DE2411207C2

DE2411207C2 -

Info

Publication number: DE2411207C2
Application number: DE19742411207
Authority: DE
Inventors: Takayasu Kawasaki Kanagawa Jp Tsuchida; Hiroshi Yokohama Kanagawa Jp Matsui; Hitoshi Zushi Kanagawa Jp Enei; Fumihiro Fujisawa Kanagawa Jp Yoshinaga
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1973-03-12
Filing date: 1974-03-08
Publication date: 1989-07-20
Also published as: FR2221518B1; GB1440879A; DE2411207A1; JPS49116294A; JPS5121079B2; FR2221518A1

Description

Die Erfindung betrifft die durch die Patentansprüche gekennzeich neten Gegenstände.

L-Phenylalanin, das nachstehend kurz als Phenylalanin bezeich net wird, wurde als Nahrungsmittelzusatz und in der medizini schen Forschung verwendet.

Es ist ein fermentatives Verfahren zur Erzeugung von Phenylala nin mit Hilfe einer auxotrophen Mutante von Micrococcus glutamicus mit Tyrosinbedarf bekannt, mit welchem Phenylalanin in einem Nährmedium angereichert werden kann (bekanntgemachte Japanische Patentanmeldung 6345/1962). Es ist außerdem bekannt, daß eine Mutante von Brevibacterium oder Corynebacterium, die resistent gegen Phenylalanin-Analoge ist, höhere Mengen an Phenylalanin bildet (US-PS 36 60 235). Der bei dem bekannten Verfahren verwendete beste Stamm war eine Mutante von Coryne bacterium, die resistent gegenüber Phenylalanin-Analoga war und für ihr Wachstum Tyrosin benötigte. Diese Mutante bildete 1,68 g/dl Phenylalanin aus 15 g/dl Saccharose (DT-OS 21 37 071).

Es wurde nun gefunden, daß eine stark erhöhte Menge an Phenyl alanin mit Hilfe von neu aufgefundenen Mutanten von Brevibac terium gebildet werden kann, die resistent gegen Tryptophan- Analoge und Phenylalanin-Analoge sind und für ihr Wachstum Tyrosin benötigen.

Gegenstand der Erfindung sind L-Phenylalanin bildende Mutanten Brevibacterium flavum FERM BP-1316, Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1317 und Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1071.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur fermen tativen Herstellung von L-Phenylalanin durch Züchtung einer Mu tante von Brevibacterium unter aeroben Bedingungen in einem wäs serigen Fermentationsmedium bis zur Anreicherung einer wesentli chen Menge von L-Phenylalanin in dem Medium und Gewinnung des angereicherten L-Phenylalanins aus der Fermentationsbrühe. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine der vorstehend definierten L-Phenylalanin bildenden Mutanten verwendet.

Den erfindungsgemäßen Mutanten ist gemeinsam, daß sie Tyrosin-Bedarf haben, gegen 5-Methyltryptophan, d. h. ein Tryptophan-Analoges, und gegen p-Fluorphenylalanin, d. h., eines der bekannten Phenylalanin-Analogen, resistent sind. Bekanntlich haben Phenylalanin-Analoge, die als Antago nisten zu Phenylalanin bekannt sind, folgende Eigenschaf ten:

1. Sie sind Phenylalanin-analoge Verbindungen,
2. sie hemmen das Wachstum von Mikroorganismen und
3. diese Wachstumshemmung wird durch das Vorliegen von Phenylalanin in dem Medium mehr oder weniger beseitigt.

Zur Zeit bekannte Phenylalanin-Analoge, welche die vorstehend angegebenen Eigenschaften aufweisen, sind β-Amino-β-phenyl propionsäure, o-Fluorphenylalanin, m-Fluorphenylalanin, p-β- Fluorphenylalanin, β-2-Thienylalanin, β-3-Thienylalanin, β-2- Furylalanin, β-3-Furylalanin, o-Aminophenylalanin, p-Amino phenylalanin, m-Aminophenylalanin, α-Amino-β-phenyläthan sulfonat, β-2-Pyrrolalanin, 1-Cyclopenten-1-alanin, 1-Cyclo hexen-1-alanin, β′-4-Pyridinylalanin, b-4-Pyrazolalanin, p- Nitrophenylalanin, β-4-Thiazolalanin, Cyclohexylalanin, 2-Amino- 4-methyl-4-hexensäure, s-(1,2-Dichlorvinyl)-cystein, o-Chlor phenylalanin, m-Chlorphenylalanin, p-Chlorphenylalanin, o-Brom phenylalanin, m-Bromphenylalanin, p-Bromphenylalanin, m-Fluor tyrosin, 3-Nitrotyrosin und 3-Jodtyrosin.

