DE2048356A1 - Verfahren zur Herstellung von Citronen saure und/oder Isocitronensaure und Zellen von Mikroorganismen auf mikrobioligischem Wege - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Citronen saure und/oder Isocitronensaure und Zellen von Mikroorganismen auf mikrobioligischem Wege

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DE2048356A1
DE2048356A1 DE19702048356 DE2048356A DE2048356A1 DE 2048356 A1 DE2048356 A1 DE 2048356A1 DE 19702048356 DE19702048356 DE 19702048356 DE 2048356 A DE2048356 A DE 2048356A DE 2048356 A1 DE2048356 A1 DE 2048356A1
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citric acid
acid
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Kazuo Nakamshi Toru Machida Tokio Kimura (Japan)
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Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/48—Tricarboxylic acids, e.g. citric acid
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Description

" Verfahren zur Herstellung von Citronensäure und/oder Isocitronensäure und Zellen von Mikroorganismen auf mikrobiologischem Wege "
Priorität: 9. Oktober 1969, Japan, Fr. 80333/69
21. November 1969, Japan, ITr. 92925/69 - ;
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure und Isocitronensäure, sowie von Zellen von Mikroorganismen auf mikrobiologischem Wege unter Verwendung von Mikroorganismen, die Kohlenwasserstoffe verwerten können.·
Es ist bekannt, die verschiedensten StoffWechselprodukte von
Mikroorganismen unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen als
Hauptkohlenstoffquellen herzustellen. In der Literatur finden
sich zahlreiche Berichte über die Herstellung von Mikroorganismen-Zellen, einschliesslich Hefe-Zellkörpern, Aminosäuren,
nucleinsäuren,, organischen Säuren, Zuckern, Enzymen und Vitaminen.
109818/1847
Zur Herstellung von Citronensäure wurden Verfahren entwickelt, die Bakterien, Schimmelpilze und Hefen verwenden. Jedoch sind diese Verfahren zur Herstellung .von Citronensäure nicht zufriedenstellend, da die Produktausbeuten gering sind, die Züchtungen lange Zeit erfordern und das Produkt manchmal als ein Gemisch mit Isocitronensäure erhalten wird, die schwer von der Citronensäure abzutrennen ist.
Es sind auch verbesserte Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismenzellen in hohen Ausbeuten unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen bekannt, wodurch sich eine Senkung der Produktionskosten ergab. Da jedoch die meisten Mikroorganismen-Zellen als Tierfutter verwendet v/erden, ist es notwendig unl wünschenswert, die Herstellungskosten weiter zu senken. Andererseits läuft die Bildung von Mikroorganismen-Zellen aus Kohlenwasserstoffen im lebenden Körper über-komplizierte Reaktionen ab. Es wurde festgestellt, daas die Gewinnung und Verwertung von brauchbaren Substanzen, die bei diesen Stoffwechselreaktionen auftreten, sehr nützlich ist, um die Rohmaterialquellen wirksam zu verwerten. In einem solchen Fall ist der Hauptzweck die alleinige Herstellung von Zellkörpern, und deshalb ist es natürlich, dass nur eine geringe Menge von Nebenprodukten in der Gärmaische gebildet wird. Ia Zellen von Mikroorganismen grosstechnisch hergestellt werden, ist es notwendig, sehr grosse Mengen an Gärmaische zu behandeln. Dementsprechend beschränkt sich die Gewinnung von Nebenprodukten aus der Gärmaische nur auf leicht gewinnbare Produkte. Citronensäure weist eine geringe Löslichkeit auf und ist als Calciumsalz in heissem V/asser sciiv/er löslich. Deshalb ist es sehr einfach, Citronensäure aus solchen
" 109818/1847
Gärmaischen zu gewinnen.
Die vorgenannten Verfahren zur Herstellung von Citronensäure unter Verwendung von BakterienJ Schimmelpilzen oder Hefen' sind nur auf die Bildung von Citronensäure ausgerichtet, v/obei die Citronensäure bei geeigneter Steuerung des Wachstums der Mikroorganismen-Zellen gebildet wird, z.B. durch Zugabe einer stoffwechselhemmenden Substanz, Beschränkung der Stickstoffmenge oder Kontrolle einer anderen Nährstoffquelle, weshalb im Stoffwechsel einige Abweichungen verursacht werden. Andererseits werden bei der Herstellung von Mikroorganismen-Zellen aus Ko^lenwasserstof- i fen nach den bekannten Verfahren die zur Bildung der Mikroorganismen-Zellen essentiellen Nährstoffquellen in ausreichender Menge verwendet. Dies hat zur Folge, dass sich in der Gärmaische nur eine geringe Menge der Stoffwechsel-Zwischenprodukte anreichert und keine oder fast keine Citronensäure gefunden wird,
Aufgabe der Erfindung war es, ein einfaches und billiges Verfahren zu entwickeln, bei dem Citronensäure und Isocitronensäure auf mikrobiologischem Wege angereichert und gleichzeitig : beträchtliche. Mengen von Mikroorganismen-Zellen gebildet werden. i Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
. Die Erfindung beruht auf dem Befund, dass bei den Versuchen zur Herstellung von Zellen von Mikroorganismen unter Verwendung von Kohlenv/asser st offen sich eine beträchtliche Menge Citronensäure in der Gärmaische dann anreichert, wenn dem ITährmedium ein Alkohol zugesetzt wurde.' Überraschenderweise wird jedoch die Menge der aus den Kohlenwasserstoffen gebildeten Zellen von Mikroorganismen bei entsprechender Alkoholkonzentration nicht beeinträch-
1 098 1 8/ 1 8/, 7
■ BAD
tigt. Es wurde weiterhin gefunden, dass der Proteingehalt der so erhaltenen Mikroorganismen-Zellen im Vergleich zu den Zellen, bei
noch etwas
denen nur Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoffquelle dienten,/höher lag.
