DE1802754C3 - Verfahren zur Herstellung von g-beta-D-Ribofuranosid-S'-mono-, -di- und -tri-phosphaten von 2-substituierten 6-Hydroxypurinen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von g-beta-D-Ribofuranosid-S'-mono-, -di- und -tri-phosphaten von 2-substituierten 6-HydroxypurinenInfo
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Description
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichne:,
daß man das 6-Hydroxypurin nach Ablauf der halben Züchtungsdauer dem Medium zufügt.
XOHX
IO
■5
20 Die Erfindung \ trifft ein Verfahren zur Herstellung
von 9-iJ-D-Ribofuranosid-5'-mono-, -di- und -iriphosphaten
von 2-substituierten 6-Hydroxypurinen <ki
allgemeinen Formel
OH
OH
in der R die Reste -CH3, -CH2-CH3, -SH,
—S—CH3,-S—CH2-CH3,-NH- CH3 oder
— N
und X die Reste
O
O
CH,
CH,
XOH2C
35
— P — OH — P — O — P — OH
oder
OH
OH
OH
40 OH OH
der R die Reste -CH3, -CH2-CH3, -SH.
-S-CH3, -S-CH2-CH3, -NH-CH3 oder
in
— P — O — P — O—P — OH
—N
CH3
45
CH,
OH
OH
OH
bedeutet, durch Züchten von Mikroorganismen in Gegenwart der entsprechenden Base als Vorläufer,
dadurch gekennzeichnet, daß man Corynebacterium sp. ATCC 21 084 oder Arthrobacter
sp. ATCC 21 085 unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 20 bis 40° C und
einem pH-Wert von 4,0 bis 9,5 in einem wäßrigen 55 oder
Nährmedium züchtet, welches ein 2-substituiertes 6-Hydroxypurin der allgemeinen Formel
und X die Reste
— P—OH
OH
O
O
P —O—P —OH
OH
OH
OH
— P —O —P —O —P —OH
60 OH
OH
OH
R-C
C-N^ C-N'
CH
N
in der R die oben angegebene Bedeutung besitzt, bedeutet, durch Züchten von Mikroorganismen in Gegenwart der entsprechenden Base als Vorläufer. Es ist dadurch gekennzeichnet, daß man Corynebacterium sp. ATCC 21 084 oder Arthrobacter sp. ATCC 21 085 unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 20 bis 40° C und einem pH-Wert von 4,0 bis 9,5 in einem wäßrigen Nährmedium züchtet,
in der R die oben angegebene Bedeutung besitzt, bedeutet, durch Züchten von Mikroorganismen in Gegenwart der entsprechenden Base als Vorläufer. Es ist dadurch gekennzeichnet, daß man Corynebacterium sp. ATCC 21 084 oder Arthrobacter sp. ATCC 21 085 unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 20 bis 40° C und einem pH-Wert von 4,0 bis 9,5 in einem wäßrigen Nährmedium züchtet,
welches ein 2-substituiertes 6-Hydroxypurin der allgemeinen
Formel
OH
C
C
N
j
j
R-C
\
C-Ns
C-Ns
CH
C—
(II)
in der R die oben angegebene Bedeutung besitzt, enthält und die gebildeten Verbindungen der angegebenen
allgemeinen Formel I in üblicher Weise aus der Kulturbrühe isoliert.
2 - Dimethylamino - 6 - hydroxypurin - 9 - β - D - ribofuranosid-5'-diphosphorsäure
ist in der RNS von Hefen gefunden worden (Journal of Biological Chemistry, Vol. 234, S. 1525 [1959]; Journal of the American
Chemical Society, Vol. 87 [1965], S. 3752); auch 2 - Methylamino - 6 - hydroxypurin - 9 - β - D - ribofuranosid-5'-diphosphorsäure
ist in RNS nachgewiesen worden (ζ. B. Biochemica Biophysica Acta, Vol. 61
[1962], S. 340). Es ist bekannt, da3 die Verbindungen der allgemeinen Formel I Strukturanaloge der Nucleinsäuren
aufbauenden Nucleotide sind, daß einige von ihnen einen angenehmen und aromaartigen
Geschmack besitzen und daß die synergistische Geschmackswirkung derselben mit Natriumglutamat
größer ist als diejenige vor. Inosi-säure oderGuanylsäure
(»Summery of Lectu.ef of the 1967 General Meeting of the Japan Agricultural Jhemical Society«
[1967], S. 187 bis 188). In diesem Schrifttum wird auch
die Herstellung dieser Verbindungen durch chemische Syntheseverfahren beschrieben. Diese Verfahren sind
jedoch für industrielle Zwecke ungeeignet, und zwar auf Grund der anzuwendenden kostspieligen Rohmaterialien
und der komplizierten Verfahrensdurchführung.
