DE1695327B2 - Verfahren zur fermentativen herstellung von nikotinamidadenindinukleotid - Google Patents

Verfahren zur fermentativen herstellung von nikotinamidadenindinukleotid

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DE1695327B2 DE1967K0063053 DEK0063053A DE1695327B2 DE 1695327 B2 DE1695327 B2 DE 1695327B2 DE 1967K0063053 DE1967K0063053 DE 1967K0063053 DE K0063053 A DEK0063053 A DE K0063053A DE 1695327 B2 DE1695327 B2 DE 1695327B2
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Description

35
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Nikotinamidadenindinukleotid.
Nikotinamidadenindinukleotid, auch bekannt unter der Bezeichnung Coenzym I, Dehydrogenase-Coenzym I, Diphosphopyridinnukleotid oder Cozymase, hat die folgende Strukturformel
45
NH,
CONH,
HC
HCOH
HCOH
HC
OH
55
CH2-O-P 0-P-O-CH2
Il Il ο ο
Nikotinamidadenindinukleotid spielt eine wichtige Rolle bei biochemischen Reaktionen, z. B. bei der alkoholischen Gärung von Glukose. Es kommt in Hefen, Pilzen und in Bakterien vor. Die Extraktion aus Mikroorganismenzellen und Reinigung des dabei erhaltenen Rohmaterials eignet sich jedoch nicht für die großtechnische iHejJsteHung von Nikotinamidadenindinukleotid. >■■ ""'■■'
In der japanischen Patentanmeldung 29 811/1964 ist ein Verfahren zur Herstellung von Nikotinamidadenindinukleotid auf fermentativem Wege unter Verwendung von Hefe beschrieben. Bei diesem Verfahren werden nur verhältnismäßig geringe Mengen an Nikotinamidadenindinukleotid in den Kulturlösungen angereichert.
In der französischen Patentschrift 14 29 86? ist ein Verfahren zur Herstellung von Nikotinamidadenindinukleotid auf fermentativem Wege durch Züchten von Mikroorganismen in einem Nährmedium, das Adenin und/oder Nikotinamid enthält, beschrieben. Dieses Verfahren liefert jedoch das gewünschte Nikotinamidadenindinukleotid ebenfalls nur in verhältnismäßig geringen Ausbeuten.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Nikotinamidadenindinukleotid anzugeben, mit dessen Hilfe es möglich ist, die gewünschte Verbindung auf technisch einfache und wirksame Weise in hohen Ausbeuten herzustellen.
Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe dadurch gelöst werden kann, daß man bestimmte Mikroorganis men in einem Nährmedium züchtet, das neben Adenin und/oder Nikotinamid noch ein bestimmtes oberflä chenaktives Mittel enthält. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Nikotinamidadenindinukleotid durch Kultivierung eines Mikroorganismus in einem Adenin und/oder Nikotinamid enthaltenden wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedinguiigen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß als Mikroorganismus Corynebacteriumsp. ATCC 21084, Arthrobacter sp. AtCC 21085 oder Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 verwendet wird und daß die Kultivierung bei einer Temperatur von etwa 20 bis 400C und bei einem pH-Wert von etwa 5 bis 9 in einem Nährmedium durchgeführt wird, das ein oberflächenaktives Mittel aus der Gruppe der Polyoxyäthylensorbitanfettsäureester mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Poiyoxyäthylenalkylamine mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Polyoxyäthylenalkyläther mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Polyoxyäthylenalkylallyläther mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Alkyltrimethylammoniumhalogenide mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Alkylbenzyldimethylammoniumhalogenide mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Alkylpyridiniumhalogenide mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Alkylbetaine mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der höheren Fettsäureester und höheren Fettsäureamide enthält.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in dem Kulturmedium angereicherte Nikotinamidadenindinukleotid läßt sich in Anwesenheit eines oberflächenaktiven Mittels leicht abtrennen, weil es darin extra-zellulär angesammelt wird, so daß sich die früher erforderliche mechanische und chemische Aufspaltung der Zellwände sowie die Denaturierung und Zerstörung derselben erübrigt. Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt somit gegenüber den bisher bekannten Verfahren im Hinblick auf eine großtechnische Verwertung entscheidende Vorteile.
