DE1925952A1

DE1925952A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase

Info

Publication number: DE1925952A1
Application number: DE19691925952
Authority: DE
Inventors: Fumio Kato; Yoshinobu Miyamura; Masao Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1968-06-05
Filing date: 1969-05-21
Publication date: 1969-12-11
Also published as: DE1925952B2; US3627639A; CA940852A; FR2010156A1; DE1925952C3; GB1215786A

Description

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<i ί.

Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Tokyo, Japan

Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase

Verbesserte Ausbeuten an L-Asparaginase werden durch. Kultivierung eines zum Genus Serratia gehörenden Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem -wäßrigen Nährmedium, in dem die Menge an Ammoniakstickstoff auf einen Wert von 10 mg/ml oder weniger geregelt ist, unter Anwendung ziemlich großer Mengen an Kohlenstoff quelle (etwa 1 bis 15 Gew.-$) in dem-Medium erzeugt. Serratia marcescens ist der bevorzugte Mikroorganismus. Die erhaltenen gereinigten L-Asparaginase Präparate haben eine spezifische Aktivität von wenigstens 1500 Einheiten pro mg Protein und zeigen günstige Wirkung gegen Leukämie bei Mäusen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase, insbesondere zur Herstellung von L-Asparaginase mit Antitumorwirksamkeit durch Fermentation. Im speziellen betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase durch Kultivierung L-Asparaginase-erzeugender Mikroorganismen, die zum Genus Serratia gehören, in einem geeigneten Mhrmedium, wobei eine Kontrolle hinsichtlich der Menge an Ammoniakstiekstoff in dem Medium beibehalten wird.

In jüngster Zeit wurde ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase mit Antitumorwirksainkeit durch Kultivierung eines L-Asparaginase-erzeugenden Mikroorganismus, der zum Genus Serratia gehört, in einem flüssigen Kulturmedium als

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Ersatz für das übliche feste KuIturmedium, das bisher verwendet worden war (japanische Patentanmeldung 9116/1968 entsprechend der deutschen Patentanmeldung P 19 04 330,2) entwickelt. Diesem Verfahren haftet jedoch der Nachteil an, daß nur eine geringe Menge an Zellen gebildet wird, da das verwendete Kulturmedium eine relativ geringe Konzentration an Kohlenstoffquelle aufweist.

Daher besteht eine Aufgabe der Erfindung in einem verbesserten Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase, welches die bisherigen liachteile und Unzulänglichkeiten beseitigt.

Eine andere Aufgabe der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase durch Fermentation, das in wirksamer und relativ einfacher Weise durchgeführt werden kann.

Ferner liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase durch Fermentation, das in vorteilhafter Weise in industriellem Maßstab unter Erzielung einer hohen Produktausbeute durchgeführt werden kann.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht in der Zugänglichmachung von L-Asparaginase.

Gemäß der Erfindung wurde gefunden, daß L-Asparaginase mit Antitumorwirksamkeit in großen Mengen durch Fermentation' erzeugt wird, wenn die als Ammonstiekstoff (NH₅-F) vorliegende Stickstoffmenge In dem Kulturmedium unabhängig von der : ■ Konzentration der Kohlenstoffquelle im Medium entsprechend - · geregelt wird. Die Erfindung betrifft also die Herstellung von L-Asparaginase mit Antitumorwirksamkeit durch Kultivierung eines zum Genus Serratia gehörenden Mikroorganismus in

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einem flüssigen Kulturmedium anstelle des in der vorstehend erwähnten Patentanmeldung verwendeten üblichen festen Kulturmediums. Weitere Untersuchungen, die zur vorliegenden Erfindung führten,zeigten, daß die antiturmorwirksamen L-Asparaginasezellen in größeren Ausbeuten erzeugt werden können, wenn eine relativ hohe Konzentration an Kohlenstoffquelle in dem Kulturmedium unter angemessener Regelung der als Ammonstickstoff (ΗΗ,-Ν) vorliegenden Stickstoffmenge verwendet wird.

