DE1695349A1 - Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnucleotiden - Google Patents

Description

K 790 - S/B

Kyowa Hakko Kogyo Go₀, Ltd., Tokyo / Japan

Verfahren zur Herstellung von 5'—Purinnucleotiden

Zusammenfassung des Inhalts

Das Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnucleotiden, wie z#B« 5'-Inosinsäure, 5^f-Guanylsäure, 5^1I-Adenylsäure, 5'-Xanthylsäure und 5'-Uridylsäure, durch Fermentation umfasst die Kultivierung eines Mutantenstammes von Brevibacterium ammoniagenes_;der Nucleotide nicht zersetzt,unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium, das als Zusatz eine Purinhase oder ein Purinnucleosid,entsprechend dem gewünschten 5»-Purixinucleotid, enthält«, Der berrorzugte Mikroorganismue ist Brevibacterium ammoniagenes ATOG 21152.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren üur Herstellung von 5»- Purinnucleotiden, insbesondere zur Herstellung von 5'-Purinnucleotiden durch Fermentation. Im speziellen befasst sich die Erfindung mit einem Verfahren zur Herstellung von 5^f-Purinnucleotiden, wie as.B· S'-Inoainsäure, 5'-Guanylsäure, 5*-Adenylsäure und 5'-Uridylsäure, durch Fermentation und genauer ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnucleotiden durch Fermentation mit speziellen Mutantenetämmen von Mikroorganismen.

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Die 5'-liuele ο tide sind bekannte Substanzen, die breite Anwendung, beispielsweise auf dem Nahrungsmittel- und medizinischen Sektor, finden» Die Eigenschaften dieser Verbindungen sind.bekannt und werden beispielsweise in "Merck Index", 7 ο Auflage 1960 erörtert,,

Ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnucleotiden unter Anwendung verschiedener Mikroorganismen wurde bereits in der . japanischen Patentanmeldung 12136/63 ausgeführte Ferner wurde von Nakayama und Mitarbeiten in Patent Official Report 17638, 1966, ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Uridylsäure in hoher Ausbeute durch Zugabe von Uracil zu dem Kulturmedium vorgeschlagen« Es wurde nun festgestellt, daß Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872, das in dem letztgenannten Patent eingesetzt wird, 5*-Uridylsäure unter bestimmten Bedingungen erheblich zersetzt. Tatsächlich hat dieser Stamm von Brevibacterium ammoniagenes die Fähigkeit, 5'-NUcIeOtIdS unter gewissen Bedingungen beträchtlich zu zersetzen. Es gelang nun,einen Mutantenstamm des Elternstamms Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 zu erhalten, der keine Zer~ Setzungseigenschaften aufweist, d»h» die Mutante zersetzt 5^f~ Nucleotide, wie z*B« 5'-Uridylsäurβ,nicht· Diese Mutante wurde duroh Behandlung von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 mit verschiedenen Mutationsquellen erhalten.

Eine Aufgabe der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Erzeugung von ^'-Purinnucleotiden, das die Bachteile und Unzulänglichkeiten bisheriger Verfahren beseitigt,

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Eine weitere Aufgabe besteht in einem Verfahren zur Herstellung von 5t~Purinnucleotiden, wie z«B_e 5»-InasinsSure, 5*-Guanylsäure, 5'-Adenylsäure und 5^f-Uridylsäure, durch Fermentation, das in wirksamer und einfacher Weise durchgeführt werden kann«

Ferner liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von 5^f-Purinnucleotiden durch Fermentation, das in vorteilhafter Weise in technischem Maßstab unter geringen Kosten und Erzielung hoher Produktausbeuten durchgeführt werden kann*, '

Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus ist ein Mutantenstamm, der die Eigenschaft besitzt,Nucleotide nicht zu zersetzen« Der Mutantenstamm wird durch verschiedene Mutationsbehandlungen von Brevibacterium ammoniagenes ATCG 6872 unter Verwendung von Ultraviolettbestrahlung, Behandlung mit Kobalt 60 oder verschiedenen Arten chemischer Reagentien erhalten« Der erhaltene Mutantenstamm ist Brevibacterium ammoniagenes Nr« 5417 ATGG 21152. ... ,

Die Zersetzung verschiedener Nucleotide durch den Mutantenstamm der vorliegenden Erfindung und durch dessen Elternstamm ist in Tabelle I wiedergegeben» Als eine Enzymprobe wurde die durch 72-stündige Kultivierung der obigen Stamme in einem Kulturmedium, das pro Liter Wasser 50 g/l Glucose, 1 g/l KH₂PO₄, 3 g/l

,1 g/l MgSO₄ο7H₂O^ 10·g/l Pepton, 10 g/l Hefeextrakt und 5 g/l Harnstoff aufwies, erhaltene Kulturflüssigkeit verwendet.

