DE1517831B

DE1517831B - Verwendung von Fermentationsflüssigkeiten zur Gewinnung von Flavinadenindinucleotid

Info

Publication number: DE1517831B
Authority: DE
Inventors: Masao Machida; Nakamura Nobuo Tokio; Takasawa Seigo Machida; Tanaka (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd

Description

stoff, muß dieser Nährstoff dem Kulturmedium ebenfalls zugefügt werden. Wesentliche Nährstoffe dieses Typs schließen z. B. Aminosäuren, wie z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure, Threonin, Methionin, usw. und/oder Vitamine, wie Biotin, Thiamin, Cobalamin usw. ein.

Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, wie z. B. unter aerobem Schütteln der Kultur, oder durch Rühren und Belüften einer Submerskultur. Die Temperatur wird vorzugsweise zwischen etwa 20 und 4O⁰C gehalten, der pH zwischen etwa 5,5 und 9,0. Die Züchtung dauert normalerweise 2 bis 10 Tage.

Die Züchtung der zuvor genannten Mikroorganismen unter den oben angegebenen Bedingungen ergab eine Produktion von FAD mit Ausbeuten im Bereich von 50 bis 150μg/ml Kulturflüssigkeit. Die darin produzierte FAD-Menge ist der produzierten 5'-Nucleotidmenge proportional. Je mehr 5'-Nucleotid produziert und angereichert wird, um so mehr FAD wird produziert und angereichert.

Als Beispiel wird in Tabelle 1 der Zusammenhang zwischen 5'-Inosinsäure und FAD, produziert durch Fermentation mit zwei bestimmten Stämmen von Brevibacterium ammoniagenes, in Abhängigkeit von der vergangenen Kulturzeit gezeigt. Annähernd die gleichen Ergebnisse erhält man, wenn andere Stämme verwendet werden oder wenn andere 5'-Nucleotide produziert und angereichert werden.

Tabelle 1

Kultur zeit	Brevibacterium	6872	ammoniagenes	FAD
(Std.)	ATCC	FAD	ATCC 19 183	^g/ml)
	5'-Inosin-	^g/ml)	5'-Inosin-
	säure		säure	14,1
	(mg/ml)	14,8	(mg/ml)	40,0
24	1,2	44,9	0,9	53,5
36	2,5	83,1	2,5	85,7
48	5,3	96,6	3,9	114,6
60	8,2	104,4	6,8	116,8
72	8,6	117,0	8,8
84	10,6	118,0	8,9
96	12,7

Pepton, 1% Hefeextrakt und 0,25 °/₀ NaCl, gezüchtet. Von diesem Anzuchtmedium werden 10 Volumprozent in ein Fermentationsmedium eingeimpft, welches die folgenden Stoffe in 11 Wasser enthielt:
5

100 g Glucose,
6 g Harnstoff,
1OgK₂HPO₄,
10 g KH₂PO₄,

10 g MgSO₄ · 7 H₂O,

0,1 g CaCl₂ · 2 H₂O,
10 mg Ca-Pantothenat,
2 mg Thiaminhydrochlorid,
30 μ-g Biotin.

Nach Beendigung der Kultur können das 5'-Purinnucleotid und FAD aus der Fermentationsflüssigkeit auf einfache Weise durch Anwendung eines der üblichen Verfahren, wie Trennung über ein Ionenaustauscherharz, Chromatographie, Lösungsmittelextraktion, Anwendung von Aktivkohle u. ä. abgetrennt werden. Das so gewonnene FAD kann weiterhin auf übliche Weise gereinigt werden und gibt bei Kristallisation ein Produkt hoher Reinheit.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern. Wenn nicht anders erwähnt, bedeuten die angegebenen Prozentgehalte Gewichtsprozent pro Liter Wasser.

Beispiel 1

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 wird als

Ausgangsstamm verwendet und 24 Stunden lang in einem Kulturmedium, enthaltend 2°/₀ Glucose, 1% 19-ml-Anteile der wäßrigen Lösung, die die Kulturmediumbestandteile außer Harnstoff enthielt, werden getrennt in einzelne 250 ml konische Kolben gegossen. Die Kolben werden im Autoklav bei etwa 1 kg/cm² Druck 15 Minuten lang sterilisiert. Danach wird zu jedem Kolben 1 ml einer getrennt sterilisierten 12%igen Harnstofflösung gegeben, wonach die Einimpfung der Anzuchtkultur vorgenommen .wird.
- Die Züchtung wird unter aerobem Schütteln bei 3O⁰C durchgeführt.

