DE1807265C

DE1807265C - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Threonin

Info

Publication number: DE1807265C
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Sagamihara; Tanaka Haruo Machida; Käse Hiroshi Koganei; Nakayama (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Publication date: 1972-08-31

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Threonin durch Züchten von Mikroorganismen in Sorbit als Kohlenstoffquelle und Diaminopimelinsäure und/oder Lysin enthaltenden Nährmedien. *

L-Threonin ist als sogenannte essentielle Aminosäure für die Ernährung von Mensch und Tier von Bedeutung. Getreideprotein enthält nur wenig L-Threonin; daher wird L-Threonin als Ergänzungsaminosäure zur Verbesserung des Nährwertes von Getreideprotein verwendet.

Zur Herstellung von L-Threonin sind bisher synthetische und proteolytische Verfahren angewendet worden. Obgleich bereits Versuche zu einer fermentativen Herstellung von L-Threonin unternommen worden sind, waren diese Verfahren im industriellen Maßstab anfangs nicht erfolgreich, insbesondere nicht, wenn ein so kostspieliges Ausgangsmaterial wie L-Homoserin als Ausgangsmaterial verwendet wurde (vgl. USA.-Patentschrift 3 099 064; japanische Patentschrift 2986/61 und Sugawaraet al., »Amino Acid and Nuclsic Acid«, Bd. 10, S. 68 [1964]) oder wenn die Anreicherung des Produktes in der Fermentationsflüssigkeit gering war (USA.-Patentschriften 2 937 121 und 2 937 122).

Aus der britischen Patentschrift 863 765 ist ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Threonin durch aerobe Züchtung von Escherichia coli ATCC 13070 und ATCC 13071 in einem Sorbit oder Mannit als Kohlenstoffquelle und die üblichen Nährstoffe sowie, bei Verwendung von Escherichia coli ATCC 13071,100 bis 140 mg/Liter Diaminopimelinsäure und, bei Verwendung von Escherichia coli ATCC 13070, 100 bis 250 mg/Liter Diaminopimelinsäure und bis zu 100 mg/Liter i.-Methionin enthaltenden wäßrigen Nährmedium bekannt.

Aufgabe der Erfindung ist ein verbessertes biotechnisches Verfahren zur Herstellung von i.-Threonin.

Diese Aufgabe wird beim vorliegenden Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Threonin durch Züchten von Mikroorganismen in Sorbit als Kohlenstoffquelle und Diaminopimelinsäure und/oder Lysin enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Verhältnissen dadurch gelöst, daß als Mikroorganismen Bacillus megaterium ATCC 21209, Arthrobacter paraffineus ATCC 21322, Aerobacter arogenes ATCC 21321 oder Serratia marcescens ATCC 21212 eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen gehören zu den Arten Aerobacter, Serratia, Arthrobacter und Bacillus..Das Wachstum der erfindungsgemäß vervvendetenspeziellenMikroorganismenstämme ist diaminopimelinsäureabhängig. Hinsichtlich ihrer Diaminopimelinsäureabhängigkeit bestehen zwei Möglichkeiten, entweder ist für das Wachstum unbedingt Diaminopimelinsäure erforderlich, öderes ist Diaminopimelinsäure oder Lysin für das Wachstum erforderlich.

ίο Die erfindungsgemäß verwendeten Nährmedien enthalten als Kohlenstoffquelle Sorbit. Als Stickstoffquelle können verschiedene anorganische oder organische Salze oder Verbindungen verwendet werden, z. B. Harnstoff, Ammoniak oder Ammoniumsalze,

is wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphoshpat, oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischexu uKt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Caseinhydrolysate, Fischpreßsäfte,

ao Reiskleieextrakt usw. Diese Stoffe können einzeln oder als Gemische von zweien oder mehreren verwendet werden. Anorganische Substanzen, die zu dem Medium hinzugegeben werden können, sind z. D. Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat usw.

Die erfindungsgemäß verwendeten Nährmedien müssen entweder Diaminopimelinsäure oder Lysin oder eine diese Stoffe enthaltende Substanz enthalten. Diese Zusatzstoffe können in verschiedenen Konzentrationen angewendet werden; eine Konzentration von etwa 10 bis etwa 300 mg/1 an Diaminopimelinsäure oder Lysin wird im allgemeinen bevorzugt.

Die Züchtung der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen, z. B. aerobem Schütteln der Kultur oder durch Rühren und Belüften einer Submerskultur, bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C und einem pH-Wert von etwa 4,0 bis 9,5 durchgeführt.