Andere Untersuchungen zeigten, dass gev/isse Zusätze zum Uährinedium eine grosse Wirkung auf Anreicherung und Ausbeute an Citronensäure und Isocitronensäure in der Gärmaische haben. Bei Verwendung 'von geeigneten Zusätzen kann die Isolierung und Gewinnung der gebildeten Citronensäure oder Isocitronensäure viel einfa-
% eher gestaltet werden. Um chemische Substanzen τ,ν finden, die eine vermehrte Bildung von Citronensäure bei Verwendung von Mikroorganismen, die Kohlenwasserstoffe verwerten, und Kohlenwasserstoffen als Hauptkohlenstoffquelle bewirken, wurden sorgfältig Aconitase-Hemmstoffe, Metallchelate bildende Verbindungen, Alkohole, grenzflächenaktive Verbindungen, deionisierende Agentien und Fluoride untersucht. Dabei wurde erfindungsgemäss festgestellt, dass Kaliumferrocyanid und Monofluoressigsäure eine beachtliche Wirkung zeigen. Es wurde erfindungsgemäss festge-
~ stellt, dass die"Ausbeute an Isocitronensäure durch Zusatz von Kaliumferrocyanid zum Nährmedium stark gesteigert werden kann, während die Ausbeute an Citronensäure in beträchtlichem Umfang durch Zusatz von Monofluoressigsäure zum Uährmedium gesteigert wird. Der Zusatz dieser Verbindungen zu den Nährmedien beeinflusst nicht nur die Ausbeute und die Anreicherung von Isociitronensäure und Citronensäure, sondern beeinflusst auch in beträchtlichem Masse dre Veränderung des Bildungsverhältnicses dieser organischen Säuren.
BAD ORIGINAL
10 9 8 18/18 L7
Ein Kaliumferroeyanid-Zusatz zum Hährmedium in einer wirksamen Menge "bis herauf zu 5 Gewichtsprozent ist bevorzugt. Die dem Nährmedium zuzusetzende Henge an Monofluoressigsäure liegt vorzugsweise zwischen einer wirksamen Menge und etwa 20 millimolar. Jedoch ist es schwierig, genaue Konzentrationsgrenzen anzugeben, da die Mengen stark vom einzelnen verwendeten Mikroorganis-
' mus und den Züchtungsbedingungen abhängen. Ausserdem kann die Konzentration im Verhältnis zur Zugabezeit verändert werden. Obwohl es möglich ist, das Nährmedium mit allen Zusätzen auf einmal oder in Abständen zu· versetzen, liegt die optimale Zeit
. für die Zugabe während der relativ frühen ZüchtungsStadien, wobei die besten Ergebnisse üblicherweise bei einer Zugabe zwischen 0 und 24 Stunden Züchtungszeit erreicht werden.
Der überraschende Befund, dass die Produktivität an Isocitronensäure durch Zugabe von Kaliumferrocyanid zum Hährmedium erhöht wird, eröffnet einen vorteilhaften V/eg zur Herstellung von Citronensäure sowie von Isocitronensäure.
Die Bildung und Anreicherung von Citronensäure in Gegenwart üblicher citronensäurebildender Mikroorganismen bei Verwendung von Monofluoressigsäure als Zusatz zum Hahrmedium ist bekannt. Dieses Verfahren wurde unter Verwendung von Zuckern als Kohlenstoff quelle durchgeführt. Nach dem Verfahren der Erfindung wird · Monofluoressigsäure einem Nährmedium zugesetzt, das Kohlenwasserstoffe assimilierende Mikroorganismen enthält. Es werden beträchtliche Mengen von Citronensäure gebildet, so dass das Verfahren in industriellem Maßstab durchgeführt v/erden kann. Ausserdem v/ird das Züchtungsverfahren erfindungsgemäss durch die Tatsache stark vereinfacht, dass die Monofluoressigsäure dem
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- β- 2046356
Nährmediura zu Beginn der Züchtung zugesetzt werden kann. 1^
Insbesondere wenn Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoffquellen verwendet werden, v/ird eine glatte Wirkung der Aconitase-Aktivität als nötig erachtet. Es scheint deshalb, dass die Wirkung von
Kaliumferrocyanid oder lionofluoressigsäure so besonders ist, dass isie nicht ausschliesslich einfach durch die Funktion erklärt wer-
.
den kann, von der bisher in der Literatur berichtet wurde. Bei Verwendung dieser Zusätze wird erfindungsgemäss ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure und Isocitronensäure geschafj) fen, das technisch durchgeführt werden kann.
Im Zusammenhang mit der ersten Durchführungsform der Erfindung, bei der Citronensäure und Zellen von Mikroorganismen auf mikro-.biologischem Wege unter Verwendung eines Alkohols als Zusatz zum Nährmedium hergestellt v/erden, wurde festgestellt, dass Alkohole im allgemeinen verwendet werden können. Alkohole mit 1 -bis 20 Kohlenstoffatomen sind besonders wirksam* Vorzugsweise werden gesättigte Alkohole mit 1 bis 2 0 Kohlenstoffatomen verwendet. Diese Alkohole werden von den verwendeten Mikroorganismen ver- W wertet und zeigen auch eine Hemmwirkung. Daher ist es nötig, ihre " Konzentration sorgfältig zu wählen.
Die Wirkungen bei Zusatz verschiedener Alkohole auf die Ausbeute an Zellen von Mikroorganismen, den Gehalt an Protein im Zellkörper und die Bildung von Citronensäure sind in Tabelle I wiedergegeben, wobei die Mikroorganismen-Zellen aus η-Paraffinen unter Verwendung von -Candida "zeylanoides A.T.C.C. 15585 hergestellt wurden. Die Züchtung erfolgte 36 Stunden unter aeroben Bedingungen und unter Schütteln in Flaschen. Das Nährmedium hatte die
BAD
109818/18 4 7
folgende Zusammensetzung:
2,0$ (Vol./Vol.) η-Paraffine (C15, C16, C17, C18)
(Gemisch aus gleichen Volumenteilen)
2,0$ (Gew./Vol.) IiH4Cl
0,1$ MgSO4.7H2O
0,1$ FeSO4.7H2O
0,002$ ZnSO4.7H2O
0,004$ • MnSO4.4H2O
0,001$ CuSO4.5H2O
0,001$ Maisquellwasser
0,1$ Thiaminhydr0chlorid
30p jug/Liter . CaCO3
0,5$ (Gew. /Vol. )
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- 8 Tabelle I
bei Zusatz " von verschiedenen Alkoholen Rohpr0 tein
gehalt der
Zellkörper
(trocken),		 Ausbeute
an Citro
nensäure ,
rag/ml
[onzentra-
kion,
/(VoI./Vol.)		 Ausbeute
•an (trok-
kenen) ·
Zellkör
pern ,
kg/ml		 62,4 0
0 11,9 62,4
62,7
63,1
62,9
63,2		 0,5
0,8
1,5
2,6
3,4
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5		 12,1
12,3
12,6
-12,7
13,1		 62,8
62,6
63,3 ;
63,9
64,5		 0,4
0,6
1,2
2,0
2,5
0,4
0,6
0,8
1,0		 14,6
17,2
19., 1
. 21,4
23,2		 62,4
62,8
63,6
63,2
63,3		 '0,3
0,7
1,2
1,8
2,1
0,1
0,2
0,3
0,4 ·
0,5		 ♦ 12,0
'12,2
12,6
12,5
12,3		 63,6
64,2 ·
65,1
66,0
65,7		 0,3
0,7
1,6
2,8
3,6
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0		 14,7
15,6
17,7
'21,6
24,7		 63,1
63,8
64,4
65,8
65,1		 0,3
0,6
1,6
2,1
3,?