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Tabelle I

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Uucleotid Zersetzungsgrad

ATCG 21152 ATCC 6872

5'-Adenylsäure 0 .25

5'«Guanylsäure 0 100

5*~Inosinsäure 0 20

5'-Xanthylsäure . 0 60

5^tUridylsäure 0 80

Bs -wurde auch gefunden, daß der Mutantenstamm Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21152 5*-Cytidylsäure nicht zersetzt*

Gemäß der Erfindung werden also 5'-Purinnucleotide in hoher Ausbeute durch Fermentation erhalten, indem dieser Mutantenstamm unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird. Um 5'"-Ur idyl säure zu erhalten,werd.en Uracil, Uridin oder ein Vorläufer davon oder Orotsäure zu dem Kulturmedium zugesetzt» Andere 5'-Purinnucleotide werden in hoher Ausbeute erhalten, indem zu dem Kulturmedium entsprechende Purinbasen, wie z„B« Hypoxanthin, Guanin, Adenin, deren Nucleoside und dergl, zugesetzt werden» Natürliche Substanzen,die diese Zusätze enthalten, geeignete Derivate davon oder KuItürflüssigkeiten _f welche diese enthalten, können ebenfalls in wirksamer Weise zu dem Kulturmedium zugegeben werden« Die Kultivierung wird dann in Anwesenheit des geeigneten Zu-

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satzes mit dem Brevibacterium ammoniagenes Mutantenstamm Mr. 5417 ATCC 21152 durchgeführt«,

Die nach der vorliegenden Erfindung verwendete Zusammensetzung des Kulturmediums ,die Kultivierungsmethode, die Gewinnungsme«- thode für das Produkt und dergl« sind beispielsweise in den japanischen Patentschriften 12136/63, 17615/63 und 12769/64 beschriebene Im allgemeinen ist sowohl ein synthetisches Kulturmedium als auch ein natürliches Nährmedium für die vorliegende Erfindung geeignet, soweit es die für das Wachstum des verwendeten Stammes wesentlichen Nährstoffe enthalte Derartige Nährstoffe sind bekannt und dazu gehören Substanzen, wie beispielsweise eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und dergl., die von dem verwendeten Mikroorganismus in geeigneten Mengen gebraucht werden«, Als Kohlenstoffquelle können beispielsweise Kohlehydrate, wie z«,B<> Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melasse und dergle oder irgendeine andere geeignete Kohlenstoff— quelle, wie beispielsweise Glycerin,„Mannit, Sorbit, organische Säuren und dergl» genannt werden«, Diese Substanzen können entweder einzeln oder in Gemischen von zwei oder mehreren verwendet werden. Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen, wie z„B» Harnstoff oder Ammoniumsalze, beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat und dergl« oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie z,B, Malsquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Gaaeinhydrolysate, Casaminosäure,

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Reiskleieextrakt und dergle verwendet werden_e Diese Substanzen können ebenfalls entweder einzeln oder in Kombinationen von zwsi oder mehreren verwendet werden» Zu den anorganischen Verbindungen die dem Kulturmedium zugesetzt werden können gehören Magnesiumsulfat, Hatriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat oder andere Eisensalze, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid und dergl». Bei Mutanten,die spezielle Nährstoffe erfordern, müssen Substanzen, die für dieses Wachstum notwendig sind, gleichfalls dem Kulturmedium zugesetzt werden«,

