DE1442258C

DE1442258C - Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsaure

Info

Publication number: DE1442258C
Authority: DE
Inventors: Yuichi; Uno Tetauo; Kubota Yoshita; Hosoda Hiroshi; Hofu Noguchi (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Publication date: 1972-07-20

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Züchten eines Glutaminsäure bildenden Mikroorganismus der Art Micrococcus glutamicus.

In letzter Zeit sind in starkem Maße Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation entwickelt worden. Weiterhin sind diese Verfahren wegen einer starken Zunahme im Verbrauch und den Anwendungsmöglichkeiten von L-Glutaminsäure in immer größerem Maße industriell durchgeführtworden.

Aus der schweizerischen Patentschrift 36 68 25 ist ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von i.-Glutaminsäure unter Verwendung von Brevibacterium lactofermentus als Mikroorganismus bekannt. Aus der französischen Patentschrift 1 335 693 ist ein weiteres Verfahren zur biotechnischen Herstellung von !.-Glutaminsäure bekannt, bei dem Microbacterium ammoniaphiliun als Mikroorganismus verwendet wird. Zahlreiche Faktoren, die bei der Herstellung von steinsäure, Apfelsäure, Malonsäure, Adipinsäure, Gluconsäure, Acetylcitronensäure oder Acetyläpfelsäure ausführt.

Bei der Untersuchung der verschiedenen Faktoren, die bei der fermentativen Herstellung von L-Glutaminsäure mit Hilfe von Mikroorganismen der Art Micrococcus glutamicus von Bedeutung sind, wurde gefunden, daß in einem Kulturmedium eine größere Menge an L-Glutaminsäure angesammelt wird, wenn man dem Kulturmedium, das für die das Wachstum der Mikroorganismen wesentlichen bzw. unentbehrlichen Nährstoffe, wie z. B. eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen u. dgl. enthält, einen oder mehrere der obengenannten Ester zusetzt.

Die im folgenden beschriebenen Versuche, bei denen i.-Glutaminsäure durch Fermentation unter Verwendung von Micrococcus glutamicus hergestellt wurde, zeigen die Wirkung, die durch den Zusatz der erfin-

g g

i.-Glutaminsäure durch Fermentation von Bedeutung 20 dungsgemäß verwendeten Ester erzielt wird, j

sind, sind jedoch zur Zeit noch unbekannt. Im Hinblick auf die Fermentationsbedingungen bei derartigen Verfahren existieren daher noch zahlreiche Probleme. Die Untersuchung und Auswertung dieser Faktoren ist daher von großer Bedeutung, wenn man die optimalen Bedingungen bestimmen will, unter denen sich die !.-Glutaminsäure in industriellem Maßstab in hoher Ausbeute herstellen läßt.

Es ist bekannt, daß es bei der Herstellung von L-Glutaminsäure durch Züchten von L-Glutaminsäure bildenden Mikroorganismen erforderlich ist, dem Kulturmedium die für das Wachstum der Mikroorganismen wesentlichen bzw. unentbehrlichen und spezifischen Nährstoffe, wie z. B. Vitamine, Aminosäuren usw., in geringen Mengen zuzusetzen oder ein diese Substanzen enthaltendes Rohmaterial zu dem eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen u. dgl. enthaltenden Nährmedium zu geben. Weiterhin ist es bekannt, daß derartige Zusätze die Ausbeute an [.-Glutaminsäure bei der fermentativen Herstellung erhöhen können.

Aus der französischen Patentschrift 1 335 176 ist z. B. ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Glutaminsäure bekannt, bei dem Microbacterium ammoniaphilum in einem Nährmedium gezüchtet wird, das Fettsäureester des Sorbitans enthält, und aus der französischen Patentschrift 1 342 365 ist ein weiteres Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Glutaminsäure bekannt, bei dem ein i-Glutaminsäure erzeugender Mikroorganismus in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das eine grenzflächenaktive Substanz enthält.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neues verbessertes Verfahren zur biotechnischen Herstellung von !-Glutaminsäure.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von !.-Glutaminsäure durch Züchten eines Glutaminsäure bildenden Mikroorganismus der Art Micrococcus glutamicus in einem eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und zum Wachstum des Mikroorganismus notwendige Nährstoffe enthaltenden wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation in

25

30

35 Wenn nicht anders angegeben, sind die angegebenen Prozentzahlen Gewichtsprozente.

Versuch I

Die Versuchsreihe zeigt die Abhängigkeit der erhaltenen Ausbeute an L-Glutaminsäure von der Art und der Menge von dem Kulturmedium zugesetzten Estern der Bernsteinsäure.