Ganz allgemein werden, wenn eine relativ hohe Konzentration an Kohlenstoffquelle im Kulturmedium verwendet wird, die anderen Nährstoffe, wie beispielsweise eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und dgl., ebenfalls in einer großen Menge verwendet, um das Wachstum des Mikroorganismus bei optimalen Bedingungen zu halten. In diesem Fall variiert die Stickstoffmenge in Form von Ammonstickstoff im Kulturmedium in Abhängigkeit von der Stickstoffquelle (organische und anorganische Stoffe), die zusammen mit der Kohlenstoffquelle verwendet wird . und dgl. Wenn die Menge an im Medium vorliegender Stickstoffquelle groß ist, ist das Wachstum der Mikroorganismen gut. Wenn jedoch die Kultivierung so ausgeführt wird, daß die Menge an Ammonstickstoff auf einem festen Wert (10 mg/ml oder weniger) gehalten wird, so ist die Bildung der gewünschten ZeJLlen besonders günstig.

Irgendein zum Genus Serratia gehörender Mikroorganismus, der L-Asparaginase erzeugen kann, kann erfindungsgemäß eingesetzt werden. Jedoch sind die zu Serratia marcescens gehörenden Mikroorganismen besonders bevorzugt. Der Mikroorganismus wird in ein Kulturmedium, das eine Konzentration von 1 bis 15 1° an Kohlenstoffquelle (Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Saccharose, Fructose, Glycerin und dgl.) und ferner

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eine geeignete Menge der Stickstoffquelle (einschließlich organischer und anorganischer Materialien), anorganische Salze und andere Nährstoffe enthält, eingeimpft. Anschliessend wird die Kultivierung durchgeführt, indem die Stickstoff menge in Form von Ammonstickstoff in dem Kulturmedium bei einer Konzentration von 10 mg/ml oder weniger und bevorzugt bei 5 mg/ml oder weniger gehalten wird.

Um die beachtliche Wirkung der Erfindung aufzuzeigen, sind die Ergebnisse von Vergleichsversuchen zwischen dem Verfahren der Erfindung und dem der vorstehend erwähnten älteren Patentanmeldung in Tabelle I wiedergegeben. Die aufgeführten analytischen Werte sind die nach beendeter Kultivierung erhaltenen Ergebnisse.

Tabelle	I
Verfahren zur Her-
—.^^^ stellung von
■ L-Asparaginase	Verfahren A
Anal ysen- " —^^^_^
werte "~ ^
(Ammonstickstoff)	Spuren
feuchte Zellen	16 mg/ml
L-Asparaginase-Aktivität	65

Verfahrai 1 Verfahren

spezifische Aktivität der rohen enzymatisehen Plüsoigkeit

9 mg/ml Spuren 65 mg/ml 44 mg/ml

13 Ein- 196 EinEinheiten/ml heiten/ml heiten/ml

18,6 Ein- 1,05 Ein- 27,9 Einheiten/mg heiten/ng heiten/mg

Verfahren A: Kultivierung unter Belüften und Rüliren während 16 Stunden bei 30 ^CC in einem Kulturmedium vom pH-Wert 7,0, das 0,3 jß Glucose, 1,0 % Fleischextrakt, 1,0 # Pepton, 0,5 # natriumchlorid und 0,5 i* Heieextrakt (japanische Patentanmeldung 9116/1968, deutsche Patentanmeldung P 19 04 330.2) enthält.

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Verfahren B: Das gleiche Verfahren wie Verfahren A mit der Ausnahme, daß die Menge an Glucose 4,0 $ beträgt und der pH-Wert mit Ammoniakwasser auf 7,0 Ms 8,5 eingestellt wird (japanische Patentanmeldung 9116/1968, deutsche Patentanmeldung P 19 04 330.2)

Verfahren 0: Kultivierung unter Belüften und Rühren während 36 Stunden bei 30 ⁰G in einem 4,0 % Glucose, 2,0 ft Fleischextrakt, 2,0 # Pepton, 0,5 $> Hefeextrakt und 0,5 i° Natriumchlorid enthaltenden Kulturmedium. Der pH-Wert des Mediums wird mit Natriumhydroxyd auf 7,0 bis 8,5 eingestellt (vorliegende Erfindung).

