DE1695304A1

DE1695304A1 - Verfahren zur Herstellung von 5'-Inosinsaeure und 5'-Guanylsaeure-Nucleotiden

Info

Publication number: DE1695304A1
Application number: DE19681695304
Authority: DE
Inventors: Shigeo Abe; Akira Furuya; Ryo Okachi
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1967-03-18
Filing date: 1968-03-15
Publication date: 1972-04-13
Also published as: DE1695304C3; FR1556191A; GB1184133A; US3620921A; DE1695304B2; IT1009007B

Description

»Verfahren zur Herstellung von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure-Nucleotiden"

Zus amme nfas sung;

Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von 5'-Inosinsäure und 5^f-Guanylsäure-Nucleotiden, wie z.B. 5'-Guanosinmonophosphat, 5'-Guanosindiphosphat und 5'-Guanosintriphosphat, durch Fermentation, wobei mutante Stämme von Mikroorganismen mit geeigneten Eigenschaften unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen, 5'-Xanthylsäure enthaltenden Nährmedium gezüchtet werden. Die Produkte sind z.B. als Würzstoffe brauchbare

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure-Nucleotiden, wie z.B. 5'-Guanosinmonophosphorsäure, 5'-Guanosindxphosphorsäure und 5'-Guanosintriphosphorsäure. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure-Nucleotiden durch Fermentation» Speziell betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung dieser Substanzen durch Fermentation mit mutanten, spezielle Eigenschaften aufweisenden Stämmen.

SJ'-Guanylsäure-Nucleotide und 5'-Inosinsäure sind in der Technik verbreitet als Wiirzstoffe verwendet worden· Weiterhin sind sie wichtige Stoffe auf dem Gebiet der Medizin. Die Verfahren nach dem bisherigen Stand der Teohnik zur Herstellung dieser Produkte jedoch weisen zahlreiche Nachteile auf, einschließlich der zu ihrer Durchführung erforderlichen hohen Kosten, sowie der erhaltenen niedrigen Ausbeuten.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure-Nucleotiden, das die Nachteile und Mängel der bisherigen Verfahren ausschaltet·

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure-Nucleotiden durch Fermentation, welches auf wirksame und einfache Art und Weise durchgeführt werden kann.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren

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zur Herstellung von 5'-Inos±nsäure und 5' —Guanylsäure-Nucleotiden durch Fermentation, welches vorteilhaft im industriellen Maßstab bei niedrigen Kosten mit hohen
Produktausbeuten durchgeführt werden kann«

Ein weiteres Ziel der Erfindung sind 5'-Guanylsäure-Nucleotide, wie z.B. 5^l-G-uanosinmonophosphat,
5'-Guanosindiphosphat und 5'-Guanosintriphosphat, sowie 5'-Inosinsäure·

Diese und weitere Ziele und Vorteile der Erfindung gehen für den Fachmann aus der folgenden Beschreibung und den Ansprüchen hervorο

Die vorliegende Erfindung ist gekennzeichnet durch die Züchtung von Mikroorganismen mit der Fähigkeit, 5'-Inosinsäure zu produzieren und außerdem jy'-Xanthvlsäure säure-Nucleotide umzuwandeln, und zwar mit hoher Ausbeute in einem wässrigen, 5'-Xanthylsäure enthaltenden Nährmedium. 5'-Inosinsäure wird in der sich ergebenden Kulturflüssigkeit angereichert und gleichzeitig wird 5'-Xanthylsäure in y-Guanylsäure-Nucleotide umgewandelt. Die Gewinnung der Produkte wird auf übliche Art und Weise ausgeführt·

Nach zahlreichen Untersuchungen hinsichtlich der Produktion von Nucleotiden durch Fermentation ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung gelungen, Mutanten und Mikroorganismen zu erzeugen, welche die Fähigkeit besitzen, wesentliche Mengen an 5'-Inosinsäure anzureichern und darüberhinaus

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mit hoher Ausbeute in 5'-Guanylsäure-Nucleotide umzuwandeln. Die vorliegende Erfindung schlägt daher ein industriell durchführbares Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung dieser Produkte bei niedrigen Kosten vor«.

Die für das Verfahren der Erfindung verwendeten . Mikroorganismenstämme sind Mutanten, die induziert werden, indem man zu verschiedenen Gattungen gehörende Mikrοorganism men mit UV-Strahlung oder Kobalt-6Ü-Gammastrahlen usw. bestrahlt, oder sie mit chemischen Mitteln, wie z.B. Dimethylsulfat, salpetriger Säure, Nitrosoguanidin usw. behandelt. Die erhaltenden Mutanten besitzen die Eigenschaften, daß sie für ihr Wachstum Adeninverbindungen (Adenin, Adenosin oder Adenylsäure) unbedingt benötigen, oder daß sie zur Beschleunigung ihres Wachstums Purinverbindungen benötigen. Wie oben angegeben, reichern diese Mutanten wesentliche Mengen an 5'-Inosinsäure in der Kulturflüssigkeit an. Darüberhinaus sind sie gleichzeitig dadurch charakterisiert, daß sie die Fähigkeit besitzen, die zu dem Züchtungsmedium hinzugesetzte 5'-Xanthylsäure mit hoher Ausbeute in 5'-Guanylsäure-Nucleotide umzuwandeln. Mutanten mit anderen Nährstoffbedarfs-Eigenschaften (z.B. solche, die für ihr Wachstum Aminosäure, Vitamine, Purine, Pyrimidine und dgl» benötigen) außer den obigen speziellen Merkmalen werden ebenfalls erhalten·

Entweder ein synthetisches oder ein natürliches Nährmedium ist für die vorliegende Erfindung geeignet, solange es die für das Wachstum des verwendeten Stammes not—

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wendigen Nährstoffe enthält. Solche Nährstoffe sind in der Technik bekannt; zu ihnen gehören Substanzen wie eine Kohlenstoff quelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Substanzen und ogl., die durch den verwendeten Mikroorganismus in geeigneten Mengen ausgenutzt werden. So können als Kohlenstoffquelle beispielsweise Kohlenhydrate, z.B. Glucose, Fructose, Maltose, Sucrose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen usw·, oder jede andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie organische Säuren, z.B. Essigsäure, Milchsäure, Glutaminsäure usw. genannt werden. Diese Substanzen können entweder einzeln oder in Gemischen zweier oder mehrerer verwendet werden. Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Terbindungen verwendet werden, wie z.Bο Harnstoff, flüssiger Ammoniak oder Ammoniumsalze, z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat, usw. oder natürliche stickstoffhaltige Stoffe, wie z.B. Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Caseinhydrolysate, Casaminosäure, Fischpreßsäfte, Reiskleieextrakt usw. Auch diese Substanzen können entweder allein oder als Kombination von zwei oder mehreren verwendet werden. Anorganische Stoffe, die zu dem Züchtungsmedium hinzugefügt werden können, sind z.B. Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat usw. Selbstver-

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ständlich können in dem wässrigen Nährmedium auch geeignete Purin- und Pyrimidinverbindungen vorliegen.

Darüberhinaus sollten im Falle der Verwendung von Stämmen mit speziellen Nährstoff-Bedürfnissen entsprechende Substanzen zu dem Züchtungsmedium hinzugesetzt werden» Dazu gehören, wie oben angegeben, Substanzen wie Aminosäuren, Vitamine, Purine, Pyrimidine, Biotin usw„

Außerdem kann es vorteilhaft sein, in dem Züchtungsmedium oberflächenaktive Substanzen zu verwenden, z.B. diejenigen, die in der schwebenden Anmeldung Serial No. 643,832, eingereicht am 6, Juni 1967, beschrieben werden, auf die hier im Hinblick auf die oberflächenaktiven Mittel Bezug genommen wird. Die zu dem Medium hinzuzufügenden oberflächenaktiven oder Disperiermittel können anionisch, kationisch ojader nichtionisch seino Solche Substanzen sind in der Technik bekannt und umfassen allgemein Materialien, wie die Natriumsalze von höhermolekularen Alkylsulfaten oder -sulfonaten, Polyoxyäthylenglycolderivate, höhere Fettsäuren mit 12-20 Kohlenstoffatomen, z.B. Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure und dgl., organische Ester von höheren Fettsäuren, wie z.B. Sofbitanmonooleat usw.