Als Fermentationsbehälter wurde bei sämtlichen Fermentationsversuchenein 5-Liter-Kolben verwendet.

270 ecm einer Impfflüssigkeit, die Micrococcus glutamicus ATCC Nr. 13032 als L-Glutaminsäure bildenden Bakterienstamm enthielt, wurden zum Beimpfen eines Kulturmediums verwendet, das 13% eines durch Säurehydrolyse hergestellten Stärkehydrolysate (berechnet als Glucose), 0,1% Ammoniumhydrogenphosphat, 0,1% Diammoniumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,004% Mangansulfat, 0,002% Eisen(II)-sulfat,0,3% Kaliumsulfat, 0,5% Harnstoff und 3μ g/Liter Biotin enthielt. Das auf diese Weise beimpfte Kulturmedium wird 48 Stunden unter den folgenden Bedingungen gehalten:

Umdrehungsgeschwindigkeit... 600 Umdrehungen

pro Minute

Temperatur 34⁰C

Belüftungsgeschwindigkeit 3 Liter/Minute

Während des Züchtern wird der pH-Wert mit Hilfe einer 30%igen Harnstoff lösung bei 7,0 gehalten.
Es werden die folgenden Ergebnisse erhalten:

45

50

55

(1) Di-n-butylsuccinat
Di-n-butylsuccinat
Di-n-butylsuccinat

kein Zusatz

(2) Di-n-octylsuccinat
Di-n-octylsuccinat
Di-n-octylsuccinat

kein Zusatz

Gegenwart von 0,01 bis 1,0 Gewichtsprozent eines oder 65 (3) Di-n-hexylsuccinat mehrerer Ester von Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Di-n-hexylsuccinat Isobutyl-, Amyl-, Isoamyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Di-n-hexylsuccinat Noiiyl- oder Decylalkohol mit Citronensäure, Bern- kein Zusatz

Menge an

zugesetztem

Ester

0,10
0,15
0,20

Menge an
gebildeter
L-Glutaminsäure
(mg/ccni)

63,3
65,0
68,1
55,5
60,0
65,3
66,0
55,6
68,1
66,6
58,8
55,2

Versuch 2

Diese Versuchsreihe zeigt den Einfluß von n-Propylestern verschiedener genannter Säuren.

Die Fermentationsversuche wurden wie bei Versuch 1 durchgeführt. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

	Zugegebene Estermenge	Gebildete Menge an !.-Glutamin säure
	(7o)	(mg/ccm)
Di-n-propylsuccinat ...	0,1 0,2	61,2 67,0
Di-n-propylmalat	0,1 0,2	60,4 64,4
Di-n-propylmalonat ...	0,1 0,2	63,1 66,9
Di-n-propyladipat ....	0,1 0,2	62,0 66,8
Mono-n-propylgluconat	0,1 0,2	64,0 67,1
kein Zusatz	—	55,5

Versuch 3 .

Die Fermentationsversuche wurden in einem 5-Liter-Kolben durchgeführt.

2730 ecm eines Kulturmediums, das 13 % eines durch Säurehydrolyse hergestellten Stärkehydrolysate (berechnet als Glucose), 0,1 % Ammoniumhydrogenphosphat, 0,1 % Diammoniumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,004% Mangansulfat,

ίο 0,002% Eisen(II)-sulfat, 0,3% Kaliumsulfat, 0,5% Harnstoff und 3 μ g/Liter Biotin enthielt, wurde mit 270 ecm einer Impfflüssigkeit beimpft, die Micrococcus glutamicus ATCC Nr. 13032 als L-Glutaminsäure bildenden Bakteriönstamm enthielt. Das Medium wurde 48 Stunden unter den folgenden Bedingungen gehalten :

Drehgeschwindigkeit 600 Umdrehungen

pro Minute

_ao Temperatur 34⁰C .

Belüftungsgeschwindigkeit 3 Liter/Minute

Während des Züchtens wurde der pH-Wert mit Hilfe einer 30%igen wäßrigen Harnstofflösung bei 7,0 gehalten.

Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

	Zugegebene Estermenge	Gebilde Menge an L-Glutamin säure
■	(%>	(mg/ccm)
(1) Tri-n-butylcitrat ...	0,05	-68,2
Tri-n-butylcitrat ...	0,10	68,2
Tri-n-butylcitrat ...	0,15	71,4
Tri-n-butylcitrat ...	0,20	70,0
kein Zusatz	—	56,0
(2) Di-n-butylciirat	0,05	57,6
Di-n-butylcitrat	0,10	60,0
Di-n-butylcitrat....	0,15	63,5
Di-n-butylcitrat	0,20	63,0
kein Zusatz	—	55,0
(3) Mono-n-butylcitrat	0,05	61,8
Mono-n-butylcitrat	0,10	62,1
Mono-b-nutylcitrat	0,15	65,0
Mono-n-butylcitrat	0,20	65,2
kein Zusatz	—	55,6
[4) Tri-n-amylcitrat ...	0,05	56,9
Tri-n-amylcitrat	X),10	58,9
Tri-n-amylcitrat ...	0,15	62,2
Tri-n-amylcitrat ...	0,20	64,3
kein Zusatz	— ■	54,8
[5) Tri-n-hexylcitrat ...	0,05	57,8
Tri-n-hexylcitrat ...	0,10	67,3
Tri-n-hexylcitrat ...	0,15	66,4
Tri-n-hexylcitrat ...	0,20	56,9
kein Zusatz	—	55,0

Die Versuche 1, 2 und 3 zeigen, daß die gebildete Menge an L-Glutaminsäure in allen Fällen, in denen die Fermentation in Gegenwart eines der genannten Ester durchgeführt wurde, bedeutend höher war.

Die genannten Ester werden dem Fermentationsmedium in geeigneter Weise in Mengen von etwa 0,01 bis 1,0 Gewichtsprozent zugegeben, obgleich dieser Bereich etwas mit der Art des verwendeten L-Glutaminsäure bildenden Bakterienstammes, der Zusammensetzung des Kulturmediums, der Zuckerkonzentration und insbesondere der Art des als Zusatz verwendeten Esters variiert. Es liegt auf der Hand, daß zur Erzielung einer größtmöglichen Bildung an L-Glutaminsäure die Zugabe von optimalen Mengen

5 6

der Ester erforderlich ist, nachdem einmal über die hydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumcarbo-

verschiedenen anzuwendenden Züchtungsbedingungen nat, Mangansulfat usw.

entschieden worden ist. ■ Die im folgenden beschriebenen Vergleichsversuche,

Die bakteriologischen Eigenschaften von Mikro- in denen Micrococcus glutamicus ATCC 13058 sowohl

Organismen der Art Micrococcus glutamicus, wie sie 5 ohne Zusatz als auch unter Zusatz der erfindungs-

bei den obigen Versuchen verwendet wurden, sind in gemäß verwendeten Ester in den gleichen Nährmedien

der japanischen Patentschrift 243 382 beschrieben unter gleichen Fermentationsbedingungen mit dem

worden. beim Verfahren nach der schweizerischen Patentschrift

Was die Zusammensetzung des Kulturmediums Nr. 36 68 25 verwendeten Brevibacterium lactofermen-

anbetrifft, so kann entweder ein künstliches Kultur- io tus verglichen wird, zeigen die Überlegenheit des er-

medium oder ein Kulturmedium verwendet werden, findungsgemäßen Verfahrens.

das auf natürlichen organischen Substanzen beruht, Das verwendete Kulturmedium hatte die folgende

solange nur das Kulturmedium die für das Wachstum Zusammensetzung:

der verwendeten Mikroorganismen wesentlichen Nähr- Glucose 12°/

stoffe enthält. Diese Nährstoffe sind wohlbekannt 15 Ammoniumhydrogenphosphät '.'.'.'. 0,1%

und umfassen eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoff- Diammoniumhydrogenphosphat.. / 0,1 %

quelle, anorganische Verbindungen u. dgl., die von Magnesiumsulfat 0,05%

dem verwendeten Bakterienstamm in geeigneten Mangansulfat 0 004°/

Mengen verwertet werden. Als Quelle für Kohlenstoff Eisen(II)-sulfat 0002°/°

können beispielsweise Glucose, Saccharose, Mannose, ao Kaliumsulfat 03°/ °

Gelactose, Fuctose, Maltose, Lactose, Trehalose, Harnstoff- 0 5°l°

Cellobiose, Raffinose, Arabit, Sorbit, Inosit, Xylose, Casaminosäiire ..... 01 °/°

