DE1817666C - Verfahren zur Herstellung von L Threonin - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung moniae — ATCC 21 215, — ATCC 21 217, Arthro-

von !.-Threonin durch Züchten von Mikroorganismen bacter paraffineus ATCC 21 218 oder ATCC 21 219

in assimilierbaren Kohlen- und Stickstoff, anorga- einsetzt,

nische Salze und für die jeweiligen Mikroorganismen Mit den erfindungsgemäß zum Einsatz kommenden

erforderliche Wachstumsfaktoren enthaltenden Nähr- 5 Mikroorganismen wird die Menge an L-Threonin, die

medien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Ver- in der Kühlflüssigkeit angereichert wird, wesentlich

hältnissen. heraufgesetzt, wobei die zur Befriedigung der speziellen

L-Threonin ist als essentielle Aminosäure für die Nährstoffbedürfnisse dieser Mikroorganismen erfor-

Ernährung von Mensch und Tier besonders wichtig. derlichen Nährstoffe in einer für das Wachstum dieser

Da der Gehalt an L-Threonin beispielsweise in Ge- io Mikroorganismen optimalen oder geringeren Menge

treideprotein gering ist, stellt L-Threonin eine äußerst im Nährmedium vorliege-.. Dabei ist der Einsatz des

ausschlaggebende Aminosäure zur Erhöhung des Nähr- teuren Homoserine nicht mehr erforderlich. Gegenüber

wertes von Substanzen, wie z. B. Getreideprotein, dar, der britischen Patentschrift 863 765 wird eine um das

indem man diesen L-Threonin zusetzt. 3,5- bis 4fache höhere Ausbeute an L-Threonin erzielt,

Es wurden Verfahren zur Herstellung von L-Thre- 15 d. h. 4,1 bis 10,7 mg/ml erfindungsgemäß gegenüber

onin beschrieben. Eines dieser Verfahren geht von 1 bis 3 mg/ml nach der britischen Patentschrift 863 765

Homoserin als Substrat aus (vgl. USA.-Patent- Darüber hinaus ergibt sich erfindungsgemäß bei Ver-

schrift 3 099 604; japanische Patentveröffentlichung wendung von Glucose als Kohlenstoffquelle eine eben-

2896/61). Nach einem anderen Verfahren wird ein falls gute Ausbeute an L-Threonin (4,1 bis 7,8 mg/ml),

Diaminopimelinsäure bedürftiger Bakteriensiamm be- 20 wie auch i--Threonin in beträchtlicher Ausbeute bei

nutzt (vgl. USA.-Patentschriften 2 937 121 und Verwendung von Mannitol und Sorbitol erzielt wird.

2 937 122). Ernndungsgemäß besteht daher nicnt der Zwang, die

Aus der britischen Patentschrift 863 765 ist ein Ver- Kohlenstoffquelle auf spezielle, dem Nährmedium

fahren zur Herstellung von L-Threonin bekannt, nach zuzufügende Kohlenhydrate zu beschränken. Dies

welchem Mikroorganismen der Gattung Escherichia as sollte als bedeutender Fortschritt gegenüber der be-

coli ATCC 13070 oder 13071 in einem wäßrigen Nähr- kannten Lehre gewertet werden,

medium gezüchtet werden, das Sorbitol oder Mannitol, Das L-Threonin sammelt sich in der Fermen-

eine Stickstoffquelle, eine Magnesiumquelle, eine Ka- tationsflüssigkeit an und kann daraus gewonnen wer-

liumquelle und Spurenelemente enthält, und zwar in den.

Gegenwart von Diaminopimelinsäure und L-Methionin 30 Was die Zusammensetzung des Züchtmediums und

in vorgegebenen Konzentrationen. Die erzielten Aus- das verwendete Züchtungsverfahren anbetrifft, so

beuten an L-Threonin nach dem bekannten Verfahren können die üblichen für die Aminosäurefermentation

sind unbefriedigend. Wenn Glucose als Kohlenstoff- benutzten Arbeitsweisen eingesetzt werden. Es kann

quelle verwendet wird, ergibt sich eine außerordent- also entweder ein synthetisches oder natürliches Nähr-

lich schlechte Ausbeute, weshalb die bekannte Lehre 35 medium, das zur Züchtung der erfindungsgemäß ver-

nur für die Verwendung von Mannitol oder Sorbitol wendeten Stämme geeignet ist, verwendet werden, so-

einen technischen Wert besitzt. Die Beschränkung auf lange es die für das Wachstum der eingesetzten Stämme

diese bestimmten Kohlenstoffquellen stellt jedoch erforderlichen Nährstoffe enthält. Solche Nährstoffe

einen erheblichen Nachteil dar, abgesehen von den sind in der Technik bekannt und umfassen Substanzen,

auch dann noch unbefriedigend niedrigen Ausbeu- 40 wie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, an-

ten. organische Verbindungen u. dgl., die von den Mikro-

Die französische Patentschrift 1 484 846 schlägt ein Organismen in geeigneten Mengen nutzbar gemacht

fermentatives Verfahren zur Herstellung von Threonin. werden können. Als Kohlenstoffquelle können bei-

vor, bei welchem neben Glukose zusätzlich noch spielsweise verwendet werden: Kohlenhydrate, wie