Wenn die erfindungsgemäß mutanten Stämme in einem wie oben beschriebenen Nährmedium gezüchtet werden, wird 5'-Inosinsäure in der erhaltenen Kulturflüssigkeit angereichert. Die zu dem Züchtungsmedium hinzugefügte 5'-Xanthyl-

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säure wird in 5'-Gruanylsäure-Nucleotide umgewandelt, und dementsprechend werden diese Substanzen ebenfalls in der enstehenden Kulturflüssigkeit angereichert. Die 5'-Xanthylsäure kann entweder zum Zeitpunkt des Einimpfens des Mikroorganismus in das Fermentationsmedium oder nach dessen üfachstum hinzugegeben werden. Die hinzugefügte Menge an 5'-Xanthjlsäure beträgt im allgemeinen 5,ü-3ü mg/ml. Die verwendete Menge kann jedoch in Abhängigkeit von den verwendeten Stämmen variierenο

Verschiedene Formen der 5^f-Xanthylsäure können als Zusatz zu dem Medium verwendet werden. Die Bezeichnung "5'-Xanthylsäure" soll in der vorliegenden Erfindung alle diese Formen umfassen. Z.B. kann 5'-Xanthylsäure von hoher Reinheit verwendet werden oder es können rohe 5^I-Xanthylsäure, 5'-Xanthylsäure enthaltende Substanzen oder 5*-Xanthylsäure enthaltende Kulturfliissigkeiten, die durch Fermentation erhalten worden sind, verwendet werden, wenn das Wachstum der Mikroorganismen, die Anreicherung von 5'-Inosinsäure oder die Umwandlung in 5'-Guanylsäure-Nucleotide dadurch nicht nachteilig beeinflußt werden.

Die Fermentation oder Züchtung der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen, wie z.3. aerobem Schütteln der Kultur oder durch Rühren und Belüftung einer Submerskultur, bei einer Temperatur von etwa 20-40 C und einem pH-Wert von etwa 5,5-9,0 durchgeführt. Während der Züchtung

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ist es erwünscht, den pH-Wert der Kulturflüssigkeit einzustellen, und zwar mit balzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Ammoniakwasser, Kaliumhydroxid oder Natriumhydroxid usw., abhängig von den speziellen verwendeten Stämmen,, Kach etwa 2 bis 8 Tagen der Züchtung unter diesen Bedingungen werden wesentlichen Mengen an 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure-Nucleotiden, nämlich 5'-Guanosinraonophosphorsäure, 5'-Guanosindiphosphorsäure und 5'-Guanosintriphosphorsäure, einzeln oder im Gemisch in der entstandenen Kulturflüssigkeit und in den Mikroorganismenzellen gefunden.

Nach Beendigung der Züchtung können die 5'-Guanylsäure-Nucleotide und 5'-Inosinsäure entweder als einzelne Terbindungen oder im Gemisch gemäß üblichen Yerfahren gewonnen werden, z.B. durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, Lösungsmittelextraktion, Ausfällung, Adsorption, Chromatographie und dgl.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, jedoch nicht begrenzen. Falls nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben in der gesamten Erfindung auf das Gewicht pro Liter Wasser. Die erfindungsgemäß vorteilhaft verwendeten Mikroorganismenstämme werden in den Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

Brevibacterium ammoniagenes IXG-21 ATCC 21172 wird als Einsaatstamm verwendet. Dieser Stamm ist eine Mutante, die

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erhalten worden ist durch Behandlung von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 mit UY-Strahlen. Dieser mutante Stamm ist Adenin-bedürftig <> Das Einsaatbacterium wird in einen Medium gezüchtet, das 2 % Glucose, 1 % Pepton, 1 % Hefeextrakt und 0,3 # Natriumchlorid enthält, und zwar 24 Stunden lang bei 30⁰C. Das Einsaatmedium besitzt einen pH-Wert von 7,2.

Die entstandene Einsaatkultur wird in einer Menge von 10 Vol.-# in das Fermentationsmedium eingeimpft. ml-Anteile des Einsaat- oder Fermentationsmediums werden in 250 ml-Erlenmeyerkolben eingefüllt und nach Sterilisation (10 Minuten lang bei 120⁰C unter Druck) verwendet« Das Fermentationsmedium besitzt folgende Zusammensetzung:

10 φ Glucose 0,6 % Harnstoff 1,0 £

1,0 $ ₂₄ 1,0 # MgSO₄ . 7H₂O 0,01 % CaCl₂ . 2H_£0 30 u g/l Biotin 20 mg/1 Adenin 5 mg/1 Vitamin B₁ 10 mg/1 Calciumpantothenat 1,0 £ Fleischextrakt

Der pH-Wert des Mediums wird mit verdünntem Natriumlydroxid auf 7,8 eingestellt. 5'-Xanthvlsäure (80 % Reinheit)

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ist vor der Einimpfung des Einsaatstammes in das Fermentationsmedium in einer solchen Menge zu dem Fermentationsmedium hinzugegeben worden, daß sich eine Endkonzentration von 25 mg/ml ergibt.

