DE3121926C2

DE3121926C2 - Verfahren zur Herstellung von L-Prolin durch Züchten eines Mikroorganismus

Info

Publication number: DE3121926C2
Application number: DE3121926A
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Tokio/Tokyo Hagino; Toshihide Hofu Yamaguchi Nakanishi
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1980-06-05
Filing date: 1981-06-03
Publication date: 1985-10-03
Also published as: JPS572690A; JPS641116B2; US4444885A; CA1166588A; FR2483948B1; IT8167770A0; GB2077262A; IT1172243B; GB2077262B; DE3121926A1; FR2483948A1

Abstract

Ein Verfahren zur Herstellung von L-Prolin durch Fermentierung, bei welchem ein Mikroorganismus gezüchtet wird, der zum Genus Corynebacterium, Arthrobacter, Brevibacterium, Microbacterium und Saccharomyces gehört und fähig ist, L-Prolin in einem Zuchtmedium zu erzeugen, um L-Prolin in der Zuchtbrühe anzureichern, aus welcher dann das L-Prolin gewonnen wird, ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Zuchtmedium verwendet wird, welches wenigstens einen Stoff, der aus L-Glutaminsäure sowie D-, L- und DL-pyrrolidonkarbonsäure ausgewählt wird, in Verbindung mit einem Kohlenstoff lieferanten, einem Stickstofflieferanten und anorganischen Verbindungen enthält.

Description

a) als Mikroorganismus

Corynebacterium glutamicum ATCC 21 157,

Corynebacterium glutamicum ATCC 21 158,

Corynebacterium glutamicum ATCC 21 159,
Corynebacterium glutamicum ATCC 21 355,

Corynebacterium acetophilum FERM BP-229,

Corynebacterium acetoacidophilum

FERM BP-230.

Arthrobacter citreus FERM BP-231,
Brevibacterium lactofermentum FERM BP-232,

Microbacterium ammoniaphilum FERM BP- 233 oder

Saccharomyces cerevisiae ATCC 20 169 und

b) ein Nährmedium, das pro Liter 3 bis 150 g Glutaminsäure, D-, L- oder DL-Pyrrolidonkarbonsäure enthält,

einsetzt.

Für das erfindungsgemäße Verfahren können synthetische oder organische Nährmedien verwendet werden, solange das Nährmedium nur eine geeignete Menge an assimilierbaren Kohlenstofflieferanten, Stickstofflieferanten und anderen organischen Substanzen sowie weiteren Nährstoffen enthält, die für das Wachstum des jeweiligen Mikroorganismus benötigt werden. Bevorzugte Kohlenstofflieferanten sind Kohlehydrate, wie Glukose, Fruktose, Saccharose, Sorbit, Glycerin, Maltose, Mannit, Stärkehydrolysat und Melassen, ferner organische Säuren, wie Essigsäure, Pyruvinsäure, Milchsäure, Fumarsäure und Zitronensäure, sowie Alkohole, wie Methanol und Äthanol. Bevorzugte Stickstofflieferanten sind Ammoniak, verschiedene anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat und Ammoniumazetat, ferner verschiedene Stickstoff enthaltene Verbindungen, wie Harnstoff, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Reisquellwasser, Caseinhydrolysat, Sojamehlhydrolysat, fermentierte Mikrobenkörper und deren Hydrolysate. Bevorzugte anorganische Substanzen sind Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat und Kalziumkarbonat. Zusätzlich können Spurenmengen an Nährstoffe, wie Biotin und Thiaminpantothensäure, verwendet werden. Bei Nährstoff erfordernden Mikroorganismen muß dem Nährmedium eine geeignete Menge eines derartigen Nährstoffes zugesetzt werden, wie er für das Wachstum der

Mikroorganismen erforderlich ist. Ein derartiger Zusatz ist allerdings dann nicht erforderlich, wenn der erforderliche Nährstoff in der als Stickstofflieferant verwendeten natürlich vorkommenden Substanz enthalten ist

Die Lieferanten für L-Glutaminsäure und L-, D- und DL-Pyrrolidonkarbonsäure, welche dem Nährmedium zugesetzt werden müssen, sind isolierte L-Glutaminsäure und Natriumglutamat sowie L-, D- und DL-Pyrrolidonkarbonsäure, ferner L-Glutaminsäure-Fermentierungsflüssigkeit, wie beispielsweise Glutaminsäure-Fermentierungsbrühen, Filtrat nach Entfernung von Mikrobenzellen aus den Fermentierungsbrühen, Mutterlauge aus der Trennung von Glutaminsäure aus Glutaminsäure-Fermentierungsflüssigkeit, Mutterlauge aus der Trennung von Natriumglutamat, gemahlene Melassen und deren Ablauge, welche eine große Menge an Glutaminsäure oder Pyrrolidonkarbonsäuie enthalten iowie andere. Glutaminsäure oder Pyrrolidonkarbonsäure enthaltende Substanzen.

