DE1642706B2

DE1642706B2 - Verfahren zur mikrobiellen herstellung von guanosindi- und -triphosphat

Info

Publication number: DE1642706B2
Application number: DE1964K0062339
Authority: DE
Inventors: Shukuo Tokio; Nakayama Kiyoshi Sagamihara; Nara Takashi To io; Sato Zenroku Machida; Tanaka Haruo. Tokio; Kinoshita (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1963-10-30
Filing date: 1964-10-27
Publication date: 1976-12-23
Also published as: DE1257148B; DE1261858B; GB1079529A; GB1065380A; US3296089A; US3296088A; BR6463844D0; DE1277856B; BE655014A; CH459230A; FR1459747A; US3313710A; GB1080426A; DE1642706A1; NL6412534A; ES308770A1; FR1440633A

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrowellen Herstellung von Guanosindi- und -triphosphat

Guanosindiphosphat (GDP) und Guanosintriphosphat (GTP) spielen eine wichtige Rolle beim Stoffwechsel und als biochemische Reagentien sowie als Reagentien mit energiereichen Phosphatbindungen und sind daher für die Herstellung von Arzneimitteln von Bedeutung.

Die Herstellung von GDP und GTP erfolgte bisher durch chemische Synthese oder nach einem enzymatisehen Verfahren auf Hefebasis, bei dem man von Guanosin ausgeht. Die mit diesen bekannten Verfahren erzielbaren Ausbeuten sind jedoch verhältnismäßig gering, so daß eine großtechnische Herstellung von GDP und GTP damit nicht möglich ist Außerdem hat das bekannte enzymatische Verfahren den Nachteil, daß eine große Menge Hefe erforderlich ist, so daß GDP und GTP aufgrund ihrer kostspieligen Herstellungsverfahren verhältnismäßig teuer sind.

Gegenstand des älteren deutschen Patents 14 45 977 ist ein großtechnisch durchführbares Verfahren, mit dessen Hilfe man auf mikrobiellem Wege durch Züchten der Stämme ATCC 6871 oder 6872 von Brevibacterium ammoniagenes in einem Nährmedium, das einerseits Pantothensäure, Pantothensäuresalz, Pantethein, /5-Alanin oder Coenzym A und andererseits Vitamin Bt oder dessen Salze bzw. diese Substanzen enthaltende Naturstoffe enthält, aus Guanin Guanosinmonophosphat in guten Ausbeuten herstellen kann.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Guanosindiphosphat und Guanosintriphosphat anzugeben, mit dessen Hilfe es möglich ist, diese beiden wichtigen Substanzen auf wirtschaftliche Weise großtechnisch herzustellen.

Es wurde nun gefunden, daß sich beim Verfahren gemäß Patent 14 45 977 in der Kulturflüssigkeit neben dem Guanosinmonophosphat auch Guanosindiphosphat und Guanosintriphosphat in beträchtlichen Mengen anreichern.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur mikrowellen Herstellung von Guanosindiphosphat und -triphosphat durch Züchten der Stämme ATCC 6871 oder 6872 von Brevibacterium ammoniagenes in einem Nährmedium, das neben üblichen Nährstoffen Pantothensäure, Pantothensäuresalze, Pantethein, ^-Alanin oder Coenzym A, Vitamin Bi oder dessen Salze oder diese Substanzen enthaltenden Naturstoffe sowie Guanin oder Guanosin enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das im Kulturmedium angereicherte Guanosindiphosphat und -triphosphat von dem gleichzeitig gebildeten Guanosinmonophosphat auf an sich bekannte Weise abgetrennt wird.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, Guanosindiphosphat und Guanosintriphosphat auf verhältnismäßig einfache Weise in großtechnischem Maßstab unter Erzielung hoher Ausbeuten herzustellen.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet sich jedes übliche Nährmedium, das eine Kohlenstoffquelle, z.B. Kohlehydrate, wie Glucose, Hydrolyseprodukte von Stärke oder Melassen, eine Stickstoffquelle, wie Harnstoff, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, anorganische Salze, wie Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat Calciumchlorid und stickstoffhaltige Naturstoffe, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt Pepton, Caseinaminosäuren, Fischextrakt in geeigneten Mengenverhältnissen enthält. Die Zugabe von Pantothensäure, Pantothensäuresalzen, Pantethein, /?-Alanin oder Coenzym A, Vitamin Bt oder dessen Salzen bzw. diese Substanzen enthaltenden Naturstoffen erfolgt zur Stabilisierung des Wachstums der Mikroorganismen und der Fermentation. Guanin oder Guanosin kann dem Nährmedium gleich zu Beginn oder während der Züchtung zugegeben werden. Besonders große Mengen an GDP und GTP werden in der Kulturflüssigkeit angereichert wenn die Konzentration an dem Nährmedium zugegebenem anorganischem Phosphat berechnet als PO4, oberhalb 0,4 Gew.-% liegt. Die besten Ergebnisse werden mit PCvKonzentration zwischen 0,4 und 1,6% erhalten. Während der Fermentation können je nach Bedarf auch Glucose und andere Nährstoffe dem Nährmedium zugegeben werden.

Guanin oder Guanosin, berechnet als Guanin, wird dem Nährmedium in einer Menge von 1 bis 10 mg Guanin pro cm³ zugegeben.

Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, z. B. in einer Schüttelkultur oder in einer Submerskultur unter Rühren und Belüften, bei einer Temperatur von 20 bis 40°C. Nach einer Züchtungsdauer von 36 bis 120 Stunden haben sich in der Kulturflüssigkeit GDP und GTP angereichert. Die Ausbeute an GDP und GTP kann erhöht werden, wenn der pH-Wert des Nährmediums nach der Zugabe von Guanin oder Guanosin zwischen 7,5 und 5,5 gehalten wird, beispielsweise durch Zugabe eines geeigneten Neutralisationsmittels, wie wäßriger Natronlauge.

Das in der Kulturflüssigkeit angereicherte GDP und/oder GTP wird nach Beendigung der Züchtung auf an sich bekannte Weise, beispielsweise unter Anwendung einer Ionenaustauscherharzbehandlung, durch Adsorption, Fällung oder Extraktion, abgetrennt.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Die darin angegebenen Prozentangaben beziehen sich, wenn nichts anderes angegeben ist, auf das Gewicht.

Beispiel 1

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 wurde in einem 2% Glucose, 1% Pepton, 1% Hefeextrakt 0,3% NaCI und 30 μg/I Biotin enthaltenden Impfmedium 24 Stunden lang bei 30° C gezüchtet.

Ein Nährmedium der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung wurde mit 10 Vol.-% des erhaltenen Impfmediums beimpft. Die Züchtung wurde als Schüttelkultur bei 30° C durchgeführt

Das verwendete Nährmedium hatte die folgende Zusammensetzung:

Glucose

Harnstoff

KH₂PO₄

K₂HPO₄

MgSO₄ · 7H₂O

Biotin

Calciumpantothenat

100 g

6g
10g
10 g
10g
30 μg

2 mg

Die obigen Substanzen wurden unter Auffüllen auf 1 liter in Wasser gelöst, und der pH-Wert des Nährmediums wurde vor der Sterilisation mit NaOH auf 8,0 eingestellt. 20-cm³-Anteile des beimpften Nährmediums wurden in 250-cm³-Erlenmeyerkolbcn gegeben und zum Züchten verwendet, nachdem 3 g CaCO₃ *e 100 cm³ Medium hinzugegeben und sie 10 Minuten lang im einem Autoklav unter einem Druck von 1 kg/cm² sterilisiert worden waren.

Nach 72stündigem Züchten des auf diese Weise beimpften Nährmediums wurde eine solche Menge Guanin zugegeben, daß in der Kulturflüssigkeit eine Guaninkonzentration von 2 mg/cm³ erreicht wurde. Nach weiterem 48stündigem Züchten hatten sich in der Kulturflüssigkeit 2,0 mg/cm³ GTP (berechnet als freie Säure) gebildet. Nach Zugabe des Guanins wurde der pH-Wert durch Zugabe von Natriumhydroxyd zwischen neutral und schwach sauer gehalten. Am Ende der Züchtung betrug der pH-Wert 5,8.

Es wurden nur 0,26 mg/cm³ GTP gebildet, wenn kein Guanin zugegeben wurde und sonst die gleichen Bedingungen herrschea Der End-pH-Wert betrug in diesem Falle 6,2.

Das durch Entfernung der Bakterienzellen aus der Kulturflüssigkeit erhaltene Ritrat wurde durch eine Säule mit einem stark basischen Anioriecausiauscherharz geleitet, und das GTP wurde mit verdünnter Salzsäure eluiert Diese Fraktion wurde mit wäßriger

ίο Natriumhydroxydlösung neutralisiert, noit Aktivkohlepulver behandelt, eingeengt und gekühlt, um das Natriumsalz von GTP zu erhalten.

Beispiel 2

Es wurde Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871 verwendet 100 g Glucose, 6 g Harnstoff, 6 g KH₂PO₄, e g K₂HPO₄, 6 g MgSO₄ · 7H₂O und 3 g Hefeextrakt wurden in Wasser unter Auffüllen auf 1Uter gelöst Der pH-Wert wurde auf 6,0 eingestellt und die Lösung in Erlenmeyerkolben gegossen. CaCO₃ wurde in einer Menge von 3 g/100 cm³ Lösung zugegeben, und dann wurde in einem Autoklav unter einem Druck von

1 kg/cm² 10 Minuten sterilisiert Das auf diese Weise erhaltene Medium wird als Nährmedium verwendet

Nach 72stündigem Züchten wurde eine solche Menge Guanin zugegeben, daß eine Guaninkonzentration von

2 mg/cm³ erreicht wurde. Nach der Zugabe des Guanins wurde weitere 24 Stunden lang gezüchtet Es wurden 0,57 mg/cm³ GTP und etwas GDP gebildet.

Claims

Patentanspruch:

':' Verfahren zur mikrowellen Herstellung von Guanpsindi- und -triphosphat durch Züchten der S Stämme ATCC 6871 oder 6872 von Brevibacterium aramoniagenes in einem Nährmedium, das neben üblichen Nährstoffen Pantothensäure, Pantothensäuresalze, Pantethein, jJ-Alanin oder Coenzym A, Vitamin Bi oder dessen Salze oder <'iese Substanzen enthaltenden Naturstoffe sowie Guanin oder Guanosin enthält, dadurch gekennzeich ".ti, daß das im Kulturmedium angereicherte Guanos^;cdiphosphat und -triphosphat von dem gleichzeitig gebildeten Guanosinmonophosphat auf an sich bekannte Weise abgetrennt wird.