Zu dem Kulturmedium werden auf einmal oder nach, und nach =die geeigneten Purinbasen, Purinnucleoside, natürliche Substanzen,die diese enthalten oder deren Derivate bei Beginn der Kultivierung oder während des Fermentierungsverlaufs zugesetzt« So wird beispielsweise ITracil, Uridin oder Orotsäure dem Kulturmedium vollständig auf einmal oder nach und nach entweder zu Beginn der Fermentation oder während der Fermentation zugegeben, wenn 5*- Uridylsäure hergestellt werden soll» In Jedem Fall wird, wenn Uraoil oder dergleichen in dem Kulturmedium als Charakteristikum des verwendeten Stammes erzeugt wird, oder,wenn Uracil oder dergl» in dem Kulturmedium durch Zusatz von Uracilderivaten erzeugt werden, das gleiche Ergebnis erhalten»

Es sei daraufhingewiesen, daß die Quelle für Purinbasen dem Medium zugesetzt werden kann, indem eine diese Stoffe enthaltende Kulturflüssigkeit zugegeben wird, wobei die Kulturflüssigkeil;

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erhalten wird, indem eine Purinbasen- oder Purinnucleotid— fermentation in Anwesenheit geeigneter Mengen Kohlenstoff— quellen, Stickstoffquellen, anorganischer Substanzen und dergl₀ durchgeführt wirdο

Die gemäß der Erfindung verwendete Fermentation oder das Kultivierungsverfahren wird unter aeroben Bedingungen, wie z«,B« aerobes Schütteln der Kultur oder unter Belüften und Schütteln einer Submerskultur bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40"C und bei einem pH-Wert von etwa 5 bis 9 durchgeführte Nach etwa 2-bis 8-tägiger Kultivierung unter diesen Bedingungen haben sich beträchtliche Mengen 5'-Purinnucleotide in der resultierenden Kulturflüssigkeit sowie in den Bakterienzellen angesammelt©

Wach Beendigung der Fermentation können die erzeugten 5ⁿ·—Purinnucleotide aus der Permentationsflüssigkeit durch übliche Mittel, wie z»B» Ionenaustauschbehandlung, wie im folgenden Beispiel 1 beschrieben, Extraktion mit Lösungsmitteln, Ausfällung mit Metallsalze^ Adsorption, Chromatographie und dergl« gewonnen werden»

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung ohne sie zu begrenzen. Palis nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro Liter Wasser»

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Beispiel 1

Brevibacterium ammoniagen.es ITr* 5417 ATGC 21152 wird als Impfbakterium verwendet. Als Vergleich, wird Brevi/'bacterium ammoniagenes ATGO 6872 verwendet* Die Impfkultüren werden durch. 24-stündiges Kultivieren in einem aus 20 g/l Glucose, 10 g/l Pepton, 10 g/l Hefeextrakt, 2,5 g/l HaCl und 3 g/l Harnstoff bestehenden Kulturmedium erhalten« Die Impfkulturen werden in das Fermentationsmedium in einem Verhältnis von 10 Volumen-^ eingeimpft, 20 ml beider Kulturmedien, d.h.» des Impf mediums und des FermentationsmediumSjwerden je in 250 mlf konische"Kolben gegoßen und vor der Verwendung sterilisiert»

Das verwendete Permentationsmedium weist folgende Zusammensetzung auf:

100 g Glucose

10 g KH₂PO₄

10 g K₂HPO₄

10 g MgSO₄ο7H₂O

0,1 g CaCl₂*2H₂O

10 mg FeS0₄,7H₂0
1 mg ZnSO₄*7H₂O

20 mg Cystein

5 mg Thiamin.

10 mg Calciumpantothenat 30 zug Biotin

6 g Harnstoff

²»5* 5»0 und 10,0 g Pleischextrakt (vergl· Ta-109815/2182 ^{belle 1Z)}

Diese Bestandteile werden in einem Liter destillierten Wasser gewasch.en_e Der" pH-Wert wird vor der Sterilisation auf 8,3 eingestellt»

Stamm

Die Kultivierung wird unter aerobem Schütteln der Kultur in dem !Fermentationsmedium bei 30⁰C durchgeführt. Nach 72-stündiger Kultivierung werden 10 mg/ml Guanin zu dem Medium zugegeben und die Kultivierung fortgesetzt« Die Mengen an Guanylsäure, die sich in der Fermentationsflüssigkeit nach 96-stündiger bzw» 144-stündiger Kultivierung angesammelt haben, sind in Tabelle II wiedergegeben*.