Die Züchtung wird dann unter aerobem Schütteln der Kultur 120 Stunden lang bei 30⁰C durchgeführte Der pH-Wert des Mediums wird während der Züchtung mit verdünntem Ammoniakwasser auf 7,5 eingestellt, beginnend 72 Stunden nach Anfang der Züchtung und dann bis zur Beendigung. Nach Abschluß der Fermentation werden 1O₁8 mg/ml 5'—Guanosinmonophosphorsäure, 2,4 mg/ml 5'-Guanosindiphosphorsäure, 8,2 mg/ml 5'-Guanosintriphosphorsäure und 12,7 mg/ml 5'-Inosinsäure in der Kulturflüssigkeit angereichert gefunden. Kleine Mengen an 5'-Xanthylsäure, Guanosin, Guanin und Hypoxanthin sind ebenfalls in der Fermentationsflüssigkeit angereichert«

Ein Liter des Filtrates, das man erhalten hat, indem man die Mikroorganismenzellen von der Kulturflüssigkeit abfiltrierte, wird mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt und an Aktivkohle adsorbiert. Die mit äthanolischem Ammoniak erhaltene Abflußlösung wird dann konzentriert. Danach wird der pH-Wert der konzentrierten Lösung auf 2,5 eingestellt und die Lösung durch ein Anionenaustauscherharz (Dowex-1, Cl-Form) geschickt und mit Salzsäure eluiert. Es werden Fraktionen erhalten, die 5^f-Inosinsäure, 5'-Guanosinmonophosphorsäure, 5'-Guanosindiphosphorsäure und 5'-Guanosin-

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triphosphorsäure enthalten· Die Lösungen, die diese Fraktionen enthalten, werden auf einen pH—Wert von 7,0 eingestellt und unter vermindertem Druck eingeengt. Äthanol wird hinzugefügt und das Gemisch der Natriumsalze von 5¹-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure~Nucleotiden abgetrennt. Die Ausbeute beträgt 21,4 g.

Das Gemisch der Natriumsalze wird wiederum durch ein Anionenaustauscherharz (Dowex-1, Cl-Form) geschickt, und die vier daran adsorbierten Verbindungen, 5'-Inosinsäure, 5'-Guanosinmonophosphorsäure, 5'-Guanosindiphosphorsäure und 5'-Guanosintriphosphorsäure, werden fraktioniert eluiert und auf aiese Weise voneinander getrennt.

Der pH-Wert einer jeder Fraktionslösung wird auf 7,U eingestellt und die Lösungen unter vermindertem Druck konzentriert. Äthanol wird hinzugefügt und jede der Verbindungen in Form des Natriumsalzes abgetrennt. Die Ausbeute beträgt 8,7 g 5'-Inosinsäure, 8,2 g 5'-Guanosinmonophosphorsäure, 1,8 g Guanosindiphosphorsäure und 6,7 g Guanosintriphosphorsäure·

Beispiel 2

Brevibacterium ammoniagenes IXG-21 ATCC 21172 wird wiederum als Einsaatstamm verwendet. Eine Einsaatkultur wird unter Verwendung desselben Mediums und derselDen Bediigmgen wie in Beispiel 1 erhalten.

Die entstandene Einsaatkultur wird in einer Menge von 1ü Vol.-% in ein Fermentationsmedium der folgenden

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Zusammensetzung eingeimpft:

15 # Glucose 0,6 # Harnstoff

ΰ,5^ MgSO₄ . 7H₂O

0,01 % CaCl₂ . 2H₂O

10 mg/1 FeSO₄ .

1 mg/1 ZnSO₄ . ₂

3 mg/1 MnCl₂ . 4H_£0

5 mg/1 Vitamin B₁

10 mg/1 Calciumpantothenat

30 mg/1 Adenin

30 pg/1 Biotin

1,0 # Fleischextrakt

Die Züchtung wird 72 Stunden lang bei 35⁰C durchgeführt. Dann wird eine 5'-Xanthylsäure enthaltende Fermentationsflüssigkeit (enthaltend 30 mg/ml 5'-Xanthylsäure) in einer äquivalenten Menge zu der Fermentationsflüssigkeit des vorliegenden Beispiels hinzugefügt. Außerdem wird ein oberflächenaktives Mittel, Cation F2-50 (Alkyldimethylbenzylammoniumohlorid, hergestellt von Nippon Yushi Co., Ltd.) zu dem Medium in einer Menge von 3,0 mg/ml hinzugegeben. Die
Züchtung wird dann weitere 48 Stunden lang durchgeführt.
Während der Züchtung wird eine Ammoniumchloridlösung in
einer solohen Menge zu dem Medium hinzugefügt, daß sich eins

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von 0,5$ ergibt.Der pH-Wert des Mediums wird Ig95304

\während der Züchtung /

Endkonzentration/mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf

7,6 eingestellt.

