DE2108404A1 - Verfahren zur Erzeugung von L Arginin durch Mikroorganismen - Google Patents
Verfahren zur Erzeugung von L Arginin durch MikroorganismenInfo
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Description
TELEFON: 555476 8000 MD NCHEN 15,
TEtEGRAMME: KARPATENT NUSSBAUMSTRASSE 10
22. Februar 1971
W. 40366/71 7/Mac
Ajinomoto Co., Inc.
Chuo-ku, Tokyo (Japan)
Chuo-ku, Tokyo (Japan)
Verfahren zur Erzeugung von L-Arginin durch Mikroorganismen
Gewisse Bakterien der Gattung Brevibacterium und Corynebaeterium erzeugen extrazellular L-Arginin
in ausreichenden Mengen für eine Gewinnung in technischem Maßstab, wenn sie auf einem Glucose- oder
Essigsäuremedium gezüchtet werden.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung von L-Arginin durch bakterielle
Fermentation oder Gärung.
L-Arginin ist eine wichtige Aminosäure und ist als Lebensmittelzusatzstoff, in der Medizin und als
Tierfutterrnittelzusatzstoff angewendet worden.
BAD ORIGINAL 10983771098
L-Arginin 1st in technischem Umfang aus natürlichem Proteinhydrolysate mit verhältnismäßig
hohen Kosten in einer komplexen Iaolierungsarbeitsweise hergestellt worden. Es ist bekannt, daß gewisse
Bakterien von Corynehacteriurr oleophila und
Brevibaceteriurn incertum L-Arginin aus Kohlenwasserstoffen
in sehr geringer Konzentration erzeugen (U.S.-P. 5 222 258 und U.S.-P. 5 440 141).
Es ist nun gefunden worden, daß gev/isse Bakterien der Gattung Brevibacterium und Ccrynebacterium die
Fähigkeit haben, L-Arginin zu erzeugen, wenn sie in einem Medium gezüchtet v/erden, das ein Kohlenhydrat,
eine organische Säure oder einen Alkohol als Kohlenstoff
quelle enthält.
Mikroorganismen, die bei der vorliegenden Erfindung angewendet werden können, gehören zur Gattung Brevibacterium
oder Corynebacteriunn und haben die Fähigkeit, L- Arginin
in einem Kulturmedium zu erzeugen, das ein Kohlenhydrat, eine organische Säure, einen Alkohol oder eine Mischung
davon enthält, und sie schließen Brevibacterium flavura
AECC 21493 und Corynebacterium acetoacidophilu® AJ-5278
(EEBM P-63,0, wobei die FERM P-Ho. sich auf den Mikroorganismus
bezieht, der in dem Fermentation Rese&rch
Institute, Agency of Industrial Science and Technology,
the Ministry of the IndustrialTieade and Industry, Japan
hinterlegt worden ist) ein.
Die bei dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendeten Kulturmedien sind an sich üblich und enthalten
assimilierbares Kohlenhydrat, organische Säure oder
Alkohol al3 Kohlenstoff quelle, eiu« aoeiailieifbar· Stickötoffquelle
und anorganische Salze.
109837/!098
Es können auch geringere Mengen von organischen und anorganischen Stoffen, wie Vitamine, Aminosäuren, Korneinweichflüssigkeit
(Maiseinweichflüssigkeit), Proteinhydrolysat oder Pepton, den Kulturmedien zugesetzt v/erden.
Beispiele von assimilierbaren Kohlenhydraten sind Glucose,
Sucrose , Stärkehydrolysat" und Stärke, wobei die assimilierbaren organischen Säuren aus Essigsäure, Glucosesäure,
Bernsteinsäure und Citronensäure bestehen.! und
der Alkohol kann zum Beispiel aus Äthanol bestehen.
Zur Erzielung einer guten Ausbeute von L-Arginin wird die Fermentation oder Gärung eerob unter Rühren,
Belüftung und oder anderer Bewegung ausgeführt. Die
Gärung wird bei 24 bis 370C 2 bis 7 Tage bei einem PH-Wert
von5»0 bis 9,0 durchgeführt. Der gewünschte pH-Wert
kann durch Zusatz von anorgatjischer oder organischer Säure
oder einer alkalischen Verbindung, wie Harnstoff, Calciumkärbonat oder gasförmigem Acnoniak zu dem Medium aufrechterhalten
v/erden.