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0		 13,1
15,9
18,2
21,8
23,7		 63,1
65,2
66,0
65,3
65,7		 0,4
0,8
1,9
2,6
V8
0,2
0,4
0,6
0,8
Ir 0		 13,1
16,1
19,2
21,1
24,3
V/irkung
I
Alkohol
Kein Zusatz
Methanol
Äthanol
\
Butanol
Laurylallcohol
Stearylalkohol
Oleylalkohol
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Wie aus Tabelle I hervorgeht, wird in der Gärmaische keine Citronensäure gebildet, wenn das iTährmedium nicht mit einem Alkö-' hol versetzt wird« Jedoch wird eine geringe Menge an Gitronen- ; säure gebildet und angereichert, wenn verschiedene Alkohole EU-gesetzt werden. Ausserdem ist der verwendete Mikroorganismus in ,der Lage, Alkohole mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen zu verwerten und Mikroorganismen-Zellen in einer Ausbeute (berechnet no.ch Kohlenstoff) zu bilden, die fast so gut ist v/ie bei der Verwendung von η-Paraffinen oder Äthanol. Ausserdem geht aus Tabelle I hervor, dass der Proteingehalt bei Zusatz eines Alkohols zum ■ Ilährmedium etwas erhöht ist.
Im Verfahren der Erfindung können die verschiedensten,Kohlenwasserstoffe verwertende Mikroorganismen, z.B. Bakterien, Hefen :oder Schimmelpilze ,verwendet werden. Vorzugsweise verwendete Bakterien sind solche der Gattungen Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium oder Nocardia. Vorzugsweise verwendete Hefen sind solche der Gattungen Candida, Torulopsis, Endomyces, .Pichia, Hansenula, Mycoderma oder Endomycopsis. Bevorzugt verwendete Pilze sind solche der Gattungen Aspergillus oder Penicillium.
Zur Durchführung des Fermentationsverfahrens der Erfindung können entweder synthetische oder natürliche Nahrmedien verwendet werden, wenn sie die für das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus essentiellen Nährstoffe enthalten. Diese Nährstoffe sind bekannt; dazu gehören z.B. Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Salze, die in geeigneten Mengen von den verwendeten Mikroorganismen verwertet werden. Das mikrobiologische
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Züchtungsveffahren aer Erfindung wifd iß eittem geeigneten wäss-' figen llährraedium durchgeführt, dä§ Sitten Kdhlehwasser'stof f idör
ι- '
: ein Gemisch von Kohlenwasserstoffen als Häuptkdhlenötofi quelle enthält* Solche Kohlenwasserstoffe sind geräd- oder* verzweigt= kettige Paraffine (Alkane), insbesondere sOlöhe mit Il Ms ., 20 Kohlenstoffatomen, z.B. n-Pentäiti* ft^Öötäiij n-Decän^ fi-Üodecanj ; n-Hexadecan» Isopentan und Iöeöötäil, Öy§löfäiaffine, z.Bi Gyclö^- hexan und Gyclooctan, gefäd= und ire'fawSigtfeettige Olefine, ζ,Β*· Penten-2, Hexen-1, Octett^I und 0&%Βϊι-^ί Gyölöolefine, ζ»~Βι Cyclohexen, aromatische Kohlenwasserstoffe* ZiBs Beflzöl und o-Xylol, und Gemische derselben5 ioWie Kohlenv/assefstoffgemi-
sehe, z.B. Kerosin, Leicht öle'j Schwer'ölfe uftd Paraffinöles* Ge-, ringe Mengen von anderen Kohlenstoffquellen, wie Kohlehydrate, ζ*B. Glucose, Fructose,. Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysat und Melassen, oder ändefe geeignete Kohlenstöffquellen, z.B. Glycerin, Mannit, Sorbit und organische Säuren^können neben dem Kohlenwasserstoff im Uährmedium verwendet werden* Diese Substanzen können entweder einzeln oder als Gemisch von zwei ■oder mehr Substanzen verwendet werden*
Als Stickstoffquellen können die verschiedensten Arten Von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen verwendet werden, z.B. Harnstoff, wässrige Ammoniaklösung öder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitra.t, ; Ammoniumphosphat und Ammoniumacetat, Aminosäuren oder natürli-• ehe stickstoffhaltige Substanzen, z.B. Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischütehl, Pepton, Bouillon, Caseinhydrolysate, lösliche Stoffe1 aus Fischen und Weizenkleieextrakt.
■■■-;"· - 2048358
Diese Substanzen können auch im Gemisch verwendet werden.
Folgende anorganische Verbindungen können dem ITährmedium zugesetzt werden: Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphs/t, Dikaliumlrydrogenphosphat, Eisensulfat und andere Eisensalze, Manganchlorid, Calciumchlorid und Natriumchlorid. Ausserdem kann es nötig sein, je nach dem im besonderen Fall verwendeten Mikroorganismus, dem Nährmedium bestimmte essentielle Nährstoffe "zuzusetzen, wie Aminosäuren, z.B. Asparaginsäure, Threo-
j nin und Methionin, und/oder Vitamine, z.B. Biotin, Thiamin und ; Cobalamin.