Arabinose, Stärkehydrolysatlösung, Rübenmelassen, Biotin 55v/l

Restmelassen (Rummelassen) u. dgl. verwendet werden. Thiamin 20Ov/1

Diese Substanzen können entweder einzeln oder in as

Form von Gemischen aus zwei oder mehr dieser Ester organischer Säuren, wie in der nachstehenden Substanzen verwendet werden. Als Quelle für Stick- Tabelle angegeben, wurden nur der Kultur von stoff sind verschiedene anorganische und organische M. glutamicus ATCC 13 058 zugesetzt.
Verbindungen, wie z. B. Ammoniak, Ammonium- 2730 ml des Mediums dieser Zusammensetzung sulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammo- 30 wurden in einen 5 Liter fassenden Schüttelfermenter niumcarbonat, Ammoniumacetat usw., Nitrate, Harn- gegeben und unter Druck sterilisiert. Dann wurden stoff oder andere stickstoffhaltige Stoffe, wie Fleisch- 270 ml einer Impfkultur der unten angegebenen extrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, die getrockne- Stämme, die 12 Stunden in einem 5% Glucose, l°/₀ ten, löslichen Rückstände der Alkoholdestillation, Pepton, 0,5% Fleischextrakt, 0,5% Ammonium-Caseinhydrolysat, Fischmehl, Sojabohnenölmehl, Sei- 35 sulfat, 0,05% Kaliumhydrogenphosphat, 0,05% Didenraupenpuppen, Treber u. dgl. verwendet werden. kaliumhydrogenphosphat, 0,025% Magnesiumsulfat, Auch diese Stoffe können entweder einzeln oder in 0,001 % Mangansulfat, 0,001% Eisen(II)-SuIfat, 0,5% Form von Gemischen aus zwei oder mehr dieser Harnstoff und 10 v/l Biotin enthaltenden Medium Stoffe verwendet werden. Weiterhin ist es erforderlich, vorgezüchtet worden waren, zugesetzt. Es wurde zu dem Kulturmedium für das Wachstum der Bak- 40 48 Stunden bei einer Temperatur von 33°C unter terien unentbehrliche bzw. wesentliche Bestandteile zu Rühren (600 UpM) und Belüften (3 Liter/Minute) gegeben, wie z. B. Aminosäuren, wie Asparaginsäure, züchtet. Während der Züchtung wurde der pH-Wert Glutaminsäure, Threonin, Methionin usw., und/oder der Kulturbrühe mit 30%iger Harnstofflösung auf 7,0 Vitamine, wie z. B. Biotin, Thiamin, Cobalamin usw. eingestellt. Die Konzentrationen und die Ausbeute Zu anorganischen Verbindungen, die zu dem Kultur- 45 der nach Abschluß der Fermentation in der Kulturmedium gegeben werden können, gehören unter brühe gebildeten L-Glutaminsäure sind für jeden anderem Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummono- Versuch in der nachfolgenden Tabelle angegeben.

Zugesetzter Ester

Zugesetzte Estermenge

(7o>

M. glutamicus

ATCC 13 032

Erzeugte Menge

L-Glutaminsäure

Konzentration
(mg/ml)

Ausbeute (7.)

B. lactofermentus

ATCC 13 869 Erzeugte Menge L-Glutaminsäure

Konzentration (mg/ml)

Ausbeute

Tri-n-butylcitrat ..
Tri-n-amylcitrat ..
Tri-n-hexylcitrat ..
Di-n-butylsuccinat
Di-n-butylmalat ..
Di-n-butylmalonat

n-Butyladipat

n-Butylgluconat ..
ohne Zusatz

0,2

0,15

0,1

0,2

Die folgenden Ausführungsbcispiele erläutern die Erfindung. Die angegebenen Prozentzahlen sind, wenn nicht anders angegeben Gewichts-Volumprozente.

67,1
66,6
65,2
65,0
64,5
63,2
62,3
62,5
51,2

59,2 58,8 57,5 57,3 56,9 55,8 55,0 55,1 45,1

50,5

44,5

Beispiel 1

2730 ecm eines Kulturmediums, das 12% Glucose, 0,1 % Ammoniumhydrogenphosphat, 0,1 % Diammo-

j 7 8

niumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, Beim Einengen von 1 Liter der Fermentations-

0,004% Mangansulfat, 0,002% Eisen(II)-sulfat, 0,3 % flüssigkeit unter Druck, Entfernen der Bakterienzellen

! Kaliumsulfat, 0,5% Harnstoff, 5,5 μ g/Liter Biotin, nach · Behandlung mit Salzsäure und Auskristalli-

! 0,1% Caseinaminosäuren, 10 μ g/Liter Thiamin und sierenlass^n bei einem pH-Wert von 3,2 mit Salzsäure