Das in der Gärungsbrühe angesammelte L-Arginin kann durch übliche Verfahren, wie z. B. durch Anwendung eines
Ionenaustauscherharzes in Kombination mit einer Fällung gewonnen werden. Das L-Arginin wurde durch die Ergebnisse
einer Rinhydrinreaktion auf einem Papierchroinatogrcmm,
Rf-V.'erten auf dem Pauierchroinatograrr.m, einer positiven
Sakaguchi Reaktion und Wachstumskurven von Arginin erfordernden Mutanten von Milchsäurebakterien, bestätigt.
Das L-Arginin in der Brühe wurde durch Bioerprobung unter Anwendung von Leuconostoc mesenteroides ATCC 8042 bestimmt.
BAD ORIGINAL
109837/1098
Es wurde eine 300 ml-Menge eines Mediums mit einem Gehalt von 10 g/dl Glucose, 0,1 g/dl KH2PO4, 0,04 g/dl
MgSO4-7H2O, 4 g/dl (NH4J2SO4, 100 γ/ΐ Biotin, 200 γ/l
Vitamin B1-HCl, 2 Teile je Million (2ppm) Pe und Mn-Ionen,
1 ml/dl Sojabohnenprotein-Hydrolysat ("Aji-Eki")
und 5 g/dl CaCO5, mit einem pH-Wert von 7,0, in
ein Glasgärgefäß eingebracht, nach Sterilisierung wurde das Medium mit Brevibacterium flavum ATCC 21493, das
zuvor auf einer Bouillonschräge bei 300C 24 Stunden
gezüchtet worden war, eingeimpft und bei 310C 48 Stunden
unter Belüften gezüchtet und gerührt. Die Züchtungsbrühe enthielt, wie gefunden wurde, 2,1 g/dl L-Arginin.
1 Liter der Züchtungsbrühe wurde zentrifugiert, um bakterielle Zellen und andere feste Substanzen zu entfernen,
wobei die überstehende Flüssigkeit auf eine Säule, die mit Kationenaustauschharz (Amberlite C-50 HHa+
Typ)» gefüllt war, geführt und !-Arginin wurde mit 2n-Ammoniakwasser
eluiert. Das Eluat wurde konzentriert, rohes kristallines L-Argin in wurde aus V/asser umkristallisiert
und 12 g reines L-Arginin wurden erhalten.
Corynebacterium acetoacidophilum AJ-3278 (PERI1I P-630) wurde
auf einem 20 ral-Medium, das 10g/dl Sucrose, 0,1 g/dl KH2PO4,
0,04 g/dl MgSO4.7H2O, 4 g/dl (HH4)2SO4, 200 γ/l Biotin,
200 γ/l Vitamin B11HCl, 2 Teile je hillion (2ppm) Pe und
Mn-Ionen und 5 g/dl CaCo^1 mit einem PH-Wert von 7,0 enthält,
bei 300C 72 Stunden unter Schütteln gezüchtet.
Die Züchtungsbrühe enthielt, wie gefunden wurde, 1,8 g/dl
L-Arginin.
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Brevibacterium flavum ATCC 21493 wurde bei 31,50C 12 Stunden
auf einem Saatkulturmedium, das 3,0 g/dl Stärkehydrolysat
(GiucQseequivalent), 0,3 g/dl Aramoniumazetat, 0,15 g/dl KB2-PO41
0,04 g/dl MgSO4.7H2O, 2 Teile je Million (2ppm) Pe und
Mn-Ionen, 3,0 ml/dl Sojabohnenprotein-Hydrolysat ("Aji-Eki"),
50 γ/l Biotin, 300 γ/l Vitarain B-^HCl und 0,2 g/dl Harnstoff
mit einem PH-Wert von 7.0 enthält, gezüchtet.
15 ml der Saatkultur wurden zugegeben, um ein 300 ml Hauptzüchtungsraedium
anzuimpfen, das je dl 0,8 g Ammoniumazetat, 0,41 g Natriumazetat, 0,10 g KH2PO4, 0,04 g MgSO4.7H2O,
2 Teile je Million (2ppm) Fg und Mn-Ionen, 0,2 g/dl Harnstoff,
2 ml Sojabohnenprotein-Hydrolysat ("Aji-Eki"), 50 γ/l Biotin und 200 γ/l Vitamin B^.HCl enthielt und wurde in einem 500 ml
Gärgefäß bei 31.50C mit 1350 u/min.und unter Einführung van
einem halben Volumen Luft je Minute, gezüchtet.