In einigen Fällen kann es nötig oder erwünscht sein, einen Alkohol, eine Mono- oder Dicarbonsäure oder ein natürliches Fett "oder Öl oder ein Gemisch dieser Substanzen als Kohlenstoffquelle oder zumindest als teilweise Kohlenstoffquelle dem Nähmredium zuzusetzen. Der Zusatz vm pflanzlichem oder tierischem Öl und/ oder einer oberflächenaktiven Verbindung kann ebenfalls zur Steigerung der Produktausbeute beitragen.
Die Züchtung der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen, wie Schütteln der Kultur unter aeroben Bedingungen, oder im Submersverfahren unter Rühren und Luftzufuhr durchgeführt. Im Falle der ersten Durchführungsform unter Zusatz eines Alkohols arbeitet man bei Temperaturen von z.B. etwa 15 "bis 450C und einem p„-Wert von etwa 1,0 bis 9,0, und im Fall der zweiten Durchführungsform unter Zusatz von Kaliumferrocyanid oder Monofluoressigsäure bei Temperaturen von z.B. etwa 20 his 37°C und einem-p„—Vifert von etwa 1,0 bis 7,5.
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Die Beispiele erläutern die Erfindung. Wenn nicht anders ange-
Volumeneinheit Wasser, geben, so bedeuten Prozentangaben Gewichtsprozent pro / Die Produkte v/erden nach üblichen Verfahren, z.B. durch Behandlung mit Ionenaustauscherharzen, Extraktion mit Lösungsmitteln, Aus-■-fällung, Adsorption oder Chromatographie, gewonnen.
Beispiel 1
18,9 Liter eines Hährmediums der folgenden Zusammensetzung werden in einen 30-Liter Fermenter gebracht:
2,5$ (Vol./Vol.) η-Paraffine (C12, C15, C14)
(Gemisch aus gleichen Volumenteilen)
2,0$ (Gew./Vol.) UH4Cl
0,1$ KH2PO4
0,1$ K9HPO,
0,1$ MgSO4 . 7H2O
0,001$ MnSjP, . 4Ho0
0,002$ FeSO4* .' 7H2O
0,001$ .ZnSO4 . 7H2O
0,0005$ CuSO4 . 5H2O
0,0065$ V X»XX a J £~XXv ί*7^·^θ A * p*·" O ^*^
τ* Ό / (-- τ* ζ.
0,0002$ H5BO5
500 jxg/ml Nonion LP-20R (oberf
Verbindung)
1 ml/Liter Sojabohnenöl
200 /ig/Liter Thiamin-hydroenlorid
0,05$ Maisquellwasser
Ein Liter einer Anzuchtkultur von Torulopsis famata A.T.C.C, 15586 v/ird dem oben angegebenen Nährmedium zugesetzt. Dann v/erden 100 ml Äthanol zugegeben. Man züchtet bei 34°C bei einer Be-
BAD Of!lG/MAL ' 1098 18/18U
lüftungsgesehwindigkeit von 20 Liter/Min, und einer Rührge«· schwindigkeit von 500 U,/Min, V/ährend der Züchtung wird der PjT-V/ert mit ISprozentiger wässriger Ammoniaklösung auf 6,50 gehalten, '
Nach 42 Stunden ist die Züchtung vollständig, und die Konzentration der Mikroorganismen-Zellen in der Grärmaische erreicht 20 mg/ml. Die Ausbeute an Citronensäure beträgt 3»0 mg/ml.
Zum Yergleich züchtet man ebenso in einem Hahrmedium, das kein Äthanol enthält. Die Konzentration der gebildeten Zellkörper beträgt 14 mg/ml, wobei keine Citronensäure beobachtet wird.
Die bei Zusatz von Äthanol zum llährmediura erhaltenen Mikroorganismen-Zellen v/erden einige Male in einem Sharpies-Zentrifugalseparator gewaschen' und der Abtrennung durch Zentrifugation unterworfen, !lach dem Gefriertrocknen erhält man 365 g Zellkörper. Der Proteingehalt in den Zellkörpern beträgt 61 fo0 Führt man die Züchtung ohne Äthanolzusatz zum Hahrmedium durch, so erhält man 246 g Zellkörper mit einem Proteingehalt von 59 ^.
Nach dem Entfernen der Mikroorganismen-Zellen aus der Gärmaische werden 200 g Calciumchlorid zugesetzt, und der p^-Wert wird mit wässriger Ammoniaklösung auf 8,0 eingestellt. Die erhaltene Flüssigkeit wird 5 Minuten auf 1000C erwärmt. Die entstandenen Calciumcitrat-Kristalle werden abfiltriert und mit 2 Litern V/asser versetzt. Der p^-V/ert wird-mit Salzsäure auf 2,0 eingestellt, wobei sich das. Calciumcitrat löst. Beim Wiederholen dieser Operation erhält man 65 g kristallines CaIeiumcitrat,
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β u β ZQ483S8
Bei β ρ !__ β I^ Jg !
300 ml einer Anzuchtkultur von looardia. paraffin! Q&. A»fiVC,C, 21198 v/erden, zu 3 Litern einesin einem 5 Littr«»Ferraenter befind« liehen ilährmediums der folgenden Zusammensetzung
3,5/ (VoI,/VoI,) η-Paraffine (0lgf o.^, o
0,1/ (Gew./VoI,) IHgPO, \
ο,ι/ Z ^4 , J^ftgU
0,05/ MgSO4 . 7HgO
0,0005/ ZnSO4 ;".7%o
0,05/ Mai s φ Mllwaoetr
2,5/ (IH4), iSD4
0,01/ CaCl0
Zu diesem Nährmedium werden 15 ml Methanol gegeben. Man züohtet bei 28 C unter einer Belüftungsgeschwindigkeit von 3 Lifern/Min.
. und einer Rührgeschwindiglieit von 650 U,/Min. Der p^Wert wird während der Züchtung mit 18prozentiger wässriger Ammoniaklösung auf 7,0 gehalten.
