DE1517831C

DE1517831C - Verwendung von Fermentationsflussig keiten zur Gewinnung von Flavinadenindi nucleotid

Info

Publication number: DE1517831C
Application number: DE19661517831
Authority: DE
Inventors: Masao Machida Nakamura Nobuo Tokio Takasawa Seigo Machida Tanaka, (Japan) B21b 11 00
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1965-08-13
Filing date: 1966-08-12
Publication date: 1973-06-20

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von durch Züchten von 5'-Purinnucleotid produzierenden Mikroorganismen der Gattungen Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium und Flavobacterium bei hierfür üblichen Bedingungen erhaltenen Fermentationsflüssigkeiten zur Gewinnung von Flavinadenindinucleotid.

Flavinadenindinucleotid (FAD) wird seit kurzem — als Vitamin B₂ oder wirksame Form von Riboflavin — als Droge und Zusatz zu Nahrungs- und Futtermitteln verwendet; es besitzt starke biologische Aktivität und große Löslichkeit in Wasser, was seine Verwendung an Stelle von Riboflavin stark gesteigert hat.

Die bisherigen biotechnischen Verfahren zur Herstellung von Flavinadenindinucleotid bestehen in der Extraktion von FAD aus lebenden Zellen oder in der Synthese von FAD aus Riboflavin. Das Verfahren zur Extraktion von FAD aus Zellkörpern von Eremothecium ashbyii — ein Riboflavin produzierender Mikroorganismus — wird in der USA.-Patentschrif t2 973 305 beschrieben und dürfte das bisher wirksamste Verfahren zur Herstellung von FAD in industriellem Maßstab sein. Es hat jedoch den Nachteil, daß FAD in den Mikroorganismenzellen in einem frühen Züchtungsstadium angereichert wird, weshalb im Laufe der Zeit FAD über Flavinmononucleotid zu Riboflavin abgebaut wird. Die Gewinnung von FAD aus dem Kulturmedium ist zudem schwierig und wirft Probleme hinsichtlich der Extraktion des FAD aus den Zellen und der Isolierung des extrahierten FAD von anderen Flavinkörpern auf.

Nach Biochemical Journal 54,1953, S. 437 ff, können nur unbefriedigende Ausbeuten an FAD erhalten werden, bestenfalls 0,11 mg je Liter Nährmedium.

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, eine verbesserte Methode zur biotechnischen Herstellung von Flavinadenindinucleotid zu schaffen, die einfach und wirksam, wirtschaftlich und in industriellem Maßstab vorteilhaft durchgeführt werden kann. Ferner sollte eine solche Methode die Gewinnung des FAD nach der Fermentation in hoher Reinheit und guter Ausbeute erlauben.

Die Erfindung besteht nun in der Verwendung von durch Züchten von 5'-Purinnucleotid bildenden Mikroorganismen der Gattung Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium und Flavobacterium bei hierfür üblichen Bedingungen erhaltenen Fermentationsflüssigkeiten zur Gewinnung von Plavinadenindinucleotid.

Das Züchten der Mikroorganismenstämme aus den obigen Gattungen selbst ist bekannt. Es wurde nun gefunden, daß erhebliche Mengen FAD in der Kulturflüssigkeit angereichert werden, wenn man 5'-Purinnucleotid produzierende Stämme von Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium oder Flavobacterium unter den gleichen Bedingungen, die zur Herstellung von 5'-Purinnucleotiden verwendet werden, zur Züchtung einsetzt. Das FAD wird zusammen mit dem 5'-Purinnucleotid produziert und angereichert; es ist nicht durch andere Flavinkörper verunreinigt, was die Gewinnung von FAD aus den Fermentationsflüssigkeiten besonders einfach und vorteilhaft macht.

ίο Das Verfahren der vorliegenden Erfindung hat den Vorteil, daß das FAD neben 5'-PurinnucIeotiden hergestellt und leicht von diesen abgetrennt werden kann. Gegenüber dem Fermentationsverfahren der USA.-Patentschrift 2 973 305 weist das erfindungsgemäße Verfahren bedeutende Vorteile auf. Die durch die Züchtung erzielbaren Ausbeuten an FAD sind zwar bei beiden Verfahren numerisch etwa gleich. Während jedoch erfindungsgemäß das FAD außerhalb der Zellen-in der Fermentationsflüssigkeit angesammelt wird, liegt das FAD bei dem bekannten Verfahren intrazellulär vor, so daß dort aufwendige Isolierungsund Gewinnungsoperationen notwendig sind, um das

- FAD zu isolieren. Die Gewinnung äes FAD aus den erfindungsgemäß zu verwendenden Fermentationsflüssigkeiten gestaltet sich, verglichen mit den umständlichen Extraktions- und Gewinnungsmaßnahmen, die nach der USA.-Patentschrift erforderlich sind, verhältnismäßig einfach.

