DE1695327C3

DE1695327C3 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von Nikotinamidadenindinukleotid

Info

Publication number: DE1695327C3
Application number: DE19671695327
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Kamitsuruma Sagamihara Nakayama (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1966-08-08
Filing date: 1967-08-07
Publication date: 1977-10-13

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Nikotinamidadenindinukleotid.

Nikotinamidadenindinukleotid, a :ch bekannt unter der Bezeichnung Coenzym I, Dehydrogenase-Coenzym [, Diphosphopyridinnuk eotid oder Cozymase, hat die feigende Strukturformel

45

NH,

CONH₂

OH

55

60

CH₂-O-P-O-P-O-CH₂

Il Il ο ο

Nikotinamidadenindinukleotid spielt eine wichtige Rolle bei biochemischen Reaktionen, z. B. bei der alkoholischen Gärung von Glukose. Es kommt in Hefen, Pilzen und in Bakterien vor. Die Extrak π aus Mikroorganismenzellen und Reinigung des dabei erhaltenen Rohmaterials eignet sich jedoch nicht für die großtechnische Hersteilung von Nikotinamidadenindinukleotid.

In der japanischen Patentanmeldung 29 811/1964 ist ein Verfahren zur Herstellung von Nikotinamidadenindinukleotid auf fermentativem Wege unter Verwendung von Hefe beschrieben. Bei diesem Verfahren werden nur verhältnismäßig geringe Mengen an Nikotinamidadenindinukleotid in den Kulturlösungen angereichert.

In der französischen Patentschrift 14 29 867 ist ein Verfahren zur Herstellung von Nikotinamidadenindinukleotid auf fermentativem Wege durch Züchten von Mikroorganismen in einem Nährmedium, das Adenin und/oder Nikotinamid enthält, beschrieben. Dieses Verfahren Heien jedoch das gewünschte Nikotinamidadenindinukleotid ebenfalls nur in verhältnismäßig geringen Ausbeuten.

Aufgabe der Erfindung ist es. ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Nikotinamidadermdinukleotid i-nzugeben, mit dessen Hilfe es möglich ist, die gewünschte Verbindung auf technisch einfache und wirksame Weise in hohen Ausbeuten herzustellen.

Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe dadurch gelöst werden kann, daß man bestimmte Mikroorganismen in einem Nährmedium züchtet, das neben Adenin und/oder Nikotinamid noch ein bestimmtes oberflächenaktives Mittel enthält. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Nikotinamidadenindinukleotid durch Kultivierung eines Mikroorganismus in einem Adenin und/oder Nikotinamid enthaltenden wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß als Mikroorganismus Corynebacterium sp. ATCC 21084, Arthrobacter sp. AtCC 21085 oder Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 verwendet wird und daß die Kultivierung bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40⁰C und bei einem pH-Wert von etwa 5 bis 9 in einem Nährmedium durchgeführt wird, das ein oberflächenaktives Mittel aus der Gruppe der Polyoxyäthylensorbitanfettsäureester mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Poiyoxyäthyienaikylamine mit 12 bib 18 Kohlenstoffatomen, der Polyoxyäthylenalkyläther mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Polyoxyäthylenalkylallyläther mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Alkylirimethylammoniumhalogenide mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Alkylbenzyldimethylammoniumhalonrenide mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Alkylpyridiniumhalogenide iiiit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Alkylbetaine mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der höheren Fettsäureesterund höheren Fettsäureamide enthält.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in dem

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nutiuiiutuiuiii ang^i ciunci tt iiiiMruiiailfluauciIlIIUlIIU-kleotid läßt sich in Anwesenheit eines oberflächenaktiven Mittels leicht abtrennen, weil es darin extra-zellulär angesammelt wird, so daß sich die früher erforderliche mechanische und chemische Aufspaltung der Zellwände sowie die Denaturierung und Zerstörung derselben erübrigt. Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt somit gegenüber den bisher bekannten Verfahren im Hinblick auf eine großtechnische Verwertung entscheidende Vorteile.

Es wird angenommen, daß die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mikroorganismen bei Zugabe der oberflächenaktiven Mitte! zu dem Nährmediu.n bestimmte Produkte absondern und extra-zellulär erzeugen, die für die Bildung von Nikotinamidadenindinukleotid erforderlich s'nd.

Gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung wird die Kultivierung in einem Nährmedium durchgeführt, welches das oberflächenaktive Mittel in einer Menge von etwa 0.01 bis 0,5 Gew.-% enthält.

Die erfindungsgemäß verwendbaren oberflächenaktiven Mittel, die einzeln oder in Form von Kombinationen auf einmal oder in Abständen zugesetzt werden können, können entweder gleich zu Beginn der Kultivierung oder zu irgendeinem beliebigen Zeitpunkt während der Kultivierung zugegeben werden. Ihre Zugabemenge ist abhängig von dem jeweils verwendeten oberflächenaktiven Mittel, der Zugabezeit und dem jeweils verwendeten Mikroorganismus. Sie liegt jedoch im allgemeinen innerhalb des Bereiches von etwa 0,01 bis etwa 0,5 Gew.-%.

Bei dem erfindungsgemäß verwendeten Fermentationsmedium kann es sich entweder um ein synthetisches oder um ein natürliches Nährmedium handein, welches die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus enthält Solche Fermentationsmedien enthalten eine Kohlenstcffquelle, Kohlehydrate, eine Stickstoffquelle und anorganische Verbindungen, dit. von dem verwendeten Mitcroorganismus in bestimmten Mengen verbraucht werden.

Beispiele für verwendbare Kohlehydrate sind Glukose, Fruktose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate und Melasse. Es könner auch geringe Mengen anderer Kohlenstoffquellen, wie Glycerin, Mannit, Sorbit und organische Säuren, in dem Fermen»ationsmedium zusammen mit uen Kohlehydraten verwendet werden.