Nach 40 Stunden ist die Züchtung beendet. Die Konzentration der gebildeten Zellkörper beträgt 21,0 mg/ml und die Ausbeute an Citronensäure 2,0 mg/ml. Wenn die Züchtung ohne Methanolzusatz durchgeführt wird, beträgt die Konzentration der gebildeten Zellkörper 20,8 mg/ml, während keine Bildung von Citronensäure beobachtet wird.
Verfährt man mit de?» ß-ärmaisehe wie in Beispiel 1, so erhält man Mikroorganismen-^Zellen und kristallines Calciumoitrat. Die ■ Ausbeute an trockenen Zellkörp©3?n beträgt 53 g und an Calcium-
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citrat 6,1 g. Züchtet man ohne Methanolzusatz, so erhält man 52 g trockene Zellkörper. Der Proteingehalt der Mikroorganismen-• Zellen beträgt bei der Durchführung des Verfahrens der Erfindung !57,1 /3/während der Proteingehalt von Mikroorganismen-Zellen, die .ohne Zusatz von Methanol erhalten wurden, 56,3 $> beträgt.
Beispiel 3
!3 Liter eines IJährmediums der folgenden Zusammensetzung werden in einen 5 Liter-Fermenter gebracht:
4$ (Vol./Vol.) η-Paraffine (C12, C15, C14)
.(Gemisch aus gleichen Volumenteilen)
2,0fo (Gew./Vol.) %
0,15*
0,05c/o
0,002f/
KH2PO4 7H2O
K2HPO4 2H2O
MgSO4 . 7H2O
MnSO4 . 5H2O
FeSO4 . 7H2O
CuSO4 .
ZnSO4 .
Ό, 0015* ·
200 jag/ml . Nonion OT-221 (oberflächenaktive
} Verbindung)
1 ml/Liter Sojabohnenöl
1 mg/Liter Thiamin-hydrochlorid
0,5$ (Vol./Vol.) Laurylalkohol
i ■
Dann werden 300 ml einer Lösung einer Kultur von Penicillium janthinellum A.T.C.C. 13154 als Anzuchtmikroorganismen zugesetzt. Man züchtet 3 Tage bei einer Temperatur von 26 C unter einer ,Beliiftungsgeschvindigkeit von 3 Litern/Hin, und einer Rührgeschwindigkeit von 650 U./Min. Der anfängliche p^-Wert be-
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j trägt 6,0.
Die Konzentration der gebildeten Zellkörper beträgt 30 mg/ml bei einer Citronensäureausbeute von 1,8 mg/ml. Wird in einem llährmedium gezüchtet, 'das keinen Laurylalkohol' enthält, so beträgt
die Konzentration der gebildeten Zellkörper 24 mg/ml, und keine . j . ·
Citronensäure wird gebildet. Unterv/irft man die Gärmaische der
gleichen Behandlung wie in Beispiel 1, so erhält man 85 g Zellkörper lind 5,6 g kristallines Calciumcitrat. Der Proteingehalt ^ i der Zellkörper .beträgt 36 /. Bei 'Züchtung in einem Ifährmedium ; ohne Zusatz von LaurylrTJnhol erhält man 69 g Zellkörper mit einem Proteingehalt Von 31 /.
'! Beispiel 4
In einen 5 Liter-Fermenter werden 3 Liter eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung gebracht:
3,0/ (Vol./YoI.) η-Paraffine (C12, C13, C14)
(Gemisch aus gleichen Volumenteilen)
0,1/ (Gew./Vol.) KH2PO4 7H2O O4
0,1/ K2HPO4 7H2O
0,3/ KCl 7H2O Thiamin-hydr0ch
ο,ι/ MgSO4 . 4H2O
0,005/ PeSO4 . Maisquellwasser
0,001/ ZnSO4 . -(NH4 )2S
0,001/ MnSO4 . CaCl2
0,02/
2,5/
0,3/
100 ^ig/Liter
BAD
1098 18/1847 ■..
Bis ses Bährüiediuöi wird mit 300 ml einer Anzucht lösung von Ärthrobaeter paraffineus A.T.C.C, 15591 versetzt. Man züchtet bei 30 C bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 3 Mtern/Min» : und einer Rührgeschwindigkeit von 800 U,/Min., wobei der Pjj-W .mit 28prozentiger wässriger Ammoniaklösung auf 6,80 gehalten ■ wird» 6 Stunden nach dem Beginn der Züchtung werden 15 ml n-Amylalkohol zugesetzt. Die Ausbeute an Mikroorganismen-Zellen erreicht nach 24~stündiger Züchtung ein Maximum mit einer Konzentration von 18,5 mg/ml. Die Ausbeute an Citronensäure beträgt 1,3 mg/ml, Zum Vergleich dazu züchtet man im gleichen Medium, aber ohne Zusatz von η-Amylalkohol, und erhält eine Konzentration von Mikroorganismen-Zellen γοη 18,0 mg/ml, während keine Citronensäure gebildet wird. .
Behandelt man die bei Zugabe von n-Amylalkohol erhaltene Gärmaische auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1, erhält man 49 g trockene Mikroorganismen-Zellen und 4»5 g Calciumcitrat. Der Proteingehalt der Mikroorganismen-Zellen beträgt 51,0 cß>. Aus der ohne Zusatz von η-Amylalkohol erhaltenen Yergleichsgärmaisehe werden 48 g Mikroorganismen—Zellen mit einem Proteingehalt von 48,2 fo gewonnen.
Beispiel 5
In einem 250 ml-Erlenmeyerkolben befinden sich 20 ml eines 0,25 Φ Hefeextrakt, 0,5 $ Fleischextrakt, 0,5 # Pepton und 0,25 cß> Natriumchlorid enthaltenden ITährraediums vom pH~V/ert 7,0. In diesem llährmedium v;ird Arthrobacter paraffineus A. T, C. C. 15591 24 Stunden bei einer Temperatur von 30 C unter aeroben Bedingungen und unter Schütteln gezüchtet. Jeweils 10 °/o der entstan-
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- 18 - ' 2Ö48-3'Sir- .-
■denen Kultur werden auf 20 ml eines in 500 ml Sakaguehi—Flaschen enthaltenen Züchtungsmediums der folgenden Zusammensetzung übertragen: - ■ .
