DE1257148B

DE1257148B - Verfahren zur Herstellung von Adenosindiphosphat und -triphosphat

Info

Publication number: DE1257148B
Application number: DEK54362A
Authority: DE
Inventors: Shukuo Kinoshita; Takashi Nara; Zenroku Sato; Haruo Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1963-10-30
Filing date: 1964-10-27
Publication date: 1967-12-28
Also published as: DE1261858B; GB1079529A; GB1065380A; US3296089A; US3296088A; BR6463844D0; DE1277856B; BE655014A; CH459230A; FR1459747A; US3313710A; GB1080426A; DE1642706A1; DE1642706B2; NL6412534A; ES308770A1; FR1440633A

Description

BUNDESREPUBLIKDEUTSCHLAND DEUTSCHES 4OWm& PATENTAMT

PATENTSCHRIFT

Int. Cl.:

Deutsche Kl.:

Nummer:

Aktenzeichen:

Anmeldetag:

Auslegetag:

Ausgabetag:

C07d

A61k

12 ρ-7/10
30h-2/36

1 257 148
K54362IVd/12p

27. Oktober 1964

28. Dezember 1967
11. Juli 1968

Patentschrift stimmt mit der Auslegeschrift überein

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Adenosindiphosphat (im folgenden als ADP bezeichnet) und Adenosintriphosphat (im folgenden als ATP bezeichnet) durch fermentatives Züchten bestimmter Mikroorganismen unter bestimmten Bedingungen in Gegenwart von Adenin oder Adenosin.

Ziel der Erfindung ist es, ATP und ADP, die wichtige Rollen im Stoffwechsel spielen und als biochemische Reagenzien, als Reagenzien mit energiereichen Phosphatbindungen und für Arzneimittel von Bedeutung sind, wirtschaftlich und mit guten Ausbeuten herzustellen.

Bisher wurden ATP und ADP durch Isolierung aus Extrakten von Organismen oder auf enzymatische Weise durch Züchten einer großen Menge Hefe in einem Medium hergestellt, das Adenosin und Phosphat enthält (vgl. Ostern und Mitarbeiter, »Hoppe-Seylers Zeitschrift für physiologische Chemie«, Bd. 251, 1938, S. 258); Die Ausbeuten bei diesen Verfahren sind jedoch gering, und das enzymatische Verfahren hat den Nachteil, daß es eine große Menge Hefe erfordert. Es gab daher bisher kein wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung von ATP und ADP.. ...

Es wurde bereits vorgeschlagen, Brevibacterium ammoniagenes des Stammes ATCC Nr. 6871 oder *5 6872 in einem Nährmedium aerob in Gegenwart von Adenin oder Adenosin zu züchten. Hierbei wird hauptsächlich 5'-Ädenylsäure gebildet.

Gemäß der Erfindung wird die Züchtung bei etwa 20 bis 4O⁰C so durchgeführt, daß das Nährmedium mehr als 0,4 Gewichtsprozent eines anorganischen Phosphats, berechnet als Phosphationen, enthält und daß nach der Zugabe des Adenins bzw. Adenosins das Kulturmedium bei einem pH-Wert von etwa 5,5 bis 7,5 gehalten wird, und anschließend das entstandene ADP und ATP in bekannter Weise isoliert wird.

Als Kulturmedium ist jedes Medium geeignet, das eine Kohlenstoffquelle, z.B. Kohlehydrate (Glucose, Hydrolyseprodukte von Stärke oder Melassen usw.), eine Stickstoffquelle (Harnstoff, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat usw.), anorganische Salze (Kaliumphosphate, Magnesiumsulfat, Calciumchlorid usw.) und stickstoffhaltige Naturprodukte (Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Caseinaminosäuren, Fischextrakte usw.) in geeigneten Mengenverhältnissen enthält. Die Zugabe von Aminosäuren und Vitaminen, wie Biotin, Vitamin B₁, Pantothensäure oder von Substanzen, die die gleiche physiologische Wirkung haben (z.B. ß-Alanin und Coenzym A im Falle der Pantothensäure), ist im Hinblick auf die Stabilisierung des Wachstums der Bakterien Verfahren zur Herstellung

von Adenosindiphosphat und -triphosphat

Patentiert für:

Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd., Tokio

Vertreter:

Dr.-Ing. H. Ruschke und Dipl.-Ing. H. Agular,

Patentanwälte, München 27, Pienzenauer Str. 2

Als Erfinder benannt:

Shukuo Kinoshita, Tokio;

Kiyoshi Nakayama, Sagamihara-shi;

Takashi Nara, Tokio;

Zenroku Sato, Machida-shi;

Haruo Tanaka, Tokio (Japan)

Beanspruchte Priorität:
Japan vom 30. Oktober 1963 (57 520),
vom 27. November 1963 (63 229)

und der Fermentation sowie zur Erzielung der gewünschten Produkte in guter Ausbeute vorteilhaft.

Die besten Ergebnisse werden mit einer Phosphationen-Konzentration zwischen etwa 0,4 Gewichtsprozent und etwa 1,6 Gewichtsprozent erhalten. Glucose und andere Nährstoffe können während der Fermentation je nach Bedarf nachgegeben werden. Die Menge an Adenin oder Adenosin berechnet als Adenin beträgt vorzugsweise etwa 1 bis 10 mg/ccm Nährmedium.

Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, wie z.B. in einer Schüttelkultur oder einer Submerskultur unter Rühren und Belüften. Die Züchtungsdauer beträgt etwa 36 bis 120 Stunden. Die Einhaltung des erforderlichen pH-Wertes erfolgt durch Zugabe eines geeigneten Neutralisationsmittels, wie wäßriger Natronlauge. Das gebildete ATP und/ oder ADP wird nach Beendigung der Züchtung mit Hilfe einer bekannten Ionenaustauscherharzbehandlung, Adsorption, Fällung oder Extraktion isoliert.

Die folgenden Beispiele erläutern bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Prozentangaben beziehen sich, wenn nicht anders angegeben, auf das Gewicht.

809 586/375

Claims

3 4

Beispiel 1 linen Natriumsalze von ATP bzw. ADP erhalten

a) Bereitung des Ausgangsmediums werden.

Das Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung: 5 Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6871 wird

_inn in gleicher Weise wie im Beispiel 1 gezüchtet, wobei

■■■■■ Λ Ο«^{3 m}8 ATP/ccm Kulturflüssigkeit und 0,2 mg ADP/

Monokaliumphosphat 10 g ecm gebildet werden.

Dikaliumphosphat 10 g B e i s ρ i e 1 3

Magnesiumsulfat (Heptahydrat) .... 10 g ¹⁰ _a) Brevibacterium ammoniagenes, ATCC Nr. 6872

Biotin ■■■'■■■■■ 3Q wird während 48 Stunden in gleicher Weise wie

_r. ., /VV'-JVrVL''J "A ■ ni„ ™ Beispiel la) in einem Fermentätionsmedium

Calciumchlorid (Dihydrat) 0,1g .. ... , . . r, . -, „ ™.

^{v J} ' gezüchtet, das durch Zugabe von 3 mg/1 Thiamm

Die obigen Substanzen wurden in Wasser unter 15 und 3 mg/1 Calciumpantothenat zu einem Me-

Auffüllen auf 11 gelöst, und der pH-Wert des Fermen- dium gleicher Zusammensetzung wie im Beispiel 1

tationsmediums wird vor der Sterilisation mit Natron- erhalten worden ist.

lauge auf 8,0 eingestellt. 20-ccm-Anteile des Fermen- _b) Hernach wird Adenin zugegeben, und nach

tationsmediums werden in 250-ccm-Erlenmeyerkolben ₄₈ stunden weiterem Züchten haben sich 2,8 mg/

gegeben und nach lOminütiger Sterilisation in einem ao _{ccm Αχρ und} ^_{1 mg/ccm ADp neben einer}

Autoklav unter einem Druck von 1 kg/cm* verwendet. geringen Menge 5'-Adenylsäure (AMP) gebildet,

Außerdem wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC _{wenn der pH}-Wert nach der Zugabe des Adenins

•Nr. 6872 in einem Medium, das 2% Glucose, 1% zwischen 6,5 und 5,8 gehalten worden ist.

Pepton, 1% Hefeextrakt, 0,3% Natriumchlorid und . 30 μg/l Biotin enthält, 24 Stunden bei 30⁰C gezüchtet, as

Das obige Fermentätionsmedium wird mit 10 Vo- Patentansprüche:
lumprozent der so erhaltenen Kultur beimpft und

72 Stunden bei 3O⁰C gezüchtet. 1. Verfahren zur Herstellung von Adenosin-

u\ c-c j so TJ * 11 λ cjjii diphosphat und -triphosphat durch aerobe Züch-

b) Erfindungsgemäße Herstellung der Endprodukte _3o ^ _v^_n Brevibacterium ammoniagenes des Stam-

Zu dem nach a) erhaltenen beimpften und bebrüte- mes ATCC Nr. 6871 oder 6872 in einem Nährten Fermentationsmedium werden 2 mg Adenin je medium in Gegenwart von Adenin oder Adenosin Kubikzentimeter der Fermentationsflüssigkeit zugege- bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40⁰C, daben. Nach 24stündigem Züchten haben sich in der durch gekennzeichnet, daß das Nähr-Kulturflüssigkeit 2,98 mg ATP/ccm und 0,85 mg 35 medium mehr als 0,4 Gewichtsprozent eines anor-ADP/ccm (in beiden Fällen beziehen sich die Ge- ganischen Phosphats, berechnet als Phosphationen, wichtsangaben auf die freien Säuren) gebildet. Nach enthält und daß nach der Zugabe des Adenins bzw. der Zugabe des Adenins wird der pH-Wert mit Hilfe Adenosins das Kulturmedium bei einem pH-Wert von Natronlauge bei etwa 5,5 bis 7,5 gehalten; er von etwa 5,5 bis 7,5 gehalten wird und anschließend beträgt am Ende der Züchtung 5,8. 40 das entstandene Adenosindiphosphat und -tri-

Das nach Filtrieren der Fermentationsflüssigkeit phosphat in bekannter Weise isoliert wird,

erhaltene Filtrat wird durch eine Säule eines stark 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn-

basischen Anionenaustauscherharzes (z.B. des unter zeichnet, daß das Nährmedium das Adenin bzw.

dem Handelsnamen »Dowex 1 (X2)« bekannten Aus- Adenosin (berechnet als Adenin) in einer Menge

tauschers in der Chloridform) geleitet, und ATP und 45 von etwa 1 bis 10 mg/ccm Nährmedium enthält.

ADP werden durch Eluieren mit verdünnter Salzsäure —

erhalten. Diese Fraktionen werden mit Natrium- In Betracht gezogene Druckschriften:

hydroxyd neutralisiert, mit Aktivkohlepulver behan- Bekanntgemachte Unterlagen des belgischen Pa-

delt, eingeengt und sodann gekühlt, wobei die kristal- tents Nr. 621122.

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