Wie sich aus !Tabelle I ergibt, wird die Aktivität pro ml der Kulturflüssigkeit im vorliegenden Verfahren um das 3- bis 4-fache gegenüber dem vorher beschriebenen Verfahren gesteigert. Darüberhinaus zeigt die spezifische Aktivität der Kulturflüssigkeit eine Steigerung um das 1,5-fache.

Die Beziehungen zwischen der als Ammonstickstoff in dem Kulturmedium vorliegenden Stickstoff menge und der Antitumorwirksamkeit der L-Asparaginase und deren spezifische Aktivität sind in Tabelle II aufgeführt.

Tabelle II

Stickstoff in Form
von Ammoniak

0,1
mg/ml

0,5 mg/ml

L-Asparaginaseaktivität 194 193 132

EinheL- EMiei- Elnheitsar/ml ten/ml ten/ml

Spezifische Aktivität
der rohen enzymatischen
Flüssigkeit

27 26,5 19,5 L-Eiohei- Einheiten/mg ten/ing

5,0 · mg/ml

54

Einheiten/ml

9,8

Einheiten/mg

10,0 mg/ml

11

0,8

Einheiten/mg

L/&L

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Die erhaltenen L-Asparaginase-Präparate zeigen also eine Anbitumorwirksamkeit, die fähig ist, eine experimentelle Leukämie einer Maus, ähnlich wie im Pail der vorstehend erwähnten Patentanmeldung, vollständig zu heilen.

Sowohl ein synthetisches Kulturmedium als auch ein natürliches Nährmedium ist zur Kultivierung der erfindungsgemäß verwendeten Stämme geeignet, so lange es die wesentlichen Nährstoffe zum Wachstum der verwendeten Stämme enthält. Derartige Nährstoffe sind bekannt und dazu gehören Stoffe, wie beispielsweise eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und dgl., die von den verwendeten Mikroorganismen in geeigneten M_engen gebraucht werden. Als Kohlenstoffquelle seien beispielsweise Kohlehydrate, wie z.B. Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melasse und dgl., oder irgendeine andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie z.B. organische Säuren, beispielsweise Essigsäure, Milchsäure und dgl., genannt. Diese Stoffe können entweder einzeln oder in Gemischen von zwei oder mehreren eingesetzt werden. Als eine Stickstoffquelle können verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen, wie beispielsweise Harnstoff, flüssiges Ammoniak oder Ammoniumsalze, wie beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat und dgl», oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie z.B. Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Caseinhydrolysate, Caseinaminosäure, lösliche Fischsubstanz, Reiskleieextrakt und dgl., verwendet werden. Diese Stoffe können wiederum entweder einzeln oder in Kombinationen von zwei oder mehreren eingesetzt werden. Zu anorganischen Verbindungen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, gehören Magnesiumsulfat, ITatriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Bisen-

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sulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat und dgl. Wachstumsförderade Mittel, wie beispielsweise Biotin, oder Vitamine, z.B. ein Thiamin oder Cobalamin, können ebenso, falls erwünscht oder erforderlich, dem Medium zugesetzt werden.

Die Fermentation oder Kultivierung der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen, wie z.B. aerobes Schütteln der Kultur oder unter Rühren und Belüften einer üubmerskultur bei einer Temperatur von beispielsweise etwa 20 bis 40 ⁰C und einem pH-Wert von beispielsweise etwa 6,0 bis 10,0 durchgeführt. Hach etwa 1- bis 3-tägiger Kultivierung unter diesen Bedingungen haben sich große Mengen L-Asparaginase in der erhaltenen KuIturflüsnigkeit angesammelt.

Nach beendeter Kultivierung kann die !(-Asparaginase durch übliche Mittel, wie beispielsweise Ionenaustauschharzbehandlung, Extraktion mit Lösungsmitteln, Ausfällung, Adsorption, Chromatographie oder dgl., abgetrennt werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindimg, ohne sie au begrenzen. Falls nicht anders angegeben, beziehen sich die in der Anmeldung aufgeführten Prozentangaben auf das Gewi chi pro 1 Wasser.