Die Menge an im Medium enthaltener Glutaminsäure oder Pyrrolidonkarbonsäure kann je nach der Art der verwendeten Mikroorganismen und der Zeit des Zusatzes der Säure und auch aufgrund der unterschiedlichen Zusammensetzung des Nährmediums schwanken und beträgt 3 bis 150 g/l des Mediums. Bei Konzentrationen von mehr als 150 g/I können allerdings negative Auswirkungen hinsichtlich des zur Einstellung des pH-Wertes verwendeten Salzes sowie der Viskosität beobachtet werden. Die Säure kann dem Nährmedium auf einmal oder nach Impfung intermittierend zugesetzt werden, bis die Mikroorganismen ständig wachsen. Die Bedingungen der L-Prolin-Fermentierung können je nach den verwendeten Mikroorganismen schwanken, und die Temperatur beträgt vorzugsweise 25 bis 40⁰C. Während der Fermentierung wird der pH-Wert des Mediums vorzugsweise auf 6 bis 9 gehalten, indem beispielsweise anorganische oder organische Substanzen verwendet werden, welche einen sauren oder alkalischen pH-Wert besitzen, wie Harnstoff und Kalziumkarbonat. Unter diesen Bedingungen wird die Fermentierung aerob durchgeführt, um eine möglichst große Menge an L-Prolin vorzugsweise in etwa 24 bis 120 Stunden anzureichern. Die Gewinnung von L-Prolin aus den fermentierten Brühen kann durch an sich bekannte Verfahren erfolgen, wie beispielsweise durch Verwendung von Ionentauscherharz und Kristallisierung aus Methanol oder durch Kombination beider Methoden.

Die Erfindung wird nachstehend anhand einiger Beispiele erläutert; die Prolinmenge wurde nach einer bekannten Methode bestimmt (J. Biol. Chem., 199/1952, S. 91-95).

Beispiel 1

Ein Zuchtmedium (30 ml) mit untenstehender Zusammensetzung wurde in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben eingefüllt, sterilisiert und mit Corynebacterium acetophilum FERM BP-229 geimpft. Die Fermentierung wurde 24 h lang bei 28° C durchgeführt, wobei mit 220 U/ min geschüttelt wurde.

Das Hauptmedium hatte nachstehende Zusammensetzung:

Fleischextrakt
Pepton
Hefeextrakt
Natriumchlorid
(pH =7,2)

10 g/l

3 g/l

Ablaugen	170 g/l
	(als Glukose)
Sojamehlhydrolysat	20 g/l
KH^PO₄	0,6 g/l
MgSO₄ · 7 H₂O	0,6 g/l
(NH₄);SO₄	23,4 g/l
FeSO₄ · 7 H₂O	0,012 g/l
Thiaminhydrochlorid	100μg/l
CaCO₃	30 g/l
(pH = 7,4)

Dem Hauptmedium wurde eine vorgegebene Menge von Natrium-L-Glutamat oder DL-Pyrrolidonkarbonsäure gemäß Tabelle 1 zugesetzt. Das Medium (300 ml) wurde dann in einen 2-l-Erlenmeyerkolben mit einer Prallfläche übergeführt. Nach der Sterilisierung wurde jedes Hauptmedium jeweils mit 30 ml dieser Zuchtkultur geimpft und dann bei 28⁰C 4 Tage lang unter Schütteln mit 220 U/min gezüchtet. Für jeden Fall ist die angereicherte Menge an L-Prolin in nachstehender Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Angehäufte Menge an L-Prolin durch Zusatz von
(A) Natriumglutamat oder
(B) L-Pyrrolidonkarbonsäure

Zusatz (g/l)	A (g/l)	B(g/I)
0	25,1	24,8
35 1	25,3	25,1
3	26,9	27,7
10	31,4	30,1
20	35,6	34,8
50	39,1	35,4
40 90	40,5	36,6
100	40,7	36,8
	Beispiel 2

Arthrobacter citreus FERM BP-231, Microbacterium ammoniaphilum FERM BP-233, Brevibacterium lactofermentum FERM BP-232 und Saccharomyces cerevisiae ATCC 20 169 wurden jeweils nach dem Verfahren so gemäß Beispiel 1 behandelt, wobei das Hauptmedium jedoch nachstehende Zusammensetzung hatte:

Glukose	100 g/l
KH₂PO₄	0,5 g/l
K₂HPO₄	0,5 g/l
(NH₄J₂SO₄	30 g/l
Sojamehlhydrolysat	20 g/l
Biotin	100 μg/l
MgSO₄ · 7 H₂O	0,25 g/l
FeSO₄ · 7 H₂O	12 mg/1
MnSO₄ · 4 H₂O	12 mg/1
ZnSO₄ · 7 H₂O	10 mg/1
Thiaminhydrochlorid	100μg/l
CaCO₃	30 g/l
(pH = 7,2)