Die Züchtung dauert 48 Stunden, dann wird dem Züchtungsmedium Hypoxanthin in einer Menge von 5 mg/ml zugegeben. Nach weiteren 48 Stunden Kulturzeit waren in der Fermentationsflüssigkeit 12,7 mg 5'-Inosinsäure pro Milliliter und 118,0 μg FAD pro Milliliter produziert und angereichert worden.

11 der entstandenen Kulturflüssigkeit wird filtriert und die Mikroorganismen daraus entfernt. Das Filtrat wird auf pH = 8,0 eingestellt. Es wird dann in eine Austauschersäule übergeführt, welche mit 200 ml Diaion SA 21A, einem stark basischen Ionenaustauscherharz, gefüllt ist, das mit ausreichend Salzsäure behandelt und mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen wurde. Nach Waschen der Säule mit Wasser wird die Trennung erreicht mit 11 einer wäßrigen Lösung die 0,02 η an Salzsäure und 1 m an Natriumchlorid ist. Dadurch werden die 5'-Inosinsäure und Flavinmononucleotid vollständig von der Säule entfernt. Das Harz wird dann mit einer wäßrigen Lösung' von 0,02 η Salzsäure und 1 m Natriumchlorid behandelt, und etwa 500 ml nur FAD enthaltender Ausflußlösung werden gewonnen. Diese Lösung enthält 82,0 mg FAD.
Die Ausflußlösung mit dem FAD wird mit Ammoniumsulfat gesättigt und mit Phenol extrahiert. Der phenolischen Lösung wird eine ausreichende Menge Äthyläther zugefügt. Sodann wird mit Wasser rückextrahiert. Die gewonnene wäßrige Lösung wird bei 50° C auf etwa 10 ml konzentriert. Man fügt eine aus-

reichende Menge Äthanol hinzu und läßt die Lösung stehen. Das ausgefällte FAD wird mittels einer Zentrifuge abgetrennt. Das erhaltene FAD wird getrocknet und seine Aktivität mit einer Apo-(B)-Aminosäureoxidase gemessen. Gewonnen werden 61,7 mg FAD mit einer Reinheit von 82%· Dieses FAD enthält nur zu vernachlässigende Verunreinigungen mit Flavinderivaten. Eine höhere Reinheit des FAD kann leicht durch Wiederholen der oben beschriebenen Ionenaustauschchromatographie erreicht werden.

Beispiel 2

Micrococcus glutamicus ATCC 19185 wird als Saatstamm verwendet. Dieser Mikroorganismus wird

24 Stunden lang bei 3O⁰C in einem Anzuchtmedium, enthaltend 2% Glucose, 1% Pepton, 1% Fleischextrakt, 0,3 % NaCl und 20 μg Biotin, gezüchtet. 10 Volumprozent dieses Anzuchtsaatmediums werden in das folgende Fermentationsmedium eingeimpft, wobei die angegebenen Mengen pro Liter Wasser zu verstehen sind:

70 g Glucose,

6 g Harnstoff,

1 g KH₂PO₄,

3 g K₂HPO₄,

0,03 g MgSO₄- 7 H₂O,

0,01 g FeSO₄ · 7 H₂O,

5 g Casaminosäure,
30 μg Biotin,

5 mg Thiammhydrochlorid,
10 mg Calciumpantothenat,
20 mg Adenin,
20 mg Guanin.

Die Menge von 6 g Harnstoff pro Liter Kulturmedium wird als 40%ige wäßrige Lösung, die getrennt hergestellt und sterilisiert wurde, zugefügt. Der pH der Lösung wird vor der Sterilisation auf 7,5 eingestellt.

Das Fermentationsmedium wird zu 30-ml-Anteilen in einzelne 250-ml-Kolben konischer Form gegossen.

Die Züchtung wird unter aerobem Schütteln bei 3O⁰C durchgeführt. Nach 96 Stunden Kulturzeit werden in der Fermentationsflüssigkeit 10,7 mg 5'-Inosinsäure pro Milliliter und 113,7 μg FAD pro Milliliter gefunden. Diese können aus dieser wie im Beispiel 1 beschrieben abgetrennt werden.

