DE2321461A1 - Verfahren zur fermentativen herstellung von l-lysin - Google Patents

Description

PATENTANWÄLTE D-8 MÜNCHEN 9O

MARIAHILFPLATZ 2 & 3

dr. O. DITTMANN POSTADRESSE

K. L. SCHIFF j..Q MÜNCHEN 95

dr. A. v. FÜNER i'OSrfAUh θϋοιβο

DIPL. ing. P. STREHL 9 *3 9 1 A ß 1 TELEFON (0811) 45Θ3Β4

DR. XJ. SCHUBBWIOPF ^£Ji ItU · TELEGR. AUROMARCPAT MÜNCHEN

DIPL₁INO-D-EBBINGHATJs TELEX B-23565 AURO D

AJINOMOTO CO., INC. 27. April 1973

DA-TO 493

Prioritäten: 27. April 1972, Japan, Nr. 42 527/72

' 18. Aug. 1972, Japan, Nr. 82 641/72

19. Sept. 1972, Japan, Nr. 94 030/72

30. Nov., 1972, Japan, Nr. 120 247/72

Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin

Die Erfindung betrifft die Herstellung von L-Lysin und insbesondere ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin.

Ziel der Erfindung ist es, L-Lysin aus ohne weiteres verfügbaren Ausgangsmaterialien mit niedrigen Kosten herzustellen. L-Lysin ist bekanntlich für die menschliche und tierische Ernährung unumgänglich, so daß für diese Substanz ein weiter Anwendungsbereich als Ergänzungsmittel für- ITehrungs- und Futtermittel erwartet werden kann.

Die Bildung von L-Lysin aus fermentierbaren Kohlenhydraten ■ durch Mikroorganismen ist bereits bekannt. Unter den L-Lysinbildenden Mikroorganismen sind drei Bakterientypen als repräsentativ bekannt. Der erste Typ stellt eine Mutante dar, die zum Wachstum Aminosäuren braucht, welche der L-Lysin-Biosynthese verwandt sind. Ein Beispiel hierfür ist die Homoserin erfordernde Mutante von Micrococcus glutamicus, welche in der US-PS 2 979 4-39 beschrieben wird. Der zeite Typ wird durch Threonin- oder methioninempfindliche Mutanten und durch threoninempfindliche und Threonin erfordernde Mutanten deren Wachstum durch eine niedrige Konzentration von Threonin oder Methionin inhibiert wird, dargestellt, wobei die letztere Mutante zum Wachstum Threonin benötigt. Diese Mutanten εΐι'.α in der FR-PS 1 533 688 beschrieben. Der dritte Typ ist eine Mutante, welche gegenüber S-(2-Aminoäthyl)-L-cystein (nachstehend als AEC,abgekürzt), das das Schwefelanaloge von L-Lysin

309845/1108

ist, beständig ist. Diese Mutanten sind in der US-PS 3 707 441 beschrieben. .

Es wurde nun gefunden, daß eine Mutante, welche gegenüber einer Rückkopplungö-Inhibierung (feedback inhibition) ν,οη Lysin und Lysin-Analogen beständig ist und die ein Nährstofferfordern!s für mindestens eine Substanz aus der Gruppe Serin, Prolin, Alanin, Nikotinamid, Pantothensäure, Thiarain, Guanid, Hypoxanthin und Vitamin ILp besitzt, bei der Kultivierung in einem geeigneten Medium, welches assimilierbare Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und Mineralien enthält, L-Lysin erzeugt, das in dem-Medium in großen Mengen angesammelt wird. Das auf diese Weise erzeugte L-Lysin kann leicht aus dem Medium gewonnen werden.

Beim Verfahren der Erfindung werden nun Stämme verwendet, die dazu imstande sind, L-Lysin zu erzeugen und die aus Mutanten ausgewählt werden, welche eine Beständigkeit gegenüber Lysin und Lysin-Analogen und eines oder mehrere der oben'genannten Nährstofferfordernisse besitzen. Die verwendeten Mikroorganismen können leicht durch die bekannten Methoden zur Erzeugung von Mutanten aus Stammstämmen von Mikroorganismen der Arten Brevibacterium und Cprynebacterium erhalten werden.

Die fermentative Herstellung von L-Lysin unter Berücksichtigung bestimmter Nährstoff-Erfordernisse ist bereits bekannt. Dagegen sind aber die Nährstoff-Erfordernisse der erfindungsgemäßen Mutanten völlig neue Erfordernisse, wobei bislang noch nicht bekannt war, daß diese einen spezifischen Effekt auf die Erzeugung von L-Lysin ausüben. -

Die hierin verwendete Bezeichnung "Nährstoff-Erfordernis" soll über" die normale Definition hinaus auch unvollständige und unzulängliche Stämme umfassen, deren Wachstum durch solche Nährstoffe beschleunigt wird.

Als Mikroorganismen können nach einem Verfahren der Erfindung auch solche verwendet werden, welche Mutanten mit anderen

3098 4 5/1108

232H61

biologischen Eigenschaften, z.B. anderen Nährstoff-Erfordernissen und/oder Beständigkeiten gegenüber anderen Substanzen zusammen mit den oben beschriebenen Erfordernissen und der Beständigkeit gegenüber Lysin-Analogen wie AEC aufweisen.

Die erfindungsgemäß verwendeten Stämme können durch Screening oder durch herkömmliche Induzierungsmethoden für künstliche Mutanten hergestellt werden. Diese Methode wird hierin weiter unten erläutert.

Eepräsentative Mutanten, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, sind z.B. folgende Stämme:

Brevibacterium lactofermentum Y-108 (ATCC 21798) (ein Serin benötigender und gegenüber AEC beständiger Stamm)

Brevibacterium lactofermentum AC-73 (ATCC 21799) (ein Pantothensäure benötigender und gegenüber AEC beständiger Stamm)

Brevibacterium lactofermentum AD-5 (ATCC 21800) (ein Thiamin benötigender und gegenüber AEC beständiger Stamm)

Brevibacterium lactofermentum AD-162 (ATCC 21801) (ein Adenin oder Guanin benötigender und gegenüber AEC beständiger Stamm)

Brevibacterium lactof ermentum AJ-34-24- (FERM P-I7II) (ein Alanin benötigender und gegenüber AEC beständiger Stamm)

Brevibacterium lactof ermentum AJ-34-25 (FERM P-1712) (ein Alanin oder Valin benötigender und gegenüber AEC beständiger Stamm)

Brevibacterium lactofermentum AJ-3429 (FERM P-I857) (ein Alanin plus Leucin benötigender und gegenüber AEC beständiger Stamm)

Brevibacterium lactofermentum AJ-3391 (FERM P-1570) (ein Prolin benötigender und gegenüber AEC beständiger Stamm)

30 9 845/ 11 08.