Beispiel 1

Serratia marcei.-oons? ATCC-60 wird in einem flüssigen ?. ^c/. trooke-

Nähr

ne Bouillon enthaltendenMöedium unter Belüften und Rühren während 7 Stunden bei 30 ^CC kultiviert. Die erhaltene FuI tür flüssigkeit wird al ρ Impfkultur eingesetzt. Diese Impfkuliur wiic* in einen rermentat ioiisbehält er von π 1 Inhalt im Verhältnis von 10 Volumen-^ in 3 1 eines Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung eingeimpft:

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BAD ORIGINAL

4,0 j6 Glucose

2,0 1» Pepton

2,0 i» Fleischextrakt

0,5 # Hefeextrakt

0,5 56 Natriumchlorid

Die Kultivierung wird dann während 36 Stunden hei 30 ⁹C und 400 U.p.m. unter Belüften in einem Ausmaß von 3 1 pro Minute kultiviert. Der pH-Wert des Mediums wird mit Calciumhydroxid auf 7,0 his 8,5 eingestellt. Sie erhaltenen Zellen werden durch einen Zentrifugalseparator abgetrennt, wobei 210 g nasse Zellen erhalten werden·

Die Zellen werden in einer 0,01 m-Trls-Pufferlösung (pH 8,5) suspendiert und mit einem Schalloszillator (10 Eo) während . 10 Minuten behandelt, um die Zellen zu zerstören. Man erhält eine rohe Extraktflüssigkeit mit einer L-Asparaginase-Aktivität von 150 Einheiten/ml und einer spezifischen Aktivität von 25,0 Einheiten pro mg Protein. Diese Extraktfltissigkeit wird einer Behandlung zur Entfernung von Nucleinsäuren mit Mn , der Entfernung von Proteinverunreinigungen durch Erhitzen, fraktionierte Fällung mit Ammonsulfat, Chromatographie mit Diäthylaminoäthyloellulose und Biogelen und dgl. unterworfen, wobei das enzymatische Protein gereinigt wird, und man erhält ein L-Asparaginase-Präparat mit einer spezifischen Aktivität von 1500 Einheiten pro mg Protein in einer Ausbeute von etwa 20 £· Dieses Präparat zeigt eine Antitumorwirksamkeit, die befähigt ist, eine experimentelle Leukämie ntt einer Dosierung von einigen 10 Aig vollständig zu heilen.

Beispiel 2 Serratia marcescens ATCO 19180 wird in der gleichen Weise

wie in Beispiel 1 beschrieben zur Herstellung einer Impfkultur kultiviert. Diese Impfkultur wird in einen Fennentationebehäl-

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BAD ORIGINAL

ter* von 5 1 Inhalt im Verhältnis von 10 Volumen-^ in 3 1 eines Fennentationsmediums der folgenden Zusammensetzung eingeimpft:

8	*	Glucerin
3	*	Pepton
ο,	25 t	Kaliumsulfat
ο,	05 %	Kaiiumpho sphat
ο,	05 #	Dikaliumpho sphat
ο,	05 %	Magnesiumsulfat
10	mg/l	Eisensulfat
10	mg/l	Mangansulfat
10	mg/l	Cadmiumsulfat
10	mg/l	Kupfersulfat
10	mg/l	Zinksulfat

Die Kultivierung wird dann während 60 Stunden "bei 30 ⁰C unter aeroben Bedingungen bei 400 U.p.m· und unter Belüften in einem Ausmaß von 3 1 pro Minute durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums wird mit einer 40 #-igen Natriumhydroxydlösung auf 7,0 bis 8,5 eingestellt. Die erhaltenen Zellen werden durch einen Zentrifugalabscheider abgetrennt,und man erhält 360 g feuchte Zellen. Diese Zellen werden den gleichen Behandlungen,wie in Beispiel 1 beschrieben, zur Reinigung der Enzyme unterzogen, wobei ein Präparat mit einer spezifischen Aktivität von 2000 Einheiten pro mg Protein in einer Ausbeute von etwa 20 $ erhalten wird. Dieses Enzympräparat ist in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 gegenüber Leukämie einer Maus wirksam.

