DE1695323B2

DE1695323B2 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat

Info

Publication number: DE1695323B2
Application number: DE1695323A
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Sagamihara Nakayama (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1966-08-08
Filing date: 1967-07-24
Publication date: 1974-06-20
Also published as: BE702406A; CH510735A; YU155967A; NL6710555A; GB1161262A; ES343895A1; YU31708B; DE1695323A1; US3762999A; DE1695323C3

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat durch Züchten eines Mikroorganismus.

Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat (nachfolgend mit ADP und ATP abgekürzt) spielen eine wichtige Rolle beim Stoffwechsel im lebenden Organismus Sie stellen wichtige biochemische Reagentien und wertvolle Arzneimittel dar.

Aus den französischen Patentschriften I 440 633 und 1 372 054 sind bereits Verfahren zur Herstellung von ADP und ATP durch Züchten von bestimmten Mutanten von Mikroorganismen in einem üblichen wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen bekannt; die dabei erzielbaren Ausbeuten an ADP und ATP sind jedoch nicht zufriedenstellend.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Adenosindiphosphat (ADP) und Adenosintriphosphat (ATP) anzugeben, das technisch einfach und wirtschaftlich durchführbar ist und die gewünschten Substanzen in höheren Ausbeuten liefert als die bisher bekannten Verfahren.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat durch Züchten eines Mikroorganismus in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart von Kohlehydraten al« Hauptkohlenstoffquelle, anorganischen Phosphaten sowie von Adenin, Adenosin cder Adenosinphosphat, das dadurch gekennzeichnet ist, daß als Mikroorganismus Corynebacterium ATCC 21 084 oder Arthrobacter ATCC 21 085 verwendet wird und daß die Züchtung in einem Nährmedium, das 1 bis 10 mg Adenin, Adenosin oder Adenosinphosphat pro ml enthält, bei einer Temperatur von 20 bis 4O⁰C und einem pH-Wert von 5 bis 9 durchgeführt wird.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden beträchtlich höhere Ausbeuten an Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat erzielt als nach den bekannten Verfahren.

Das erfindungsgemäß verwendete Nährmedium ist entweder ein synthetisches oder ein natürliches Nährmedium, welches die für das Wachstum der eingesetzten Mikroorganismenstämme wesentlichen Nährstoffe enthält. Ein derartiges Nährmedium enthält Kohlehydrate als Hauptkohlenstoffquelle, anorganische Phosphate, sowie andere übliche Nfthrstoffe, wie eine Stickstoffquelle und anorganische Verbindungen,

Das erfindungsgemäß verwendete Nährmedium zur Herstellung von APP und ATP enthält Kohlehydrate als Hauptkohlenstoffquelle in einer Menge von 5 bis 20%. Kohlehydrate, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, sind beispielsweise Glukose, Fruktose, Maltose, Rohrzucker, Stärke, Stärkehydrolysat und Melassen. Geringe Mengen anderer geeigneter Kohlentsoffquellen, wie beispielsweise Glycerin, Mannit, Sorbit, organische Säuren und Kohlenwasserstoffe, können dem Nährmedium zusammen mit den Kohlehydraten zugesetzt werden. Die Kohlehydrate können entweder einzeln oder in Mischungen aus zwei oder mehreren Kohlehydraten verwendet werden, wobei geringe Mengeo anderer Kohlenstoffquellen ebenfalls entweder einzeln oder in Mischungen aus zwei oder mehreren Bestandteilen zugegeben werden können.

Die anorganischen Phosphate, die in dem erfindungsgemäßen Nährmedium zur Erzeugung von Adenosindiphosphat und/oder Adenosintriphosphat verwendet werden, liegen in einer Menge von 0,4 bis 3%, berechnet als PO₄, vor. Geeignete anorganische Phosphate, die in wirksamer Weise verwendet werden können, sind beispielsweise Natriumphosphat, Natriumdihydrogenphosphat, Natriummonohydrogenphosphai, Kaliumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat oder Kaliummonohydrogenphosphat. Die bevorzugten Phosphate sind Kaliummonohydrogenphosphat und Kaliumdihydrogenphosphat. Andere anorganische Verbindungen, welche dem erfindungsgemäß verwendeten Nährmedium zugesetzt werden können, sind beispielsweise Magnesiumsulfat, Eisensulfat oder andere Eisensal/e, Magnesiumchlorid und Calciumchlorid.

Zur erfindungsgemäßen Herstellung von ADP und ATP werden Adenin, Adenosin oder Adenosinphosphat dem Nährmedium in einer Menge von 1 bis 10 mg/rnl zugesetzt. Bei geringerer Konzentration ist die Menge an ADP und ATP entsprechend niedriger. Werden größere Menppn als die vorstehend erwähnten verwendet, dann ist die Umwandlungsgeschwindigkeit von Adenin bzw. Adenosin bzw. Adenosinphosphat zu ADP und ATP niedrig Adenin, Adenosin und Adenosinphosphat können zu Beginn der Züchtung oder während der Züchtung zugesetzt werden. Adenin kann in Form von unschädlichen Salzen, beispielsweise in Form des Hydrochlorids oder Sulfats zugesetzt werden.

Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen eingesetzt werden, beispielsweise Harnstoff oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat, sowie eine oder mehr als eine Aminosäure zusammen mit anderen Aminosäuren oder natürliche Substanzen, die Stickstoff enthalten, beispielsweise Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, Pepton, Bouillon, Kaseinhydrolysate, lösliche Fischbestandteile oder Reiskleie. Diese Substanzen können entweder für sich allein oder in Kombination aus zwei oder mehreren Bestandteilen verwendet werden. Bei der Züchtung von Corynebacterium ATCC 21 084 und Arthrobacter 21 085 gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es außerdem erforderlich, Biotin zuzusetzen.

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Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen diums zugesetzt, das vorher in einem Autoklaven 10 durchgeführt, beispielsweise wird entweder eine Kultur Minuten lang bei I kg/cm⁸ sterilisiert worden war.
unter aeroben Bedingungen geschüttelt oder eine Sub- Die Kultur wurde auf 20 ml des Gärungsmediums mers-Kultur gerührt, wobei eine Temperatur von 20 in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben in einer Menge von bis 40^cC und ein pH-Wert von 5 bis 9 eingehalten 5 |0 Volumprozent aufgeimpft. Die Gärung wurde werden. Dabei werden bemerkenswert große Mengen durch Schütteln der Kultur bei 30"C unter aeroben an Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat in Bedingungen durchgeführt. Nach 72stündiger Züchder Gärungsflüssigkeit angereichert. tung wurde Adenin dem Gärungsmedium zur Einstel-Nach Beendigung der Gärung können Adenosindi- lung einer Konzentration von 2 mg/ml zugesetzt, phosphat und Adenosintriphosphat von der Kultur- io Nach einer Züchtung von weiteren 48 Stunden sambrühe in üblicher Weise abgetrennt werden, bdspiels- melten sich Adenosindiphosphat und Adenosintriweise durch Behandlung mittels eines lonenaus- phosphat in der Gärungsflüssigkeit in Mengen von tauscherharzes, durch Ausfällung mit Metallsalzen, 1,1 mg/ml bzw, 4,2 mg/ml an.
durch Extraktion, Adsorption oder Chromatographie. Das aus der Gärungsflüssigkeit durch Filtrieren Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. So- 15 erhaltene Filtrat wurde durch eine Säule mit einem fern nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozent- stark basischen Anionenaustauscherharz (Chloridangaben auf das Gewicht. Typ) geleitet. Die jeweils durch Eluierung mit Salzsäure erhaltenen Adenosindiphosphat- und Adenosin-

Beispiel ί triphosphatfraktionen wurden mit N'aü jnlauge neutra-

20 lisiert und anschließend mit Kohlepulver behandelt.

Corynebapterium ATCC 21 084 wurde als Impf- Danach erfolgte eine Konzentrierung und Abkühlung,

bakterium verwendet. Es wurde bei 30⁼C 24 Stunden Auf diese Weise wurden Kristalle der Natriumsalze

lang in einem aus 2% Glukose, I % Pepton, 1 % Hefe- von Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat

extrakt, 0,3% Natriumchlorid und 30 μg/l Biotin be- erhalten.

stehenden Nährmedium gezüchtet. 25 Wenn das vorstehend beschriebene Beispiel wieder-

Das verwendete Gärungsmedium hatte die folgende holt wurde, wobei nur die Glukosekonzentration auf

Zusammensetzung: 3% geändert !vurde oder nur die Konzentration von

K₂HPO₄ und KH₂PO₄ auf 0,2% abgeändert wurde,

120 g Glukose, während alle anderen Bedingungen die gleichen blie-

12 g KyHPO₁, 30 ben, waren die Mengen an gebildetem ADP und ATP

i2g Kn₂PO₄, in beiden Fällen jeweils um 0,5 mg/ml niedriger.

12 g MgSO₄-7 H₂O, ο · · , ,

6 g Harnstoff. Beispiel 2

IO g Hefeextrakt, Arthrobacter sp. ATCC 21085 wurde als Impf-

30 [ig Biotin pro Liter Nährmedium. 35 bakterium verwendet, wobei die anderen Züchtungs-

bedingungen die gleichen wie in Beispiel I waren. Die

In.der oben erwähnten Zusammensetzung wurde Mengen an Adenosindiphosphat und Adenosintri-

Harnstoff in Form einer 12%igen Lösung getrennt phosphat, die sich in der Gärungsflüssigkeit ansam-

Iterilisiert und zu 19 ml des Restes des Gärungsme- melten, betrugen 2,1 mg/ml özw. 3,8 mg/ml.

Claims

i 695

Patentanspruch:

Verfahren zur ferrnentativen Herstellung von Acjenosindiphosphat und Adenosintriphosphat durch Zuchten eines Mikroorganismus in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart von Kohlehydraten als Hauptkohlenstoffquelle, anorganischen Phosphaten sowie von Adenin, Adenosin oder Adenosinphopshat, d a - « durch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Corynebacterium ATCC 21 084 oder Arthrobacter ATCC 21 085 verwendet wird und daß die Züchtung in einem Nährmedium, das 1 bis 10 mg Adenin, Adenosin oder Adenosinphosphat pro ml enthält, bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C und einem pH-Wert von 5 bis 9 durchgeführt wird.