Brevibacterium lactofermentum AJ-3394- (FEEM P-1573) (ein Vitamin B. ρ benötigender und gegenüber AEC beständiger Stamm)

Brevibacterium lactofermentum AJ-3395 (FERM P-1574-) (ein Nicotinamid benötigender und gegenüber AEC beständiger Stamm)

Brevibacterium lactofermentum AJ-3396 (FEEM P-1575) (ein Hypoxanthin benötigender und gegenüber AEC beständiger Stamm)

Brevibacterium lactofermentum AJ-3392 (FERM Ρ-157Ό (ein Nicotinamid und Leucin benötigender und gegenüber AEC beständiger Stamm)

Brevibacterium lactofermentum AJ-3393 (FEEM P-1572) (ein Serin und Leucin benötigender und gegenüber AEC beständiger Stamm)

Coryiiebacterium glutamicum AJ-3397 (FEEPi P-1613) (ein Serin benötigender und gegenüber AEC beständiger Stamm)

Corynebacterium glutamicum AJ-34-58 (FERM P-1982) (ein Prolin benötigender und gegenüber AEC beständiger Stamm)

Corynebacterium glutamicum AJ-3460 (FEEM P-1984-) (ein Guanin benötigender und gegenüber AEC beständiger Stamm)

Corynebacterium glutamicum AJ-34-61 (FEEM P-1985) (ein Vitamin B.ρ und Leucin benötigender und gegenüber AEC beständiger Stamm) . ·

Corynebacterium lilium AJ-3464- (FEEM P-2026) (ein Alanin benötigender und gegenüber AEC beständiger Stamm)

Corynebacterium acetoacidophilum AJ-34-65 (FEBM P-2027) (ein Alanin benötigender und gegenüber AEC beständiger Stamm).

Die angegebenen FEEM P-Nummern sind die Niederlegungsnummern beim Fermentation Eesearch Institute, Agency of Industrial Science of Technology, the Ministry of the Industrial Trade and Industry, Japan. Von dieser Hinterlegungsstelle sind diese

309845/1108

Stämme mit den IERM P-Nummern erhältlich. Die Erfindung wird durch Versuche erläutert..

Versuch 1

Mutantenstämme mit einem bestimmten Nährstoff-Erfordernis wurden durch eine Nachbildungsmethode aus Kolonien isoliert, welche in einer vollständigen Agar-Flachplatte erschienen waren. In dieser waren Mikrobenzellen, erhalten durch Röntgenbestrahlung von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, 4- bis Ί0 Tage bei 31⁰C kultiviert worden.

Die Nährstoff-Erfordernisse der Mutanten, welche, wie vorstehend beschrieben, isoliert worden waren, wurden nach bekannten Methoden bestimmt. Als Ergebnis wurden u.a. vier Stämme, nämlich eine Serin benötigende, Pantothensäure benötigende, Thiamin benötigende und Guanin (oder Adenin) benötigende Mutante erhalten.

Diese vier Stämme wurden jeweils 30 Minuten bei 30 C mit 200 jug/ml Nitrosoguanidin behandelt. Sodann wurden sie auf Agar-Flachplatten inokuliert, welche 2. g/dl Glucose, Oi3 g/dl Harnstoff, die benötigte Substanz (30 mg/dl Serin, 10 mg/1 Calciumpantothenat, 100 mg/1 Adenin), 0,5 g/dl Threonin,

⁺⁺ 2 ppm Mn⁺¹"

0,1 g/dl KH₂PO₄-, 0,04 g/dl MgSO₄^H₃O₁ 2 ppm Fe⁺⁺, 2 ppm Mn⁺¹", 50 pg/1 Biotin, 100 ug/1 Thiamin, 500 fig/ml AEC und 2 g/dl Agar bei einem pH-Wert von 7*0 enthielten. Die Kultivierung erfolgte 4- bis 10 Tage bei 31⁰C

Durch Untersuchung der Fähigkeit zur L-Lysinerzeugung der einzelnen Stämme, welche aus Kolonien isoliert worden waren, die auf den Kulturplatten erschienen waren, wurden die folgenden vier Mutanten-Stämme erhalten, die dazu imstande sind, große Mengen von L-Lysin zu erzeugen.

309845/1108

Brevibacterium lactofermentum Y-108 (AEC^ + Ser~) ¹¹ . ■ " AC-73 (AEC ^ + Pantothensäure") " " AD-5 (AEC^ + Thiamin*")

¹¹ " AD-162 (AEC^ + Adenin^ oder

Guanin")

Das Wachstum dieser vier Mutantenstamme in einem Minimalmedium Und in einem Minimalmedium, das mit dem erforderlichen Nährstoff versetzt worden war, wurde wie folgt getestet:

Ein Minimalmedium enthaltend 2 g/dl Glukose, 1 g/dl Ammoniumsulfat, 0,3 g/dl Harnstoff, 0,1 g/dl KH₂PO₄, 0,04 g/dl MgSO₄.7H₂O, 2 ppm Fe-und Mn-Ionen, 50 ug/1 Biotin und 200 ug/1 Thiaminhydrochlorid mit einem pH-Wert von 7»2 wurde hergestellt. In dieses Minimalmedium wurden jeweils 30 mg/dl der in Tabelle 1 angegebenen Aminosäure, 10 mg/1 Calciumpantothenat oder 100 mg/1 Adenin zugegeben. Sodann wurde jeder Mutanten-Stamm unter Schütteln 24· Stunden bei 31⁰C kultiviert. Die Kulturbriihe wurde auf das 26-fache des ursprünglichen Volumens verdünnt. Die spezifische optische Dichte wurde bestimmt, indem die Lichtabsorption bei 562 m/i bestimmt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

Versuch_2

Brevibacterium lactofermentum ATCC I3869 wurde 30 Minuten bei 30⁰C mit 250 ug/ml Nitrosoguanidin behandelt.- Der Stamm wurde auf eine Agarplatte inokuliert, welche 2 g/dl Glukose, 0,3 g/dl Harnstoff, 1 g/dl (NH₄) ₂S0₄, 0,5 g/dl Threonin, 0,1 g/dl KH₂PO₄, 0,04· g/dl MgSO₄.7H₂O, 2 ppm Fe und Mn-Ionen, 50 pg/l Biotin, 200 ug/1 Thiamin.HCl, 5 mg/ml AEC und 2 g/dl Agar bei einem pH-Wert von 7,0 einhielt. Es erfolgte eine 4— bis 10-tägige Kultivierung bei 31⁰C. Aus jeder Kolonie, die auf der kultivierten Agar-Platte als AEC-beständige Stämme erschienen, wurden Stämme isoliert. Aus diesen wurden die Mutanten, die L-Lysin erzeuget konnten, ausgewählt, indem die Bildungsfähigkeit von L-Lysin jedes Stammes untersucht wurde.

309845/1108

Die Mutante (ein AEC-beständiger Stamm, jedoch ohne Nährstoff-Erfordernis) wurde erneut mit 250 pg/ml Nitrosoguanidin 30 Minuten*bei 30⁰C behandelt. Nach dieser Behandlung wurden Mutanten, welche große Mengen von L-Lysin erzeugen konnten, als Mutanten.mit einer AEC-Beständigkeit zusammen mit anderen Erfordernissen isoliert. Die Nährstoff-Erfordernisse der bei dem vorstehend genannten Verfahren isolierten Mutanten wurden nach bekannten Methoden bestimmt.