Vor der Verwendung wurde dem Hauptmedium Na-Irium-L-Glutamat (20g/l) oder L-Pyrrolidonkarbonsäu-

5 6

re (20 g/l) zugesetzt, um L-Prolin gemäß Tabelle 2 anzu- beimpft und bei 28° C unter Schütteln mit 220 U/min

reichern. 24 h lang gezüchtet

Einem Hauptmedium, bestehend aus Tabelle 2

5 Saccharose 20 g/l

Angehäufte Menge an L-Prolin durch Zusatz von Ammoniumazetai 7 g/l

(A) Natriumglutamat oder MgSO₄ · 7 H₂O 0,6 g/l

(B) L-Pyrrolidonkarbonsäure KH₂PO₄ 4 g/1

(1) ArthrobactercitreusFERMBP-231 (NH₄J₂SO₄ 40 g/l

(2) Brevibacterium lactofermentum FERM BH-232 io Sojamehlhydrolysat 20 g/l

(3) Miwobacterium ammoniaphilum FERM BP-233 FeSO₄ · 7 H₂O 0,012 g/l

(4) Saccharomyces cerevisiae ATCC 20 169 MnSO₄ -4H₂O 0,012 g/l

ZnSO₄ · 7 H₂O 0,01 g/l

Zusatz (g/l) (1) (2) (3) (4) Biotin 100μgl

15 Thiaminhydrochlorid 100 μgl

Ohne - 4,3 6,8 3,2 2,1 (pH = 7,4)

A 20 13,1 17,4 16,1 11,3

B 20 12,9 16,2 15,3 10,5 wurde eine Mutterlauge zugesetzt, die durch Kristalli

sierung und Trennung von Natriumglutamat in einer

B e i s ρ i e 1 3 20 Menge von 20 g/l, berechnet als Glutaminsäure, erhal

ten worden war. Jeweils 700 ml der Mischung wurde in

Die gleiche Behandlung, wie im Beispiel 1 beschrie- eine Gärflasche gefüllt und sterilisiert. Danach wurde ben, wurde unter Verwendung von Corynebacterium das Hauptmedium mit jeweils 200 ml der Zuchtkultur glutamicum ATCC 21 355 und eines Nährmediums geimpft und bei 30⁰C unter aeroben Bedingungen gedurchgeführt, welches nachstehende Zusammensetzung 25 züchtet. Während der Fermentierung wurde der pH-hatte: Wert des Mediums auf 7,0 durch Zusatz von Essigsäure

lösung eingestellt.

72 h nach Beginn der Fermentierung betrug der Essigsäureverbrauch 15% auf Basis des Ausgangsvolu-30 mens des Mediums; die angereicherte L-Prolinmenge betrug 38,8 g/l bei FERM BP-229 bzw. 30,1 g/l bei FERM BP-230. Zum Vergleich wurde die gleiche Behandlung ohne Zusatz von Glutaminsäurelösung durchgeführt, wobei die entsprechende L-Prolin-Werte 35 25,4 g/l bei FERM BP-229 bzw. 21,3 g/l bei FERM BP-230 ausmachte.

24 h nach Beginn der Fermentierung wurde dem Medium 40 g/l Paraldehyd zugesetzt. Die Fermentierung
wurde bei 28° C 4 Tage lang unter Schütteln mit 220
U/min durchgeführt. Es sammelte sich 27,0 g/l L-Prolin 45
an. Die gleiche Behandlung unter Zusatz von 20 g/l Natriumglutamat ergab 38,9 g/l angesammeltes L-Prolin.

wurde in einen 2-1-Erlenmeyerkolben mit Prallfläche ge- 65
füllt und sterilisiert. Danach wurde das Zuchtmedium
mit Corynebacterium acetophilum FERM BP-229 bzw.
Corvnebacterium acetoacidoDhilum FERM BP-230

Glukose	120 g/l
Harnstoff	3 g/l
Ammoniumsulfat	30 g/l
Ammoniumchlorid	30 g/l
KH₂PO₄	1,5 g/l
K₂HPO₄	0,5 g/l
MgSO₄ · 7 H₂O	0,5 g/l
FeSO₄ · 7 H₂O	0,02 g/l
MnSO₄ ■ 4 H₂O	0,02 g/l
Biotin	50 μ_δ/1
Thiaminhydrochlorid	lmg/1
Pepton	10 g/l
(pH = 7,2)