Nach etwa 2 bis 4 Tagen der Züchtung unter diesen Bedingungen sind wesentliche Mengen an L-Threonin in der Fermentationsflüssigkeit produziert und angereichert worden. Nach Abschluß der Züchtung kann das L-Threonin aus der Kühlflüssigkeit mit Hilfe der

♦5 üblichen Arbeitsweisen gewonnen werden, z. B. durch Behandlung mit einem lonenaustauscherharz, Extraktion mit Lösungsmitteln, Adsorption, Ausfällung, Chromatographie od. dgl.

Beispiel 1

Bacillus megaterium ATCC 21209, ein diaminopimelinsäureabhängiger Stamm, wird 24 Stunden lang in einem 20 g/l Glucose, 10 g/l Pepton, 10 g/l Hefeextrakt, 2,5 g/l NaCl und 50 mg/l Diaminopimelin säure enthaltenden Kulturmedium gezüchtet. Impfkultur wird in einem Verhältnis von 10 Volumprozent in einen 250-ml-Erlcnmeycrkolben eingeimpft, der 20 ml eines wäßrigen Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung enthält:

30 g/l Sorbit 14 g/l (NH₄J₂SO₁ 1 g/l KHjPO₄

0,3 g/l MgSO₄ · 7 HjO

5 g/I MaisqueNwasser 200 mg/'l Diaminopimelinsäure 20 g/l CaCO₃

Das Fermentationsmedium wird vor seiner Verwendung sterilisiert.

Die Züchtung wird unter aerobem Schütteln der Kultur bei 30⁰C 96 Stunden lang durchgeführt. Nach Abschluß der Züchtung beträgt die in der Fermentationsflüssigkeit angereicherte Menge an L-Threonin 3,8 mg/ml.

B e i s ρ i e 1 2

Die in Tabelle 1 genannten diaminopimelinsäureabhängigen Bakterienstämme weiden jeweils in einem 20 g/l Glucose, 10 g/l Pepton, 10 g/l Hefeextrakt, 2,5 g/I NaCI und 50 mg/1 Diaminopimelinsäure enthaltenden Kulturmedium gezüchtet. Die Impfkulturen werden in einem Verhältnis von 10 Volumprozent in große Reagenzgläser eingeimpft, die je 10 ml eines Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung enthalten:

20 g/l Sorbit
14 g/l (NH₄J₂SO₄

1 g/l KH₂PO₄

0,3 g/l MgSO₄ · 7 H₂O

5 g/l Maisquellwasser
100 mg/1 Diaminopimelinsäure
20 g/l CaCO₃

Das Fermentationsmedium wird vor seiner Verwendung sterilisiert.

Die Züchtung jedes der Stämme wird unter aerobem Schütteln bei 28° C 96 Stunden lang durchgeführt. Nach 96 Stunden sind die in der Tabelle angegebenen Mengen an L-Threonin von den verwendeten Stämmen in den jeweiligen Fermentationsflussigktiten angereichert worden.

Verwendeter Stamm

Aerobacter aerogenes ATCC 21321
Serratia marcescens ATCC 21212

Beispiel 3

Erhaltene Menge an L-Threonin

3,8 mg/ml
4,3 mg/ml

Arthrobacter paraffineus ATCC 21322, ein diaminopimelinsäureabhängiger Stamm, wird in ein Kulturmedium eingeimpft, das 2% Sorbit, 1% Fleischextrakt, 1 % Pepton, 0,5% Hefeextrakt und 0,3% NaCl enthält. Die Züchtung wird 24 Stunden bei 30⁰C durchgeführtem eine Impfkultur zu erhalten.

2 ml der erhaltenen Impfkultur werden in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben eingeimpft, der 20 ml eines sterilisierten Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung enthält:

30	g/i	mg/1	Sorbit
20	g/I	(NH₄J₂SO₄
2	g/l	KH₂PO₄
2	g/l	K₂HPO₄
1	g/l	MgSO₄ · 7 H₂O
10	mg/1	FeSO, -7H₈O
10	mg/1	MnSO₄ · 7 H₂O
10	mg/1	ZnSO₄
5	mg/1	Thiamin
3	g/l	Hefeextrakt
20 g/l	CaCO₃
100	meso-Diaminopimelinsäure

Die Züchtung wird dann unter aerobem Schütteln

der Kultur bei 30⁰C 96 Stunden lang durchgeführt.

Als Ergebnis sind in der erhaltenen Fermentationsflüssigkeit 4,9 mg/ml L-Threonin angereichert worden.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Threonin durch Züchten von Mikroorganismen in Sorbit als Kohlenstoffquelle und Diaminopimelinsäure und/oder Lysin enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Verhältnissen, dadurchgekennzeichn e t, daß man als Mikroorganismen

Bacillus megaterium ATCG 21209, Arthrobacter paraffineus ATCC 21322, Aerobacter aerogenes ATCC 21321, Serratia marcescens ATCC 21212

einsetzt.