Durch dieses Verfahren wurden die folgenden sechs Stämme erhalten:

Brevibacterium lactofermentum AJ-339^/l (AEC^ + Pro")

" " AJ-3392 (AEO^ + Nicotinamid

+ Leu )

¹¹ " AJ-3393 (AEC/ + Ser" + Leu")

" " .AJ-3394- (AECi" + Vitamin B₁₂)

" " AJ-3395 (AEC^ + Nicotinamid)

" ". Ao-3396 (AEC^ + Hypoxanthin)

Die Nährstoff-Erfordernisse der sechs Stämme wurden bestätigt, indem das Wachstum auf folgende Veise untersucht wurde:

Ein Minimalmedium, enthaltend 2 % Glucose, 0,3 % Harnstoff,

1 % (NH₄)^SO₄, 0,1 % KH₂PO₄, 0,0A- % MgSO₄-TH₂O, 2ppm Fe⁺⁺,

2 ppm Mn , 50 ug/1 Biotin und 200 )&g/l Thiamin.HCl mit einem pH-Wert von 7,2,wurde hergestellt.

3 ml-Ansätze dieses Minimalmediums, die mit den in Tabelle gezeigten Nährstoffen versetzt worden waren, wurden jeweils mit den Mutanten-Stämmen inokuliert, welche zuvor auf einer Bouillon-Schrägkultur kultiviert worden waren. Es erfolgte . eine 24-stündige Kultivierung bei 31⁰C unter Belüften und Rühren. Die Kulturbrühe wurde auf das 26-fache des ursprünglichen Volumens verdünnt. Durch Messung der Lichtabsorption bei 562 iu wurde die spezifische optische Dichte festgestellt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt.

309845/1 108

Versuch_3

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 wurde 30 Minuten bei 3Ö°C mit 250 pg/ml Nitrosoguanidin behandelt, auf eine Agar-Platte inokuliert, welche 2 g/dl Glucose, 0,3 g/dl'Harnstoff, 1 g/dl (NH₄)₂S0₄, 0,4 g/dl.Threonin, 0,1 g/dl KH₂PO₄, 0,04 g/dl MgSO₄. H₂O, 2 ppm Fe-und Mn-Ionen, 50 ug/1 Biotin, 100 jug/1 Thiamin.HCl, 4 mg/ml AEC und 2 g/dl Agar enthielt und einen pH-Wert von 7,0 hatte. Es erfolgte eine 4- bis 10-tägige Kultivierung bei 31°C- Aus jeder Kolonie, welche auf der kultivierten Agar-Platte als AEC-beständiger Stamm erschien, wurden Stämme isoliert. Daraus wurden die Mutanten mit einer Erzeugungsfähigkeit für L-Lysin ausgewählt, indem · die Erzeugungsfähigkeit für L-Lysin jedes Stammes bestimmt wurde. Auf diese Weise wurde, wie oben beschrieben, der Mutantenstamm Kr. 872 erhalten..

Der Mutanten st am τη ITr. 872 (eic AEC -be ständiger Stamm, welcher jedoch kein Nährstoff-Erfordernis hatte) wurde erneut mit 250 jug/ml Nitrosoguanidin bei 30⁰C 30 Minuten behandelt. Nach dieser Behandlung wurden Mutanten mit einer Fähigkeit zur Erzeugung großer Mengen von L-Lysin als Mutanten mit einer AEC-Beständigkeit und einigen Erfordernissen isoliert. Die Nährstoff-Erfordernisse der nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren isolierten Mutanten wurden durch bekannte Verfahren bestimmt.

Als gute Erzeuger für L-Lysin wurden die folgenden zwei Mutantenstämme, welche Nährstoff-Erfordernisse für Alanin, Alanin oder Valin zusammen mit einer AEC-Beständigkeit aufwiesen, erhalten.

Brevibacterium lactofermentum AJ-3424 (AECo + AIa")

¹¹ " AJ 3425 (AEC^ + Ala" oder VaI")

Der Mutanten-Stamm AJ-3424 wurde wie vorstehend beschrieben weiter mit Nitrosoguanidin behandelt. Dabei wurde als guter

309845/1108

232U61

L-Lysin-Erzeuger der Stamm AJ 3^-29 mit einer AEC-Beständigkeit und Nährstoff-Erfordernissen für Alanin und Leucin erhalten.

Die Nährstoff-Erfordernisse dieser drei Stämme wurden durch Untersuchung' des Wachstums auf die folgende Weise bestimmt:

Ein Minimalmedium enthaltend 2 % Glucose, 0,3 % Harnstoff,

1 % (NH₄)pS0₄, 0,1 % KH₂PO₄, 0,04 % MgSO₄.7H₂O, 0,05 % NaGl,

2 ppm Fe , 2 ppm Mn⁺⁺, 50 ug/1 Biotin und 200 ug/1 Thiamin.HCl mit einem pH-Wert von 7,0 wurde hergestellt.

Es.wurden Zellsuspensionen dieser drei Stämme hergestellt, indem Mikrobenzellen der jeweiligen Stämme, welche zuvor 24 Stunden bei 31⁰C auf einer Bouillon-Schrägkultur· kultiviert worden waren, zu 6 ml dieses Minimalmediums gegeben wurden. Die Konzentrationen der Mikrobenzellen (OD) in jeder Suspension betrugen für den Stamm AJ-3424 0,250 und für den Stamm AJ-3425 .0,295.

3 ml-Ansätze dieses Minimalmediums, das mit den in den Tabellen 3 und 4 gezeigten Nährstoffen versetzt- worden waren, wurden mit jeweils 0,1 ml der Zellsuspensionen versetzt. Sodann wurde 24 Stunden bei 31⁰C unter Belüften und Rühren kultiviert. Die Kulturbrühe wurde auf das 26-fache ihres ursprünglichen Volumens verdünnt. Die spezifische optische Dichte wurde durch Messung der Lichtabsorption bei 562 um bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 und 4 zusammengestellt.

Versuch 4

Corynebacterium glutamicum AJ-34-63 (FERM P-1987) mit einer AEC-Beständigkeit, aber ohne ein Nährstoff-Erfordernis wurde wie im Beispiel 3 unter Verwendung von Micrococcus glutamicus ATCC 13032 (die Klassifizierung für diesen Stamm wurde zu Corynebacterium glutamicum geändert) als Ausgangsetamm err.9I-ten.

30 9 8 45/1108

Nach dem Verfahren des Beispiels 3 wurden aus dem Stamm AJ-3463 die folgenden drei Mutanten-Stämme mit AEC-Beständigkeit und einigen Nährstoff-Erfordernissen erhalten:

Corynebacterium glutamicum AJ-3458 (AEC* + Pro")

¹¹ " " AJ-3460 (AEC^ + Guanin")

" " AJ-3461 (AEC^ + Vitamin B₁₂"

Die Nährstoff-Erfordernisse dieser drei Stämme wurden bestimmt, indem ihr Wachstum nach der Arbeitsweise des Beispiels 3 unter Verwendung des folgenden Mediums untersucht wurde:

Zusammensetzung des Mediums:

Glucose	(pH-Wert 7,0)	2	O/ JQ
(NH4)2S04	1	°/o
KH2PO4	0,	1 °/o
MgSO4.7H2O	o,	04 %
NaCl	o,	05 %
Biotin	50	ps/i
Thiamin.HCl	200	/ig/1
Fe++	2	ppm
Mn++	2	ppm
CaCO5	2	%

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt.

