DE2730964C3

DE2730964C3 - Verfahren zur Herstellung von L-Lysin auf mikrobiologischem Wege

Info

Publication number: DE2730964C3
Application number: DE2730964A
Authority: DE
Inventors: Kazumi Araki; Tokio Machida; Kiyoshi Sagamihara Kanagawa Nakayama; Yoshitake Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1976-07-09
Filing date: 1977-07-08
Publication date: 1980-10-02
Also published as: AU520674B2; US4169763A; JPS579798B2; FR2357644B1; DE2730964B2; FR2357644A1; GB1577975A; DE2730964A1; JPS539394A; PL199507A1; MX4943E; PL106406B1; AU2687477A; CA1085328A

Description

Die essentielle Aminosäure L-Lysin stellt ein wertvolles Arzneimittel bzw. einen wertvollen Zusatz zu Lebens- und Futtermitteln dar.

Zur Herstellung von L-Lysin auf mikrobiologischem Wege wurden bisher die nachstehenden Verfahren vorgeschlagen: Verfahren unter Verwendung von Mutanten mit einem Bedarf an Homoserin (oder Methionin und Threonin) (vgl. US-PS 2 979439) oder unter Verwendung von Mutanten mit einem NährjtoiYbedarf an Threonin, Methionin, Arginin, Histidin. Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Cystin oder Cystein (vgl. US-PS 3 700557); Verfahren unter Verwendung von Mutanten mit einer Resistenz gegen Lysinanaloge (vgl. US-PS 3 707441), unter Verwendung von Mutanten, die zur Bildung von L-Lysin fähig sind und resistent gegen Bacitracin, Penicillin G oder Polymyxin sind (vgl. US-PS 3687810); sowie Verfahren unter Verwendung von Mutanten mit einem Nährstoffbedarf für Homoserin. Threonin, Threonin und Methionin. Leucin, Isoleucin oder Gemische davon und einer Resistenz gegen Lysin, Threonin, Isoleucin oder deren Analoge (vgl. US-PS 3 708395), und unter Verwendung von Mutanten mit einer Resistenz gegen Lysinanaloge und einem Nährstoffbedarf an Serin, Prolin. Alanin, Nicotinamid, Nicotinsäure, Pantothensäure. Thiamin. Guanin, Adenin, Hypoxanthin oder Vitamin B₁, (vgl. US-PS 3825472).

Aus der DIZ-OS 253f999 ist ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin durch Züchtung einer L-Lysin bildenden Mutante von coryneformen. Glutaminsäure bildenden Bakterien in einem Nährmedium bekannt, das dadurch gekennzeichnet ist. daß man als L-Lysin bildende Mutante einen Mikroorganismus der Art Brcvibactcrium aminogenes, Brevibacterium divaricatum. Brevibacterium flavum. Brcvihactcrium lactofcrmenlum. Brevibacterium roscuin. BrcMhiitcriiim sacchamUticum. Firevibacteriiim immiiriophilitim. ('orvnehactcrium ticctoacidophilum. Comiebaclerium glutamicum, ("oryncbacterium herailis. ('(imiehacterium liliiim. Corynchacteriiiin ciillunae. Microbactcrium ammoniaphilum oder Arlhrobacter sp. in einem ersten Nährmedium züchtet, iliis -issimilicrbare Kohlenstoff- iiml Stickstoffciuellen sowie 2 his I 5(1 ml Liter einer Kuliurhrühe Λ enthält, die bei der Züchtung eines L-Leucin bildenden Mikroorganismus der Art Brevibacterium aminogenes, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium immariophilium, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium callunae, Microbacterium ammoniaphilum oder Arthrobacter sp. in einem zweiten Nährmedium erhalten worden ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Verwendung bestimmter Stämme der Gattung Corynebacterium zu schaffen, die resistent sind gegen mindestens eine Verbindung aus der Gruppe der Asparaginsäureanalogen und Sulfonamide (Sulfa-Arzneistoffe) und die eine merklich verbesserte Fähigkeit zur Bildung von L-Lysin aufweisen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Die Tatsache, daß unter Verwendung von Stämmen der Gattung Corynebacterium mit einer Resistenz gegen mindestens eine Verbindung aus der Gruppe Asparaginsäureanaloge und Sulfonamide die Produktion von L-Lysin auf mikrobiologischem Wege verbessert werden kann, ist bisher nicht beschrieben worden.