Homoserin als Kohlenstoffquelle verwendet wird; die 45 Glukose, Fruktose, Maltose, Saccharose, Stärke,

dort eingesetzten Mikroorganismen produzieren da- Stärkehydrolysate, Melassen usv., oder jede andere

gegen bei Verwendung von Glukose als Kohlenstoff- geeignete Kohlenstoffquelle, wie organische Säuren,

quelle zur Lieferung der zum Wachstum der Zellkörper z.B. Essigsäure, Milchsäure usw. Diese Substanzen

der Mikroorganismen notwendigen Energie und zur können entweder einzeln oder im Gemisch von zweien

Herstellung von Threonin praktisch kaum Threonin, 5° oder mehreren verwendet werden. Als Stickstoffquelle

wenn kein Homoserin zugefügt wird. können verschiedene Arten anorganischer oder or-

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein Ver- ganischer Salze oder Verbindungen verwendet werden, fahren zur biotechnischen Herstellung von i.-Threonin wie Harnstoff, wäßriges Ammoniak oder Ammoniumzu entwickeln, welches sich inwirksamerundverhältnis- salze, z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, mäßig einfacher Weise bei niedrigen Kosten und unter 55 Ammoniumnitrat. Ammoniumacetat, Ammonium- Erzielung hoher Produktausbeuten in vorteilhafter phosphat usw., oder natürliche stickstoffhaltige Sub-Weise industriell durchführen läßt. Die Nachteile und stanzen, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fletsch· Mangel der bisherigen bekannten Verfahren zur Her- extrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Caseinhydroly* stellung von L-Threonin sollten mit diesem neuen Ver- sate, Casaminosäuren, Fischpreßsäfte, Reiskleieextrakt fahren überwunden und ausgeschaltet werden. 60 usw. Auch diese Substanzen können entweder einzeln

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Her* oder in Kombination von zweien oder mehreren ver·

stellung von i.-Threonin durch Züchten von Mikro· wendet werden, Zu den anorganischen Verbindungen,

Organismen in assimilierbaren Kohlen· und Stickstoff, die dem ZUchtungsmedium hinzugefügt werden kön-

anorganische Salze und für die jeweiligen Mikroofganis· nen, gehören Magnesiumsulfat, Natriumphosphat,

men erforderliche Wachstumsfaktoren enthaltenden η Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummohohydrogen·

Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur* und phosphat, Gisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlo-

ρΗ-Verhältnissen, weichte dadurch gekennzeichnet ist, rid, Natriumchlorid, Zinksulfat usw.

daß ηΊΗΟ als Mikroorganismus Klebsieila pneu· Im Falle der Verwendung von Kohlenwasserstoffe

assimilierenden Mikroorganismen können Kohlenwasserstoffe, ζ. Β, η-Paraffine, Roherdöle, Kerosen u.dgl., im Nährmedium als Kohlenstoffquelle verwendet werden.

Eine wichtige Züchtungsbedingung der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Menge der bedürfnismäßig erforderlichen Nährstoffe (Isoleucin, Methionin, Diaminopimelinsäure und biosynthetische Vorläufer, die diese Verbindungen ersetzen können, oder Quellen von Isoleucin, Methionin und Diaminopimelinsäure) auf solches Ausmaß zu beschränken, daß die Nährstoffbedürfnisse der verbesserten L-Threonin produzierenden Mikroorganismenstämme, die erfind ungsgemäu verwendet werden, befriedigt werden. Dieses notwendige Ausmaß ist die optimale Menge oder weniger, die für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlich ist. Vorzugsweise liegt die Menge jedes dieser in dem Med.\bm vorhandenen Nährstoffe im Bereich von etwa 5 bis 1000 mg/1.

Die Fermentation oder Züchtung der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, z. B. unter aerobem Schütteln der Kultur oder unter Rühren und Belüften einer Submerskultur, und zwar bei einer Temperatur von beispielsweise etwa 20 bis 40⁰C und einem pH-Wert von beispielsweise etwa 4,5 bis 9,5. Nach etwa 2 bis 7 Züchtungstagen unter diesen Bedingungen findet man große Mengen an L-Threonin in der Ferm".ntationsflüssigkeit.