0,1$
Ia2HPO4 .. X2H2
0,05$
0,002$
0,05$ Mais quellwas s er
2,0$ HH4HO5--
5$ n-Paraffin—Gemisch (Gemisch aus gleichen
; Volumenteilen C-, 2, C-,, und C-, 4)
5$ CaCO3
Man züchtet bei 30 C unter Schütteln. 6 Stunden nach Züchtungsbeginn wird liatriummonofluoracetat. in einer Konzentration von 0,1 $ zugesetzt. Dann wird 4 Tage weitergezüchtet, wobei 18,2 mg/ml Calciumcitrat (als Citronensäure) sich in der Gärnai-
^ sehe anreichern. Bei Verwendung des gleichen Nährmediums ohne Zusatz von liatriummonofluoracetat erhält man nur 9,3 mg/ml Citronensäure.
Nach dem Ende der Züchtung wird die Gärmaische mit einem gleichen Volumen an 2n HCl versetzt, um alles Calciumcitrat in Lösung zu bringen. Die Mikroorganismen-Zellen werden durch Zentrifugati on entfernt. Durch Zugabe von HH4OH wird die erhaltene überstehende Lösung.auf den pH-Wert 8,0 eingestellt, und nach Erhitzen gewinnt man durch Filtration etwa 360 mg CaIciuncitrat. Bei der Wiederholung dieses Vorgehens erhält man 332 mg kristal-
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2048351
lines Calciumcitrat.
Beispiel 6
20 ml eines 5 $ n-Paraffin-Gemisch (Vol./Vol.), 0,5 1<> Fleischextrakt, 0,5 fo Polypepton, 0,25 $> natriumchlorid und 5 $> CaCO3 enthaltenden Uährmediums vom p^-V/ert 6,0 werden in eine Sakaguchi-Plasche gegeben. In diesem Nährmedium wird Candida zeylanoides A.T.C.C. 15585 2 Tage unter aerobem Schütteln bei 30 C gezüchtet. Jeweils 10 $ des entstandenen Gemisches werden auf Sakaguchi-Flaschen übertragen, die Jeweils 20 ml eines ITährmediums der folgenden Zusammensetzung enthalten:
v n-Paraffin-Gemisch (YoI./Vol.)
0,3/,
KH2PO
MgSO
4 · 7H2O
500 yug/liter 500 jig/iiter 500 jig/Liter 200 ^ug/Liter
200 jig/Liter 5 ml/Eiter
1 mg/Liter
856
56
Der Pjj-W
CuSO4 . 5H2O (HH4O6Mo7O24 . 4H2O Nonion OT-221 (oberflächenaktive Verbindung)
H3BO3
Sojabohnenöl Thiamin
Hatriummonofluoraeetat CaCO-
des Mediums beträgt 6,0.
Man züchtet 4 Tage unter den gleichen Bedingungen wie in Bei- · spiel 5. Nach vollendeter Züchtung haben sich 105 mg/ml. Calcium
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citrat (als Citronensäure) und 12 mg/ml Calciuraisocitrat (als . Isocitronensäure) in der entstandenen Gärmaische angereichert.
■ In einem Vergleichsversuch wird auf die gleiche V/eise gezüchtet, j aber der Zusatz von Monofluoressigsaure unterbleibt. In diesem '•Fall werden nur 65 mg/ml Calciumcitrat (als Citronensäure) ge- .
bildet, während sich 63 mg/ml Calciumisocitrat (als Isocitronen-
■ säure) in der Gärmaische angereichert haben.
Behandelt man die Gärmaische nach vollendeter Züchtung auf die , in Beispiel 5 beschriebene Weise," so erhält man 2,05 g Calcium-
ι ■
citrat, wenn das Nährmedium nach dem Verfahren ck * Erfindung gei züchtet wird. Die erhaltenen Kristalle enthalten 10,3 i° Calcium- '■■■ isocitrat (als Isocitronensäure).
Beispiel 7
20 ml eines 5$ n-Paraffin-Gemi&ch (Vol./Vol..), 0,5 ^Fleischextrakt, 0,5 $ Polypepton, 0,25 fi Natriumchlorid und 5 rß> Calciumcarbonat enthaltenden Nährmediums vom ρ,.-Wert 6,0 v/erden in eine Sakaguchi-Flasche gegeben. In diesen ITährmedium wird Candida ^ jlipolytica A.T.C.C. 8661 2 Tage bei 300C unter aerobem Sehüt-J teln gezüchtet. Jeweils 10 fo der entstandenen Kultur v/erden auf
Sakaguchi-Flaschen übertragen, die jeweils 20 ml eines Nährme-• diums der folgenden Zusammensetzung enthalten ;::
10/ n-Paraffin-G 7H2O
0,3/ NH4NO3 4H2O
0,1/ KH2PO4 5H2O
0,05/ . . MgSO4 .
500yUg/Liter 1-InSO4 .
500 ug/Liter CuSO4 .
109818/18*. 7
2048IÜ
10 mg/Liter FeSO4 . 7H2O
500 ^ig/Liter (UH4)gHo7024 « 4H2O
200 jAg/Liter H3BO3
200 mg/Liter Nonion OT-221 (oberflächenaktive
Verbindung)
5 ml/Liter ' 'Sojabohnenöl
Maisquellwasser
i Qfo CaCO-
: Der pjT-V/ert des llährmediums beträgt 6,0.
Man züchtet unter aerobem Schütteln unter den ixi aieispiel 5 ! beschriebenen Bedingungen und setzt 24 Stunden nach Züchtungsbe-, ginn Kaliumferrocyanid bis zu einer Konzentration von 2,0 Ge-■: Wichtsprozent zu. Man züchtet v/eitere 72 Stunden und erhält 4,6 mg/ml Calciumcitrat (als Citronensäure) und 10,8 mg/ml CaI-ciumisocitrat (als Isocitronensäure) in der entstandenen Gärmaische.
Die Gärnaisehe aus 50 Flaschen wird vereinigt und mit H2SO4 ver- ■ setzt. Zur Entfernung der Calciumsalze und der Mikroorganismen v/ird abfiltriert. Dann versetzt man die Lösung mit gesättigtem Ba(OH)2, v/odurch die Bariumsalze 'erhalten v/erden. !lach der Lactonisierung, Methylierung, Demethylierung und Lactonisierung erhält man 1,25 g Lacton der Isocitronensäure.