Versuch_5

Wie im Versuch 3 wurden beide Mutanten-Stämme Corynebacterium AJ-3397 (FEBM P-1613) und Corynebacterium lilium AJ-3464 (FERM P-2026) hergestellt. Der Ausgangsstamm für den Stamm AJ-3397 war Micrococcus glutamicus ATCC 13032; derjenige für den Stamm AJ-3464 Corynebacterium lilium NERL B-2243 (ATCC 15990) . Ihre Klassifizierungsmerkmale sind in der US-PS 3 087 863 beschrieben.

309845/1108

232U61

Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung gegenüber den herkömmlichen Methoden besteht darin, daß erfindungsgemäß neue Arten von Mutanten zur Verfugung gestellt werden, die erhebliche Mengen von L-Lysin erzeugen können. Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß die L-Lysin-Produktivität nicht sehr stark durch Schwankungen der Menge von Threonin und der anderen Nährstoffe in dem Medium beeinflußt wird, da die erfindungsgemäß verwendeten Stämme gegenüber Lysin-Analogen beständig sind.

Die Zusammensetzung des Fermentationsmediums und die Kultivierungsmethode entsprechen den herkömmlichen Verfahren, Vielehe zur Fermentation von Aminosäuren verwendet v/erden. Für die Zwecke der Erfindung sind sowohl Medien geeignet, die gewöhnlich für herkömmliche Aminosäurefermentationen verwendet werden, als auch die bekannten Medien für die Erzeugung von Lysin durch Fermentation. Somit ist für die Kultivierung der erfixiduugfatjSmäß verwendeten Stämme entweder ein synthetisches Kulturmedium oder ein natürliches Nährmedium geeignet, solange es die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum der verwendeten Stämme enthält. Solche Nährstoffe sind bekannt. Beispiele hierfür sind Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Verbindungen, welche von den verwendeten Mikroorganismen in den.entsprechenden Mengen verwertet werden.

Als Kohlenstoffquellen können z.B. Kohlenhydrate wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate, .. Molassen und dergleichen sowie andere geeignete Kohlenstoffquellen wie organische Säuren, z.B. Essigsäure, Propionsäure, Fumarsäure etc., organische Substanzen, z.B. Benzoesäure,oder Alkohole, z.B. Methanol und Äthanol, genannt werden. Diese Substanzen können entweder für sich oder im Gemisch von zwei oder mehreren verwendet werden.

Je nach der Assimilierfähigkeit der verwendeten Mikroorganismen ist es möglich, in dem Fermentationsmedium als Kohlenstoffquelle Kohlenwasserstoffe in größeren oder geringeren Mengen

309845/1108

zu verwenden.

Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder von Verbindungen wie Harnstoff oder Ammoniumsalze, z.B. Anmioniumchlorid, Ammoηiumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat etc. sowie ein oder mehrere Aminosäuren oder natürlich stickstoffenthaltende Substanzen, wie Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, Peptone, Bouillon, Caseinhydrolysate, lösliche Fischprodukte, Reiskleienextrakt etc. Diese Substanzen können entweder für sich oder im Gemisch von -zwei oder mehreren verwendet werden.

Beispiele für anorganische Verbindungen, die zu dem Kulturmedium gegeben werden können, sind Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat und andere Eisensalze, Manganchlorid, Calciumchlorid und Natriumchlorid.

In dem Kulturmedium sollten Nährstoffe und andere Substanzen vorhanden sein ^ die für das Wachstum der Mut ante notwendig sind. Die wachstumsfördernden Mittel und die Nebennährstoffe, welche die Ausbeute und die Herstellungsgeschwindigkeit von L-Lysin verbessern, umfassen Aminosäuren, wie Serin, Prolin, Alanin, Leucin, etc., verschiedene Vitamine wie Vitamin B^i Thiamin, Pantothensäure, Nicotinamid (oder Nicotinsäure) etc., Purinbasen wie Guanin, Adenin und Hypoxanthin, S'ojabohnenproteinhydrolysate, Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit, Peptone, Caseinhydrolysat und dergleichen.

Es stellt einen wichtigen Faktor dar, die Menge der benötigten Aminosäure und der anderen Nährstoffe auf weniger als die optimale Konzentration für das Wachstum des Stammes der Mikroorganismen zu begrenzen, was eine Technik darstellt, die bei Aminosäurefermentationen ziemlich allgemein angewendet wird.

309846/1108

Die Fermentation wird bei Temperaturen zwischen 24 und 37°C über Zeitspannen von etwa 24 bis 96 Stunden und unter aerobischen Bedingungen unter Schütteln oder Belüftung und Rühren durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums wird zwischen 5 und 9 eingestellt..Wenn der pH des Mediums unterhalb 5>0 abfällt, dann wird er mit Neutralisationsmitteln wie Calciumcarbonat und wäßrigem Ammoniak eingestellt. Wenn organische Säuren als Kohlenstoffquellen verwendet werden, dann neigt der pH-Wert des Mediums dazu anzusteigen. Er wird dann durch Zusatz von Säuren, _Z.B. solchen organischen Säuren, die als Kohlenstoffquelle dienen oder durch Chlorwasserstoff oder Schwefelsäure auf einen Wert.innerhalb des oben genannten Bereiches eingestellt. Die Isolierung des L-Lysins aus der Kulturbrühe kann nach bekannten Methoden erfolgen. Die Bakterienzellen können durch Filtrieren oder durch Zentrifugieren entfernt werden. Das L-Lysin kann unter Verwendung von Cationaustauscherharzen isoliert werden.

Das erfindungsgemäß hergestellte L-Lysin wurde anhand von Testergebnissen der Rf-Werte auf Papierchromatogrammen, Elektrophorese, der Antwort auf Mikrobiountersuchungen und der Antwort auf Lysin-Decarboxylase sowie von unter Verwendung von authentischenProben erhaltenen Ergebnissen identifiziert.

Die Menge des in der Kulturbrühe erzeugten Lysins wurde unter Verwendung von Lysin-Decarboxylase bestimmt.

Beispiel 1

Ein Kulturmedium, enthaltend 10 g/dl Glucose, 5 g/dl (NH₄)-SO₄, 0,1 g/dl KH₂PO₄, 0,04 g/dl MgSO₄. HpO, 2 ppm Fe und Mn-Ionen, 50 ug/1 Thiamin-HCl, 50 jig/1 Biotin, 1,5 ml/dl Sojabohnenproteinhydrolysat (mit 7 % Gesamtstickstoff) und 5 g/dl Calciumcarbonat sowie einem pH-Wert von 7,2 wurde hergestellt. 20 ml-Ansätze des Mediums wurden in 500 ml Schüttelkolben gebracht und sterilisiert. Die in Tabelle 6 angegebenen Stämme wurden in das Medium inokuliert und unter

3 09845/1108

Schütteln 72 Stunden bei 31°C kultiviert. Die Menge des gebildeten L-Lysins (als Hydrochlörid) ist in Tabelle 6 angegeben.

Die Kulturmedien für die Stämme AC-73 und AD-162 enthielten 5 mg/ml Calciumpantothenat und 100 mg/l Adenin bzw. Guanin.

Die Bakterienzellen und feste Calciumsalze wurden aus der Kulturbrühe des Stammes Y-108 durch Zentrifugierung entfernt. Ein Liter der überstehenden Flüssigkeit wurde in eine Säule eingegeben, welche mit einem starken Gationenaustauscherharz (Amberlite IR-120 in der Wasserstoff-Form) gefüllt war. Das auf dem Harz adsorbierte L-Lysin wurde mit 3%igem wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde unter verminderten Druck konzentriert. Zu der konzentrierten Lösung wurde Salzsäure gegeben. Es wurde in einem Eisschrank abgekühlt, um das L-Lysiu auszufällen. Auf diese Weise wurde rohres kristallines L-Lysin-hydrochlorid-dihydrat in einer Menge von 30,2 g erhalten.