Nach Abschluß der Züchtung kann das L-Threonin mittels üblicher Arbtitsweiscn, z. B. Ionenaustauscherharz-Behandlung, Lösungsmittelextraktion, Ausfällen, Adsorption, Chromatographie od. dgl., gewonnen werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Wenn nicht anders vermerkt, beziehen sich die Prozentangaben auf Gewichts-/Volumprozent.

Beispiel 1

Die L-Threonin produzierenden Klebsiella pneumonia Stämme ATCC 21215 undATCC 21217 werden in einem Impfmedium 24 Stunden lang bei 30°C gezüchtet, das aus 2 % Glukose, 1 % Pepton, 1 % Hefeextrakt, 0,25 °/o NaCl und 50 mg/1 Diaminopimelinsäure besteht. Die so erhaltene Impfkultur wird in einer Menge von 2 ml in einen konischen 250-ml-Kolben eingeimpft, der 20 ml eines sterilisierten Produktionsmediums enthält, das hergestellt worden ist durch Zusatz der die Nährstoffbedürfnisse der verwendeten Stämme befriedigenden Substanzen (wie in Tabelle I gezeigt) zu einem Grundmedium, das die folgenden Bestandteile enthält:

1.4%

0,03%

0,05%

0,025%

0,001%

Glukose
(NH₄J₁SO₄ K₁HPO₄ KH₁PO₄ MgSO₄ · 7 H₁O FeSO₄ · 7 H₁O 4H₁O

0,001 % MnSO₄
2% CaCOj

Die ZUchtung wird dann unter aerobem Schütteln der Kulturen 96 Stunden lang bei 3O⁰C durchgeführt

Tabelle 1	Verwendete 5 Stämme	Zusatzmenge der bedürf nismIBig	L-Me-	Meso-	Produ zierte Menge an
		erforderlichen Substanzen zum Grundmedium mg/1	thiontn	DL-jnino-	!--Threo
Klebsiella			pimelin- säure	nin (g/l)
pneumonae	L-lSO-
	leucin	100
ATCC 21217			200
(me-, dap*)				7,2
ATCC 21215 __		100
(isol-, me",		200
15 dap-*)			7,8
50

*) isol- zeigt Bedürftigkeit für Isoleucin, me" für Methionin; dap~ für Diaminopimelinsäure.
Die gleichen Abkürzungen werden nachstehend verwendet.

Beispiel 2

Es werden die L-Threonin produzierenden Stämme Arthrobacter paraffineus ATCC 21218 und — ATCC 21219 24 Stunden bei 30⁰C in einem Impfmedium gezüchtet, das 2% Sorbit, 1% Pepton, 0,5 °/₀ Hefeextrakt, l°/₀ Fleischextrakt und 0,3 °/₀ NaCl enthält. Die erhaltene Impfkultur wird in 2-mI-Anteilen in konische 250-ml-Kolben eingeimpft, von denen jeder 20 ml eines Produktionsmediums enthält, das hergestellt wurde durch Zugabe der bedürfnismäßig erforderlichen Substanzen, wie in Tabelle 2 gezeigt, zu dem folgenden Grundmedium:

5%	n-Paraffingemisch (Cn-C18)
2%	(NH4)aSO4
0,2%	KH2PO4
0,2%	K2HPO4
0,1%	MgSO4 · 7 H1O
0,001 %	FeSO4 ■ 7 H2O
0,001 %	MnSO4 · 7 H2O
0,001%	ZnSO4
5 mg/1	Thiamin
0,3%	Hefeextrakt
2%	CaCO3

Die Züchtung wird durchgeführt unter aerobem Schütteln während 96 Stunden bei 30⁰C.

Die in der Fermentationsflüssigkeit als Ergebnis der Züchtung produzierten Mengen an L-Threonin gehen aus Tabelle 2 hervor.

SS	Afthrobaeler	Tabelle 2	t*Me-	Meso-	Produ
	paraffineus		(hionin	Diamino	zierte Menge
	65 ATCC 21218	Zusaumenge der bedUrfni»·		pimelin säure	an
verwendete Stamme £«*	(isol-, me-)	mäßig erforderlichen	100		t-Thfi-
OO	ATCC 21219	Substanzen zum Ofundmedlum (mg/1)			mn {,g/i;
(Isol-, dap-)
Mso·	200	10,1
leucin
		10,7
100
100

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von L-Threonin durch Züchten von Mikroorganismen in assimilierbaren Kohlen- und Stickstoff, anorganische Salze und für die jeweiligen Mikroorganismen erforderlichen Wachstumsfakioren enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichenTemperatur- und pH-Verhältnissen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Klebsieila pneumoniae -ATCC 21215, -ATCC 21217, Arthrobacter paraffines -ATCC 21218 oder -ATCC 21219 einsetzt.