Die anzuwendenden optimalen Züchtungsbedingungen sind jene, die üblicherweise zur Herstellung von 5'-Purinnucleotiden durch Züchten der genannten Mikroorganismenarten angewendet werden. Für die Zusammensetzung des Kulturmediums ist entweder ein synthetisches oder natürliches Kulturmedium brauchbar, solange es die zum Wachstum der verwendeten Mikroorganismen-Stämme notwendigen Nährstoffe enthält. Solche Nährstoffe sind dem Fachmann wohlbekannt und schließen Substanzen, wie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Vetbindungen u. ä., in angemessenen Mengen, welche von dem verwendeten Stamm benötigt werden, ein. So mögen als Kohlenstoffquelle als Beispiele Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Saccharose, Maltose, Lactose, Stärkehydrolysate, Melassen oder andere Kohlenhydrate u. ä. erwähnt werden. Die Kohlenstoffquelle kann entweder eine Substanz oder eine Mischung zweier oder mehrerer Substanzen sein. Als Stickstoffquelle können Verwendung finden verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindüngen, wie z. B. Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumkarbonat, Ammoniumacetat usw., Nitrate, Harnstoff oder andere Stickstoff enthaltende Verbindungen, wie Peptone, Kaseinhydrolysate, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisextrakt (cornsteep liquor), zur Branntweinherstellung verwendete Maische (Distillers solubles), Fischmehl, Reisschalenextrakt u. ä. Stickstoffquelle kann ebenfalls eine dieser Substanzen oder eine Mischung zweier oder mehrerer sein. Für die anörganischen Verbindungen, die dem Kulturmedium zugefügt werden, kommen in Frage: Kaliumdihydro-. genphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumkarbonat, Mangansulfat, Kaliumchlorid, und auch andere Metallsalze wie die von Zink, Eisen usw. Auch Mutanten aus den erwähnten Gattungen, die durch Mutationen erzeugende Methoden erhalten wurde, können ebenfalls verwendet werden. Benötigt der verwendete Mutant einen speziellen Nähr-

1 α

stoff, muß dieser Nährstoff dem Kulturmedium ebenfalls zugefügt werden. Wesentliche Nährstoffe dieses Typs schließen z. B. Aminosäuren, wie z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure, Threonin, Methionin, usw. und/oder Vitamine, wie Biotin, Thiamin, Cobalamin usw. ein.

Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, wie z. B. unter aerobem Schütteln der Kultur, oder durch Rühren und Belüften einer Submerskultur.DieTemperaturwirdvQrzugsweisezwischen etwa 20 und 40° C gehalten, der pH zwischen etwa 5,5 und 9,0. Die Züchtung dauert normalerweise 2 bis 10 Tage.

Die Züchtung der zuvor genannten Mikroorganismen unter den oben angegebenen Bedingungen ergab eine Produktion von FAD mit Ausbeuten im Bereich von 50 bis 150μg/ml Kulturflüssigkeit. Die darin produzierte FAD-Menge ist der produzierten 5'-Nucleotidmenge proportional. Je mehr 5'-Nucleotid produziert und angereichert wird, um so mehr FAD wird produziert und angereichert.

Als Beispiel wird in Tabelle 1 der Zusammenhang zwischen 5'-Inosinsäure und FAD, produziert durch Fermentation mit zwei bestimmten Stämmen von Brevibacterium" ammoniagenes, in Abhängigkeit von der vergangenen Kulturzeit gezeigt. Annähernd die gleichen Ergebnisse erhält man, wenn andere Stämme verwendet werden oder wenn andere 5'-Nucleotide produziert und angereichert werden.

Tabelle!

