfang aus natürlichem Proteinhydrolysat mit verhältnismäßig hohen
Kosten in einer komplexen Isolierungsarbeitsweise hergestellt worden. Es ist bekannt, daß gewisse Bakterien
von Corynebacterium oleophila und Brevibacterium incertum L-Arginin aus Kohlenwasserstoffen
in sehr geringer Konzentration erzeugen (U.S.-P. 3222258 und U.S.-P. 3440141).
Gemäß der US-PS 3222258 werden Aminosäuren
durch Mikroorganismen in Kulturmedien hergestellt, die Kohlenwasserstoffe oder Mischungen davon als
Hauptquelle von assimilierbarem Kohlenstoff enthalten. Die Ausbeute an L-Arginin bei dem bekannten
Verfahren ist sehr gering und beträgt maximal 0,35%.
Gemäß der US-PS 3440141 beträgt die Höchstausbeute 0,0532 g/dl und ist ebenfalls als sehr gering
zu bezeichnen.
Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Erzeugung von L-Arginin durch Mikroorganismen
an einem eine Kohlenstoffquelle enthaltenden Kulturmedium, wobei im Vergleich mit den
bekannten Verfahren eine wesentlich höhrere Ausbeute erzielt wird.
Das Verfahren gemäß der Erfindung zui Herstellung von L-Arginin durch Mikroorganismen in einem
eine Kohlenstoffquelle enthaltenden Kulturmedium ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein Bakterium,
das zur Gattung Brevibacterium oder Corynebacterium gehört und die Fähigkeit hat, L-Arginin aus einem
Kohlerihydraf zu erzeugen, auf einem Kulturmedium
züchtet, das wenigstens ein assimilierbares Kohlenhydrat, eine assimilierbare organische Säure
oder einen assimilierbaren Alkohol als Kohlenstoffquelle enthält, und angesammeltes !.-Arginin aus der
Züchtungsbrühe gewinnt.
Mikroorganismen, die bei der vorliegenden Erfindung
angewendet werden können, haben die Fähigkeit, L-Arginin in einem Kulturmedium zu erzeugen,
das ein Kohlenhydrat, eine organische Säure, einen Alkohol oder eine Mischung davon enthält, und sie
schließen Brevibacterium flavum ATCC 21493 und Corynebacterium acetoacidophilum AJ-3278 (FERM
P-630, wobei die FERM P-No. sich auf den Mikroorganismus bezieht, der in dem Fermentation Research
Institute, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of the Industrial Trade and Industry,
iu Japan, hinterlegt worden ist) ein.
Es können auch geringere Mengen von organischen und anorganischen Stoffen, wie Vitamine, Aminosäuren,
Maiseinweichflüssigkeit, Proteinhydrolysat oder Pepton, den Kulturmedien zugesetzt werden. Beispiele
von assimilierbaren Kohlenhydraten sind Glucose, Sucrose, Stärkehydrolysat und Stärke, wobei die
assimilierbaren organischen Säuren aus Essigsäure, Glucosesäure, Bernsteinsäure und Citronensäure bestehen,
und der Alkohol kann zum Beispiel aus Ätha-
-'fi nol bestehen.
Zur Erzielung einer guten Ausbeute von L-Arginin wird die Gärung aerob unter Rühren, Belüftung und
oder anderer Bewegung ausgeführt. Die Gärung wird bei 24 bis 37 ° C 2 bis 7 Tage bei ein ;m pH-Wert von
2> 5,0 bis 9,0 durchgeführt. Der gewünschte pH-Wert
kann durch Zusatz von anorganischer oder organischer Säure oder einer alkalischen Verbindung, wie
Harnstoff, Calciumkarbonat oder gasförmigem Ammoniak zu dem Medium aufrechterhalten werden.