: 0,1% Diisobutylsuccinat enthält, werden in einen 5 werden 57,2 g rohe kristalline L-Glutaminsäure er-

5-Liter-Fermentationskolben gegeben und unter Druck halten.

sterilisiert. Sodann werden 270 ecm einer Impfflüssig- B e i s d i e 1 3
keit von Micrococcus glutamicus ATCC Nr. 13 032,

die die durch 12stündige Schüttelkultur in einem Es wird in ähnlicher Weise wie im Beispiel 1 geKulturmedium erhalten worden ist, das 5% Glucose, io züchtet, jedoch wird ein durch Säurehydrolyse herg;-1% Caseinhydrolysat, 0,5% Fleischextrakt, 0,5% stelltes Weizenstärkehydrolysat (das 12,1% direkt Ammoniumsulfat, 0,05% Kaliumhydrogenphosphat, reduzierende Zucker enthält) verwendet. Als Ester 0,05% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,025% Magne- wird 0,1% Di-n-hexylsuccinat verwendet. Es wird siumsulfat, 0,001% Mangansulfat, 0,001% Eisen(II)- 40 Stunden gezüchtet.

sulfat, 0,5% Harnstoff und 10 μ g/Liter Biotin enthält, 15 Bei Beendigung der Fermentation beträgt die in der

zum Beimpfen in den Fermentationskolben gegeben. Fermentationsflüssigkeit enthaltene Menge an L-Glut-

Das Fermentationsmedium wird dann 48 Stunden aminsäure 58,2 mg/ccm, was einer Ausbeute (bezogen

unter den folgenden Bedingungen gehalten: Tempera- auf Zucker) von 45,7% entspricht. Wird zu dem

tür 34° C, Drehgeschwindigkeit 6C0 Umdrehungen pro Medium kein Di-n-hexylsuccinat gegeben, so werden

Minute, Belüftungsgeschwindigkeit 3 Liter/Minute. 20 nur 49,8 mg/ccm L-Glutaminsäure in einer Ausbeute

Der pH-Wert der Fermentationsflüssigkeit wird mit von 39,1 % (bezogen auf Zucker) gebildet,

einer 30%igen wäßrigen Harnstofflösung bei 7,0 ge- Beim Einengen von 1 Liter der Fermentations-

halten. flüssigkeit unter vermindertem Druck, Entfernen der

Nach der Beendigung der Fermentation beträgt die Bakterienzellen nach Behandlung mit Salzsäure und in der Fermentationsflüssigkeit enthaltene Menge an 35 Auskristallisierenlassen bei pH = 3,2 mit Salzsäure L-Glutaminsäure 55,5 mg/ccm und die Ausbeute, be- werden 53,4 g rohe kristalline L-Glutaminsäure erzogen auf Zucker, 49,0%. Wird kein Diisobutylsucci- halten.

nat zugegeben, ansonsten jedoch unter den gleichen B e i s D i e 1 4
Bedingungen wie im vorliegenden Beispiel gearbeitet,

so werden nur 44,9 mg/ccm L-Glutaminsäure in einer 30 Es wird wie unter Beispiel 1 gearbeitet, doch werden

Ausbeute (bezogen auf Zucker) von 39,7 % gebildet. an Stelle des dort verwendeten Diisobutylsuccinats

Durch Einengen von 1 Liter der Fermentations- 0,2% Di-n-butylmalat verwendet,

flüssigkeit unter vermindertem Druck, Entfernen der Bei Beendigung der Fermentations haben sich in der

Bakterienzellen nach Behandlung mit Salzsäure und Fermentationsflüssigkeit 69,0 mg/ccm L-Glutaminsäure

Auskristallisierenlassen bei einem pH-Wert von 3,2 35 gebildet, was einer Ausbeute von 46,0% (bezogen auf

mit Salzsäure werden 44,0 g rohe kristalline L-Gluta- Zucker) entspricht. Wenn ohne Zugabe von Di-n-butyl-

minsäure erhalten. malat gearbeitet wird, erhält man nur 58,5 mg/ccm

. . . L-GI utaminsäure in einer Ausbeute (bezogen auf Zuk-

* ei spiel Z ker) von 39,0%.