Beispiel 3

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 wird als Saatstamm verwendet. Die Züchtung wird 110 Stunden lang unter den gleichen Bedingungen und im gleichen Medium, wie im Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt. Als Ergebnis fanden sich in der Kulturflüssigkeit 11,2 mg 5'-Inosinsäure pro Milliliter und 121,2 μg FAD pro Milliliter.

Bei spi el 4

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 wird als Saatstamm verwendet, und die Züchtung wird wie im Beispiel 1 beschrieben ausgeführt, außer daß dem Kulturmedium an Stelle von Hypoxanthin 1 mg Adenin pro Milliliter zugegeben werden. Die Züchtung wird 96 Stunden lang ununterbrochen durchgeführt. Als Ergebnis fanden sich in der Fermentationsfiüssigkeit 8,3 mg 5'-AdenyIsäure pro Milliliter und 101,2 μg FAD pro Milliliter.

Beispiel 5

Derselbe Saatstamm, wie im Beispiel 4 beschrieben, wird unter den gleichen Bedingungen und in den gleichen Medien wie im Beispiel 1 gezüchtet, außer daß an Stelle von Hypoxanthin dem Kulturmedium 1 mg Guanin pro Milliliter zugegeben werden. Nach 96 Stunden kontinuierlicher Züchtung waren in der Kulturflüssigkeit 5,2 mg 5'-Guanylsäure pro Milliliter und 82,3 μg FAD pro Milliliter angereichert.

Beispiel 6

Als Saatstamm wird Brevibacterium linens ATCC 9175 verwendet, und die Züchtung wird wie im Beispiel 1 beschrieben ausgeführt, außer daß dem Fermentationsmedium 2 mg Adenin pro Milliliter an Stelle von Hypoxanthin zugefügt werden. In der Fermentationsfiüssigkeit wurden 8,2 mg 5'-Adenylsäure und 59,7 μg FAD pro Milliliter angereichert.

Beispiel 7

Micrococcus freudenreichii ATCC 8459 wird als Saatstamm verwendet und die Züchtung unter den gleichen Bedingungen und in den gleichen Medien wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Hypoxanthin wird dem Kulturmedium in der Menge von 2 mg/ml zugegeben. Nach 96 Stunden Kulturzeit waren in der Fermentationsflüssigkeit 9,7 mg 5'-Inosin-

ao säure pro Milliliter und 98,3 μg FAD pro Milliliter angereichert.

Beispiele

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 wird als Saatstamm verwendet und die Züchtung wie im Beispiel 1 beschrieben ausgeführt. Der Fermentationslösung wird eine Menge von 2 mg Xanthin pro Milliliter zugesetzt. Nach Beendigung der Züchtung fanden sich 7,2 mg 5'-Xanthylsäure pro Milliliter und 62,4 μg FAD pro Milliliter der Kulturflüssigkeit.

Beispiel9

Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 15592 wird als Saatstamm verwendet, und die Züchtung wird wie im Beispiel 1 beschrieben ausgeführt. Der Kulturflüssigkeit wird 1 mg Hypoxanthin pro Milliliter zugesetzt. Nach Beendigung der Züchtung werden pro Milliliter der Fermentationsflüssigkeit 8,9 mg 5'-Inosinsättre und 53,5 μg FAD gefunden.

Beispiel 10

Flavobacterium arborescens ATCC 4358 wird als Saatstamm verwendet und die Züchtung unter den gleichen Bedingungen und in den gleichen Medien wie im Beispiel 1 beschrieben ausgeführt. Als Ergebnis sind pro Milliliter der Fermentationsflüssigkeit 7,2 mg 5'-Inosinsäure und 61,3 μg FAD angereichert.

B e i s ρ i e 1 11

Flavobacterium devorans ATCC 10829 wird als Saatstamm verwendet. Die Züchtung wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt. Als Ergebnis finden sich pro Milliliter der Fermentationsflüssigkeit 8,9 mg 5'-Inosinsäure und 98,3 μg FAD angereichert.