ίο Das in der Gärungsbrühe angesammelte L-Arginin
kann durch übliche Verfahren, wie z, B. durch Anwendung eines Ionenaustauscherharzes in Kombination
mit einer Fällung gewonnen werden. Das L-Arginin wurde durch die Ergebnisse einer Ninhydrinreak-
J-) tion auf einem Papierchromatogramm, Rf-Werten auf
dem Papierchromatogramm, einer positiven Sakaguchi Reaktion und V achstumskurven von Arginin erfordernden
Mutanten von Milchsäurebakterien, bestätigt. Das L-Arginin in der Brühe wurde durch
to Bioerprobung unter Anwendung von Leuconostoc
mesenteroides ATCC 8042 bestimmt.
Beispiel 1
Es wurde eine 300 ml-Menge eines Mediums mit
Es wurde eine 300 ml-Menge eines Mediums mit
4-i einem Gehalt von 10 g/di Glucose, 0,1 g/dl KH2PO4,
0,04 g/dl MgSO4 · 7HjO, 4 g/dl (NH.)2SO4, 100 y/l
Biotin, 200 y/l Vitamin B, · HCI, 2 Teile je Million Fe und Mn-Ionen, 1 ml/dl Sojabohnenprotein-Hydrolysat
und 5 g/dl CaCO?, mit einem pH-Wert von
V) 7,0, in ein Glasgärgefäß eingebracht, nach Sterilisierung
wurde das Medium mit Brevibacterium flavum ATCC 21493, das zuvor auf einer Bouillonschräge
bei 30° C 24 Stunden gezüchtet worden war, angeimpft und bei 31 ° C 48 Stunden unter Belüften ge-
> -> züchtet und gerührt. Die Züchtungsbrühe enthielt, wie
gefunden wurde, 2,1 g/dl L-Arginin.
1 Liter der Züchtungsbrühe wurde zentrifugiert, um bakterielle Zellen und andere feste Substanzen
zu entfernen, wobei die überstehende Flüssigkeit auf
wi eine Säule, die mit Kationsaustauschharz gefüllt war,
geführt und L-Arginin wurde mit 2n-Amrnofiiakwasser
eluiert. Das Eluat wurde konzentriert, rohes kristallines L-Arginin wurde aus Wasser umkristallisiert
und 12 g reines !.-Arginin wurden erhalten.
Corynebacterium acetoacidophilum AJ-3278 (FERM P-630) wurde auf einem 20 ml-Medium, das
10 g/dl Sucrose, 0,1 g/dl KH2PO4, 0,04 g/dl
MgSO -7H2O, 4 g/dl (NH4J2SO4, 200 y/1 Biotin,
200 y/l Vitamin B, · HCl, 2 Teile je Million Fe und Mn-Ionen und 5 g/dl CaCo3, mit einem pH-Wert von
7,0 enthalt, bei 30° C 72 Stunden unter Schütteln gezüchtet
Die Züchtungsbrühe enthielt, wie gefunden wurde, 1,8 g/dl L-Arginin.
Brevibacterium flavum ATCC 21493 wurde bei
31,5° C12 Stunden auf einem Saatkulturmedium, das 3,0 g/dl Stärkehydrolysat (Glucoseäquivalent),
0,3 g/dl Ammoraumazetat, 0,15 g/dl KH2PO4,
0,04 g/dl MgSO4 · 7ILO, 2 Teile je Million Fe und
Mn-Ionen, 3,0 ml/dl Sojabohnenprotein-Hydrolysat 50 y/1 Biotin, 300 y/I Vitamin B1 · HQ und 0,2 g/dl
Harnstoff mit einem pH-Wert von 7,0 enthält, gezüchtet.
15 ml der Saatlcütur wurden zugegeben, um ein
300 ml Hauptzüchiiingsmedium anzuimpfen. das ie dl 0,8 g Ammoniumazetät, 0,41 g Natriumazetat, 0,10 g
KH2PO4, 0,04 g MgSO4 -7H2O, 2 Teile je Million
(2 ppm) Fe und Mn-Ionen, 0,2 g/dl Harnstoff, 2 ml Sojabohnenprotein-Hydrolysat, 50 y/1 Biotin und
200 y/1 Vitamin B1 · HCl enthielt und wurde in einem
500 ml Gärgefäß bei 31,5° C mit 1350 U/min und unter Einführung von einem halben Volumen Luft je
Minute, gezüchtet.