5-Methyltryptophan, gegen das die erfindungsgemäßen Mutanten resistent sind, ist ein Tryptophan-Analoges, wie auch die fol genden bekannten Verbindungen 6-Methyltryptophan, 4-Methyltryptophan, Naphthylalanine, Indol acrylsäure, Naphthylacrylsäure, β-(2-Benzothienyl)-alanin, Styrylessigsäure, α-Amino-β-3-(indazol)-propionsäure, 5-Fluor tryptophan, 6-Fluortryptophan, 4-Fluortryptophan und 7- Azatryptophan. Solche Tryptophan-Analoge haben die nachstehenden allgemeinen Merkmale und sind allgemein als Antagonisten von Tryptophan bekannt.

1. Sie sind Verbindungen, die Tryptophan analog sind,
2. sie hemmen das Wachstum von Mikroorganismen,
3. die Hemmung wird durch das Vorliegen von Tryptophan in dem Medium mehr oder weniger beseitigt.

Gewöhnlich ist eine Mutante, die gegen eines der Phenylalanin- Analoga resistent ist, auch gegen einige der anderen Phenylala nin-analogen Verbindungen resistent, und eine Mutante, die re sistent gegen eines der Tryptophan-Analoga ist, ist auch gegen einige andere Tryptophan-Analoga resistent.

Die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mutantenstäm me angewendeten Mutationsmethoden sind übliche Methoden, wie Be strahlen von Zellen der Elternstämme mit Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlung oder Gammastrahlung in mutagenen Dosen, oder Behandlung mit Natriumnitrit, N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguani din oder Diäthylsulfatlösung, die als chemische mutagene Mittel bekannt sind.

Die Methoden zur Selektion der erfindungsgemäßen Mutanten aus den bestrahlten bzw. behandelten Elternstämmen sind ebenfalls üblich. Das heißt, der Tyrosin-Bedarf der Mutan ten kann mit Hilfe der Übertragungsmethode (Replica-Methode, J. Bacteriol. 63, 399 (1952)) ausgenutzt werden. Die gegen Phenylalanin-Analoge der Tryptophan-Analoge resistenten Mutan ten können ausgesondert werden, indem die behandelten Stämme auf einem Medium gezüchtet werden, das ausreichend Phenyl alanin-Analoge oder Tryptophan-Analoge enthält, um das Wachstum der Elternstämme zu hemmen.

Die Resistenz einer Mutante gegen die Analogen der Aminosäuren wird bestimmt, indem das relative Wachstum der Mutante auf einem diese Aminosäure-Analogen enthaltenden Medium mit dem des Eltern stammes verglichen wird. Das relative Wachstum ist das Verhältnis des Wachstums auf dem Medium, das die Analogen der Aminosäuren enthält, zu dem Wachstum auf einem Medium, das frei von den Ana logen der Aminosäuren ist.

Die Nährmedien, die mit Hilfe der erfindungsgemäß verwendeten Mutanten-Stämme fermentiert werden, sind als solche üblich und enthalten assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff, zum Wachstum der Mutanten benötigtes L-Tyrosin, anorganische Salze und erwünschte organische Spurennährstoffe, wie Vitamine und Aminosäuren. Zu assimilierbaren Kohlenstoffquellen gehören beispielsweise Glucose, Fructose, Saccharose, Stärkehydrolysate, Melassen, Äthanol, Propanol, Glycerin, Essigsäure, Benzoesäure, Propionsäure und höhere Fettsäuren.

Zu assimilierbaren Stickstoffquellen gehören organische und an organische stickstoffhaltige Substanzen, wie Nitrate, Ammonium salze, gasförmiges Ammoniak, Ammoniumhydroxidlösung und Harn stoff.

Zum Erzielen einer guten Ausbeute an Phenylalanin wird die Fer mentation aerob unter Belüftung und/oder Rühren durchgeführt. Die besten Ausbeuten werden bei einer Regelung des pH-Wertes innerhalb des Bereiches von 5 bis 9 erzielt. Der gewünschte pH-Wert kann aufrechterhalten werden, indem gasförmiges oder wäßriges Ammoniak oder organische Säuren dem Medium von Zeit zu Zeit zugesetzt werden. Einige dieser Verbindungen können auch zur Zuführung von assimilierbarem Stickstoff dienen. Wenn die Fermentation bei 24 bis 37°C durchgeführt wird, hat die Konzen tration an Phenylalanin in der Kulturbrühe innerhalb 2 bis 7 Tagen ihren Maximalwert erreicht.

Das in der Fermentationsbrühe angereicherte Phenylalanin kann durch übliche Methoden gewonnen werden, wie durch Entfernen der Zellen durch Filtration oder Zentrifugieren, Leiten der Brühe über ein Ionenaustauscherharz und Ausfällen am isoelektrischen Punkt von Phenylalanin. Das in der Brühe vorliegende Phenyl alanin wird durch biologischen Test unter Verwendung von Leuconostoc citrovorum bestimmt.

