DE1595862C3

DE1595862C3 - Verfahren zur Herstellung von 5 Fluoruracilribosid

Info

Publication number: DE1595862C3
Application number: DE1595862A
Authority: DE
Inventors: Toshio Machida Komuro; Masanaru Kawasaki Misawa; Kiyoshi Sagamihara Nakayama; Takashi Tokio Nara
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1965-07-19
Filing date: 1966-07-19
Publication date: 1973-11-08
Also published as: DE1595862A1; CA924255A; US3650897A; GB1148058A; DE1595862B2

Description

HC

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HO — CH₂ — C — C — C — CH

! OH OH

L..O-

10

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 5-Fluoruracilribosid der Formel

C

F-C NH

35

5-Fluoruracilribosid durch Kultivierung eines Mikro-Organismus in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart der entsprechenden Base.

Aus der österreichischen Patentschrift 205 666 ist es bereits bekannt, daß Nucleoside durch Züchtung eines Mikroorganismus in Gegenwart der entsprechenden Base als Vorläufer hergestellt werden können. Nach den Angaben in dieser Patentschrift ist es möglich, auf diese Weise 6-Azauracilribosid durch Züchtung von Escherichia coli in Gegenwart von 6-Azauracil herzustellen. ■ ■. . ■ ■ ._T . ., ■ . ■ . .

In J. American Chemical Society, 83, (1961) S. 4060 bis 4065, ist die Herstellung von 5-FIuoruracilribosid durch chemische Synthese beschrieben. Diese Synthese ist jedoch umständlich und kostspielig.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Herstellung von 5-Fluoruracilribosid anzugeben, das in großtechnischem Maßstabe wirtschaftlich durchgeführt werden kann und zu hohen Produktausbeuten führt. ■ i^;6o

Es wurde nun überraschend gefunden, daß 5-Fluoruracilribosid durch Kultivierung bestimmter Mikroorganismen in wäßrigen Nährmedien unter aeroben Bedingungen in Gegenwart der entsprechenden Base auf einfache und wirtschaftliche Art und Weise hergestellt werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein Verfahren zur Herstellung von 5-Fluoruracilribosid durch Kultivierung eines Mikroorganismus in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart der entsprechenden Base, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus den Stamm ATCC19062 der Art Bacillus subtilis oder den Stamm ATCC 19063 der Art Streptomyces fradiae einsetzt, die Kultivierung bei 20 bis 40° C und einem pH-Wert von 5 dis 9 durchführt und die Base in einer Menge von 0,1 bis 10 mg/ml dem Kulturmedium zusetzt.

Nach .dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, 5-Fluoruracilribosid auf fermentativem Wege in hohen Ausbeuten nach einem großtechnisch durchführbaren wirtschaftlichen Verfahren herzustellen. Das erfindungsgemäß hergestellte 5-Fluoruracilribosid hat die oben angegebene Formel und stellt ein bekanntes Antikrebsmittel dar (vgl. zum Beispiel die USA.-Patentschriften 2 721 866 und 2 724 711). Die erfindungsgemäß erhältliche Verbindung ist außerdem von Bedeutung als Antagonist des Nucleinsäurestoffwechsels (vgl. zum Beispiel A. L i η d η e r et al., »Experimental Cell Research«, Ergänzungsband 9, [1963], S. 485 bis 511).

Die bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens angewendeten Kultivierungsbedingungen entsprechen den üblicherweise für Fermentationsprozesse angewendeten Bedingungen. Für die Durchführung eignet sich sowohl ein synthetisches Kulturmedium als auch ein natürliches Nährmedium, sofern es die für das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus-Stammes wichtigen Nährstoffe enthält. Derartige Nährstoffe sind bekannt; dazu gehören eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Verbindungen.

Als Kohlenstoffquelle können z. B. Kohlehydrate, wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke oder Stärkehydrolysate, verwendet werden. Auch andere Kohlenstoffquellen, wie z. B. Glycerin, organische Säuren und Glutaminsäure, können verwendet werden. Es kann sowohl eine einzige Kohlenstoffquelle als auch ein Gemisch von zwei oder mehreren Kohlenstoffquellen eingesetzt werden.

Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen, wie z. B. Harnstoff oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und Ammoniumphosphat, oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie z. B. Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Kaseinhydrolysat, Casaminosäure, lösliche Fischprodukte und Reiskleieextrakt, verwendet werden. Auch die stickstoffhaltigen Substanzen können entweder einzeln oder in Kombination von zwei oder mehreren verwendet werden.

Zu.den anorganischen Verbindungen, die dem erfindungsgemäß verwendeten Kulturmedium zugesetzt werden können, gehören Salze, wie z. B. Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat,. Eisensulfat und andere Eisensalze, Manganchlorid, Calciumchlorid, sowie andere geeignete Salze von z. B. Magnesium und Zink.

Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen, z. B. unter aerobem Schütteln der Kultur oder Rühren einer Submerskultur unter Belüftung, bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40⁰C und einem pH-Wert von 5,0 bis 9,0 durchgeführt. Nach etwa zwei- bis zehntägiger Kultivierung haben sich beträchtliche

Mengen des gewünschten 5-Fluöruracilribosids in der Kulturflüssigkeit sowie in den Zellkörpern selbst angesammelt.

Nach Beendigung der Kultivierung kann das 5-Fluoruracilribosid aus der Fermentationsflüssigkeit auf übliche Weise, z. B. durch Ionenaustauscherharzbehandlung, Extraktion mit Lösungsmitteln, Ausfällung mit Metallsalzen oder Adsorption, gewonnen werden.

Die zuzufügende Menge an 5-Fluoruracil-Base liegt zwischen etwa 0,1 bis 10 mg/ml des Kulturmediums.

Das folgende Beispiel soll die Erfindung näher erläutern. Falls nicht anders angegeben, beziehen sich die %-Angaben darin auf Gramm pro 100 Milliliter Wasser.

Beispiel

Als Impfbakterium wurde Bacillus subtilis ATCC 19062 verwendet. Dieser Stamm wurde in einem Kulturmedium, bestehend aus 2% Glucose, 1% Pepton, l°/₀ Hefeextrakt, 0,25 °/₀ NaCl und 30 μ g/l Biotin bei 30⁰C 24 Stunden lang kultiviert. Der pH-Wert des Kulturmediums wurde auf 7,3 eingestellt. Das erhaltene Impfmedium wurde in einer Menge von 10 Volumprozent in ein Fermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung eingeimpft:

10% Glucose,
1 % Hefeextrakt,
1%(NH₄)₂SO₄,
0,6% K₂HPO₄,
0,6% KH₂PO₄,

0,6% MgSO₄-7H₂O,
2% CaCO₃.

Der pH-Wert des Fermentationsmediums wurde mit

ίο 5n Natriumhydroxyd vor der Sterilisierung eingestellt. Dann wurden 30-ml-Anteile des Gemisches aus Impfkultur und Fermentationsmedium in einzelne konische 250-ml-Glasgefäße gegossen und sterilisiert.
Die Kultivierung wurde dann unter aerobem Schütteln bei 3O⁰C durchgeführt. Nach 68stündiger Kultivierung wurde 5-Fluoruracil zu der Kulturflüssigkeit zugegeben, um eine Konzentration von 2 mg/ml zu erhalten. Nach 120stündiger Kultivierung hatten sich 2,5 mg/ml 5-Fluoruracilribosid in der

ao Fermentationsflüssigkeit angesammelt. Das erhaltene 5-Fluoruracilribosid wurde durch Chromatographie mittels eines stark anionischen Polystyrol-Austauscherharzes (Formiattyp) gewonnen, F. 177 bis 178⁰C.
Die gleichen Ergebnisse wurden bei Verwendung von Streptomyces fradiae ATCC 19063 als Impfbakterium erhalten.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von 5-Fluoruracilribosid durch Kultivierung eines Mikroorganismus in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart der entsprechenden Base, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den Stamm ATCC19062 der Art Bacillus subtilis oder den Stamm ATCC 19063 der Art Streptomyces fradiae einsetzt, die Kultivierung bei 20 bis 4O⁰C und einem pH-Wert von 5 bis 9 durchführt und die Base in einer Menge von 0,1 bis 10 mg/ml dem Kulturmedium zusetzt.