Aus der USA.-Patentschrift 3 308 036 war es bereits bekannt, daß bei der Züchtung bestimmter Mikroorganismen
in Gegenwart verschiedener Purine als Vorläufer die entsprechenden Nucleosid-5'-, mono-,
-di- und -triphosphate in der Kulturbrühe angereichert werden und daraus nach üblichen Arbeitsweisen isoliert
werden können.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann als Züchtungsmedium
jedes Mährmedium verwendet werden, welches 2-substituierte 6-Hydroxypurine der allgemeinen
Formel (II) enthält, und im Extremfall kann das erfindungsgemäße Ziel sogar erreicht werden, indem
man Mikroorganismenzellen zu einer wäßrigen Lösung hinzugibt, welche nur Verbindungen gemäß
der allgemeinen Formel (II) enthält und die Züchtung durchführt, da auch in diesem Falle Verbindungen der
allgemeinen Formel (I) in der Kulturflüssigkeit gebildet
werden. Jedes Nährmedium ist erfindungsgemäß brauchbar, solange es die für das Wachstum des verwendeten
Mikroorganismenstammes notwendigen Nährstoffe enthält. Solche Nährstoffe umfassen eine
Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Verbindungen. In einigen Fällen ist es außerdem
vorteilhaft und erwünscht, Phosphorsäureverbindungen, wie Phenylphosphorsäure, Ribose-1-phosphorsäure,
Inosinsäure, Adenylsäure oder Guanylsäure dem Medium zuzufügen.
Die 2-substituierten 6-Hydroxypurine der allgemeinen Formel (II) können zu Beginn der Züchtung
oder zu irgendeinem Zeitpunkt während der Züchtung, beispielsweise nach Ablauf der halben Züchtungsdauer,
dem Medium zugefügt werden. Darüber hinaus kann die Zugabe auf einmal oder in Abständen in
kleinen Anteilen erfolgen.
Die zu dem Medium hinzugesetzte Menge der 2-substituierten 6-Hydroxypurine kann in recht weiten
ίο Grenzen variiert werden. Wenn man die Züchtung mit
einer großen Menge an Mikroorganismenzellen durchführt und die 6-Hydroxypurine zu einem Zeitpunkt zufügt,
zu dem die Mikroorganismen nur langsam wachsen, können die Verbindungen in hoher Konzen-
^ration zugesetzt werden. Wenn man andererseits die 6-Hydroxypurine im Anfangsstadium der Fermentation
dem Medium zufügt, in dem ein starkes Wachstum der Mikroorganismen vor sich geht, ist es erwünscht,
die Verbindungen abstandsweise in kleinen Mengen zuzufügen, da das Wachstum der Mikroorganismen
gehemmt werden kann, wenn man eine zu große Menge davon auf einmal hinzugibt.
Die Züchtungsbedingungen entsprechen, abgesehen von den oben bereits angegebenen speziellen Anforderungen.
den in der Fermentationstechnik üblicherweise angewendeten Arbeitsweisen. So wird die Züchtung
des Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen, wie z. B. aerobem Schütteln der Kultur oder
durch Rühren und Belüften einer Submerskultur, bei einer Temperatur von 20 bis 40° C und einem pH-Wert
von etwa 4,0 bis 9,5 durchgeführt. Nach 2 bis 7 Tagen der Züchtung unter diesen Bedingungen werden große
Mengen an 9-/i-D-Ribofuranosid-5'-mono-, -di- und -triphosphaten von 2-substituierten 6-Hydroxypurinen
in der erhaltenen Kulturflüssigkeit sowie auch in den Mikroorganismenzellen angereichert gefunden.
Nach Abschluß der Züchtung können die erfindungsgemäß produzierten Ribotide aus der Kulturflüssigkeit
und den Zellkörpern auf übliche Weise isoliert und gereinigt werden. Sie können aus den Mikroorganismenzellen
z. B. mit Perchlorsäure oder warmem Alkohol extrahiert werden. Die in der Kulturflüssigkeit
angereicherten Ribotide können mit Hilfe von Arbeitsweisen, wie Behandlung mit Ionenaustauscherharzen,
Adsorption an Kohlepulver, Extraktion mit Lösungsmitteln, Chromatographie oder Ausfällung
gewonnen werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern. Prozentangaben beziehen sich auf Gramm
pro Milliliter Wasser.