BeisOiel 3

Serratia marcescens KY 4104 wird in der gleichen Weise,wie in Beispiel 1 beschrieben, zur Herstellung einer Impfkultur kultiviert. Diese Impfkultür wird in einen Fermentationebehälter mit 2 KL Inhalt im Verhältnis von 10 Volumen-^ in 1 EL

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'eines !"ermentationsmediums der gleichen Zusammensetzung,wie in Beispiel 2 beschrieben, eingeimpft. Die Kultivierung wird dann bei 30 ⁰C während 60 Stunden unter aerobem Schütteln der Kultur bei 100 U.p.m. und Belüften in einem Ausmaß von 400 1 pro min durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums wird mit ei.. ner 40 $-igen Kaliumhydroxydlösung während der Kultivierung auf 7jO bis 8,5 eingestellt. Die erhaltenen Zellen werden durch einen Zentrifugalabscheider abgetrennt und dabei 130 kg nasse Zellen erhalten.

ψ Die erhaltenen Zellen werden in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt, wobei eine rohe Enzymflüssigkeit mit einer Ir-Asparaginase-Aktivitat von 198 Einheiten/ml und einer spezifischen Aktivität von 27,6 Einheiten je mg Protein erhalten wird. Die rohe Flüssigkeit wird in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 be-schrieben, weiter gereinigt, und man erhält ein Ii-Asparaginase-Präparat mit einer spezifischen Aktvität von 2000 Einheiten pro mg Protein in einer Ausbeute von etwa 25 S^. Dieses Enzympräparat ist gegenüber Leukämie einer Maus, ähnlich wie in Beispiel 1 erörtert, wirksam.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase mit Antitumorwirksamkeit, wobei ein zum Genus Serratia gehörender L-Asparaginase erzeugender Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium kultiviert und die L-Asparaginase aus der erhaltenen Kulturflüssigkeit gewonnen wird, dadurch gekennzeichnet, daß die in dem Medium als Ammonstickstoff vorliegende Stickstoffmenge hei 10 mg/ml oder weniger gehalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Serratia marcescens verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium verwendet, daß 1 bis 15 Gew.-# einer Kohlenstoffquelle enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die in dem Medium vorliegende Menge an Ammons ticks toff auf 5 mg/ml oder weniger gehalten wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Nährmediums mit einem Alkalihydroxyd auf 7,0 bis 8,5 eingestellt wird.

6. Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase mit einer Antitumorwirksamkeit, dadurch gekennzeichnet, daß ein zu Serratia marcescens gehörender L-Asparaginase erzeugender Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das wenigstens eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle enthält, kultiviert wird, die in dem Medium vorliegende Menge an Ammons ticks toff auf 10 mg/ml oder

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weniger gehalten wird und ein L-Asparaginase-Präparat aus der erhaltenen Kulturflüssigkeit gewonnen wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40 ⁰C und einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 10,0 durchgeführt wird.

8p Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Serratia marcescens Al¹CC 60 verwendet wird.

9· Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Serratia marcescens ATCC 19180 verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Serratia marcescens KY 4104 verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein liährmedium verwendet, welches 1 bis 15 Gew.-fo einer Kohlenstoffquelle enthält.

12. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die in dem Medium vorliegende Ammonstickstoffmenge auf 5 mg/ml oder weniger gehalten v/ird.

13· Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der ) pH-Wert des ITährmediums mit einem Alkalihydroxyd auf 7,0 bis 8,5 eingestellt wird.

14. Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase mit einer Antitumorwirksamkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man einen aus Serratia marcescens ATCC 60, Serratia marcescens ATCC 19180 und/oder Serratia marcescens KY 4104 bestehenden Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen wenig-

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stens 1 bis 15 Gew.-$ einer Kohlenstoffquelle und einer Stickstoffquelle enthaltenden Nährmedium kultiviert, die Menge des in dem Medium vorliegenden Ammonstickstoffs auf 5 mg/ml oder weniger hält und ein L-Asparaginase-Präparat aus der erhaltenen Kulturflüssigkeit gewinnt.

15. Gereinigtes L-Asparaginase-Präparat mit einer spezifischen Aktivität von wenigstens 1500 Einheiten pro mg Protein.

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