2730 ecm eines Kulturmediums, das ein durch Salz- 4° Beim Einengen von 1 Liter der Fermentationsflüs-

säurehydrolyse hergestelltes Süßkartoffelstärkehydro- sigkeit, Entfernen der Bakterienzellen nach Behand-

lysat (13,5% direkt reduzierende Zucker), 0,1% Am- lung mit Salzsäure und Auskristallisierenlassen bei

moniumhydrogenphosphat, 0,1 % Diammoniumhy- pH = 3,2 mit Salzsäure werden 56,5 g rohe kristalline

drogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,004% L-Glutaminsäure erhalten.

Mangansulfat, 0,3% Kaliumsulfat, 10 μ g/Liter Biotin 45 _n .

und 0,2% Düsoamylsuccinat enthält, werden in einen B e 1 s ρ 1 e 1 5

5-Liter-Fermentationskolben gegeben und unter Druck Es wird wie unter Beispiel 1 bearbeitet, jedoch unter

sterilisiert. Verwendung von 0,1% Di-n-butylmalonat an Stelle

Das Kulturmedium wird mit 270 ecm einer Impf- von Diisobutylsuccinat.

flüssigkeit von Micrococcus glutamicus ATCC 5° Nach Beendigung der Fermentation beträgt die in Nr. 13032 beimpft. Das auf diese Weise beimpfte der Fermentationsflüssigkeit enthaltene Menge an Fermentationsmedium wird 48 Stunden unter den L-Glutaminsäure 65,5 mg/ccm und die Ausbeute (befolgenden Bedingungen gehalten: Temperatur 34°C, zogen auf Zucker) 46,8%. Wenn kein Di-n-butyl-Drehgeschwindigkeit 550 Umdrehungen pro Minute, malonat verwendet wird, werden nur 57,5 mg/ccm Belüftungsgeschwindigkeit 3 Liter/Minute. Der pH- 55 L-Glutaminsäure in einer Ausbeute von 41,1% (be-Wert der Fermentationsflüssigkeit wird mit Hilfe einer zogen auf Zucker) erhalten.

15%igen wäßrigen Ammoniaklösung bei 7,0 gehalten. Beim Einengen von 1 Liter der Fermentationsflüs-

Nach 10 Stunden wird das Kaliumsalz von Penicillin G sigkeit, Entfernen der Bakterienzellen nach Behand-

in einer Menge von 5 Einheiten je ecm zu der Kultur lung mit Salzsäure und Auskristallisieren bei einem

gegeben. 60 pH-Wert von 3,2 mit Salzsäure werden 54,0 g rohe

Bei Beendigung der Fermentation beträgt die in der kristalline L-Glutaminsäure erhalten.
Fermentationsflüssigkeit enthaltene Menge an L-GIu-

taminsäure 64,5 mg/ccm und die Ausbeute (bezogen Beispiel

auf Zucker) 47,2%. Wenn das Düsoamylsuccinat Die Fermentation wird wie unter Beispiel 2 durcli-

nicht zugegeben, ansonsten jedoch unter den gleichen 65 geführt, jedoch unter Verwendung von 0,1 % n-Butyl-

Bedingungen wie im vorliegenden Beispiel gezüchtet adipal an Stelle des dort verwendeten Diisoamylsiicci-

wird, erhält man nur 52,5 mg/ccm L-Glutaminsäure in nats.

einer Ausbeute (bezogen auf Zucker) von 38,4%. Bei Beendigung der Fermentation beträgt die in der

Fermentationsflüssigkeit gebildete Menge an L-GI utaminsäure 62,0 mg/ccm und die Ausbeute (bezogen auf Zucker) 41,3 °/₀. Wird ohne Verwendung von n-Butyladipat gearbeitet, so erhält man nur 58,0 mg/ ecm L-Glutaminsäure in einer Ausbeute von 38,7 °/₀ (bezogen auf Zucker).

Beim Einengen von 1 Liter der Fermentationsflüssigkeit unter vermindertem Druck, Entfernen der Bakterienzellen nach Behandlung mit Salzsäure und Auskristallisierenlassen bei pH = 3,2 mit Salzsäure werden 52,5 g rohe kristalline i.-Glutaminsäure erhalten.

B e i s ρ i e 1 7

Die Fermentation wird wie unter Beispiel 2 durchgeführt, jedoch werden an Stelle des dort verwendeten Diisoamylsuccinats 0,2 % n-Butylgluconat benutzt.

Bei Beendigung der Fermentation beträgt die in der FermentationsfK'.ssigkeit enthaltene Menge an L-Glutaminsäure 64,5 mg/ccm und die Ausbeute (bezogen auf Zucker) 43,0%. Wird kein n-Butylgluconat zu dem Medium gegeben, werden nur 57,2 mg/ccm !.-Glutaminsäure in einer Ausbeute von 38,1 % (bezogen auf Zucker) erhalten.