Beispiele für Asparaginsäureanaloge sind Asparaginsäurehydroxamat, a-Methylasparaginsäure, /J-Methylasparaginsäure, Cysteinsulfinsäure, Difluorbernsteinsäure und Hadacidin. Beispiele für Sulfonamide (Sulfa-Arzneistoffe) sind Sulfaguanidin. Sulfadiazin, Sulfamethacin, Sulfamerazin, Sulfamethizol, Sulfamethomidin, Sulfamethoxypyridazin, Sulfathiazol, Homosulfamin, Sulfadimethoxin, Sulfamethoxazol und Sulfaisoxazol.

Corynebacterium glutamicum NRRL-B-8182 ist ein Stamm mit einer Resistenz gegen Asparaginsäureanaloge, während Corynebacterium glutamicum NRRL-B-8183 ein Stamm mit einer Resistenz gegen Sulfonamide ist. Der Stamm NRRL-B-8182 ist eine Mutante. die auf folgende Weise erhalten wurde: Zellen von Corynebacterium glutamicum ATCC 21543 mit einer Fähigkeit zur Bildung von L-Lysin (Bedarf an Homoserin und Leucin und Resistenz gegen S-[ß-Aminoäthyl)-cystein; vgl. CA-PS 939518) werden in einem 0,1 η Tris-Maleinsäure-Puffer vom pH-Wert 6,0 in einer Konzentration von 10" Zellen/ml suspendiert. Diese Suspension wurde bis zu einer Endkonzciuration von 0,2 mg/ml mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin versetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschließend wurde die Suspension auf eine Agarplatte mit einem Minimalmedium der nachstehend angegebenen Zusammensetzung mit einem Gehalt an 1 mg/ml Asparaginsäurehydroxamat, einem Asparaginsäureanalogen, ausgestrichen. Der aus den wachsenden Kolonien ausgewählte Stamm unterscheidet sich klar vom Ausgangsstamm ATCC 21 543 in bezug auf die Resistenz gegen Asparaginsiiurchydroxaniat. Der Stamm NRRL-B-SI 83 ist eine Mutante. die auf analoge Weise erhalten wurde, wobei aber eine Agarplatte mit einem Minimalmcdium mit einem Gehalt an I mg- nil SulfiiMK'tliazin. einem Siilfonamid. einstelle von Asparaginsäurehydroxamat verwendet wurde. Der erhaltene Stamm unterscheidet sich in be/im auf seine Re-

sistenz gegen Sulfamethazin und Sulfadiazin vom Ausgangsstamm.

Das Minimalmedium der Agarplatte hatte folgende Zusammensetzung:

7H,Ö
//H₁O

Glucose

Ammoniumsulfat

KH₁PO₄

K₁HPO₄

MgSO₄ · 7H₁O

FeSO₄ ·

MnSO₄

Biotin

Vitamin Β,-hydrochlorid

Methionin

Threonin

Leucin

pH-Wert

0,5

0,3

0,15

0,05

g/dl
g/dl
g/dl
g/dl
g/dl

0,001 g/dl
0,001 g/dl
0,01 g/dl

100
1

50

20

200

7,2

μg/Liter
mg/Liter
mg/Liter
mg/Liter
mg/Liter
g/dl

Die mikrobiologischen Eigenschaften von Corynebacterium glutamicum sind in The Journal of General and Applied Microbiology, Bd. 18 (1967), S. 279 bis 301, beschrieben.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können beliebige synthetische und natürliche Nährmedien verwendet werden, die eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und andere notwendige Nährstoffe enthalten. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Sorbit, Mannit, Glycerin, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen und Endmelassen, Kohlenwasserstoffe, wie n-Paraffine und Kerosin, organische Säuren, wie Essigsäure, Fumarsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure und Bernsteinsäure, und Alkohole, wie Methanol und Äthanol. Beispiele für Stickstoffquellen sind Ammoniak, anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat und Ammoniumacetat, Harnstoff, Amine und andere stickstoffhaltige Verbindungen, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit, Caseinhydrolysat, Fischmehl, aufgeschlossenes Fischmehl, entfettete Sojabohnen, aufgeschlossene entfettete Sojabohnen, Säurehydrolysate von Sojabohnenprotein, verschiedene Mikroorganismenzellen und durch Aufschließen von Mikroorganismenzellen erhaltene Produkte. Beispiele für anorganische Verbindungen sind Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)-sulfat, Mangansulfat und Calciumcarbonat. Sofern im erfindungsgemäßen Verfahren Mikroorganismen mit einem Bedarf an speziellen Wuchsstoffen verwendet werden, so sind diese Wuchsstoffe in den entsprechenden Mengen dem Medium zuzusetzen. In manchen Fällen werden diese Wuchsstoffe als Bestandteile von natürlichen Produkten, beispielsweise zusammen mit der Stickstoffquclle, zugesetzt.

Die Produktivität an L-Lysin durch den erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismus läßt sich weiter steigern, indem man eine Leucin-Gärflüssigkcit zusetzt, wie in Beispiel 3 erläutert ist. In diesem Fall wird vorzugsweise eine Lcucin-Gärflüssigkcit in einer Menge von 0,2 bis 15 Volumprozent, bezogen auf das Medium, zugegeben.

ferner läßt sich die Produktivität des crfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismus an L-Lysin durch Zugabe von verschiedenen anderen Zusätzen zum

Medium steigern, beispielsweise durch verschiedene Antibiotika, a-Aminobuttersäure, Cystein, Norleucin, Leucin, Asparaginsäure und Glutaminsäure,

Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen, beispielsweise in einer Schütte!kultur oder in Submerskultur unter Rühren durchgeführt. Die Züchtungstemperaturen betragen im allgemeinen 20 bis 40° C und der pH-Wert des Mediums 3 bis 9, Vorzugsweise wird der pH-Wert um den Neutralpunkt gehalten, die Züchtung kann jedoch auch unter Bedingungen außerhalb dieses Bereichs durchgeführt werden, sofern die verwendeten Mikroorganismen dabei wachsen. Der pH-Wert des Mediums wird beispielsweise unter Verwendung von Calciumcarbonat, organischen oder anorganischen Säuren oder Ammoniak, Alkalihydroxiden oder pH-Puffermitteln eingestellt. Nach einer Züchtungsdauer von 1 bis 7 Tagen hat sich L-Lysin gebildet und in der Gärflüssigkeit angereichert.