Al3 der pH-Wert des Mediums nach 6 Stunden nach der Anirapfung
8,2 erreichte, begann man mit dem Zusatz 60$iger Essigsäure und gasförmigen Ammoniaks, während der pH-Wert des Mediums
zwischen 7,5 und 8,0 gehalten wurde. Die Gärung wurde 48 Stunden ausgeführt, 18 Volumen-^ Essigsäure je Volumen des
ursprünglichen Mediums wurden verbraucht, und die Züchtungsbrühe enthielt, -wie gefunden wurde, 2,60 g L-Arginin pro dl.
(10,0 f- Ausbeute bezogen auf die verwendete Essigsäure).
Aus 500 ml Züchtungsbrühe erhielt man 10,0 g L-Arginin.
Corynebacterium acetoacidophilum PERM P-63O wurde 55 Stunden
in gleicher V/eise wie in Beispiel 3. gezüchtet, 16 Volumen-^
Essigsäure j3 Volumen des ursprünglichen Mediums wurden verwendet und Ij22 g/dl L-Arginin wurden in der Züchtungebrühe
ge f undö 11,
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Ein Züchtungsmedium von einem pH-Wert von 7,2, das 1,5 ml/dl
Äthanol, 0,5 g/dl (NH4J2SO4, 0,1 g/dl KH2PO4, 0,04 g/dl MgSO4
.7H2O, 2 Teile je Million Fe-Ionen, 2ml/dl Sojabohnenprötein-Hydrolysat
("Aji-Eki"), 100 γ/ΐ Biotin, 50 γ/l Vitamin B1-HGl
und 0,1 ml/dl Korneinweichflüssigkeit (MaiseinweichfLussigkeit)
enthält, wurde hergestellt, tine 300 ml-Menge des Mediums wurde
in ein Glasgärgefäß eingebracht und mit 30 ml einer Saatkultür
von Brevibacterium flavum ATCC 21493 angeimpft, die in
gleicher Weise v/ie in Beispiel 3/ hergestellt worden ist.
Die Fermentation oder Gärung wurde durch Rühren bei 30° C
bei 1 500 U/min, und unter Einführung des gleichen Luftvolumens wie dem des Mediums je Minute während der Fermentation
oder Gärung wurde der PH-Wert des Mediums innerhalb eines Bereiches von 7,0 bis 7,5 unter Zusatz gasförmigen
Ammoniaks aufrechterhalten. Äthanol wurde dem Medium von Zeit zu Zeit zugeführt, als die Äthanolmenge in dem Medium
während der Mengenbestimmung durch Gaschromatographis unter
0,1 ml/dl absank.
Nach 48 Stunden Züchtung wurden0,96 g/dl L-Arginin in der
Züchtungsbrühe gefunden. (8,2 fo Ausbeute bezogen auf das
verwendete Äthanol).
Corynebacterium acetoacidophilum FERM P-630 wurde in der gleichen Weise v/ie in Beispiel 5 gezüchtet und die
Züchtungsbrühe enthielt, wie gefunden wurde, 0,75 g/dl L-Arginin. (7,3 7° Ausbeute bezogen auf das verwendete
Äthanol).
BAD ORIGINAL
IÜ9837/1098
Claims (5)
1. Verfahren zur Erzeugung von L-Arginin, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Bakterium,
das zur Gattung Brevibacterium oder Corynebaoterium
gehört und die Fähigkeit hat, L-Arginin aus einem Kohlenhydrat zu erzeugen, auf einem Kulturmedium
züchtot t das wenigstens ein assimilierbares Kohlehydrat, eine assimilierbare organische Säure
oder einen assimilierbaren Alkohol als Kohlenstoffquelle enthält, und angesammeltes L-Arginin aus der
Züchtungsbrülie gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 ,dadurch gekennzeichnet,
dai? das Bakterium aus Brevibacterium flavum ATCC 21493 besteht.
3. Verfahren nach Anspruch 1 ,dadurch gekennzeichnet,
daß das Bakterium aus Corynetacterium acetoacidophiluta FERM P-630 besteht.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3 ,dadurch gekennseichnet-,
daß die assimilierbare Kohlenstoff quelle aus Glucose oder Essigsäure besteht.
5. Verfahren nach Anspruch 4 ,dadurch gekennzeich net, daß die Essigsäure dem Kulturmedium vcn Ze rl"zu
Zeit zugegeben wird.
109837/1098
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DE2108404C3 DE2108404C3 (de) | 1981-03-19 |
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