Es wird angenommen, daß die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mikroorganismen bei Zugabe der oberflächenaktiven Mittel zu dem Nährmedium bestimmte Produkte absondern und extra-zellulär erzeugen, die für die Bildung von Nikotinamidadenindinukleotid erforderlich sind.
Gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung wird die Kultivierung in einem Nährmedium durchgeführt, welches das oberflächenaktive Mittel in einer Menge von etwa 0.01 bis 0,5 Gew.-% enthält
Die erfindungsgemäß verwendbaren oberflächenaktiven Mittel, die einzeln oder in Form von Kombinationen auf einmal oder in Abständen zugesetzt werden können, können entweder gleich zu Beginn der Kultivierung oder zu irgendeinem beliebigen Zeitpunkt während der Kultivierung zugegeben werden. Ihre Zugabemenge ist abhängig von dem jeweils verwendeten oberflächenaktiven Mittel, der Zugabezeit und dem jeweils verwendeten Mikroorganismus. Sie liegt jedoch im allgemeinen innerhalb des Bereiches von etwa 0,01 bis etwa 0,5 Gew.-%.
Bei dem erfindungsgemäß verwendeten Fermentationsmedium kann es sich entweder um ein synthetisches oder um ein natürliches Nährmedium handeln, welches die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus enthält. Solche Fermentationsmedien enthalten eine Kohlenstoffquelle, Kohlehydrate, eine Stickstoffquelle und anorganische Verbindungen, die von dem verwendeten Mikroorganismus in bestimmten Mengen verbraucht werden.
Beispiele für verwendbare Kohlehydrate sind Glukose, Fruktose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate und Melasse. Es können auch geringe Mengen anderer Kohlenstoffquellen, wie Glycerin, Mannit, Sorbit und organische Säuren, in dem Fermentationsroedium zusammen mit den Kohlehydraten verwendet werden.
Beispiele für verwendbare anorganische Verbindungen sind Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisensulfat oder andere Eisensalze, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid und Calciumchlorid.
Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Sa'zen oder Verbindungen wie Harnstoff oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und Ammoniumphosphat oder eine oder mehrere Aminosäuren oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, Peptone, Bouillon, Kaseinhydrolysate und Reiskleieextrakt verwendet werden.
Je nach der verwendeten Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle kann es notwendig sein, weitere Nährstoffe dem Nährmedium zuzugeben, z. B. Aminosäuren, wie Asparaginsäure, Threonin, Methionin und/oder Vitamine, wie Biotin,Thiamin und Kobalamin.
Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen, z. B. unter aeroben Schütteln der Kultur oder unter Rühren einer Submerskultur, bei einer Inkubierungstemperatur von etwa 20 bis 4O0C und einem pH-Wert von etwa 5 bis 9 durchgeführt.
Nach Beendigung der Kultivierung kann das Nikotinamidadeninnukleotid auf an sich bekannte Weise, z. B. durch Ionenaustauscherharzbehandlung, Ausfällen mit Metallsalzen, Extraktion, Adsorption oder Chromatographie aus der Kühlflüssigkeit abgetrennt werden.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung. Falls nicht anders angegeben, beziehen sich Hip Prozentaneaben auf das Gewicht.