Nach beendeter Züchtung werden Niederschläge, wie Zeilen, aus der Gärflüssigkeit entfernt. Das L-Lysin kann nach üblichen Verfahren, wie Behandlung mit Ionenaustauschern, Einengen, Adsorption und Aussalzen, gewonnen werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Als Anzuchtstamm wird Corynebacterium glutamicum NRRL-B-8182 mit einer Resistenz gegen Asparaginsäurehydraxamat verwendet. Der Anzuchtstamm wird auf ein großes 50-ml-Reagenzglas (190 x 20 mm) mit einem Gehalt an 7 ml Anzuchtmedium vom pH-Wert 7,2 überimpft. Das Anzuchtmedium enthält 4 g/dl Glucose, 0,3 g/dl Harnstoff, 0,15 g/dl KH₁PO₄, 0,05 g/dl K₂HPO₄, 0,05 g/dl MgSO₄ · 7H₂O", 50 μg/Liter Biotin, 2 g/dl Pepton und 0,5 g/dl Hefeextrakt. Die Züchtung wird 24 Stunden bei 30° C durchgeführt. 2 ml der erhaltenen Anzuchtkultur werden auf einen 300-fiiI-Erlenmeyer-Kolben mit einem Gehalt an 20 ml Züchtungsmedium vom pH-Wert 7,2 überimpft. Dieses Medium enthält 8,5 g/dl Endmelasse (als Glucose), 2 g/dl Säurehydrolysat von Sojabohnenkuchen (als Sojabohnenkuchen), 0,5 g/dl Ammoniumsulfat, 0,3 g/dl Harnstoff, 0,05 g/dl MgSO₄ · 7H₂O, 0,07"g/dl KH₂PO, und 3 g/ dl Calciumcarbonat. Die Züchtung wird unter Schütteln 3 Tage bei 30° C durchgeführt. In der Gärflüssigkeit haben sich d^nn 35 mg/ml L-Lysin (als Monohydrochlorid, was auch für die nachstehenden Angaben gilt) angereichert. Die Menge an L-Lysin. die bei gleichzeitiger Züchtung des Ausgangsstamms ATCC 21 543 unter den gleichen Bedingungen erhalten wird, beträgt 25 mg/ml.

Nach beendeter Züchtung wird 1 Liter der Gärflüssigkeit des erfindungsgemäßen Stamms zur Entfernung von Zellen und anderen Niederschlägen zentrifugiert. Der Überstand wird zur Adsorption von L-Lysin über eine mit Diaion SK-1 (H *-Form, Handelsbezeichnung für ein stark saures Ionenaustauscherharz der Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) gepackte Säule gegeben. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser mit verdünntem wäßrigen Ammoniak eluiert. Die Fraktionen mit einem Gehalt an L-Lysin werden gesammelt und eingeengt. Der pH-Wert des Konzentrats wird mit Salzsäure auf 2 eingestellt. Sodann wird das Konzentrat gekühlt und mit Äthanol versetzt, wobei L-Lysin auskristallisiert. Man erhält 2(i.5 g L-Lysin-Hydrochlorid in kristalliner Form.

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Beispiel 2

Die Züchtung wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt, wobei als Anzuchtstamm Corynebacterium glutamicum NRRL-B-8183 (mit einer Resistenz gegen Sulfamethazin) verwendet wird. In der Gärflüssigkeit werden 33 mg/ml L-Lysin angereichert. Bei der Züchtung des Ausgangsstamms ATCC 21543 unter den gleichen Bedingungen erhält man 25 mg/ml L-Lysin.

Beispiel 3

Der in Beispiel 1 eingesetzte Stamm Corynebacterium glutamicum NRRL-B-8182 wird als Anzuchtstamm verwendet. Dieser Stamm wird in einen 300-ml-ErIenmeyer-Kolben mit einem Gehalt an 20 ml des in Beispiel 1 angegebenen Anzuchtmediums überimpft. Die Züchtung wird 24 Stunden unter Schütteln bei 28° C durchgeführt. 1 Liter der Anzuchtkultur wird in einen 30-Liter-Glasfermenter mit einem Gehalt an 10 Liter Züchtungsmedium vorn pH-Wert 7,2 überimpft.

Dieses Medium enthält 14 g/dl Endmelasse (als Glucose), 0,03 g/dl MgSO₄ · 7H₁O, 0,07 g/dl KH₁PO₄, 0,3 g/dl Harnstoff, 1,8 g/dl Säurehydrolysat von'Sojabohnenkuchen (als Sojabohnenkuchen) und 1,4 Volumprozent Leucin-Gärflüssigkeit, die auf die nachstehend beschriebene Weise hergestellt worden ist. Die Züchtung wird 48 Stunden bei 28° C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min durchgeführt, wobei der pH-Wert der Gärflüssigkeit mit 22prozentigem Ammoniak auf 6,8 eingestellt wird. Es werden 58 mg/ml L-Lysin in der Gärflüssigkeit angereichert. Bei der Züchtung des Ausgangsstamms ATCC 21 543 unter den gleichen Bedingungen erhiilt man 43 mg/ml L-Lysin.