Kultur zeit	Brevibacterium ammoniagenes	FAD	ATCC -	L9183
(Std.)	ATCC 6872	fag/ml)	5'-Inosin-	FAD
	5'-Inosin-		säure	^g/ml)
	säure	14,8	(mg/ml)
	(mg/ml)	44,9 -	0,9	14,1
24	1,2	83,1	2,5	40,0
36 '	2,5	96,6	3,9	53,5
48	5,3	104,4	6,8	85,7
60	8,2	117,0	8,8	114,6
72	8,6	118,0	8,9	116,8
84	10,6
96	12,7

Nach Beendigung der Kultur können das 5'-Purin_r nucleotid und FAD aus der Fermentationsflüssigkeit auf einfache Weise durch Anwendung eines der üblichen Verfahren, wie Trennung über ein Ionenaustauscherharz, Chromatographie, Lösungsmittelextraktion, Anwendung von Aktivkohle u. ä. abgetrennt werden. Das so gewonnene FAD kann weiterhin auf übliche Weise gereinigt werden und gibt bei Kristallisation ein Produkt hoher Reinheit.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern. Wenn nicht anders erwähnt, bedeuten die angegebenen Prozentgehalte Gewichtsprozent pro Liter Wasser.

B eispiel 1

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 wird als Ausgangsstamm verwendet und 24 Stunden lang in einem Kulturmedium, enthaltend 2% Glucose, 1% Pepton, 1% Hefeextrakt und 0,25% NaCl, gezüchtet. Von diesem Anzuchtmedium werden 10 Volumprozent in ein Fermentationsmedium eingeimpft, welches die folgenden Stoffe in 11 Wasser enthielt:
5

100 g Glucose,
6 g Harnstoff,
10 g K₂HPO₄,
1OgKH₂PO₄, :... .

ίοgMgSO₄·7H₂O, ..; :..

0,1 g CaCl₂ · 2 H₂O,
10 mg Ca-Pantothenat,

2 mg Thiaminhydrochlorid,
30 μg Biotin.

19-ml-Anteile der wäßrigen Lösung, die die Kulturmediumbestandteile außer Harnstoff enthielt, werden getrennt in einzelne 250 ml konische Kolben gegossen. Die Kolben werden im Autoklav bei etwa 1 kg/cm² Druck 15 Minuten lang sterilisiert. Danach wird zu jedem |. Kolben 1 ml einer getrennt sterilisierten 12%igen Harnstofflösung gegeben, wonach die Einimpfung der Anzuchtkultur vorgenommen wird.
Die Züchtung wird unter aerobem Schütteln bei 3O⁰C durchgeführt.

Die Züchtung dauert 48 Stunden, dann wird dem - Züchtungsmedium Hypoxanthin in einer Menge von 5 mg/ml zugegeben. Nach weiteren 48 Stunden Kulturzeit waren in der Fermentationsflüssigkeit 12,7 mg 5'-Inosinsäure pro Milliliter und 118,0 μg FAD pro Milliliter produziert und angereichert worden.

11 der" entstandenen Kulturflüssigkeit wird filtriert und die Mikroorganismen daraus entfernt. Das Filtrat wird auf pH = 8,0 eingestellt. Es wird dann in eine Austauschersäule übergeführt, welche mit 200 ml Diaion SA 21A, einem stark basischen Ionenaustauscherharz, gefüllt ist, das mit ausreichend Salzsäure behandelt und mit Wasser bis zur-Neutralität gewaschen wurde. Nach Waschen der Säule mit Wasser wird die Trennung erreicht mit 11 einer wäßrigen Lösung die 0,02 η an Salzsäure und 1 m an Natriumchlorid ist. Dadurch werden die 5'-Inosinsäure und Flavinmononucleotid vollständig von der Säule entfernt. Das Harz wird dann mit einer wäßrigen Lösung von 0,02 η Salzsäure und 1 m Natriumchlorid behandelt, und etwa 500 ml nur FAD enthaltender Ausflußlösung werden gewonnen. Diese Lösung enthält 82,0 mg FAD. . '