Wenn man 1 Liter der Fermentationsflüssigkeit einengt, die Bakterienzellen nach einer Behandlung mit Salzsäure entfernt und bei einem pH-Wert von 3,2 mit Salzsäure auskristallisieren läßt, erhält man 53,3 g rohe kristalline L-Glutaminsäure.

Beispiel 8

2730 ecm eines Kulturmediums, das 12% Glucose, 0,1% Ammoniumhydrogenphosphat, 0,1% Diammoniumhydrogenphosphat, 0,05 % Magnesiumsulfat, 0,004% Mangansulfat, 0,002% Eisen(ll)-sulfat, 0,3% Kaliumsulfat, 0,5% Harnstoff, 5,5 μ g/Liter Biotin, 10 μ g/Liter Thiamin und 0,1% Tri-n-amylcitrat enthält, werden in einen 5-Liter-Fermentationskolben gegeben und unter Druck sterilisiert. Es wird mit 270 ecm einer Impfflüssigkeit von Micrococcusglutamicus ATCC Nr. 13032 angeimpft, die durch 12stündige Schüttelkultur in einem Kulturmedium, das 5% Glucose, 1 % Caseinhydrolysat, 0,5 % Fleischextrakt, 0,5% Ammoniumsulfat, 0,05% Kaliumhydrogenphosphat, 0,05 % Dikaliumhydrogenphosphat, 0,025 % Magnesiumsulfat, 0,001% Mangansulfat; 0,001% Eisen(II)-sulfat, 0,5% Harnstoff und 10μ g/Liter Biotin enthält, erhalten worden ist. Das auf diese Weise beimpfte Medium wird 48 Stunden unter den folgenden Bedingungen gehalten: Temperatur 34°C, Drehgeschwindigkeit 600 Umdrehungen pro Minute, Belüftungsgeschwindigkeit 3 Liter/Minute. Der pH-Wert der Fermentationsflüssigkeit wird mit Hilfe einer 30%igen Harnstofflösung auf 7,0 eingestellt.

Bei Beendigung der Fermentation beträgt die in der Fermentationsflüssigkeit enthaltene Menge an L-Glutaminsäure 60,4 mg/ccm und der Restzuckergehalt 0,8%. Wird kein Tri-n-amylcitrat zu dem Medium gegeben, so werden nur 48,2 mg/ccm L-Glutaminsäure gebildet, während der Restzuckergchalt 0,7% beträgt.

Beim Einengen von 1 Liter der Fermentationsflüssigkeit, Entfernen der Bakterienzellen nach Behänd-Jung mit Salzsäure und Auskristallisierenlassen bei pH 3,2 mit Salzsäure werden 55,0 g rohe kristalline i.-Glutaminsäure erhalten.

Beispiel 9

2730 ecm eines Kulturmediums, das ein durch Säurehydrolyse hergestelltes Süßkartoffelstärkehydrolysat (13,5% direkt reduzierende Zucker), 0,1% Ammoniumhydrogenphospliat, 0,1% Diammoniumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,004% Mangansulfat, 0,3% Kaliumsulfat, 10 μ g/Liter Biotin und 0,2% Tri-n-butylacetylcitrat enthält, werden in einen 5-Liter-Fermentationskolben gegeben und unter Druck

ίο sterilisiert. Das Medium wird mit 270 ecm einer Impfflüssigkeit von Micrococcus glutamicus ATCC Nr. 13032 versetzt. Das Medium wird dann 48 Stunden unter den folgenden Bedingungen gehalten: Temperatur 34⁰C, Drehgeschwindigkeit 550 Umdrehungen pro Minute, Belüftungsgeschwindigkeit 3 Liter/Minute. Der pH-Wert der Fermentationsflüssigkeit wird mit Hilfe einer 15%igen wäßrigen Ammoniaklösung auf 7,0 gehalten. Nach 10 Stunden werden 5 Einheiten ecm des Kaliumsalzes von Penicillin G zu der Kultur gegeben.

Nach Beendigung der Fermentation haben sich in der Fermentationsflüssigkeit 68,7 mg/ccm L-Glutaminsäure gebildet. Der Restzuckergehalt (direkt reduzierende Zucker) beträgt 0,6%. Wird zu dem Medium kein Tri-n-butylacetylcitrat gegeben, so werden nur 51,2 mg/ccm L-Glutaminsäure gebildet, und der Restzuckergehalt beträgt 1,1%.