Die Leucin-Gärflüssigkeit wird folgendermaßen hergestellt: Corynebacterium glutamicum ATCC 21885, ein leucinbildender Stamm, wird in einen 5-Liter-GIasfermenter mit einem Gehalt an 3 Liter Anzuchtmedium vom pH-Wert 7,2 überimpft. Dieses Anzuchtmedium enthält 5 g/dl Glucose, 1 g/dl Pepton, 1 g/dl Hefeextrakt, 0,5 g/dl Maisquellflüssigkeit. 0,25 g/dl NaCI, 0,3 g/dl Harnstoff und 50 ng/Liter Biotin. Die Züchtung wird 17 Stunden bei 30^r' C unter Belüften und Rühren bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 3 Liter/min und einer Rührjjeschwindigkeit von 600 U/min durchgeführt. 1 Liter dieser Anzuchtkultur wird in einen 30-Liter-Glasfermenter mit einem Gehalt an 10 Liter Züchtungsmedium ram pH-Wert 6,8 überimpft. Dieses Medium enthält 0,5 g/dl Ammoniumacetat, 0,2 g/dl KH₁PO₄. 0,05 g/dl MgSO₄ · 7H,O, 0,01 g/dl FeSO₄ · 7H,O, 0,001 g/dl MnSO₄ · ;iH₂O, 50 μg/Liter Biotin und 100 μg/LiterTiaminhydrochIorid. Die Züchtung wird 60 Stunden bei 30" C unter Belüftung und Rühren bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min durchgeführt. Im Verlauf der Züchtung wird eine Lösung mit einem Gehalt an 7 Prozent Ammoniumacetat und 38 Prozent Essigsäur.·. Kontinuierlich in die Gärflüssigkeit eingespeist, urn eine Kühlcnsluffqueile zur Verfügung zu stellen und den pH-Wert auf 6.8 zu halten. Man erhält eine Leucin-Gärflüssigkeit mit einem Gehalt an 15,3 mg/m! L-Leucin. Diese Gärflüssigkeit wird als Teil des Züchlungsmediums zur Herstellung von L-Lysin verwendet.

Das crfindunüspemäßi· Verfahren ist dem in der DIl-OS 2.S3 i wV beschriebenen Verführen hinsichtlich der Produktivita·, an I .-Lv si η überlegen. Dies geht aus den Beispielen I und 2 hervor. Die Ausbeulen sind um etwa 1.3- Iu, 1.4mnl höher als bei Verwendung von Corvnehucteriurn glutamicum AICC 21 543 Dieser Stamm hat die »!eichen Eigenschaften wie f'oivriebacicrium glutainieum ATC C 21 513. der in Beispiel 1 der DF.-OS 2 531 W> verwendet wird abgesehen von seiner Resistenz gegen S-(ß-Aminoäthyl)-cystein.Die Produktivität an L-Lysin vonCorynebacterium glutamicum ATCC 21 543 is! höher als die von Corynebacterium glutamicum ATCC 21513 unter den gleichen Bedingungen, da der Stamm ATCC 21 543 dadurch verbessert worden ist, daß man dem Ausgangsstamm ATCC 21513 Resistenz gegen S-(ß-Am.inoäthyl)-cystein verliehen hat.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin auf mikrobiolgischem Wege, dadurch gekennzeichnet, daß man Corynebacterium glutamicum NRRL-B-8182 oder Corynebacterium glutamicum NRRL-B-8183, in einem Nährmedium züchtet und das in der Gärflüssigkeit angereicherte L-Lysin gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium verwendet, das eine Leucin-Gärflüssigkeit in einer Menge von 0,2 bis 15 Volumenprozent des Nährmediums enthält, wobei die Leucin-Gärflüssigkeit durch Züchten von Corynebacterium glutamicum ATCC 21 885 erhalten worden ist.