Corynebacterium sp. ATCC 21 084 bzw. Arthrobacter sp. ATCC 21 085 wird als Einsaatmikroorganismus
verwendet und in einem Einsaatkulturmedium gezüchtet, welches 1% Pepton, 2% Glucose, 1%
Hefeextrakt, 0,3% NaCl und 30 (j.g/1 Biotin enthält,
und zwar 24 Stunden lang bei 30° C. Der Mikroorganismus wird dann in einem Verhältnis von 10 Volumprozent
in ein Fermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung eingeimpft:
Glukose 100 g
Harnstoff 6 g
K2HPO4 10 g
KH2PO4 10 g
MgSO4-7H2O 10 g
I 802 754 Ψ
5 '6
CaCl2 · 2H2O .! 0,1 g 48 Stunden nach Beginn der Züchtung wird 2-Me-
Biotin 30 μg thyl - 6 - hydroxypurin in einer Konzentration von
Calciumpantothenat 2 mg 2 mg/ml zu der Fermentationsflüssigkeit hinzuge-
Thiamin 5 mg geben, und die Züchtung wird weitere 48 Stunden lang
Pepton 5g 5 fortgesetzt. Als Ergebnis sind 2,4 mg/ml bzw. 1,9 mg/ml
2 - Methyl - 6 - hydroxypurin - 9 - β - D - ribofuranosid-
Das Fermentationsmedium wird in 1 1 Wasser zube- 5'-diphosphat in der Fermentationsflüssigkeit ange-
reitet und sein pH-Wert mit NaOH auf 8,0 eingestellt. reichert worden.
Danach wird das Fermentationsmedium in Kolben Das produzierte Ribotid wird an einem stark basi-
abgefüllt, und diese werden 10 Minuten lang bei io sehen Polystyrol-Anionenaustauscherharz (Ameisen-
1 kg/cm2 in einem Autoklav sterilisiert. säure-Form) adsorbiert und anschließend mit Ameisen-
20-ml-Anteile des Gemisches aus Einsaatkultur und säure eluiert. Die das Ribotid enthaltenden Fraktionen
Fermentationsmedium werden jeweils in 250-ml- werden neutralisiert und an Kohlepulver adsorbiert;
Erlenmeyerkolben eingefüllt und vor der Verwendung danach wird mit 50%igem Äthanol, der 3% HN4OH
sterilisiert. Die Züchtung wird dann unter aerobem 15 enthält, eluiert. Durch Verdampfung des Lösungs-
Schütteln der Kolben bei 300C durchgeführt. mittels wird das Ribotid als Pulver gewonnen.
Die Züchtung wird wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, an Stelle des im Beispi ■■ 1 eingesetzten 2-Methyl-6-hydroxypurins
werden jedoch jewels die in der Tabelle angegebenen Basen zugesetzt. Die erhaltenen Ausbeuten
an den den eingesetzten Basen entsprechenden 9-/J-D-Ribofuranosid-5'-phosphaten sind in der Tabelle
angegeben.
Zugesetzte Base (2 mg/ral)
Corynebacterium sp. ATCC 21084 J Arthrobacter sp. ATCC 21085
Ausbeute an dem der zugesetzten Base entsprechenden 9-/J-D-Ribofuranosid-5'-phosphorsäureestern
(mg, ml)
5'-mono- | -S'-di- | -5'-tri- | -5'-mono- | -5-di- | -5-tn |
2,2 | 1,9 | 2.1 | 2,0 | 1,85 | 1,9 |
2,2 | 2,1 | 2,3 | 1,9 | 2,4 | 2,5 |
3,0 | 3,4 | 3,1 | 2,7 | 3,0 | 3,2 |
1,0 | 0,7 | 0,9 | 0,8 | 0,85 | 1,1 |
0,4 | 0,4 | 1,2 | 0,4 | 0,4 | 1,0 |
1,2 | 1,0 | 0,9 | 1,0 | 0,9 | 1,2 |
2-Äthyl-6-hydroxypurin
2'Methylthio-6-hydroxypurin
2-Äthylthio-6-hydroxypurin
2-Methylamino-6-hydroxypurin ..
2-Dimethylamino-6-hydroxypurin
2-Mercapto-6-hydroxypurin
2-Dimethylamino-6-hydroxypurin
2-Mercapto-6-hydroxypurin
Claims (1)
1. Verfahren zur Herstellung von 9-/}-D-Ribofuranosid-5'-mono-,
-di- und -triphosphaten von 2-substituierten 6-Hydroxypurinen der allgemeinen
Formel
OH
enthält und Verbindungen der allgemeinen Formel I in üblicher Weise aus der Kulturbrühe iso-
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---|---|
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DE1802754B2 DE1802754B2 (de) | 1973-02-15 |
DE1802754C3 true DE1802754C3 (de) | 1973-09-27 |
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ID=13286720
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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1968
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