Beispiel 1
Als lmpfbakterium wurde Corynebacterium sp. ATCC 21084 verwendet. Es wurde 24 Stunden lang bei 30°C in einem Nährmedium der folgenden Zusammensetzung kultiviert: 2% Glucose, 1% Peptone, 1% Hefeextrakt, 0,3% NaCl und 30μg/l Biotin. Die Impfkultur wurde dann in einer Menge von 10 Vol.-% zu einem Fermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung pro Liter Wasser gegeben:
100 g Glukose
6 g Harnstoff
1,0% K2HPO4
1,0% KH2PO4
1,0% MgSO4 - 7H2O
1,0% Bouillon
30 μg Biotin
Der Harnstoff wurde getrennt als 12%ige Lösung sterilisiert. 19-ml-Portionen einer wäßrigen Lösung, welche die anderen Fermentationsmediumskomponenten enthielt, wurden einzeln in Kolben gegossen. Diese Kolben wurden in einem Autoklav 10 Minuten lang bei 1 kg/cm2 sterilisiert. Dann wurde 1 ml der sterilisierten
Harnstofflösung jedem Kolben vor dem Überimpfen der Impfkultur zugegeben.
Die Kombination von Impf- und Fermentationsmedien wurde in 20-ml-Portionen in konische Kolben mit einem Inhalt von jeweils 250 ml gegossen.
Die Kultivierung wurde dann unter aerobem Schütteln bei 30° durchgeführt Nach 24stündiger Kultivierung wurde Polyoxyäthylenstearylamin dem Fermentationsmedium in einer Konzentration von 1 mg/ml zugegeben. Adenin und Nikotinamid wurde dem Medium in einer Konzentration von 2 mg/1 zugesetzt. Die Kultivierung wurde anschließend weitere 96 Stunden lang durchgeführt. Es zeigte sich, daß 5,30mg/nil Nikotinamidadenindinukleotid gebildet worden waren und sich in der Kulturflüssigkeit angereichert hauen. Es wurde auch eine lonenaustauscherbehandlung gewonnen.
Mit dem gleichen Medium und unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben wurde ein Vergleichsversuch durchgeführt, wobei diesmal jedoch kein Polyoxyäthylenstearylamin dem Medium zugesetzt wurde. Die gebildete Menge an Nikotinamidadenindinukleotid betrug 0,8 mg/mg.
Beispiel 2
Es wurde das gleiche Kultivierungsverfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei diesmal jedoch Arthrobacter sp. ATCC 21085 als Mikroorganismus verwendet wurde und Cetyltrimethylammoniumbromid als oberflächenaktives Mittel in einer Konzentration von 1 mg/ml verwendet wurde. Die Menge des in der Kulturflüssigkeit angereicherten Nikotinamidadenindinukleotids betrug 4,7 mg/ml.
Unter den gleichen Bedingungen, jedoch ohne Zugabe von Cetyltrimethylammoniumbromid, wurde eine Vergleichskultivierung durchgeführt. Die Menge an gebildetem Nikotinamidadenindinukleolid betrug dabei nur 0,7 mg/ml.

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von Nikolinamidadenindinukleotid durch Kultivierung eines Mikroorganismus in einem Adenin und/oder Nikotinamid enthaltenden wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Corynebacterium sp. ATCC 21084, Arthrobacter sp. ATCC to 21085 oder Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 verwendet wird und daß die Kultivierung bei einer Temperatur γρη^ etwa 20 bis 40°C und bei einem pjfl*tyeint vom etwa '5 bis.; ft in^ einem Nährmedium durchgeführt wird, das ein oberflächenaktives Mittel aus der Gruppe der Polyoxyäthylensorbitanfettsäureester mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Polyoxyäthylenalkylami.ne mit J 2 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Polyoxyäthylenalkyläther mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Polyoxyäthylenalkylallyläther mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Alkyltrimethylammoniumhalogenide mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Alkylbenzyldimethylammoniumhalogenide mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Alkylpyridiniumhalogenide mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Alkylbetaine mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der höheren Fettsäureester und höheren Fettsäureamide enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultiv ierung in einem Nährmedium durchgeführt wird, welches das oberflächenaktive Mittel in einer Menge von etwa 0,01 bis 0,5 Gew.-% enthält.
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