Beispiel 12

Die zehn in Tabelle 2 aufgeführten Mikroorganismenstämme wurden als Einsaat-Mikroorganismen verwendet und wie im Beispiel 1 gezüchtet. 10 Volumprozent der erhaltenen Einsaatkulturen wurden in die einzelnen Fermentationsmedien eingeimpft, welche 10% Glucose, 0,6% Harnstoff, 1% K₂HPO₄, 1%

KH₂PO₄, l°/o MgSO₄, 0,01 % CaCl₂ und 0,02 °/₀ Hefeextrakt enthielten, und zwar bei einem pH-Wert von 8,0. Nach 36stündiger Züchtung wurde zum Medium Adenin gegeben, um die Adeninkonzentration auf

5 mg/ml zu bringen. Danach wurde die Züchtung weitere 48 Stunden fortgesetzt, wodurch Adenylsäure und FAD gebildet wurden und in der Fermentationsflüssigkeit sich ansammelten.

Tabelle 2

Verwendete Stämme	Adenyl säure*) mg/ml	FAD y/ml
Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871 ATCC 15 187 Brevibacterium helvolum ATCC 11822 Micrococcus glutamicus ATCC 14305 Τ ATCC 14306 . ATCC 14619 ATCC 14620 Flavobacterium harrisoni ATCC 14589 Flavobacterium fiavescens ATCC 14231 Flavobacterium sulfureum ATCC 14232	8,9 5,2 6,7 10,6 10,2 8,7 7,8 6,3 8,1 5,8	102 78 91 107 103 92 96 80 115 90

*) Das daneben produzierte Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat sind inbegriffen und in Adenylsäure umgerechnet.

209 548/328

Claims

1 2

nucleotid produzierende Stämme von Brevibacterium,

Patentanspruch: Micrococcus, Corynebacterium oder Flavobacterium

unter den gleichen Bedingungen, die zur Herstellung

Verwendung von durch Züchten von 5'-Purin- von 5'-Purinnucleotiden verwendet werden, zur Züchnukleotid bildenden Mikroorganismen der Gattung 5 tung einsetzt. Das FAD wird zusammen mit dem Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium 5'-Purinnucleotid produziert und angereichert; es und Flavobacterium bei hierfür üblichen Bedin- ist nicht durch andere Flavinkörper verunreinigt, was gungen erhaltenen Fermentationsflüssigkeiten zur die Gewinnung von FAD aus den Fermentations-Gewinnung von Flavinadenindinukleotid. flüssigkeiten besonders einfach und vorteilhaft macht.

ίο Das Verfahren der vorliegenden Erfindung hat den Vorteil, daß das FAD neben 5'-Purinnucleotiden her-

—■ gestellt und leicht von diesen abgetrennt werden kann.

Gegenüber dem Fermentationsverfahren der USA.-Patentschrift 2 973 305 weist das erfindungsgemäße

Die Erfindung betrifft die Verwendung von durch 15 Verfahren bedeutende Vorteile auf. Die durch die Züchten von 5'-Purinnucleotid produzierenden Mikro- Züchtung erzielbaren Ausbeuten an FAD sind zwar Organismen der Gattungen Brevibacterium, Micro- bei beiden Verfahren numerisch etwa gleich. Während coccus, Corynebacterium und Flavobacterium bei jedoch-erfindungsgemäß das FAD außerhalb der hierfür üblichen Bedingungen erhaltenen Fennen- Zellen in der Fermentationsflüssigkeit angesammelt tationsflüssigkeiten zur Gewinnung von Flavinadenin- 20 wird, liegt das FAD bei dem bekannten Verfahren dinucleotid. intrazellulär vor, so daß dort aufwendige Isolierungs-Flavinadenindinucleotid (FAD) wird seit kurzem und Gewinnungsoperationen notwendig sind, um das — als Vitamin B₂ oder wirksame Form von Ribo- FAD zu isolieren. Die Gewinnung des FAD aus den flavin — als Droge und Zusatz zu Nahrungs- und ~ erfindungsgemäß zu verwendenden Fermentations-Futtermitteln verwendet; es besitzt starke biologische 25 flüssigkeiten gestaltet sich, verglichen mit den umAktivität und große Löslichkeit in Wasser, was seine ständlichen Extraktions- und Gewinnungsmaßnahmen, Verwendung an Stelle von Riboflavin stark gesteigert die nach der USA.-Patentschrift erforderlich sind, hat. verhältnismäßig einfach.