Wach Abschluß der Fermentation sind 8 mg/ml 5¹—Inosinsäure, 4 mg/ml 5'-Guanosinmonophosphorsäure und 7 mg/ml 5'-Guanosintriphosphorsäure in der Kulturflüssigkeit angereichert worden. Zusätzlich finden sich kleine Mengen an 5'-Guanosindiphosphorsäure, 5'-Xanthylsäure, Guanosin und Guanin in der Kulturflüssigkeit.

Beispiel 3

Der rautante Stamm Corynebacterium glutaminum IXG-31 ATCC 21173 wird als Einsaatbacterium verwendet. Diese Mutante wird durch Behandlung von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 mit Nitrosoguanidin erhalten. Der mutante Stamm ATCC 21173 besitzt die spezielle Eigenschaft, daß sein Wachstum durch Adenin, Guanin oder Hypoxanthin erheblich beschleunigt wird» Eine Einsaatkultur dieses Stammes wird in einer Menge von 10 Vol.-# in ein Fermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung eingeimpft:

13 # Glucose

1,0	% KH₂PO₄
1,0	# K₀HPO. 2 4
1,0	% MgSO₄ . 7H_£0
1,5	% NH.Cl 4
0,5	# Hefeextrakt
	CaCO₃

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Das Fermentationsmedium besitzt einen pH-Wert von 7,3. Zum Zeitpunkt des Einimpfens der Einsaatkultur in das Fermentationsmedium wird außerdem 5'-Xanthylsäure in einer Menge von 20 mg/ml hinzugefügt. Die übrigen Züchtungsbedingungen entsprechend den in Beispiel 1 beschriebenen. Nach 120 Stunden der Züchtung sind 8,1 mg/ml 5'-Inosinsäure, 7,5 mg/ml 5'-Guanosinmonophosphorsäure und 8,4 mg/ml 5'-Gruanosindiphosphorsäure in der Kulturflüssigkeit angereichert worden. Die Anreicherung kleinerer Mengen an 5'-Xanthylsäure, Guanosin und Guanin konnte ebenfalls in der Fermentationsflüssigkeit beobachtet werden«

Beispiel 4

Unter Verwendung desselben Einsaatmediums und Fermentationsmediums, wie sie in Beispiel 1 beschrieben worden sind, wird die Züchtung 120 Stunden lang unter aerobem Schütteln bei 30⁰C unter Verwendung der in Tabelle 1 angegebenen Mutanten von verschiedenen Arten von Mikroorganismen durchgeführt. Die übrigen Züchtungsbedingungen waren mit denjenigen von Beispiel 1 identisch, mit der Abwandlung, daß zum Zeitpunkt des Einimpfens 5'-Xanthylsäure in einer Menge von 20 mg/ml hinzugesetzt wurde. Die in den entstandenen Kulturflüssigkeiten angereicherten Mengen an 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure-Nucleotiden werden in Tabelle 1 gezeigt.

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Tabelle

verwendete 8 t amme

•i unu Gattung

/Vrthrobacter ureafaciens :^;- a c 111 u s_ me gät er Ium

Brevibacterium ammoniagenes Corynebacterium glutamicum

!!■.'!•■■■.,roiioccus sodünanais as aeru^inosa

l/roteiis tu 1 gar is

^ii^rcina lutea
ksoherichia coIi

Stamm

IXG-Ol IXG-11 IXG-22 IXG-32 IXG-41 IXG-51 IXG-61 IXG-71 IXG-81 IXG-91

Mutation

hervorgerufen durch |Menge an angereicherten
Nucleotiden (mg/ml)

5'-IMP*'

5'-GDP* 5'-GTP

UV-Strahlen r-Strahlen **' Nit r ο s ο guani di η UY-Strahlen Nitrosoguanidin UV-Strahlen Diäthylsulfat salpetrige Säure] Nitrosoguanidin J^-Strahlen 8,8
4,3

