DE1795721C2

DE1795721C2 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von Orotidylsäure

Info

Publication number: DE1795721C2
Application number: DE1795721A
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Sagamihara Nakayama; Haruo Machida Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1967-04-18
Filing date: 1968-04-09
Publication date: 1975-08-14
Also published as: DE1795721B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Orotidylsäure durch Züchten eines Mikroorganismus.

Orotidylsäure, auch Orotidin-5-phosphorsäure genannt, hat die folgende Struktur:

OH OH

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Orotidylsäure ist ein wichtiges Zwischenprodukt bei der Synthese von Nucleinsäuren und stellt außerdem ein wertvolles biochemisches Reagens dar.

Orotidylsäure kann auf fermentativem Wege oder durch chemische Synthese hergestellt werden (vgl. zum Beispiel »Journal of Biological Chemistry«, Bd. 215, S. 403 [1955], und Bd. 235, S. 2379 [1960], bzw. »J. Am. Chem. Soc«, 85, S. 1118 bis 1123 [1963]). Diese Verfahren haben jedoch den Nachteil, daß zu ihrer Durchführung Ausgangsmaterialien benötigt werden, die außerordentlich teuer und schwer zugänglich sind, und daß die dabei erzielbaren Ausbeuten niedrig sind, so daß nach diesem Verfahren Orotidylsäure nicht im großtechnischen Maßstabe hergestellt werden kann.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Orotidylsäure anzugeben, mit dessen Hilfe es möglich ist, die gewünschte Verbindung auf technisch einfache und wirtschaftliche Weise im Rahmen eines großtechnischen Verfahrens unter Erzielung einer hohen Ausbeute herzustellen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Orotidylsäure durch Züchten eines Mikroorganismus, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872, Corynebacterium sp. ATCC 21 084, Arthrobacter sp. ATCC 21 085 oder Micrococcus sodonensis ATCC 15 932 in einem wäßrigen Nährmedium, das außer den üblichen Bestandteifen Orotsäure oder Orotidin in einer Konzentration von 100 μg bis 10 mg/ml, bezogen auf Orotsäure, und 6-Azauracil, 5-Hydroxyuracil oder deren Riboside in einer Konzentration von 10 bis 2000 ng/ml, jeweils bezogen auf die entsprechende Base, enthält, unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 40⁰C und einem pH-Wert von etwa 4,0 bis etwa 9.5 züchtet und die in dem Züchtungsmedium angereicherte Orotidylsäure auf an sich bekannte Weise abtrennt.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, Orotidylsäure auf fermentativem Wege technisch einfach und wirtschaftlich im großtechnischen Maßstabe herzustellen, wobei die gewünschte Orotidylsäure in hoher Ausbeute erhalten wird.

Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung eignet sich sowohl ein synthetisches Nährmedium als auch ein natürliches Nährmedium, sofern es die für das Wachstum des eingesetzten Mikroorganismen-Stammes wesentlichen Nährstoffe enthält. Derartige Nährstoffe sind bekannt. Zu ihnen gehören beispielsweise eine Kohler.stoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Verbindungen.

Geeignete Kohlenstoffquellen sind z. B. Kohlehydrate, wie Glukose, Fruktose, Maltose, Rohrzucker, Stärke. Stärkehydrolysate und Melassen oder organische Säuren, wie Essigsäure, Milchsäure und Glutaminsäure. Diese Substanzen können entweder allein oder in Mischung aus zwei oder mehreren eingesetzt werden.

Geeignete Stickstoffquellen sind Verbindungen wie Harnstoff, Ammoniak oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat. Ammoniumnitrat. Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat. Außerdem lassen sich Naturstoffe, die Stickstoff enthalten, verwenden, wie z. B. Maisquellwasser, Hefeextrakl. Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Fleischbrühe. Kaseinhydrolysate. Casaminosäure, lösliche Fischbestandteile und Reiskleie-F.xtrakt. Auch diese Substanzen können entweder allein oder in Mischung aus zwei oder mehreren eingesetzt werden.

Anorganische Verbindungen, die dem Nährmedium zugesetzt werden können, sind z. B. Magnesiumsulfat, Natriumphosphat. Kaliumdihydrogenphosphat. Kaliummonohydrogenphosphat. Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid und Zinksulfat.