Die Ausflußlösung mit dem FAD wird mit Ammoniumsulfat· gesättigt und mit Phenol extrahiert. Der phenolischen Lösung wird eine ausreichende Menge Äthyläther zugefügt. Sodann wird mit Wasser rückextrahiert. Die gewonnene wäßrige Lösung wird bei 50° C auf etwa 10 ml konzentriert. Man fügt eine ausreichende Menge Äthanol hinzu und läßt die Lösung stehen. Das ausgefällte FAD wird mittels einer Zentrifuge abgetrennt. Das erhaltene FAD wird getrocknet und seine Aktivität mit einer Apo-(D)-Aminosäureoxidase gemessen. Gewonnen werden 61,7 mg FAD mit einer Reinheit von 82%· Dieses FAD enthält nur zu vernachlässigende Verunreinigungen mit Flavinderivaten. Eine höhere Reinheit des FAD kann leicht durch Wiederholen der oben beschriebenen Ionenaustauschchromatographie erreicht werden.

B e i s ρ i e 1 2

Micrococcus glutamicus ATCC 19185 wird als Saatstamm verwendet. Dieser Mikroorganismus wird

1 Oi/ Ö J 1

24 Stunden lang bei 30° C in einem Anzuchtmedium, enthaltend 29/₀ Glucose, l°/₀ Pepton, 1% Fleischextrakt, 0,3% NaCl und .20 μg Biotin, gezüchtet. 10 Volumprozent dieses Anzuchtsaatmediums werden in das folgende Fermentationsmedium eingeimpft, wobei die angegebenen Mengen pro Liter Wasser zu verstehen sind:

70 g Glucose,

6 g Harnstoff,

1 g KH₂PO₄,

3 g K₂HPO₄,

0,03 g MgSO₄ · 7 H₂O,

0,01 g FeSO₄ · 7 H₂O,

5 g Casaminosäure,
30 μg Biotin,

5 mg Thiaminhydrochlorid,
10 mg Calciumpantothenat,
20 mg Adenin, 20 mg Guanin.

B ei sρi el 6

Als Saatstamm wird Brevibacterium linens ATCC 9175 verwendet, und die Züchtung wird wie im Beispiel 1 beschrieben ausgeführt, außer daß dem Fermentatiönsmedium 2 mg Adenin pro Milliliter an Stelle von Hypoxanthin zugefügt werden. In der Fermentationsflüssigkeit wurden 8,2 mg 5'-Adenylsäure und 59,7 μg FAD pro Milliliter angereichert.

Bei spi el 5

Derselbe Saatstamm, wie im Beispiel 4 beschrieben, wird unter den gleichen Bedingungen und in den gleichen Medien wie im Beispiel 1 gezüchtet, außer daß an Stelle von Hypoxanthin dem Kulturmedium 1 mg Guanin pro Milliliter zugegeben werden. Nach 96 Stunden kontinuierlicher Züchtung waren in der Kulturflüssigkeit 5,2 mg 5'-Guanylsäure pro Milliliter und 82,3 μg FAD pro Milliliter angereichert.

Beispiel 7

Micrococcus freudenreichii ATCC 8459 wird als Saatstamm verwendet und die Züchtung unter den gleichen Bedingungen und in den gleichen Medien wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Hypoxanthin wird dem Kulturmedium in der Menge von 2 mg/ml zugegeben. Nach 96 Stunden Kulturzeit waren in der Fermentationsflüssigkeit 9,7 mg 5'-Inosin-

ao säure pro Milliliter und 98,3 μg FAD pro Milliliter angereichert.

Die Menge von 6 g Harnstoff pro Liter Kulturmedium wird als 40°/₀ige wäßrige Lösung, die getrennt hergestellt und sterilisiert wurde, zugefügt. Der pH" der Lösung wird vor der Sterilisation auf 7,5 eingestellt.

. Das Fermentationsmedium wird zu 30-ml-Anteilen in einzelne 250-ml-Kolben konischer Form gegossen.

Die Züchtung wird unter aerobem Schütteln bei 30°C durchgeführt. Nach 96 Stunden Kulturzeit werden in der Fermentationsfiüssigkeit 10,7 mg 5'-Inosinsäure pro Milliliter und 113,7 [ig FAD pro Milliliter gefunden. Diese können aus dieser wie im Beispiel 1 beschrieben abgetrennt werden.

' B e i s ρ i e 1 3

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 wird als Saatstamm verwendet. Die Züchtung wird 110 Stunden lang unter den gleichen Bedingungen und im gleichen Medium, wie im Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt. Als Ergebnis fanden sich in der Kulturflüssigkeit 11,2 mg 5'-Inosinsäure pro Milliliter und 121,2 μg FAD pro Milliliter.