Beispiel 2

Brevibacterium lactofermentum Y-108 (ATCC 21798), AC-73 (ATCC 21799), AD-5 (ATCC 21800) und AD-162 (ATCC 21801) wurden jeweils in ein Keimmedium inokuliert, welches 1,5 g/dl Glucose, 0,3 g/dl Ammoniumacetat, 0,1 g/dl KH₂PO₄, 0,04 g/dl MgSO^.7H₃O, 2 ppm Fe-und Mn-Ionen, 50 ug/1 Biotin, 200 ug/1 Thiamin.HCl, 1,5 nil/dl Sojabohnenproteinhydrolysat (mit einem Gesamtstickstoff gehalt von 7 %) und 0,5 g/dl Hefeextrakt enthielt und das einen pH-Wert von 8,0 hatte. Es erfolgte eine 16-stündige Kultivierung bei 31°C unter Rühren und Belüften.

15 ωΐ der einzelnen Keimkulturen wurden zur Inokulierung zu 3OO ml eines Hauptkulturmediums gegeben, welches 3 g/dl Glucose, 0,5 g/dl Ammoniumacetat, 0,2 g/dl Harnstoff, 0,1 g/dl KH₂PO₄, 0,04 g/dl MgSO₄.7H₂O, 2 ppm Fe-und Mn-Ionen, 50 ug/1 Biotin,

309845/1108

15 ug/1 Thiamin.HCl, 3 ml/dl So jabohnenproteinhydrölys'at und die in Tabelle 7 gezeigten Nährstoffe enthielt, das einen pH-Wert von 7,5 hatte. Es erfolgte eine Kultivierung bei 31,5°C unter Rühren mit I5OO UpM, wobei ein gleiches Volumen von Luft je Minute eingeleitet wurde. Während der Kultivierung wurde der pH-Wert des Mediums zwischen 7,2 und 8,0 durch automatische Zugabe einer Mischlösung von Essigsäure und Ainmoniumacetat gehalten. Diese enthielt 0,25 Mol Ammoniumaeetat je Mol Essigsäure. Ihre Essigsäurekonzentration betrug 60 %.

Nach einer 48-stündigen Kultivierung wurden in der Kulturbrühe jedes Stammes 4,8 bis 6,4 g/dl L-Lysinhydrochlorid festgestellt, wie es in Tabelle 7 gezeigt wird.

Beispiel 3

Brevibacterium lactofermentum Y-108 (ATCC 21798), AC-73 (ATCC 21799), AD-5 (ATCC 2180) und AD-162 (ATCC 21801) wurden jeweils 16 Stunden bei 31,5°C unter Schütteln in einer Keimkultur kultiviert, welche 1,5 g/dl Glucose, 0,3 g/dl Harnstoff, 0,1 g/dl KH₂PO₄, 0,04 g/dl MgSO₄.7H₂O, 2 ppm Ie- und Mn-Ionen, 50 ug/1 Biotin, 200 ug/1 Thiaminhydrochlorid, 1,5 ml/dl Sojabohnenproteinhydrolysat und. 0,5 g/dl Hefeextrakt enthielt und das einen pH-Wert von 8,0 hatte.

15 ml von jeder Keimkultur wurden dazu verwendet, um 3OO ml eines Hauptkulturmediums zu inokulieren, welches folgende Bestandteile enthielt:

Glucose

Äthanol

(NH₄)^O₄

Harnstoff

KH₂PO₄

MgSO₄.7H₂O ·

Fe⁺⁺

309845/1108

1	g/dl
1,5	g/dl
0,5	g/dl
0,2	g/dl
0,1	g/dl
0,04	g/dl
2	ppm

Mn⁺⁺ 2 ppm

Biotin 50 ug/1

Vitamin B^.HCl 50 ug/1 "

Soj abohnenproteinhydrolysat

(GesamtStickstoff: 7 %) 3 ml/dl Nährstoffe gemäß Tabelle 8
pH: 7,5

Die Kultivierung erfolgte bei 31,5 C unter Rühren mit 1500 UpM, wobei je Volumen des Mediums ein gleiches Luftvolumen eingeführt würde.

Während der Fermentation wurde der pH-Wert des Mediums zwischen 7,0 und 7,5 durch Einleiten von gasförmigem Ammoniak in das Medium gehalten.

Die Menge des restlichen Äthanols wurde durch Gaschromatographiö bestimmt. Äthanol wurde in das Medium eingegeben, als das restliche Äthanol auf etwa 0,3 g/dl zurückgegangen war.

Nach 48 Stunden wurde die Kulturbrühe jedes Stammes unterscuht. Es wurde festgestellt, daß sie L-Lysinhydrochlorid in den in Tabelle 8 gezeigten Mengen enthielt.

Beispiel 4

Brevibacterium lactofermentum AJ-3391 (FERM P-I57O), AJ-3392 (FERM P-1571), AJ-3393 (FERM P-1572), AJ-3394 (FERM P-1573), AJ-3395 (FERM P-1574) und AJ-3396 (FERM P-1575) wurden als Keimstämme verwendet und in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 kultiviert, mit der Ausnahme, daß in den in Tabelle 9 angegebenen Mengen Sojabohnenproteinhydrolysat zugefügt wurde und daß zu dem Medium für den Stamm AJ-3396 5 m,g/ml Hypoxanthin gegeben wurden.

In Tabelle 9 werden die Mengen an L-Lysin (als Hydrochlorid), welche nach einer 72-stündigen Inkubierung in der resultieren-

3098AS/1108

232 Η6Ί

den Brühe gebildet worden waren, zusammengestellt.

Beispiel 5

Brevibacterium lactofermentum AJ-3391 (FERM P-1570), AJ-3392 (FERM P-1571), AJ-3393 (FERM P-1572), AJ-3394- (FERM P-1573), AJ-3395 (FERM P-1574-) und AJ-3396 (FERM P-1575) wurden jeweils als Keimstämme verwendet und unter Verwendung von Essigsäure als Hauptkohlenstoffquelle wie in Beispiel 2 kultiviert, mit der Ausnahme, daß 5 mg/ml Hypoxanthin zu dem Medium für den Stamm AJ-3396 gegeben wurden.

In Tabelle 10 ist die Menge von L-Lysin (als Hydrochlorid) angegeben, welche nach einer 48-stündigen Inkubierung in der erhaltenen Brühe jedes Stammes gebildet worden war.

Nach einer 48-stündigen Kultivierung des Stammes AJ-3392 in der oben beschriebenen Weise waren 30 Vol.-% Essigsäure je Anfangsvolumen des Mediums verbraucht worden. Es wurde festgestellt, daß die Kulturbrühe 7*1 g/dl L-Lysin-hydroChlorid, enthielt. Aus einem Liter Kulturbrühe wurden 56»3 g L-Lysinhydrochlorid-dihydrat nach der Arbeitsweise des Beispiels 1 erhalten.