Bei der Züchtung der verwendeten Mikroorganismen-Stämme wird dem Nährmedium außerdem Biotin zugesetzt.

Erfindungsgemäß werden 6-Azauracil, 5-Hydroxyuracil oder deren Riboside oder Mischungen dieser Verbindungen zusammen mit Orotsäure oder Orotidin auf einmal oder in Abständen während des Verlaufs der Fermentation zugesetzt. Das 6-Azauracil und das 5-Hydroxyuracil können dem Nährmedium auch in Form der entsprechenden Salze, beispiels-

weise in Form der Sulfate oder Hydrochloride, zugesetzt werden. Orotsäure kann in Form ihres Ammonium- oder Natriumsalzes zugegeben werden.

Die zugesetzte Menge an 6-Azauracil, 5-Hydroxyuracil oder deren Ribosiden liegt zwischen etwa IO und etwa 2000 μg/ml, bezogen auf die entsprechende Base. Die Zusatzmenge an Orotsäure oder Orotidin liegt zwischen etwa 100 μg/ml und etwa 10 mg ml. bezogen auf Orotsäure.

Die Zugabe der angegebenen Verbindungen zu dem Nährmedium kann zu verschiedenen Zeitpunkten erfolgen, und zwar entweder vor oder nach der Überimpfung der Mikroorganismen in das Medium.

Die Züchtung der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, z. B. durch aerobes Schütteln der Kultur oder durch Rühren und Belüften einer Submerskultur bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 40⁰C sowie bei einem pH-Wert von etwa 4,0 bis etwa 9,5. Nach etwa 2- bis Stägiger Züchtung unter diesen Bedingungen haben sich merkliche Mengen an Orotidylsäure gebildet, die sich in dem Züchtungsmedium anreichern.

Nach Beendigung der Züchtung kann die Orotidylsäure von dem Züchtungsmedium nach üblichen Methoden abgetrennt werden, beispielsweise durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, durch Ausfällung, durch Adsorption oder Chromatographie.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Sofern nichts anderes angegeben ist, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro Liter Wasser.

Beispiel 1

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 wurde als Impfstamm verwendet. Es wvrde in einem Impfmedium gezüchtet, das 2% Glukose, 1% Pepton, 1% Hefeextrakt, 0,3% NaCl und 30 μΒ/Ί Biotin enthielt. Die Züchtung erfolgte bei einer Temperatur von 30 C während einer Dauer von 24 Stunden.

2 ml der erhaltenen Impfkultur wurden in einen konischen 250-ml-Kolben überimpft, der 20 ml eines Nährmediums enthielt, das durch lOminütiges Behandeln unter einem Druck von 1 kg/cm² in einem Autoklav sterilisiert worden war. Das verwendete Nährmedium hatte die folgende Zusammensetzung:

Glukose 100 g

Harnstoff 6 g

KH₂PO₄ 10 g

K₂HPO₄ 10 g

MgSO₄-2H₂O 10 g

CaCl₂ -2H₂O 0,1 g

Biotin 30 μg

Hefeextrakt 10 g

Das Nährmedium wurde hergestellt, indem diese Komponenten in 1 1 Wasser aufgelöst wurden und der pH-Wert mittels NaOH auf 8,0 eingestellt wurde.

Die Züchtung wurde anschließend unter aerobem Schütteln der Kultur bei 30⁰C durchgeführt. Nach einer Züchtungszeit von 72 Stunden wurde 6-Azauracil dem Medium in einer solchen Menge zugesetzt, daß eine Konzentration von 1000 μg/ml erhalten wurde. Das Züchten wird anschließend weitere 5 Stunden lang fortgesetzt, wobei Orotsäure dem Medium in einer Menge von 3 mg/ml zugegeben wurde. Das Züchten wurde erneut 24 Stunden lang fortgesetzt.

Nach einer Gesamtzüchtungszeit von i01 Stunden wurde das Züchten beendet. Dabei stellte sich heraus, daß 3,3 mg/ml Orotidylsäure gebildet worden waren und sich in dem Züchtungsmedium angereichert hatten.