6,8
4,5
4,5
5,3
5,1
5,9

2,5

7,3

2,1
7,3
4,3
8,3

3,8

Spuren
Spuren

8,6

3,8

2,4 4,5

3.3 2,6

4.4 6,5 2,8 6,4 Spuren 3_f3 2,4 7,3

2,8
1,4
2,5
2,6

4,3 2,5

Spuren . 4,4

iAumerkungj: **^ j^-Strahlen von Kobalt-60 ■* ' " " * 5'-IMP » 5'-Inosinsaure

* 5'-GMP ■-■■ 5^f-Guanosin-l-phosphorsäure < 5^:-GDP = 5'-Guanoain-2-phosphorsäure

* 5'-GTP ~ 5^l-Guanosin-3-phosphorsäure

Aus den obigen Beispielen geht hervor, daß erfindungsgemäß Mikroorganismenstämrae verwendet werden können, die zu einer Vielzahl von Gattungen gehören· Die Hauptanforderung besteht darin, daß der verwendete Stamm imstande sein muß, 5'-Inosinsäure zu produzieren und 5'-Xanthylääure in die gewünschten 5'-Guanylsäure-Nueleotide umzuwandeine

Aus dieser Beschreibung der Erfindung ist ersichtlich, daß sie in vielfacher Hinsicht variiert werden kann· Solche Variationen sind nicht als Abweichung von Grundgedanken und Geltungsbereich der Erfindung anzusehen, sondern alle solchen Modifikationen sollen in den Bereich der folgenden Patentansprüche fallen.

Patentansprüche

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Claims

Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure-Nucleotiden, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus, der imstande ist, 5'-Inosinsäure zu produzieren und weiterhin 5'-Xanthylsäure in 5'-Guanylsäure-Nucleotide umzuwandeLn, unter aeroben Bediigmgen in einem wässrigen, 5'-Xanthylsäure enthaltenden Nährmedium züchtet, wobei gleichzeitig 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure-Nucleotide in der entstehenden Kulturflüssigkeit angereichert werden, und daß man die 5'-Inosinsäure und die 5'-Guanylsäure-Nucleotide daraus gewinnt.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus verwendet, der zu einer der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacteriura, Microbacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Proteus, Sarcina oder Escherichia gehörte

3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 20-40 C

und einem pH-Wert von etwa 5,5-9,0 durchführt,

4) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium etwa 5,0-30 mg/ml 5'-Xanthylsäure enthält.

5) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erhaltenen 5'-Guanylsäure-Nucleotide zu der Gruppe 5'-Guanosinmonophosphorsäure, 5'-Guanosindiphosphorsäure und

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5'-Guanosintriphosphorsäure gehören.

6) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine 5'-Xanthylsäure enthaltende Kulturflüssigkeit

zu dem Medium hinzufügt·

7) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium außerdem ein oberflächenaktives Mittel enthält·

8) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zu Beginn der Züchtung 5'-Xanthylsäure zu dem Nährmedium hinzufügt·

9) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die 5'-Xanthylsäure nach Beginn der Züchtung zu dem Nährmedium hinzufügt·

10) Verfahren zur Herstellung von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure-Nucleotiden, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus, der imstande iat, 5'~Inosinsäure zu produzieren und außerdem 5'-Xanthylsäure in 5 *-Guanylsäure-Nucleotide umzuwandeln, und der zu einer der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Proteus, Sarcina oder Escherichia gehört, unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 20-40⁰C und einem pH-Wert von etwa 5,5-9,0 in einem wässrigen, 5^f-Xanthylsäure enthaltenden Nährmedium züchtet, wobei gleichzeitig 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure-Nucleotide in der sich ergebenden Kulturflüssigkeit angereichert werden, und daß man die 5'-Inosinsäure

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und die 5'-Guanylsäure-Nucleotide daraus gewinnt.

11) Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium etwa 5,0-30 mg/ml 5'-Xanthylsäure enthalte

12) Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die erhaltenen 5'-Guanylsäure—Nucleotide zu der Gruppe 5^I-Guanosinmonophosphat, 5'-Guanosindiphosphat und 5'-Guanosintriphosphat gehören.

13) Verfahren nach Anpruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium außerdem ein oberflächenaktives Mittel enthält.

14) Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Brevibacterium
amraoniagenes ATCC 21172 verwendet.

15) Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Corynebacterium
glutamicum ATCC 21173 verwendet.

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