Züchtet man bei einem Vergleichsversuch auf die gleiche Weise, setzt dem ITährmedium aber kein Kaliumferrocyanid zu, so reichern sich .7,5 mg/ml Calciumcitrat (als Citronensäure) und 7,4 mg/ml Calciumisocitrat (als Isocitronensäure) in der Gärmaische an« .
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-22- 2Q48
Beispiel 8
Man züchtet auf die gleiche Weise wie in Beispiel 7, verwendet aber Candida zeylanoides A.T.C,C. 15585 als· Mikroorganismus. ; Nach vollendeter Züchtung haben sich in de.r Gärmaische 12,1 mg/ml ;· Calciumisocitrat (als Isocitronensäure) und 5,0 mg/ml Calciumj citrat (als Citronensäure) gebildet. Man verfährt jetzt wie in : Beispiel 7 und erhält 1,44 g des Lactons der Isocitronensäure.
Züchtet man bei einem Vergleichsversuch unter den gleichen Bej dingungen, setzt dem Medium aber 'icein Kalium f err ο cyanid zu, so
^ bilden sich 7,3 mg/ml Calciumisocitrat (als Isocitronensäüre) ι x ■ ■ · . ■
(und 7»5 mg/ml Calciümcitrat (als Citronensäure).
j Beispiel 9
I Penicillium janthinellum 581 A.T.C.C. 13154 wird 3 Tage bei 280C
auf einem schräggestelltem Malzextrakt-Agar-Agar-lTährboden ge-I züchtet. Mit einer Platinöse v/ird die entstandene Anzuchtkultur j in 20 ml eines 'in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben befindlichen Anzuchtnährmediüms vom pH~Wert 6,0 der folgenden Zusammensetzung eingeimpft:
5$ n-Paraffin-Gemisch (C12, O15, C14)
(Vol./Vol.)
0,025$ KHgPO. , 12HgO
0,025$ Na2IIPO. 7HgO
'0,02$ MgSO4 . 2HgO
0,001$ CaCIg . 4HgO
0,001$ MnSO4 .' 7H2O
0,5 mg/Liter ZnSO4 . 7H2O
10 mg/Liter PeSO4 .
10.9818/184
-23 - 2048351
0,6 mg/Liter H3BO3
10 ^ug/Liter Na2MoO4 . 2H2O
10 ug/liiter CoCl2 . 6H2O .
10 pg/Liter CuSO4 . 5H2O
NH4NO3
Maisquellwasser
Sojabohnenöl
CaCO3
Es wird 3 Tage "bei 28 C unter aeroben Bedingungen und unter Schütteln gezüchtet. Dann v/erden 2 ml der entstandenen Gärmai-
sehe auf 20 ml eines Züchtungsmediums der gleichen Zusammensetzung (ausgenommen: 10 c/o n-Paraffin-Gemisch (Vol./Vol.) und 5 1° CaCO^), das sich in einer Sakaguchi-Flasche befindet, übertragen. Dann wird bei 30 C unter aeroben Bedingungen und unter Schütteln mit einer ?req_uenz von*130 Schüttelbewegungen/Min, gezüchtet, liach 24-stündiger Züchtung wird dem IJährmedium ITatriummonofluoracetat in einer Konzentration von 0,01 fo zuge-.setzt. Man züchtet weitere 5 Tage. Nach beendeter Züchtung befinden sich in der Gärmaische 30 mg/ml Calciumcitrat (als Citronensäure).
Bei einem Vergleich ohne Zusatz von Honofluoracetat zum Nahrmedium erhält man nur 12 mg/ml Calciumcitrat (als Citronensäure) in der entstandenen Gärmaische.
Aus der vorstehenden Beschreibung kann entnommen werden, dass ein Alkalimetallferrocyanid, s.B. liatriumferrocyanid oder KaIi-urnferrocyanid, zur Erreichung erhöhter Ausbeuten an Isocitronensäure zugesetzt werden kann. Auf ähnliche V/eise führt der Zu-
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satz von Monofluoressigsäure oder einem ihrer Alkalimetallsalze, z.B. Hatriummonofluoracetat oder Kaliummonofluoracetat, zu erhöhten Ausbeuten an Citronensäure.
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Claims (1)

  1. ZS
    Pat e η tan s ρ r ü c he
    " 1. Verfahren zur Herstellung von Citronensäure und Zellen von • Mikroorganismen auf mikrobiologischem Wege, dadurch ge· kennzeichnet, dass ein Kohlenwasserstoffe verwer-■: tender Mikroorganismus, der fähig ist, Citronensäure-herzustellen, unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium, das zumindest einen Kohlenwasserstoff als Hauptkohlenstoffquelle enthält", in Gegenwart von zumindest einem Alkohol gezüchtet wird und die in der Gärmaische sich anreichernde Citronensäure und C1Je in der Gärmaische gebildeten Mikroorganismen-Zellen gewonnen werden. *
    ! 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass . ein Mikroorganismus der Gattungen Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, ITocardia, Candida, Torulopsis, Endomyces-, Pichia, Hansenula, Mycoderma, En&omycopsis, Aspergillus oder Penicillium verwendet wird.
    3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 15 bis 45 C und einem pjj-Wert von etwa 1,0 bis 9,0 durchgeführt wird.
    4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Alkohol mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen verwendet wird.
    5. Verfahren nach Anspruchl, dadurch gekennzeichnet, dass ein gesättigter Alkohol mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen verwendet wird* *
    10.9818/1847
    Zo
    6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ^
    ; Alkohol in einer Konzentration von etwa 0,1 "bis 1,0 c/o (Vol./VoI,) dem Währmedium zugesetzt wird.
    7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als ': Kohlenwasserstoff ein η-Paraffin mit 11 bis 20 Kohlenstoffatomen
    ', verwendet wird.
    ; 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium ausserdem eine oberflächenaktive Verbindung enthält..
    ψ 0. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als
    ': MikroorganismusTorulopsis famata, Nocardia paraffinica, Penicillium janthinellum oder Arthrobacter paraffineus verwendet v/ird.
