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Verfahren zur fermentativen Herstellung von Nicotinsäureamiddinucleotid
Die, Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Nicotinsäureamiddinucleotid
durch Züchten von Mikroorganismen in einem üb-
lichen wäßrigen Nährmedium
unter aeroben Bedingungen, Temperaturen von etwa 20 bis etwa 40'C und pH-Werten
von etwa 5,5 bis 9,0, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als
Mikroorganismen die Stämme ATCC Nr. 6872, 6871, 15750 oder 15751 von
Brevibacterium ammoniagenes verwendet und dem Nährmedium Nicotinsäure, Nicotinsäureamid,
ein Gemisch aus diesen beiden Substanzen oder ein Gemisch von einer oder beiden
dieser Substanzen mit Adenin und/oder einem Adeninderivat zusetzt.
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Als Adeninderivat wird vorzugsweise Adeninribosid oder Adeninribotid
verwendet.
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Gemäß dem bisherigen Verfahren wird zur Herstellung von Nicotinsäureamiddinucleotid
die sehr kleine Menge an Nicotinsäureamiddinucleotid, die in den Zellen von Hefen
gebildet worden ist, extrahiert. Demgegenüber wird erfindungsgemäß eine erheblich
größere Menge an Nicotinsäureamiddinuclootid (etwa 1 mg/ml oder mehr) in
der Kulturflüssigkeit bestimmter Stämme von Brevibacterium ammoniagenes (außerhalb
der Mikroorganismenzellen) gebildet. Demzufolge kann gemäß der vorliegenden Erfindung
Nicotinsäureamiddinucleotid nach einem wesentlich einfacheren Verfahren und ohne
Notwendigkeit einer Extraktionsstufe in industriellem Maßstab hergestellt werden.
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Nicotinsäureamiddinucleotid ist das Coenzym der Apozymase, die für
die alkoholische Gärung der Glucose erforderlich ist. Nicotinsäureamiddinucleotid
ist auch unter den Bezeichnungen Coenzym I, Codehydrogenase I, Cozymase und Diphosphopyridinnucleotid
bekannt und spielt eine wichtige Rolle bei biochemischen Reaktionen.
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Zur Züchtung des erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismus sind
Kulturmedien geeignet, die eine übliche Kohlenstoffquelle, z. B. Kohlenhydrate,
wie Glucose, Stärkehydrolysate, Melassen, eine Stickstoffquelle, z. B. Harnstoff
oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, anorganische Verbindungen,
z. B. Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Kaliumchlorid und natürliche stickstoffhaltige
Substanzen, z. B. Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl,
in entsprechenden Mengen enthalten. Wenn Stämme verwendet werden, die von bestimmten
Nährstoffen abhängig sind, so sollen diese Nährstoffe dem Kulturmedium zugegeben
werden.
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Der Zusatz von Nicotinsäure, Nicotinsäureamid, einem Gemisch dieser
beiden Verbindungen oder einem Gemisch von einer oder beiden dieser Substanzen,
mit Adenin und/oder seinen Derivaten, zum Züchtungsmedium kann während der Fermentation
insgesamt oder anteilsweise in Zeitabständen erfolgen.
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Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen, z. B. in einer belüfteten
und gerührten Submerskultur oder in aerober Schüttelkultur, vorgenommen. Gewöhnlich
hat sich das Verfahrensprodukt nach einer Züchtungsdauer von 2 bis 8 Tagen
in großen Mengen angesammelt.
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Nach der Beendigung der Fermentation wird das Nicotinsäureamiddinucleotid
durch übliche Behandlung mit Hilfe von Ionenaustauscherharzen oder durch bekannte
Adsorptionsverfahren isoliert.
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Beispiel 1
Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872
wird
in einem Kulturmedium, das 20/,Glucose, 1 % Pepton, 1 % Hefeextrakt,
0,3 % NaC1 und 30 #tg Biotin je Liter Wasser enthält, 24 Stunden
bei 30'C
gezüchtet, und ein Fermentationsmedium wird dann mit 10 Volumprozent
der erhaltenen Kulturflüssigkeit beimpft. 20-em3-Proben des auf diese Weise beimpften
Fermentationsmediums werden in sterilisierte 250-em"-Erlenmeyerkolben gebracht.
Es wird eine aerobe Schüttelkultur bei 30'C durchgeführt.
Das
Fermentationsmedium weist die folgende Zusammensetzung (je Liter) auf:
100 g Glucose 6 g Harnstoff 10 g KH,P04 10 g
K,HP04 10 9 M9S04'7 H90 0,1 g CaC1, - 2 H,0 10 g Hefeextrakt
30#tg Biotin Das Ferinentationsmedium wird wie folgt hergestellt: Eine 120/,ige
Harnstofflösung wird sterilisiert. 19 cms einer wäßrigen Lösung, die die
anderen Bestandteile des Fermentationsmediums enthält, wird in einen Kolben gegeben
und in einen Drucksterilisationsgefäß unter einem Druck von 1 kg/cm2
10 Mi-
nuten sterilisiert. Das Fermentationsmedium wird dann durch Vermischen
gleicher Mengen der Harnstofflösung und der Lösung, die die anderen Bestandteile
enthält, erhalten.
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Nach 72ständiger Fermentation werden 2 mg Nicotinsäureamid je Kubikzentimeter
Fermentationsflüssigkeit zugegeben. Sodann wird weitere 24 Stunden gezüchtet. Zu
diesem Zeitpunkt hat sich Nicotinsäureamiddinucleotid in der Ferinentationsflüssigkeit
in einer Menge von 0,91 Mg/CM3 angesammelt. Das Produkt wird durch übliche Ionenaustauscherharzbehandlung
isoliert.
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Beispiel 2 Es wird in der gleichen Weise wie nach Beispiel
1
gearbeitet, nur werden zusammen mit der genannten Menge Nicotinsäureamid
2 mg Adenin je Kubikzentimeter Fermentationsflüssigkeit zugegeben. Nach Ablauf
der angegebenen Zeit haben sich 1,9 mg Nicotinsäureamiddinucleotid
je Kubikzentimeter Fermentationsflüssigkeit angesammelt.
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Beispiel 3
Es wird in der gleichen Weise wie nach Beispiel 2
gearbeitet, nur werden an Stelle des Nicotinsäureamids 2 mg Nicotinsäure
je Kubikzentimeter Fermentationsflüssigkeit zugegeben. Es werden
1,9 mg Nicotinsäureamiddinucleotid je Kubikzentimeter Fermentationsmedium
erhalten.
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Beispiel 4 Es wird in der gleichen Weise wie nach Beispiel 2 gearbeitet,
jedoch unter Verwendung von Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr.
6871, 15750
bzw.
15751 an Stelle des im Beispiel 2 verwendeten Stammes Brevibacterium
ammoniagenes ATCC Nr.
6872. Die angesammelten Mengen an Nicotinsäureamiddinucleotid
sind in der folgenden Tabelle angegeben:
| Angesammelte |
| Menge an |
| Nicotinsäureamid- |
| dinucleotid |
| (mg/crns) |
Brevibacterium ammoniagenes
| ATCC Nr. 6871 ........................... 1,2 |
| ATCC Nr. 15750 .......................... 4,0 |
| ATCC Nr. 15751 .......................... 4,2 |