Beispiel 6

Brevibacterium lactofermentum AJ-3391, AJ-3392, AJ-3393, AJ-3394-, AJ-3395 und AJ-3396 wurden jeweils als Keimstämme verwendet und unter Verwendung von Äthanol als Hauptkohlenstoff quelle in derselben Weise wie im Beispiel 3 kultiviert, mit der Ausnahme, daß zu dem Medium für den Stamm AJ-3396 5 mg/ml Hypoxanthin gegeben wurden.

In Tabelle 11 ist die in der erhaltenen Brühe der einzelnen Stämme nach A8-stündiger Inkubierung erhaltene 'L-Lysinmenge (als Hydrochlorid) zusammengestellt.

309845/1108

Aus Tabelle 11 wird ersichtlich, daß sich in der Kulturbrühe nach einer 48-stündigen Kultivierung 6,3 g L-Lysin-hydrochlorid (27,7 % Ausbeute bezogen auf das eingesetzte Äthanol) befanden. Aus einem Liter der Kulturbrühe wurden nach der Arbeitsweise des Beispiels 1 50,4 g L-Lysinhydrochlorid-dihydrat erhalten.

Beispiel 7

Brevibacterium lactofermentum AJ-3424 (FERM P-1711), AJ-3425 (FERM P-1712)und Nr. 872 (Kontrollprobe) wurden als Keimst&nme verwendet und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 kultiviert, mit der Ausnahme, daß zu dem Medium für den Stamm AJ-3425 200 μg/l Thiaminhydrochlorid und 3 % Sojabohnenproteinhydrolysat gegeben wurden.

Die Tabelle 12 zeigt die gebildete Menge von L-Lysin (als Hydrochlorid) in der resultierenden Brühe jedes Stammes nach einer 72-stündigen Inkubierung.

Beispiel 8

Brevibacterium lactofermentum AJ-3424, AJ-3425 und Nr. 872 (Kontrollprobe) wurden jeweils in einem Keimkulturmedium der folgenden Zusammensetzung inokuliert,und unter Rühren und Belüften 18 Stunden bei 31⁰C kultiviert.

Keimkulturmedium:

Glucose 1,5%

Ammoniumacetat 0,3 %

Harnstoff 0,1 %

TTTT "D^ C\ Ί θ/

■ -K-H₂^U₄ ü, 1 /o .

MgSO₄.7H₂O 0,04 %

Fe⁺⁺ 2 ppm

Mn⁺⁺ 2 ppm

Biotin 50 ug/1

Thiaminhydrochlorid 200 Sojabohnenproteinhydrolysat

(mit 7 % Gesamtstickstoff) 2 % (pH: 7,5)

.'■~ 309845/1 108

232H61

300 ml-Ansätze eines Hauptkulturmediums mit der nachfolgenden Zusammensetzung wurden in 1 1-Glasfermentationskolben gegeben.

Hauptkulturmedium:	2 %
Glucose	0,5 %
Ammoniumacetat	0,2 %
Harnstoff	0,1 %
KH2PO4	0,04%
MgSO4.7H2O	2 ppm
Fe++	2 ppm
Mn++·	50 μ6/1
Biotin	50 /ig/1
' ThiaminhydrοChlorid
Soj abohnenproteinhydrolysat	2,5 %
(mit 7 % Gesamtstickstoff)
- (pH: 7,5)

Nach der Sterilisierung wurde jedes Medium mit 15 ml der obigen Keimkulturbrühe jedes Stammes inokuliert. Unter Rühren mit 1500 UpM wurde bei 31 bis 33°C kultiviert, wobei ein gleiches Luftvolumen je Minute eingeleitet wurde. Während der Kultivierung wurde der pH-Wert des Mediums zwischen 7,2 und 8,0 durch automatische Zugabe einer Mischlösung aus Essigsäure und Ammoniumacetat gehalten, welche 0,25 Mol Ammoniumacetat je Mol Essigsäure enthielt und bei welcher die Essigsäurekonzentration 60 % betrug.

!ach einer 55-stündigen Kultivierung wurde L-Lysinhydrochlorid in den in Tabelle 13 gezeigten Mengen gebildet.

Beispiel 9

Brevibacterium lactofermentum AJ-34-24, AJ-3425 und Nr. 872 (Kontrollprobe) wurden in ein Keimkulturmedium der gleichen Zusammensetzung wie im Beispiel 8 inokuliert, mit der Ausnahme, daß für diese 0,5 % Äthanol anstelle von Ammoniumacetat und 0,3 % Harnstoff gegeben wurden. Es wurde 18 Stunden unter

309845/1108

Rühren und Belüften bei 31°C kultiviert.

Die Fermentation erfolgte in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 unter Verwendung der erhaltenen Keimkulturbrühe, mit der Ausnahme, daß zu dem Hauptkulturmedium 1 % Glucose, 1 % Äthanol und 0,5 % Ammoniumsulfat anstelle von Ammoniumacetat gegeben wurden.

Während der Fermentation wurde der pH-Wert des Mediums zwischen 7,2 und 8,2 durch Einführung von gasförmigem Ammoniak in dem Medium gehalten.

Die Menge an restlichem Äthanol wurde durch Gaschromatographie bestimme. In das Medium wurde Äthanol eingegeben, als der restliche Äthanolgehalt auf etwa 0,3 % zurückging.

Nach 48 Stunden enthielt die Kulturbrühe jedes Stammes L-Lysinnydrochlorid in den in Tabelle 14 angegebenen Mengen.

Beispiel 10

Ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt. 20 ml-Ansätze dieses Mediums wurden in 500 ml Schüttelkolben gegeben und 5 Minuten bei 11O⁰C sterilisiert.

Zusammensetzung des Mediums:

Glucose 10 %

KH₂PO₄ ' 0,1 %

MgSO₄^H₂O 0,04 %

Fe⁺ 2 ppm

Mn⁺⁺ 2 ppm

Biotin 50

Thiaminhydrochlorid " 200

Soj abohnenprotexnhydrolysat
(mit 7 % Gesamtstickstoff) 1

CaCO₅ 5

(pH 7,0)

309845/1108

■- 21 -

Brevibacterium lactofermentum AJ-34-29 (FERM P-1857), welches zuvor auf einer Bouillon-Schrägkultur kultiviert worden war, wurde in d'as oben genannte Kulturmedium inokuliert. Es wurde 72 Stunden unter Schütteln bei 31⁰C kultiviert.

Als Ergebnis haben sich 5,1 g/dl L-Lysin (als Hydrochlorid) in der Kulturbrühe angesammelt (51 % Ausbeute, bezogen auf die eingesetzte Glucose).

Beispiel 11

Coryenbacteriura glutamicum AJ-3397 (FERM P-1613), AJ-34-58 (FERM P-1982), AJ-34-60 (FERM P-1984-), AJ-34-61 (FERM P-1985), Corynebacterium 1ilium AJ-34-64- (FERM P-2026) und Corynebacterium acetoacidophilum AJ-34-65 (FERM P-2027) wurden als Keimstämme verwendet und,wie im Beispiel 10 beschrieben, kultiviert, mit der Ausnahme, daß zu dem Medium für den Stamm AJ-34-60 weiterhin noch 0,5 % Hefeextrakt gegeben wurde.