Tabelle II

Zu dem Medium zugesetzte !Fleischextraktmenge

96 Stdo

GMP GDP u, GTP (mg/ml)

144 Std,

GMP GDP Ue GTP (mg/ml)

Brevibacterium
ammoniagenes
Ur_β 5417, ATCC
21152

2,5 g/l

5,0
10,0

9,5

9,3 9,8

15,0

17,4

17,3

10,2

10,1

9,5

Brevibacterium 2,5 ammoniagenes ATCG 6872 5,0	7,5 4,0	7 6	»o »3	1098 15/2182	-	4,2 3,0	5»	Guano sin-*	der Basis	51 7
10,0	1,5	2	,4		1,2	2,			0
GMPs Guanosinmonophosphat (Guanylsäure), GDP, GTPs		auf
diphosphat, Guanosintriphosphat
Sämtliche in Tabelle II aufgeführten Mengen wurden
von GMP berechnet«

1 1 des nach. Entfernen der Bakterienzellen aus der Formen— tationsflüssigkeit (12,4 mg/ml GMP, 3,0 mg/ml GDP und 1,8 mg/ml Qr¹Si) erhaltenen Filtrats wird mit Chlorwasserstoff säure auf einen pH-Wert von 1,2 eingestellt und durch eine Ionenaustausch— harzsäule Diaion SK Mr* 1 (H-Typ) geleitet. Die aus dem FiItrat eluierten GMP enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 7»2 eingestellt. Nach Konzentrierung der erhaltenen Lösung unter vermindertem·Druck werden 8,2g Natriumsalz des GMP erhalten.

Die GDP und GTP enthaltenden Fraktionen werden aus dem gleichen Ablauf an einer Ionenaustauschharzkolonne Diaion SA Nr»21A (Cl-Typ) adsorbiert und mit 0,05 η HGl gewaschen. Anschliessend wird jede GDP und GTP enthaltende Fraktion durch stufenweises Eluieren mit NaGl-haltiger 0,2 bis 0,3 η HGl erhalten.

GDP und GTP werden als Natriumsalze durch Adsorption an Aktivkohle, Waschen mit riatriumhydroxydalkalischer Äthanollösung und Zugabe einer zweifachen Äthanolmenge gewonnen. Die Ausbeuten an GDP bzw» GTP liegen bei 1,4 bzw» 0,8 g. =

Beispiel 2

Die Kultivierung wird mit dem gleichen Impfbakterium unter den gleichen Bedingungen und in dem gleichen Medium, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme durchgeführt, daß 5,0 g Fleischextrakt und Hypoxanthin anstelle von Guanin -fü» dem Me-

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dium zu Beginn der Kultivierung zugegeben werden.

Die Mengen an Inosinsäure, die sich in der erhaltenen Kulturflüssigkeit angesammelt haben, sind in Tabelle III wiedergegeben«,

Tabelle III

Stamm

Zu dem Medium zugesetzte Menge an Hypoxanthin

Menge an angesammelter Inosinsäure nach 72 Std, nach 120 Std,

Brevibacterium
ammoniagenes
JSStρ 5417 ATGO
21152

0 mg/ml
2,5 mg/ml 5,O.mg/ml 7,5 mg/ml

Spur

7,0 mg/ml 14,2 mg/ml 16,8 mg/ml

Spur

9,2 mg/ml 20,3 mg/ml 25,1 mg/ml

Brevibacterium
ammoniagenes
ATGG 6872

0 mg/ml 2,5 mg/ml 5,0 mg/ml 7,5 mg/ml

Spur

7,3 mg/ml 14,5 mg/ml 16,8 mg/ml

Spur

7,5 mg/ml 13,8 mg/ml 14,5 mg/ml

Beispiel 3

Es werden das gleiche Impfbakterium und die gleiche KuIti— vierungsmethode, wie in Beispiel 1 beschrieben, verwendet mit der Ausnahme, daß 2,5 g/l Fleischextrakt und 2 mg/l MnSO-«4H₂O

zu den Medien zugegeben werden«, Nach 24-stündiger Kultivierung en

ward 2 mg/ml Mmin B-21'5 (Polyoxyäthylenalkylämin, hergestellt von Nissan K.K.) zu dem Medium zugegeben. Nach 48~stündiger

en
Kultivierung werd jeweils 5mg der in Tabelle IV aufgeführten

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Purinbase dem Medium zugesetzt» Die Kultivierung wird dann fortgesetzt,, Die Mengen jedes der nach 72-stündiger Kultivierung und 120-stündiger Kultivierung in der erhaltenen KuIturflüssigkeit angesammelten entsprechenden 5^r-Hucleotids sind ■ in Tabelle IV wiedergegeben.