·..; B e i sp i el 4

' Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 wird als Saatstamm verwendet, und die Züchtung wird wie im Beispiel 1 beschrieben ausgeführt, außer daß dem Kulturmedium an Stelle von Hypoxanthin 1 mg Adenin pro Milliliter zugegeben werden. Die Züchtung wird 96 Stunden lang ununterbrochen durchgeführt. Als Ergebnis fanden sich in der Fermentationsflüssigkeit 8,3 mg 5'₇Adenylsäure pro Milliliter und 101,2 μg FAD pro Milliliter. '

Beispiel 8

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 wird als Saatstamm verwendet und die Züchtung wie im Beispiel 1 beschrieben ausgeführt. Der Fermentationslösung wird eine Menge von 2 mg Xanthin pro Milliliter zugesetzt. Nach Beendigung der Züchtung fanden sich 7,2 mg 5'-Xanthylsäure pro Milliliter und 62,4 μg FAD pro Milliliter der Kulturflüssigkeit.

Beispiel 9

. Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 15592 wird als Saatstamm verwendet, und die Züchtung wird wie im Beispiel 1 beschrieben ausgeführt. Der Kulturflüssigkeit wird 1 mg Hypoxanthin pro Milliliter zugesetzt. Nach Beendigung der Züchtung werden pro Milliliter der Fermentationsflüssigkeit 8,9 mg 5'-Inosinsäure und 53,5 μg FAD gefunden.
♦ * ■ ■ ·

Beispiel 10 '

Flavobacterium arborescens ATCC 4358 wird als Saatstamm verwendet und die Züchtung unter den gleichen Bedingungen und in den gleichen Medien wie im Beispiel 1 beschrieben ausgeführt. Als Ergebnis sind pro Milliliter der Fermentationsfiüssigkeit 7,2 rag '5'-Inosinsäure und 61,3 μ£ FAD angereichert.

Beispiel 11

Flavobacterium devorans ATCC 10829 wird als Saatstamm verwendet. Die Züchtung wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt. Als Ergebnis finden sich pro Milliliter der Fermentationsflüssigkeit 8,9 mg 5'-Inosinsäufe und 98,3 μg FAD angereichert. "

Beispiel 12

Die zehn in Tabelle 2 aufgeführten Mikroorganismenstämme wurden als Einsaat-Mikroorganismen verwendet und wie im Beispiel 1 gezüchtet. 10 Volumprozent der erhaltenen Einsaatkulturen wurden in die einzelnen Fermentationsrnedieri eingeimpft, welche 10°/₀ Glucose, 0,6 °/o Harnstoff, 1% K₂HPO₄, 1%

KH₂PO₄, l°/o MgSO₄, 0,01 % CaCl₂ und 0,02 °/₀ Hefeextrakt enthielten, und zwar bei einem pH-Wert von 8,0. Nach 36stündiger Züchtung wurde zum Medium Adenin gegeben, um die Adeninkonzentration auf

5 mg/ml zu bringen. Danach wurde die Züchtung weitere 48 Stunden fortgesetzt, wodurch Adenylsäure und FAD gebildet wurden und in der Fermentationsflüssigkeit sich ansammelten.

Tabelle 2	Adenyl säure*) mg/ml	FAD y/ml
Verwendete Stämme	8,9 5,2 . 6,7 10,6 10,2 8,7 7,8 6,3 8,1 5,8	102 78 91 107 103 92 96 80 115 90
Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871 ATCC 15 187 Brevibacterium helvolum ATCC 11822 Micrococcus glutamicus ATCC 14305 '...- ATCC 14306 ATCC 14619 ·. ATCC 14620 Flavobacterium harrisoni ATCC 14589 Flavobacterium flavescens" ATCC 14231 Flavobacterium sulfureum ATCC 14232

*) Das daneben produzierte Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat sind inbegriffen und in Adenylsäure umgerechnet.

309 625/164

Claims

Patentanspruch:

Verwendung von durch Züchten von 5'-Purinnukleotid bildenden Mikroorganismen der Gattung Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium und Flavobacterium bei hierfür üblichen Bedingungen erhaltenen Fermentationsflüssigkeiten zur Gewinnung von Flavinadenindinukleotid.