Der Stamm AJ 34-65 mit einer AEC-Beständigkeit und einem Alaninerfordernis wurde nach einer ähnlichen Methode,wie im Versuch 3 beschrieben, wobei als Ausgangsstamm Corynebacterium acetoacidophilum 4-10 ATCC 1387O verwendet wurde. Corynebacterium glutamicum AJ-34-61 (FERM P-1987) mit einer AEG-Beständigkeit und keinem Hahrstofferfordernis wurde gleichfalls nach einer ähnlichen Methode wie im Versuch 3 aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 hergestellt. Dieser Stamm wurde in diesem Beispiel als Kontrollprobe verwendet.

In Tabelle 15 sind die gebildeten Mengen von L-Lysin (als Hydrochlorid) nach einer 72-stündigen Kultivierung in der resultierenden Brühe der einzelnen Stämme zusammengestellt.

Beispiel 12

Corynebacterium glutamicum AJ-3397 (FERM P-1613), AJ-34-58 (FERM P-1982), AJ-34-60 (FERM P-1984·)γ AJ-34-61 (FERM P-1985),

309845/1108

232146 Γ

Corynebacterium lilium AJ-3464 (FERM P-2026) und Corynebacterium acetoacidophilum AJ-3465 (FERM P-2027) wurden als Keirastämme verwendet und, wie im Beispiel 2 beschrieben, unter Verwendung von Essigsäure als Hauptkohlenstoffquelle kultiviert, mit der Ausnahme, daß zu dem Keimkulturmedium noch 0,5 % Hefeextrakt gegeben wurden, daß der pH-Wert des Keimkulturmediums auf 7,0 eingestellt wurde und daß zu dem Hauptkulturmedium 2,5 % Sojabohnenproteinhydrolysat gegeben wurden.

In Tabelle 16 sind die Mengen an L-Lysin (als Hydrochlorid) angegeben, welche nach einer 55-stündigen Kultivierung in der resultierenden Höhe der einzelnen Stämme gebildet worden waren.

Beispiel 13 "

Corynebacterium glutamicum AJ-3397 (FERM P-1613), Corynebacterium liliuia AJ-3464 (FERM P-2026) und Corynebacterium acetoecidophilum AJ-3465 (FERM P-2027) wurden in das unten angegebene Keimkulturmedium inokuliert und 18 Stunden unter Rühren und Belüften bei 31°C kultiviert.

Keimkulturmedium:	1	,5	%
Glucose	0	,3	%
Harnstoff	0	,1
KH2PO^	0	,04	ppm
MgS0..7H?0	2		ppm
Fe++	2		pg/1
Mn++	50		ug/1
Biotin	200
Thiaminhydrochlorid			%
Sojabohnenproteinhydrolysat	1	,5
(mit 7 % Gesamtstickstoff)
(pH 7,5)

300 ml-Ansätze eines Hauptkulturmediums mit der folgenden Zusammensetzung wurden in 11-Glasfermentationskolben gegeben,

3098AS/1 108

Hauptkulturmedium: Glucose Äthanol

Harnstoff

	5	2321461	%
1	2	%
1	1
ο,	04	%
ο,		/ω
ο,		/q
ο,		ppm ·:
2		ppm
2	μδ/1
50	μβ/1
50

MgSO₄.7H₂O

Mn⁺⁺
Biotin

Thi aminhydrο chiorid
- Sojabohnenproteinhydrolysat

(mit 7 % GesamtStickstoff) 2,5 % (pH 7,5)

Nach der Sterilisierung wurde jedes Medium mit 15 ml der einzelnen kultivierten Keimbrühen der verschiedenen Stämme inokulxert. Es wurde bei 31 bis 33'⁰C unter Rühren kultiviert, wobei ein gleiches Volumen von Luft je Minute eingeleitet wurde. Während der Kultivierung wurde der pH-Wert des Mediums zwischen 7,2 und 7,8 durch Einleiten von gasförmigem Ammoniak in das Medium gehalten.

Die Menge an restlichem Äthanol in dem Medium wurde durch Gaschromatographie bestimmt. In das Medium wurde Äthanol eingegeben, als die Konzentration des restlichen Äthanols., auf etwa 0,3 % abgesunken war.

In Tabelle 17 ist die Menge von L-Lysin (als Hydrochlorid) angegeben, welche in der resultierenden Brühe der einzelnen Stämme nach einer 4-8-stündigen Kultivierung gebildet worden waren.

309845/1108

Tabelle 1

232Π6Ί

Stamm

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869

Brevibacterium lactofermentum ATCC 21798

Brevibacterium lactofermentum ATCC 21799

Brevibacterium lactofermentum ATCC 21800

Brevibacterium lactofermentum ATCC 21801

Optische Dichte (OD) bei der Kultivierung in einem Minimalmedium in Gegenwart von

keinem Nährstoff zugegebenem Nährstoff 0,400

0,065 (Serin) 0,410

0,059 (Ca-Pantothenat)0,405

0,380 0,075*

0,052 (Adenin) 0,375 * Das Minimalmedium enthielt kein Thiamin.

Tabelle 2

Stamm

ATCC 13869 AJ-3391 AJ-3392

AJ-3393 AJ-3394-AJ-3395 AJ-3396

Wachstum (OD)

Minimalmedium Minimalmedium, versetzt mit Nährstoff

0,400 - ■

0,058 0,440 (40 mg/dl Prolin)

0,057 0,420 (0,5 mg/dl Nicotinamid + 40 mg/dl Leucin)

0,052 0,460 (50 mg/dl Serin

+ 40 mg/dl Leucin)

0,058 0,390 (10 ug/dl Vitamin B-ip)

0,055 0,430 (1 mg/dl Nicotinamid)

0,059 0,420 (5 mg/dl Hypo-

xanthin)

309845/1108

	Tabelle 3	0,027	232H61	AJ-3425	0,070
Zugegebener	Konzentration	0,185	Wachstum (OD)	0,068	0,176
Nährstoff .	(mg/dl)	0,155	AJ-3424	0,170	0,250
Keiner	-	0,058	0,025	0,236	0,210
L-AIa.	50	0,045	0,152	0,160	0,071
D-AIa.	50		0,162	0,066
VaI.	50		0,080
Nie.	0,5	0,037

Thr.plus Met.-	50 50	5	0,	022	o,	020	0,072	0,076
L-Ala.plus Nie.	50 o,	5	0,	425	o,	460	0,238	0,251
D-AIa.plus Nie.	50 o,	5	0,	510	o,	480	0,348	0,341
VaI.plus Nie.	' 50 o,		-		-	0,312	0,323

(Fußnote) Nie: N cotinamid oder Nicotinsäure

Tabelle 4 (Hinsichtlich des Stamms AJ-3429)

Zugegebene Nährstoffe Wachstum (OD)

Keine 0,030 0,035

AIa. 0,031 0,033

Leu. 0,032 0,033

AIa. + Leu. 0,180 0,176

AIa. + Leu. + Nie. . 0,460 0,480

AIa. + Leu. + Nie. + Thr. + Met. 0,435 0,445

(Fußnote) Die Konzentrationen der zugegebenen Nährstoffe betrugen für jede Aminosäure 50 mg/dl und für Nicotinamid 5 mg/1. ■