Tabelle IV

Stamm

Purinbasen

Menge an angesammeltem 5^f —Purin-

nucleotid
nach 72 Std, nach 120 Std_o

Brevibacterium

ammoniagenes

Nr₀ 5417 ATCG 21152

Adenin

Guanin

Hypοxanthin

Xanthin

8,0 mg/ml
11,8 mg/ml
12,6 mg/ml

2,2 mg/ml

12,3 mg/ml

16,5 mg/ml

18,0 mg/ml

5,9 mg/ml

Brevibacterium
ammoniagenes
ATGC 6872-

Adenin Guanin Hypoxanthin Xanthin

8,5 mg/ml
10,5 mg/ml
12,3 mg/ml

2,0 mg/ml

8,2 mg/ml

6,2 mg/ml

12,0 mg/ml

1,0 mg/ml

Als Mononucleotid*

Beispiel 4

Brevibacterium ammoniagenes Nr« 5417 ATGG 21152 wird als Impfbakterium verwendet. Brevibacteritim ammoniagenes ATGG 6872 wird als Vergleich verwendet. Die Impfkulturen werden durch 24-stündig« Kultivierung in einem wäßrigen 20 g/l Glucose, 10 g/l Pepton,

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10 g/l Hefeextrakt, 2,5 g/l NaCl und 3 g/l Harnstoff enthaltenden Nährmedium erhalten. Die Impfkultur wird in ein Fermentationsmedium im Verhältnis von 10 Volumen— fo eingeimpfte Dann werden 20 ml "beider Medien (des Impf- und Fermentationsmediums) jeweils in konische. 25-0 ml Kolben gegößen und vor der Verwendung sterilisiert«

Das verwendete Fermentationsmedium wies folgende Zusammensetzung auf:

100 g Glucose 10 mg FeSO.«7H₂O 10 g KH₂PO₄ 1 mg ZnSO₄₄-TH₂O

10 g K₂HPO₄ 20 mg Cystein

10 g MgSO_4#7H₂O 5 mg Thiamin

0,1 g CaCl₂,2H₂O 10 mg Calciumpantothenat 30 Axg Biotin 6 g Harnstoff

5g Fleischextrakt 4 g Uracil

Diese Komponenten werden in einem Liter destillierten Wasser gelöst und der pH-Wert vor der Sterilisierung auf 8,3 eingestellt.

Die nach 72-stündiger bzw, 120-stündiger Kultivierung in der erhaltenen Fermenta tionsf liissigkeit angesammelten Mengen an üridylsäure sind in Tabelle V wiedergegeben.

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Tabelle V

Stamm · Menge an angesammelter 5^?-¥ridylsäure

nach 72 Std» nach 120 Std,

Brevibacterium ammoniagenes 7»5 mg/ml 9»0 mg/ml

ITr₈ 5417 ATCO 21152

Brevibacterium ammoniagenes 7jO mg/ml 4»2 mg/ml

ATGO 6872

11 des nach Entfernen der Bakterienzellen von der Fermentationsflüssigkeit ( 9 mg/ml) erhaltenen Filtrats wird auf einen pH— viert von 1,2 eingestellt und durch eine Ionenaustauschharzkolonne Diaion SK Kr₀ 1 (Η-Typ) gegeben,, Unmittelbar danach wird destilliertes Wasser durch die Kolonne gegeben» Die durch Eluierung des Flltrats erhaltenen 5*-Uridylsäure enthaltenden Fraktionen werden mit deren Waschwässeril· vereinigt und dann mit Natrium hydroxyd auf einem pH-Wert, von 7»2 eingestellt* Die erhaltene Losung wird unter vermindertem Druck konzentriert und gekühlt«, Es werden Natrium-5*-üridylatkristalle in einer Ausbeute von 4_f8 g erhalten.