Als der pH-Wert des Mediums nach 6 Stunden nach der Animpfung 8,2 erreichte, begann man mit
dem Zusatz 60%iger Essigsäure und gasförmigen Ammoniaks, während der pH-Wer. des Mediums
zwischen 7,5 und 8,0 gehalten wurde. Die Gärung wurde 48 Stunden ausgeführt, 18 Voltv ien-% Essigsäure
je Volumen des ursprünglichen Mediums wurden verbraucht, und die Züchtungsbrühe enthielt, wie
gefunden wurde, 2,60 g L-Arginin pro dl. (10,0% Ausbeute bezogen auf die verwendete Essigsäure.)
Aus 500 ml Züchtungsbrühe erhielt man 10,0 g L-Arginin.
Corynebacterium acetoacidopbiluro FERM P-630
wurde 55 Stunden in gleicher Weise wie in Beispiel 3 gezüchtet, 16 Volumen-% Essigsäure je Volumen des
ursprünglichen Mediums wurden verwendet und 1,22 g/dl L-Arginin wurden in der Züchtungsbrühe
gefunden.
Ein Züchtungsmedium von einem pH-Wert von 7,2, das 1,5 ml/dl Äthanol, 0,5 g/dl (NHJ2SO4,
0,1 g/dl KH2PO4,0,04 g/dl MgSO4 - 7H20,2 Teile je
Million Fe-Ionen, 2 ml/dl Sojabohnenprotein-Hydrolysat, 100 y/1 Biotin, 50 y/1 Vitamin B1 · HCl und
0,1 irl/dl Maiseinweichflüssigkeit enthält, wurde hergestellt,
eine 300 ml-Menge des Mediums wurde in ein Glasgärgefäß eingebracht und mit 30 ml einer
Saatkultur von Brevibacteriura flavum ATCC 23 493 angeimpft, die in gleicher Weise wie in Beispiel 3, hergestellt
worden ist. Die Fermentation oder Gärung wurde durch Rühren bei 30° C bei 1500 U/min und
unter Einführung des gleichen Luftvolumens wie dem des Mediums je Minute während der Fermentation
oder Gärung wurde der pH-Wert des Mediums innerhalb eines Bereiches von 7,0 bis 7,5 unter Zusatz gasförmigen
Ammoniaks aufrechterhalten. Äthanol wurde dem Medium vo^ Zeit zu Zeit zugeführt, als
die Äthanolmenge in dem Medium während der Mengenbestimmung durch Gaschromatographie unter
0,1 ml/dl absank.
Nach 48 Stunden Züchtung wurden 0,96 g/dl L-Arginin in der Züchtungsbrühe gefunden. (8,2%
Ausbeute bezogen auf das verwendete Äthanol.)
Corynebacterium acetoacidophilum FERM P-630 wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 5 gezüchtet
und die Züchtungsbrühe enthielt, wie gefunden wurde, 0,75 g/dl L-Arginin. (7,3% Ausbeute bezogen
auf das verwendete Äthanol.)
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von L-Arginm durch Mikroorganismen in einem eine Kohlenstoffquelle
enthaltenden Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Bakterium,
das zur Gattung Brevibacterium oder Lorynebacterium gehört und die Fähigkeit hat,
L-Argjnin aus einem Kohlenhydrat zu erzeugen* auf einem Kulturmedium züchtet, das wenigstens
ein assimilierbares Kohlenhydrat, eine assimilierbare organische Säure oder einen assimilierbaren
Alkohol als Kohlenstoffquelle enthält, und angesammeltes L-Arginin aus der Züchtungsbrühe gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterium aus Brevibacterium
flavum ATCC 21493 besteht.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterium aus Corynebacterium
acetoacidophilum FERM P-630 besteht.
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