Beim Einengen von 1 Liter der Fermentationsflüssigkeit unter vermindertem Druck, Entfernen der Bakterienzellen nach Behandlung mit Salzsäure und Auskristallisierenlassen bei pH = 3,2 mit Salzsäure erhält man 58,0 g rohe kristalline L-Glutaminsäure.

Beispiel 10

2730 ecm eines Kulturmediums wie im Beispiel 2, jedoch mit einem durch Säurehydrolyse erhaltenen Weizenstärkehydrolysat (12,1% direkt reduzierende Zucker) sowie 0,15% Tri-n-hexylcitrat, werden in einen 5-Liter-Fermentationskolben gegeben und unter Druck sterilisiert. Es wird 40 Stunden in der gleichen Weise wie im Beispiel 9 gezüchtet.

Bei Beendigung der Fermentation liegt in der Fermentationsflüssigkeit eine Menge an L-Glutaminsäure von 59,8 mg/ccm vor, und der Restzuckergehalt beträgt 0,4%. Arbeitet man ohne Zugabe von Trin-hexylcitrat zu dem Medium, so werden nur 50,2 mg/ ecm L-Glutaminsäure gebildet, während der Restzuckergehalt 0,7% beträgt.

Beim Einengen von 1 Liter der Fermentationsflüssigkeit unter vermindertem Druck, Entfernen der Bakterienzellen nach Behandlung mit Salzsäure und Auskristallisierenlassen bei pH = 3,2 mit Salzsäure erhält man 53,1 g rohe kristalline L-Glutaminsäure.

Beispiel 11

300 ecm des gleichen Kulturmediums wie im Beispiel 9, jedoch mit einem durch Säurehydrolyse erhaltenen Maisstärkehydrolysat (12,7% direkt reduzierende Zucker) und 0,10% Octylcitrat, werden in einen 5-Liter-Fermentationskolben gegeben und unter Druck sterilisiert. Es wird 42 Stunden unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 2 gezüchtet.

Bei Beendigung der Fermentation sind in der Fermentationsflüssigkeit 59,3 mg/ccm L-Glutaminsäure enthalten, und der Restzuckergehalt beträgt 0,9%. Wird zu dem Medium kein Tri-n-octylcitrat gegeben, so werden nur 49,1 mg/ccm L-Glutaminsäure gebildet, während der Restzuckergehalt 1% beträgt.

Beim Einengen von 1 Liter der Fermentationsflüssigkeit unter vermindertem Druck, Entfernen der Bakterienzellen nach Behandlung mit Salzsäure und Auskristallisierenlassen bei pH = 3,2 mit Salzsäure erhält man 53,7 g rohe kristalline L-Glutaminsäure.

Beispiel 12

Die Fermentation wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 8, jedoch unter Zugabe von 0,15 % Din-propylcitrat durchgeführt. Die am Ende der Fer- m mentation in der Fermentationsflüssigkeit enthaltene Menge an L-Glutaminsäure beträgt 59,5 mg/ccm und der Restzuckergehalt 0,8%. Wird kein Di-n-propylcitrat zugegeben, so werden nur 49,0 mg/ccm L-Glutaminsäure erhalten, und der Restzuckergehalt beträgt 0,7%.

Beispiel 13

Das Verfahren von Beispiel 8 wird unter Verwendung von 0,10% Mono-n-octylcitrat an Stelle des dort ver- ao wendeten Esters wiederholt. Am Ende der Fermentation beträgt die in der Fermentationsflüssigkeit enthaltene Menge an L-Glutaminsäure 60,8 mg/ccm und der Restzuckergehalt 0,7 %. Wird zu dem Medium kein Mono-n-octylcitrat- gegeben, so werden nur 48,5 mg/ccm L-Glutaminsäure gebildet, und der Restzuckergehalt beträgt 0,7 %.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C und bei einem pH-Wert des Kulturmediums von 5 bis 9 gezüchtet.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Züchten eines Glutaminsäure bildenden Mikroorganismus der Art Micrococcus glutamicus in einem eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Salze und zum Wachstum des Mikroorganismus notwendige Nährstoffe enthaltenden wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation in Gegenwart von 0,01 bis 1,0 Gewichtsprozent eines oder mehrerer Ester von Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, Amyl-, Isoamyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl- oder Decylalkohol mit Citronensäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, Malonsäure, Adipinsäure, GIuconsäure, Acetylcitronensäure oder Acetyläpfelsäure ausführt.