    10. Verfahren zur gemeinsamen herstellung von Citronensäure und : Zellen von Mikroorganismen auf mikrobiologischem V/ege, dadurch
    '■ gekennzeichnet,· dass ein Kohlenwasserstoffe verv/ertender Mikroorganismus, der fähig ist, Citronensäure zu bilden, der Gattung •Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Nocardia, * Candida, Torulopsis, Endomyces, Pichia, Hansenula,' Mycoderma, Endomycopsis, Aspergillus oder Penicillium,unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von etwa. 15 bis 45 C und einem Ρττ-. Wert von etwa 1,0 bis 9,0 in einem v/ässrigen Nährmedium, das zumindest einen Kohlenwasserstoff als Hauptkohlenstoffquelle enthält, in Gegenwart von zumindest einem gesättigten Alkohol •mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 1,0 fo gezüchtet wird und die in der Gärmaische sich anreichernde Citronensäure und die in der Gärmaische gebildeten
    109818/1847
    ->*- 20463-56
    ■;■ -■ ■ .,;■ ■■.■■. it
    Hikrpqrganismen-Zeilen gewonnen werden. '
    11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Kohlenwasserstoff ein η-Paraffin mit 11 bis 20 Kohlenstoffatomen verwendet wird.
    . 12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Torulopsis famata, Itfocardia paraffinica, Penicillium janthinelIum oder Arthrobacter paraffineus verwendet wird.
    "'J. Verfahren zur Herstellung von Citronensäure und/oder Isoci-
    tronensäure auf mikrobiologischem Wege, dadurch gekennzeichnet, dass ein Kohlenwasserstoffe verwertender Mikroorganismus, der fähig ist, Citronensäure und/oder Isocitronensäure zu bilden, unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Iiährmedium, das zumindest einen Kohlenwasserstoff als Hauptkohlenstoffquelle enthält, in Gegenwart von a) einem Alkalimetallferrocyanid oder b) Moiiofluoressigsäure oder einem ihrer Alkalinietallsalze gezüchtet wird und die sich in der Gärmaische anreichernde Citronensäure und/oder Isocitronensäure gewinnen wird,
    . 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismus der Gattungen Arthrobacter, Corynebeicterium, Brevibacterium, ITocardia, Candida, Torulopsis, Endomyces, Pichia, Hansenula, Mycoderma, Endomycopsis, Aspergillus oder Penicillium verv/endet wird.
    15. Verfahren"nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung bei Temperaturen von etwa 20 b
    von etwa 1,0 "bis 7,5 durchgeführt wird.
    Züchtung bei Temperaturen von etwa 20 bis 37°C und einem
    , . rt · BAD ORIGINAL
    10.9818/184 7-
    16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Alkalimetallferrocyanid Kalium- oder Natriumferrocyanid verwendet wird. ■ ■ ,
    17. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Alkalimetallsalz der Ilonofluoressigsäure natrium- oder Kaliummonofluoracetat verwendet wird.
    18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass dem Nährmedium das Ferrocyanid in einer wirksamen Konzentration
    ^ bis zu etwa 5 Gewichtsprozent zugesetzt wird.
    19. Verfahren nach'Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass
    ■ die Monofluoressigsäure oder ihr Natrium- oder Kaliumsalz dem
    ' Nährmedium in einer wirksamen Menge bis zu 20 millimolar zuge- !
    setzt wird.
    20. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Kohlenwasserstoff ein η-Paraffin mit 11 bis 20 Kohlenstoffatomen verwendet wird.
    t 21. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium ausserdem eine oberflächenaktive Verbindung enthält. ' ;
    .22. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Arthrobacter paraffineus, Candida zeylanoides, Candida lipolytica oder Penicillium janthinellum verwendet wird. . .
    EAD ORIGINAL 10.9818/18^7
    -X- 20Λ835.6
    23. Verfahren zur Herstellung von Citronensäure und/oder Isocitronensäure auf mikrobiologischem Wege, dadurch gekennzeichnet, dass ein Kohlenwasserstoffe verwertender HikrοOrganismus, der fähig ist, Citronensäure und/oder Isocitronensäure zu "bilden,
    i-der Gattung Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Noeardia, Candida, Torulopsis, Endomyces, Pichia, Hansenula, : Mycoderma, Endomycopsis, Aspergillus oder Penicillium, unter aeroben.Bedingungen bei Temperaturen von etwa 20 bis 37°C und einem Ρττ-Wert von etwa 1,0 bis 7,5 in einem wässrigen ITährmedium, das zumindest einen Kohlenwasserstoff als Hauptkohlenstoffquelle { enthält, in Gegenwart von a) Kalium- oder Natriumferrocyanid
    ι V
    oder b) Monofluoressigsäure, natrium- oder Kaliumfluoracetat gezüchtet und die sich in der Gärmaische anreichernde Citronensäure und/oder Isocitronensäure gewonnen wird.
    24. Verfahren nach Anspruch 23',. dadurch gekennzeichnet, dass ' als Kohlenwasserstoff ein η-Paraffin mit 11 bis 20 Kohlenstoff- : atomen verwendet wird..
    ;25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass als 'Mikroorganismus Arthrobacter paraffineus, Candida zeylanoides, Candida lipolytica oder Penicillium ^anthinellum verwendet
    t&9818V1847
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4014742A (en) * 1976-03-03 1977-03-29 Pfizer Inc. Production of citric acid in slack wax media
US4414329A (en) * 1980-01-15 1983-11-08 Phillips Petroleum Company Biochemical conversions by yeast fermentation at high cell densities
US4411998A (en) * 1982-03-19 1983-10-25 Showa Oil Company, Ltd. Suppressing method of iso-citric acid formation in producing citric acid from hydrocarbons by fermentation
US7223859B2 (en) * 2003-03-17 2007-05-29 Pfizer Inc. Method for producing (R)-3-[4-(trifluoromethyl) phenylamino]-pentanoic acid amide derivative

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GB1332180A (en) 1973-10-03
NL7014543A (de) 1971-04-14
US3773620A (en) 1973-11-20
CA948577A (en) 1974-06-04
FR2065725A1 (de) 1971-08-06
IT1024505B (it) 1978-07-20
FR2065725B1 (de) 1974-02-01

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