Beispiel 5

Die Kultivierung wird unter Verwendung des gleichen Impfbakteriums und der gleichen Kultivierungsmethode, wie in Beispiel 4 be« schrieben, mit der Ausnahme durchgeführt, daß 5 mg/ml Uracil, Uridln bzw. Orotsäure zu dem Kulturmedium 72 Stunden nach Beginn der Kultivierung zugesetst werden. Die Mengen an 5^f-Uridyl- säure, die sich in der erhaltenen KuItürflüssigkeit angesammelt

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haben, sind in Tabelle VI wiedergegeben,.

Tabelle VI

Stamm

Zusatz Menge an angesammelter 5'-Uridylsäure nach 96 S-tcL. nach 144 Std₀

Brevibacterium

ammo niagene s

Ir₄₁ 5417 ATCG 21152

üracil . Hrid in Orotsäure 8,0 mg/ml
4,8 mg/ml
5,2 mg/ml

10,5 mg/ml 7,0 mg/ml 7,3 mg/ml

Brevibacterium
aramoniagene s
ATOO 6872

Uracil -^

Uridin

Orotsäure 7,5 mg/ml
5,0 mg/ml
5,2 mg/ml

5,8 mg/ml 4,0 mg/ml 4,8 mg/ml

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Claims (1)

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PATENTANSPRÜCHE

1, Verfahren zur Herstellung von 5^Purinnucleotide^, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Nucleotide nicht zersetzenden Mutantenstamm von Brevibacterium ammoniagenes unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium,das als Zusatz eine dem iü'-Purinnucleotid entsprechende Purinbaseyoder ein Purinnucleosid enthält, kultiviert, das 5*~Purihnucleotid in der erhaltenen Kulturflüssigkeit ansammelt und aus derselben gewinnt*

2_e Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutantenstamm Brevibacterium ammoniagenes ATCG 21152 verwendete

3· Verfahren nach Anspruch^ 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das 5'-Purinnucleotid S'-Inosinsäure, 5'-Guanylsäure, 5^I-Adenvlsäure, 5^t~Xanthylsäure oder 5'—Uridylsäure ist,

4_# Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatz zu dem Medium zu Beginn der Kultivierung zugegeben wird,

5* Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatz zu dem Medium während des Kultivierungsver— fahrens zugegeben wird,

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Verfahren nach. Anspruch 1 bis 5t dadurch, gekennzeichnet, daß äax als Zusatz Guanin verwendet und als S'-Purinnucleotid 5'-Guanylsäure gewonnen wird»

7, Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Zusatz Hypoxanthin verwendet und als 5'-Purinnucleo—

tid 5'-Inosinsäure gewonnen wird«

Verfahren nach Anspruch 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß als Zusatz Adenin verwendet und als 5'-Purinnucleotid 5'-Adenylsäure gewonnen wird« · ■

9c Verfahren nach Anspruch. 1 bis"~5, dadurch gekennzeichnet, daß als Zusatz Xanthan verwendet und als 5'-Purinnucleotid 5'-Xanthylsäure verwendet wird,

10p Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Zusatz Uracil, TJridin oder Orotsäure verwendet und als 5'—Purinnucleotid 5'-Uridylsäure gewonnen wird«

11. Verfahren zur Herstellung von 5^f-Purinnucleotiden, dadurch gekennzeichnet, daß man Brevibacterium ammoniagenes ATGO 21152 unter aeroben-Bedingungen in einem wäßrigen Mhrmedium, das ala Zusatz eine dem 5*-Purinnucleotid entsprechende Purinbase oder ein Purinnucleoeid enthält, kultiviert, das 5'-Purinnucleotid in der erhaltenen Kulturflüssigkeit ansammelt und aus derselben gewinnt,

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12o Verfahren nach. Anspruch. 1 bis 11, dadurch gekennzelehnet, daß man die Kultivierung bei einer Temperatur von etwa 20 bis 4O⁰C und einem pH-Wert von etwa 5 bis 9 durchführt,,

13e Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als 5¹-Purinnucleotid 5^r~Inosinsäure, 5 '-Guanylsatire , 5^r~Adenylsäure, 5'-Xanthylsäure und/oder 5^l-Uridylsäure gewonnen wird*

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