309845/1 108

Fährstoff-Erfordernis

Stamm	Konz. (OD) dea? Zellsuspension	Nährstoff	Menge (mg/dl)	Wachstum (OD)
AJ-5458	0,455	L-Prölin	40 0	0,475 0,050
AJ-5460	0,450	Guanin	LAO	0,520 _ 0,090 -
AJ-5461	0,400	Vitamin B„,. + c L-rLeucin	0,01 ■ + 50 0 + 0	0,500 0,075
AJ-5465	0,451	-	-	0,512

Tabelle

Stamm Menge an gebildetem Lysin (g/dl)

Brevibacterium lactofermentum

Y-108 (FERM P-1445) ATCC 21798 - 4,1

Brevibact-erium lactofermentum

AC-75 (FERM P-1444) ATCC 21799 2<>5

Brevibacterium lactofermentum

AD-5 (B¹ERM P-1445) ATCC 21800 5,0

Brevibacterium lactofermentum

AD-.162 (PERM P-1446) ATCC 21801 2,8

Tabelle

Stamm Zugegebener Nährstoff Menge an gebildetem

Lysin (g/dl)

Y-108 (ATCC 21798)	-	6,	4 ·
AG-73 (ATCC 21799)	Ca-Pantothenat:1 5	4,	8 '
AD-5 (ATCC 21800)	-	5,	7
AD-162 (ATCC 21801)	Adenin: 100 und Guanin: 100	6.	0

3098A5/1108

Stamm Zugegebener Nährstoff Menge an gebildetem Lysin (g/dl)

Y-108 (AT.CC 21798) - 5,5

AC-73 (ATCC 21799) Ca-Pantothenat: 5 4,4

AD-5 (ATCC 21800) - 5,5

AD-162 (ATCC 21801 Adenin: 100 und

Guanin: 100 5,7

Tabelle 9

Stamm Menge an Sojabohnenprotein- Menge an gebildetem ' hydrolysat (%) L-Lysin (g/dl)

AJ-3391 3 ' 2,9

AJ-3392 1,5 5,0

AJ-3393 1,5 4,6

AJ-3394 3 3,5

AJ-3395 · 2 3,1

AJ-3396 3 3,0

Tabelle 10

Stamm Zugabe von Hypoxanthin Menge an gebildetem (mg/dl? L-Lysin (g/dl)

AJ-3391 - 5,4

AJ-3392 . - 7,1

AJ-3393 - 7,0

AJ-3394 - 6,5

AJ-3395 - 5,8

AJ-3396 5 6,1

309845/1108

AJ-3391 AJ-3392 AJ-3393 AJ-3394 AJ-3395 AJ-3396

Tabelle 11

Stamm Zugabe von Hypoxanthin Menge an gebildetem

(mg/dl) L-Lysin (g/dl)

5,2 6,3 6,5 6,1 5,0 5,5

Tabelle 12

Stamm	Menge an gebildetem L-Lysiη (g/dl)	Ausbeute bezogen auf die eingesetzte Glucose (%)
AJ-3424	4,4	44
AJ-3425	3,2	32
Nr. 872	1,8	18
	Tabelle 13
Stamm	Menge an gebildetem L-Lysin (g/dl)	Verbrauchte Essigsäure (%)
AJ-3424	7,2	22
AJ-3425	6,1	24
Nr. 872	4,0	32
	Tabelle 14
Stamm	Menge an gebildetem L-Lysin (g/dl)	Ausbeute bezogen auf das eingesetzte Äthanol (%)
AJ_3424	6,6	.. 26
AJ-3425 Nr. 872	5,6 3,6	20 17
	3098 A 5/,M 0-8

232U61

	Tabelle 15	Ausbeute bezogen auf die eingesetzte Glucose (%)
Stamm	Menge an gebildetem L-Lysin (g/dl)	" 30
AJ-3397	3,0	30
AJ-3458	3,0	41
AJ-34-61	4,1	31
AJ-3460	3,1	29
AJ-J464	2,9	32
AJ-3465	3,2	20
AJ-34-63	2,0
	Tabelle 16	Verbrauchte Essigsäure (%)
Stamm	Menge an gebildetem L-Lysin (g/dl)	22
AJ-3397	5,0	23,5
AJ-3458	5,2	- 25
AJ-3460	4,7	23
AJ- 34-6I	6,4	24
AJ-3464	5,5	22
AJ-3465	5,8
	Tabelle 17	Ausbeute bezogen auf das eingesetzte Äthanol (%)■
Stamm	Menge an gebildetem L-Lysin (g/dl)	23
AJ-3397	4,8	20,5
AJ-3464	4,1	24
AJ-3465	4,6

309845/1 108

Claims (7)

1. Patentansprüche

   (Aj Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm der Art Brevibacterium und/oder Gorynebacterium als lysinerzeugenden Stamm bei aerobischen Bedingungen in einem Medium, welches assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff, anorganische Salze, für das Wachstum erforderliche Substanzen und organische wachstumsfördernde Substanzen enthält, bei einem pH-Wert von 5 bis 9 kultiviert, bis in dem Medium L-Lysin gebildet wird, wobei der verwendete Stamm eine Beständigkeit gegenüber einer Hückkopplungsinhibierung von Lysin und Lysin-Analogen und ein Nährstoff-Erfordernis für mindestens eine der Verbindungen Serin, Prolin, Alanin, Nicotinamid, Pantothensäure, Thiamin, Guanin, Hypoxanthin und/oder Vitamin B. ρ besitzt und daß man das L-Lysin in der resultierenden Kulturbrühe ansammelt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als assimilierbare Quelle für Kohlenstoff ein Kohlenhydrat verwendet.
3. 3- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als assimilierbare Quelle für Kohlenstoff Essigsäure verwendet.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als assimilierbare Quelle für Kohlenstoff Äthanol verwendet.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4-, dadurch gekennzeichnet, daß das Lysinanaloge S-(2-Aminoäthyl)-L-cystein ist.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die für das Wachstum erforderlichen Substanzen in dem Medium als Verbindungen von natürlichen Substanzen anwendet.

   309845/1108
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als lysinerzeugenden Stamm Brevibaete'rium lactoferinentum Y-108 ATCC 21798, Brevibacterium lactofermentum AC-73 ATCC 21799, Brevibacterium lactofermentum AD-5 ATCC 21800, Brevibacterium lactofermentum AD-162 ATCC 21801, Brevibacterium lactofermentum AJ-3424 FERM P-1711, ,Brevibacterium lactofermentum AJ-3425 FERM P-1712, ' Brevibacterium lactofermentum AJ-3429 FERM P-I857, Brevibacterium lactofermentum AJ-3391 FERM P-1570, Brevibacterium lactofermentum AJ-3394 FERM P-1573, Brevibacterium lactofermentum AJ-3395 FERM P-1574--, Brevibacterium lactofermentum AJ-3396 FERM P-1575, Brevibacterium lactofermentum AJ-3392 FERM P-1571, Brevibacterium lafetofermentum AJ-3393 FERM P-1572, Corynebacterium glütamicum AJ-3397 FERTl P-I6I3, Corynebacterium lilium AJ-3464- FERM P-2026, Corynebacterium acetoacidophilum AJ-34-65 FERM P-2027, Corynebacterium glütamicum AJ-34-58 FERI¹I P-1982, Corynebacterium glütamicum AJ-3460 FERM P-1984 und/oder Corynebacterium glütamicum AJ-3461 FERM P-1985 verwendet.

   309845/1108