Beispiel	4	60 g/l
Ein Zuchtmedium (200 ml), bestehend aus	2 g/l
Saccharose	0,5 g/l
KH₂PO₄	0,01 g/l
MgSO₄ · 7 H₂O	0,01 g/l
FeSO₄ · 7 H₂O	5 g/l
MgSOi · 4 H₂O	ΙΟΟμβΙ
Maisquellwasser	ΙΟΟμβΙ
Thiaminhydrochlorid	20 g/l
Biotin	3 g/l
Sojamehlhydrolysat
Harnstoff
(pH = 7,4)

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von L-Prolin durch Züchten eines Mikroorganismus und Gewinnen des L-Prolins aus der Fermentationsflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) als Mikroorganismus Corynebacterium glutamicium ATCC 21 157, Corynebacterium glutamicum ATCC 21 158, Corynebacterium glutamicum ATCC 21 159, Corynebacterium glutamicum ATCC 21 355, Corynebacterium acetophilum FERM BP-229, Corynebacterium acetoacidophilum FERM BP-230, Arthrobacter citreus FERM BP-231, Brevibacterium lactofermentum FERM BP-232, Microbacterium ammoniaphilum FERM BP- 233 oder Saccharomyces cerevisiae ATCC 20 169 und

b) ein Nährmedium, das pro Liter 3 bis 150 g Glutaminsäure, D-, L- oder DL-Pyrrolidonkarbonsäure enthält,

einsetzt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Prolin durch Züchten eines Mikroorganismus und Gewinnen des L-Prolins aus der Fermentationsflüssigkeit.

Derartige Verfahren sind allgemein bekannt. Dabei hat man schon einen Wildstamm, einen bestimmten Nährstoff erforderlichen Stamm oder einen gegenüber einem bestimmten chemischen Wirkstoff widerstandsfähigen Stamm, beispielsweise einen Mikroorganismus vom Genus Brevibacterium, Microbacterium, Micrococcus, Paracolobacterium, Bacilus, Escherichia, Kurthia, Microbacterium, Corynebacterium oder Saccharomyces, eingesetzt (JP-PS 11751/68, 13679/68, 1193/69, 1198/69, 6631/69, 26911/69, 38876/73, 28431/74, 33190/76,40158/76,41386/79 und 105293/79). Ferner hat man bei solchen Verfahren schon die Konzentration anorganischer Salze im Nährmedium auf einen vorgegebenen Bereich einzustellen (JP-PS 38557/71 und 42597/71). Andererseits ist es bekannt, daß die Biosynthese von L-Prolin über L-Glutaminsäure durchgeführt werden kann, und daß die Absonderung von L-Prolin von Escherichia coli durch Zusatz von L-Glutaminsäure zum Nährmedium begünstigt werden kann; dieses Verfahren ist jedoch praktisch ohne Wert, weil die Menge an abgesondertem L-Prolin mit etwa 0,03 g/l nur sehr gering ist (Biochernica et Biophysica Acta, Vol. 104/1965, S. 397). Es wird auch berichtet, daß die Ausbeute an L-Prolin durch Züchtung von Kurthia catenaforma bei Zusatz eines oberflächenaktiven Wirkstoffes und L-Glutaminsäure zum Nährmedium verbessert werden kann (Microbiology, Vol. 23/1972, S. 759-764). Es ist jedoch bisher niemals berichtet worden, daß L-Prolin in größeren Mengen in der Fermentationsflüssigkeit angereichert werden kann, wenn die Züchtung durch V wendung einer Gruppe bestimmter Bakterien, und zwar der sogenannten Glutaminsäure erzeugenden Bakterien, wie die zum Genus Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter und Microbacterium gehören (J. of the Japanese Agricultural Chem. Soc, Vol. 42/1968, S. 703-710; Amino Acids and Nucleic Acids, Nr. 16/1967, S. 126—133), in einem Nährmedium durchgeführt wird, welchem L-Glutaminsäure zugesetzt wird. Bekannt ist es schließlich noch. L-Prolin unter Einsatz von Kurthia catenaform ATCC 21 144 in einem Nährmedium mit Zusatz von L-Asparaginsäure herzustellen, wobei in der Fermentationsflüssigkeit 18,4 g/l L-Prolin angesammelt werden (DE- AS 16 42 752).

Da L-Prolin in großem Umfang bei der Herstellung von Medikamenten, Nahrungsmitteln und dergleichen

ίο verwendet wird, besteht ein großes Interesse an wirtschaftlichen Verfahren zur L-Prolin-Herstellung mit weiteren Mikroorganismen. Folglich besteht die Aufgabe der Erfindung darin, für das Verfahren der eingangs genannten Art geeignete weitere Mikroorganismen zu finden, die eine möglichst hohe L-Prolin-Ausbeute ergeben.

Diese Aufgabe wird bei dem einangs genannten Verfahren gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß man