DE1277856B

DE1277856B - Verfahren zur Herstellung von Uridylsaeure

Info

Publication number: DE1277856B
Application number: DEK54603A
Authority: DE
Inventors: Shukuo Kinoshita; Kiyoshi Nakayama; Zenroku Sato; Haruo Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1963-10-30
Filing date: 1964-11-24
Publication date: 1968-09-19
Also published as: DE1642706B2; FR1459747A; DE1257148B; US3296089A; US3296088A; DE1261858B; BE655014A; GB1065380A; GB1079529A; CH459230A; ES308770A1; DE1642706A1; BR6463844D0; NL6412534A; FR1440633A; GB1080426A; US3313710A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND DEUTSCHES WTTWt PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

Deutsche KI.:

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

C07d

A 231

12 ρ-7/01
53 k-3/01

P 12 77 856.2-44 (K 54603)

24. November 1964

19. September 1968

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Uridylsäure, d. h. Uridin-5'-monophosphat, durch aerobe Züchtung eines Bakterienstammes ATCC Nr. 6871, 6872, 15 750 oder 15 751 von Brevibacterium ammoniagenes in einem Fermentationsmedium, das außer den üblichen Bestandteilen Uracil enthält.

Die erfindungsgemäß hergestellte Uridylsäure spielt als Bestandteil von Nucleinsäuren eine wichtige Rolle und ist weiterhin als Zusatzstoff für Nahrungsmittel geeignet, um deren Aroma bzw. Geschmack zu verbessern. Uridylsäure wurde bisher aus natürlichen Substanzen, Nucleoproteiden und Nucleinsäuren, ζ. B. durch enzymatische Hydrolyse von Hefenucleinsäure, im Gemisch mit verschiedenartigen Nucleotiden und Nucleosiden erhalten. Die Abtrennung der Uridylsäure erforderte aber einen erheblichen Aufwand. Die Gewinnung von Nucleotiden mittels Züchtung von Mikroorganismen wird in den bekanntgemachten Unterlagen des belgischen Patents 621122 beschrieben. Bei diesem Verfahren entsteht unter anderem auch 5'-Uridylsäure in kleineren Mengen (unter 0,5 g/l) im Gemisch neben Guanyl-, Adenyl-, Cytidyl- und Xanthylsäure im Züchtungsmedium. Demgegenüber ist es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung spezieller Bakterienstämme der Gattung Brevibacterium ammoniagenes sowie eines Uracil enthaltenden Züchtungsmediums möglich, selektiv 5'-Uridylsäure herzustellen, die sich in überraschend hohen Mengen (bis zu etwa 3,5 g/l) im Fermentationsmedium anreichert.

Als Nährmedium für das erfindungsgemäße Fermentationsverfahren ist jedes Medium geeignet, das eine Kohlenstoffquelle, z. B. Kohlehydrate (Glucose, Stärkehydrolyseprodukte und Melassen), eine Stickstoffquelle (Harnstoff, Ammoniumchlorid und Ammoniumnitrat), anorganische Substanzen (Kaliumphosphate, Magnesiumsulfat und Calciumchlorid) und stickstoffhaltige Naturprodukte (Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton und Fischmehl) in geeignetem Mengenverhältnis enthält. Derartige Nährmedien sind für die Bakterienzüchtung bekannt.

Erfindungsgemäß kann das Uracil vom Anfang der Fermentation an in dem Medium zugegen sein oder kann während des Verlaufs der Züchtung zu dem Fermentationsmedium gegeben werden. Wenn es während des Verlaufs der Züchtung zugesetzt wird, kann seine Zugabe auf einmal oder in mehreren Anteilen erfolgen. (Die Vorzüchtung der Mikroorganismen ohne Zusatz des Uracils wird hier nicht beansprucht.)

Verfahren zur Herstellung von Uridylsäure

Anmelder:

Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokio

Vertreter:

Dr.-Ing. H. Ruschke

und Dipl.-Ing. H. Agular, Patentanwälte,

1000 Berlin 33, Auguste-Viktoria-Str. 65

Als Erfinder benannt:
Shukuo Kinoshita, Tokio;
Kiyoshi Nakayama, Sagamihara-shi;
Zenroku Sato, Machida-Shi;
Haruo Tanaka, Tokio (Japan)

Beanspruchte Priorität:

Japan vom 27. November 1963 (63 230)

Die Menge des erfindungsgemäß verwendeten und dem Medium zugesetzten Uracils kann innerhalb eines breiten Bereichs variieren. Sie hängt etwas von dem speziell verwendeten Bakterienstamm ab. Im allgemeinen wird die verwendete Menge etwa 0,1 bis 10 g/l Medium betragen. Vorzugsweise liegt die Menge innerhalb des Bereichs von 1 bis 5 g/l Fermentationsmedium.

Die Fermentation wird z. B. in einer Schüttelkultur oder in einer Submerskultur unter Schütteln und Belüften durchgeführt. Sie wird bei einer Temperatur von 20 bis 40° C und bei einem pH-Wert von 5,5 bis 9,0 vorgenommen. Im allgemeinen haben sich nach einer Züchtungsdauer von 2 bis 8 Tagen bemerkenswerte Mengen von Uridylsäure gebildet und in dem Medium und in den Zellen angesammelt.
Die Uridylsäure wird nach der Beendigung der Züchtung mit Hilfe an sich bekannter Verfahren isoliert z. B. durch Behandlung mit Ionenaustauscherharzen, durch Adsorption, durch Fällung oder durch Extraktion.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Prozentangaben beziehen sich — wenn nicht anders angegeben — auf das Gewicht.

809 617/561

1 278 856

Beispiel 1

Zunächst wird eine Impfkultur hergestellt, indem Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 in einem Medium, das 2% Glucose, 1% Pepton, 1% Hefeextrakt, 0,3% Kochsalz und 30 μξ/Ι Biotin enthält, 24 Stunden gezüchtet wird. Das Fermentationsmedium wird mit 10 Volumprozent dieser Impfkultur beimpft. Beide Medien werden verwendet, nachdem 20-cm³-Anteile in 250-cm³-Erlenmeyerkolben gegeben und sterilisiert worden sind. Die Fermentation wird in einer Schüttelkultur bei 30° C durchgeführt. Das Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Glucose 100 g

Harnstoff 6 g

Kaliumbiphosphat 10 g

Dikaliumphosphat 10 g

Magnesiumsulfat-Heptahydrat 10 g

Calciumchlorid-Dihydrat 0,1 g

Biotin 30 pg

Hefeextrakt 10 g

Uracil 2 g

Die obigen Bestandteile werden in Wasser unter Auffüllen auf 11 gelöst. Die Lösung wird nach dem Einstellen auf pH 8,0, was mit Hilfe von Natronlauge erfolgt, in den obengenannten Volumanteilen in die Kolben gegeben und in einem Autoklav bei einem Druck von 1 kg/cm² 10 Minuten sterilisiert.

Nach 72stündiger Züchtung haben sich 2,60 mg/cm³ Uridylsäure gebildet und in dem Fermentationsmedium angesammelt.

Die in dem Fermentationsmedium enthaltene Uridylsäure wird durch Behandlung mit Ionenaustauscherharzen in der folgenden Weise isoliert:

Das durch Entfernen der Zellen aus der Fermentationsbrühe erhaltene Filtrat (1,21) wird mit Aktivkohle behandelt, und die auf der Aktivkohle adsorbierte Uridylsäure wird mit Hufe von 5O°/oigem wäßrigem Äthanol, das 3% Ammoniak enthält, eluiert. Das im Eluat enthaltene Ammoniak wird durch Abdampfen unter Vakuum entfernt. Die erhaltene Lösung wird durch eine Säule gegeben, die mit dem unter dem Handelsnamen »Dowex 1 ■ 2« (Chloridform) bekannten stark basischen Polystyrol-Anionenaustauscherharz beschickt ist. Die Harzsäule, die die Uridylsäure adsorbiert enthält, wird mit Wasser gewaschen und sodann in der angegebenen Reihenfolge nacheinander mit 0,01 n-, 0,05 n-, 0,1 n- und 0,5 η-Salzsäure eluiert. Die Eluatfraktionen, die die Uridylsäure enthalten, werden eingeengt und nach Zugabe von Äthanol gekühlt. Die abgeschiedene Uridylsäure wird durch Abzentifugieren isoliert und getrocknet. Ausbeute 1,1 g.

Beispiel 2

Es wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 1

gezüchtet, nur wird das Uracil nicht schon zu Beginn der Fermentation zugegeben, sondern nach einer Züchtungsdauer von 48 Stünden in einer Menge von mg/cm³ Fermentationsmedium. Nach weiterem Züchten während einer Zeitdauer von 24 Stunden haben sich 2,81 mg/cm³ Uridylsäure gebildet und in

ίο dem Fermentationsmedium angesammelt.

Beispiel 3

Es wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 2

gezüchtet, nur wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6871 verwendet, wobei sich 0,53 mg/cm³ Uridylsäure bilden und in dem Fermentationsmedium ansammeln.

Beispiel 4

Es wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 2 gezüchtet, nur wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 15 750 verwendet, wobei sich 3,20 mg/cm³ Uridylsäure bilden und in dem Fermentationsmedium ansammeln.

Beispiel 5

Es wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 2

gezüchtet, nur wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 15 751 verwendet, wobei sich 3,40 mg/cm³ Uridylsäure bilden und in dem Fermentationsmedium ansammeln.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Uridylsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Bakterienstamm ATCC Nr, 6871, 6872, 15 750 oder 15751 von Brevibacterium ammoniagenes in einem Fermentationsmedium aerob züchtet, das außer den üblichen Bestandteilen Uracil enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung in einem Fermentationsmedium, das Uracil in einer Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 10 g/l Medium enthält, bei einer Temperatur von 20 bis 40° C und bei einem pH-Wert von 5,5 bis 9,0 erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation in einer Submerskultur unter Belüften und Schütteln durchführt.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Ausgelegte Unterlagen des belgischen Patents Nr. 621122.