Die bisherigen biotechnischen Verfahren zur Her- Die anzuwendenden optimalen Züchtungsbedingunstellung von Flavinadenindinucleotid bestehen in der 30 gen sind jene, die üblicherweise zur Herstellung von Extraktion von FAD aus lebenden Zellen oder in der 5'-Purinnucleotiden durch Züchten der genannten Synthese von FAD aus Riboflavin. Das Verfahren zur Mikroorganismenarten angewendet werden. Für die Extraktion von FAD aus Zellkörpern von Eremothe- Zusammensetzung des Kulturmediums ist entweder cium ashbyii — ein Riboflavin produzierender Mikro- ein synthetisches oder natürliches Kulturmedium Organismus — wird in der USA.-Patentschrift 2 973 305 35 brauchbar, solange es die zum Wachstum der verwenbeschrieben und dürfte das bisher wirksamste Ver- deten Mikroorganismen-Stämme notwendigen Nährfahren zur Herstellung von FAD in industriellem stoffe enthält. Solche Nährstoffe sind dem Fachmann Maßstab sein. Es hat jedoch den Nachteil, daß FAD wohlbekannt und schließen Substanzen, wie eine in den Mikroorganismenzellen in einem frühen Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Züchtungsstadium angereichert wird, weshalb im 40 Verbindungen u. ä., in angemessenen Mengen, welche Laufe der Zeit FAD über Flavinmononucleotid zu von »dem verwendeten Stamm benötigt werden, ein. Riboflavin abgebaut wird. Die Gewinnung von FAD So mögen als Kohlenstoffquelle als Beispiele Glucose, aus dem Kulturmedium ist zudem schwierig und Fructose, Mannose, Galactose, Saccharose, Maltose, wirft Probleme hinsichtlich der Extraktion des FAD Lactose, Stärkehydrolysate, Melassen oder andere aus den Zellen und der Isolierung des extrahierten 45 Kohlenhydrate u. ä. erwähnt werden. Die Kohlenstoff-FAD von anderen Flavinkörpern auf. quelle kann entweder eine Substanz oder eine Mischung Nach Biochemical Journal 54,1953, S. 437 ff, können zweier oder mehrerer Substanzen sein. Als Stickstoffnur unbefriedigende Ausbeuten an FAD erhalten quelle können Verwendung finden verschiedene Arten werden, bestenfalls 0,11 mg je Liter Nährmedium. anorganischer oder organischer Salze oder Verbin-Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, eine 50 düngen, wie z. B. Ammoniak, Ammoniumsulfat, verbesserte Methode zur biotechnischen Herstellung Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumvon Flavinadenindinucleotid zu schaffen, die einfach karbonat, Ammoniumacetat usw., Nitrate, Harnstoff und wirksam, wirtschaftlich und in industriellem oder andere Stickstoff enthaltende Verbindungen, wie Maßstab vorteilhaft durchgeführt werden kann. Ferner Peptone, Kaseinhydrolysate, Fleischextrakt, Hefesollte eine solche Methode die Gewinnung des FAD 55 extrakt, Maisextrakt (cornsteep liquor), zur Branntnach der Fermentation in hoher Reinheit und guter weinherstellung verwendete Maische (Distillers solub-Ausbeute erlauben. les), Fischmehl, Reisschalenextrakt u. ä. Stickstoff-Die Erfindung besteht nun in der Verwendung von quelle kann ebenfalls eine dieser Substanzen oder eine durch Züchten von 5'-Purinnucleotid bildenden Mikro- Mischung zweier oder mehrerer sein. Für die anororganismen der Gattung Brevibacterium, Micro- 60 ganischen Verbindungen, die dem Kulturmedium coccus, Corynebacterium und Flavobacterium bei zugefügt werden, kommen in Frage: Kaliumdihydrohierfür üblichen Bedingungen erhaltenen Fennen- genphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Magnetationsflüssigkeiten zur Gewinnung von Flavinaden- siumsulfat, Calciumkarbonat, Mangansulfat, Kaliumindinucleotid. chlorid, und auch andere Metallsalze wie die von Zink, Das Züchten der Mikroorganismenstämme aus den 65 Eisen usw. Auch Mutanten aus den erwähnten Gattunobigen Gattungen selbst ist bekannt. Es wurde nun gen, die durch Mutationen erzeugende Methoden ergefunden, daß erhebliche Mengen FAD in der Kultur- halten wurde, können ebenfalls verwendet werden, flüssigkeit angereichert werden, wenn man 5'-Purin- Benötigt der verwendete Mutant einen speziellen Nähr-