Die Orotidylsäure wurde als Ammoniumsalz gewonnen, indem das Filtral. das durch Abzentrifugieren der Mikroorganismenzellen von der Kulturbrühe erhalten worden war, durch einen stark basisehen Anionenaustauscher vom Polystyrol-Ameisensäuretyp geschickt wurde. Die Orotidylsäure wurde an dem Harz adsorbiert und anschließend mittels einer wäßrigen Lösung von Ammoniumformiat eluiert. Die Fraktionen, welche die Orotidylsäure enthielten, wurden bis zur Trockne eingedampft. Die Ausbeute betrug 1,7 g pro Liter des Filtrats.

Beispiel 2 20

Die Züchtung wurde wie im Beispiel 1 durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß Orotidin an Stelle von Orotsäure als zweiter Zusatz verwendet wurde. Die Menge an gebildeter Orotidyisäure betrug 1,6 mg ml.

Beispiel 3

Durch Zugabe von sowohl 6-Azauracil als auch

Orotsäure zu dem Medium 72 Stunden nach Beginn

der Züchtung sowie durch Fortsetzung der Züchtung

für eine Dauer von weiteren 28 Stunden, wobei die anderen Bedingungen die gleichen wie im Beispiel 1

waren, wurden 2,8 mg ml Orotidylsäure in dem Züchtungsmedium gebildet.

Beispiel 4

Die Züchtung wurde wie im Beispiel 1 durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß Corynebacterium sp. ATCC 21 084 als Impfstamm verwendet wurde. Die Menge an Orotidylsäure, die in dem Züchtungsmedium gebildet wurde, betrug 2,3 mg/ml.

Beispiel 5

Die Züchtung wurde wie im Beispiel 1 durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß Arthrobacter sp. ATCC 21085 an Stelle von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 als Impfmikroorganismus verwendet wurde. Die Menge an Orotidylsäure, die in dem Züchtungsmedium gebildet wurde, betrug 2,6 mg/ml.

Beispiel 6

Es wurden die gleichen Züchtungsbedingungen wie im Beispiel 1 eingehalten, jedoch mit der Ausnähme, daß Micrococcus sodonensis ATCC 15 932 als Impfstamm verwendet wurde. Die Menge an Orotidylsäure, die in dem Züchtungsmedium gebildet wurde, betrug 0,7 mg/ml.

Beispiel 7

Die Züchtung wurde wie im Beispiel 1 durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß 6-Azauridin in

einer Konzentration von 1,5 mg/ml dem Medium uracil an Stelle von 6-Azauracil dem Medium in einer

zugesetzt wurde. Die Menge an Orotidylsäure, die Konzentration von 1 mg/ml 72 Stunden nach Beginn

in dem Züchtungsmedium anfiel, betrug 2,4 mg/ml. des Züchtens zugesetzt wurde. Das Züchten wurde

anschließend weitere 6 Stunden lang fortgesetzt. Da-

Beispiels _{5 nach ste!}i_{te sic}h heraus, daß 1,5 mg/ml Orotidyl-

Die Züchtung wurde wie im Beispiel 1 durchge- säure in dem Züchtungsmedium gebildet worden

führt, jedoch mit der Ausnahme, daß i-Hydroxy- waren und sich in diesem angereichert hatten.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur fermentativen Herstellung von Orotidylsäure durch Züchten eines Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß man Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872, Corynebacterium sp. ATCC 21 084, Arthrobacter sp. ATCC 21 085 oder Micrococcus sodonensis ATCC 15 932 in einem wäßrigen Nährmedium, das außer den üblichen Bestandteilen Orotsäure oder Orotidin in einer Konzentration von 100 μg bis 10 mg/ml, bezogen auf Orotsäure und 6-Azauracil, 5-Hydroxyuracil oder deren Riboside in einer Konzentration von 10 bis 2000 μg/ml, jeweils rs bezogen auf die entsprechende Base, enthält, unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 40"C und einem pH-Wert von etwa 4,0 bis etwa 9,5 züchtet und die in dem Züchtungsmedium angereicherte Orotidylsäure auf an sich bekannte Weise abtrennt.