Beispiele für verwendbare anorganische Verbindungen sind Kaliumphosphat, Magnesiumsuifc., Eisensulfat oder andere Eisensalze, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid und Calciumchlorid.

Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen wie Harnstoff oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und Ammoniumphosphat oder eine oder mehrere Aminosäuren oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, Peptoi.o, Bouillon, Kaseinhydrolysate und Reiskleieextrakt verwendet werden.

Je nach der verwendeten Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle kann es notwendig sein, weitere Nährstoffe dem Nährmedium zuzugeben, z. B. Aminosäuren, wie Asparaginsäure, Threonin, Methionin und/oder Vitamine, wie Biotin, Thiamin und Kobalamin.

Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen, z. B. unter aeroben Schütteln der Kultur oder unter Rühren einer Submerskultur, bei einer lnkubierungs-

älur von etwa e.
von etwa 5 bis 9 durchgeführt.

Nach Beendigung der Kultivierung kann das Nikotinamidader.innukleotid auf an sich bekannte Weise, z. B. durch ionenaustauscherharzbehandlung, Ausfällen mit Metallsalzen, Extraktion, Adsorption oder Chromatographie aus der Kulturflüssigkeit abgetrennt werden.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung. Falls nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht.

Beispiel 1

Als Impfbakterium wurde Corynebacterium sp. ATCC 21084 verwendet. Es wurde 24 Stunden lang bei 30⁰C in einem Nährmedium der folgenden Zusammensetzung kultiviert: 2% Glucose, 1% Peptone, 1% Hefeextrakt, 0,3% NaCl und 30μg/l Biotin. Die impfkuitur wurde dann in einer Menge von 10 Vol.-% zu einem Fermentationsmedium der folgenden Zusam- !o mensetzung pro Liter Wasser gegeben:

100 g Glukose
6 g Harnstoff
1,0% K₂H PO*
1,0% KH₂PO₄
1,0% MgSO₄ · 7H₂O

1,0% Bouillon
30 μg Biotin

Der Harnstoff wurde getrennt als 12%ige Lösung sterilisiert. 19-ml-Portionen einer wäßrigen Lösung, welche die anderen Fermentationsmedium^ckomponenten enthielt, wurden einzeln in Kolben gegossen. Diese Kolben wurden in einem Autoklav 10 Minuten lang bei t kg/cm² sterilisiert Dann wurde 1 ml der sterilisierten

Harnstofflösung jedem Kolben vor dem Überimpfen der Impfkultur zug^eg·—-

Die Kombination von li.jpf- und Fermentationsmedien wurde in 20-nil-Portionen in konische Kolben mit einem Inhalt von jeweils 250 ml gegossen.

Die Kultivierung wurde dann unter aerobem Schütteln bei 30° durchgeführt Nach 24stündiger Kultivierung wurde Polycxyäthylenstearylamin dem Fermentationsmedium in einer Konzentration von 1 mg/ml zugegeben. Adenin und Nikotinamid wurde dem Medium in einer Konzentration von 2 mg/1 zugesetzt. Die Kultivierung wurde anschließend weitere 96 Stunden lang durchgeführt. Es zeigte sich, daß 5,30 mg/ml Nikotinamidadenindinukleutid gebildet worden waren und sich in der Kulturflüssigkeit angereichert hatten. Es wurde durch eine lonenaustauscherbehandlung gewonnen.

Mit dem gleichen Medium und unter den gleichen Bedingungen wie verstehend beschrieben wurde ein Vergleichsversuch durchgeführt, wobei diesmal jedoch kein Pt voxyäthylensiearylamin dem Medium zugesetzt wurde. Die gebildete Menge an Nikotinamidadenindinukleotid betrug 0,8 mg/mg.

Beispiel 2

Es wurde das gleiche Kultivierungsverfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt wobei diesmal jedoch Arthrobacter sp. ATCC 21085 als Mikroorganismus verwendet •A'urde und Otyltrimethylammoniumbromid als oberflächenaktives Mittel in einer Konzentration von 1 mg/ml verwendet wurde. Die Menge des in der Kulturflüssigkeit angereicherten Nikotinamidadenindinukleotids betrug 4,/ mg/ml.

Unter den gleichen Bedingungen, jedoch ohne Zugabe von Cetyltrimethylammoniumbromid, wurde eine Vergleichskuitivierung durchgeführt. Die Menge an gebildetem Nikotinamidadenindinukleotid betrug dabei nur 0,7 mg/ml.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von Nikotinamidadenindinukleotid durch Kultivierung eines Mikroorganismus in einem Adenin und/oder Nikotinamid enthaltenden wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Corynebaclerium sp. ATCC 21084. Arthrobacter sp. ATCC ι ο 21085 oder Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 verwendet wird und daß die Kultivierung bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40⁰C und bei einem pH-Wert von etwa 5 bis 9 in einem Nährmedbrn durchgeführt wird, das ein oberfläehenaktives Mittel aus der Gruppe der Polyoxyäthylensorbitanfettsäureester mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Poiyoxyäthyienaikylamine mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Polyoxyäthylenalkyläther mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Polyoxyäthy-Icnalkylallyläther mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Alkyltrimetnylammoniumhalogenide mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Alkylbenzyldimethylammoniumhalogenide mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Alkylpyridiniumhalogenide mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der Alkylbetaine mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, der höheren Fettsäureester und höheren Fettsäureamide enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung in einem Nährmedium durchgeführt wird, welches das oberflächenaktive Mittel in einer Menge von etwa 0,01 bis 0,5 Gew.-% enthält.