Beispiel 1

Die folgenden Mutanten wurden aus Brevibacterium lactofermentum Nr. 2256, ATCC 13869, mit 250 γ/ml N-Methyl-N′-nitro-N-nitroso guanidin erzeugt:

AJ 3437 (FERM P-1914): Tyr^-, PFP^R, MT^R
AJ 3699 (FERM P-2476): Tyr^-, Trp^-, Met^-, PFP^R, MT^R

Die erfindungsgemäßen Stämme AJ 3437 und AJ 3699 sind bei der In ternationalen Hinterlegungsstelle des Fermentation Research Insti tute in Japan unter den Bedingungen des Budapester Vertrags hinter legt. Ihre Hinterlegungsnummern sind:

AJ 3437 = FERM BP-1071;
AJ 3699 = FERM BP-1317.

Tyr^-: benötigt Tyrosin
Trp^-: benötigt Tryptophan
Met^-: benötigt Methionin
PFP^R: resistent gegen p-Fluorphenylalanin
MT^R: resistent gegen 5-Methyltryptophan

Ein wäßriges Kulturmedium wurde hergestellt, das 20 g/l Glu cose, 2,0 g/l Harnstoff, 1,5 g/l (NH₄)₂SO₄, 1,0 g/l KH₂PO₄, 3,0 g/l K₂HPO₄, 0,1 g/l MgSO₄ · 7H₂O, 50 µg/l Biotin, 100 µg/l Thiamin · HCl, 1,5 g/l L-Tyrosin, 0,3 g/l L-Methionin, 10 mg/l FeSO₄ · 7H₂O, 10 mg/l MnSO₄ · 7H₂O und 0,1 g/l L-Tryptophan ent hielt, und dessen pH-Wert auf 7,0 eingestellt war. 3 Proben des wäßrigen Mediums von je 3 ml wurden zusammen mit den in Tabelle 1 angegebenen Mengen p-Fluorphenylalanin in 10 ml-Re agenzgläser gegeben. Das Medium wurde mit 15 × 10⁷ Zellen des Mikroorganismus angeimpft, der vorher in dem Grundmedium suspen diert worden war, und die Züchtung wurde 24 Stunden bei 30°C durchgeführt.

Das relative Wachstum der Mutanten ist in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Die Resistenz jedes der Stämme Nr. 2256, AJ 3437 und AJ 3699 gegenüber 5-Methyltryptophan wurde in analoger Weise bestimmt, wie vorstehend angegeben. Die dabei erhaltenen Er gebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Die Resistenz (das relative Wachstum) jedes der Stämme Nr. 2256 und AJ 3437 gegenüber dem in Tabelle 3 gezeigten Phenylalanin- Analogen oder Tryptophan-Analogen wurde in gleicher Weise wie vorstehend bestimmt.

Beispiel 2

Die nachstehende Mutante wurde aus Brevibacterium flavum Nr. 2247, ATCC 14067, mit Hilfe von 250 µg/ml N-Methyl-N′-nitro-N- nitrosoguanidin erhalten:

AJ 3698 (FERM P-2475): Tyr^-, MT^R, PFP^R

Die Mutante AJ 3698 gemäß der Erfindung ist beim Fermentation Research Institute, Japan unter der Nummer FERM BP-1316 interna tional hinterlegt.

Die Resistenz des Stammes Nr. 2247 und der Mutante gegenüber p-Fluorphenylalanin und 5-Methyltryptophan wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Ta bellen 4 und 5 gezeigt.

Tabelle 4

Tabelle 5

Beispiel 3

Ein wäßriges Kulturmedium wurde hergestellt, das pro 100 ml 13 g Glucose, 1,0 g (NH₄)₂SO₄, 0,15 g KH₂PO₄, 0,4 g MgSO₄ · 7H₂O, 5,0 µg Biotin, 20 µg Thiamin · HCl, 1,0 mg FeSO₄ · 7H₂O, 1,0 mg MnSO₄ · 7H₂O, 40 mg L-Tyrosin, 40 mg DL-Methionin, 3,0 ml Soja protein-Säurehydrolysat, 1,2 g Fumarsäure, 0,3 ml Essigsäure, 5,0 g Calciumcarbonat und 0,1 g/l L-Tryptophan enthielt, und auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. 20 ml-Proben des wäßri gen Kulturmediums wurden in 500 ml-Kolben gegeben, mit vorher gezüchteten Mutanten gemäß Tabelle 6 angeimpft und unter Schüt teln 72 Stunden bei 30°C gezüchtet.

Stamm
angereichertes Phenylalanin

(g/100 ml)
Nr. 2256
0,00
AJ 3437	2,20
AJ 3699	2,31

Aus den Kulturen von Brevibacterium lactofermentum AJ 3437 und AJ 3699 wurde Phenylalanin in kristalliner Form durch Zentrifu gieren jeder Kulturbrühe zur Entfernung von Zellen und anderen Feststoffen, Leiten der zellfreien Flüssigkeit über ein Ionen austauscherharz Diaion SK-1, Eluieren des adsorbierten Phenyl alanins mit NH₄OH und Einstellen des pH-Werts des Eluats auf den isoelektrischen Punkt von Phenylalanin, pH 5,5, in an sich bekannter Weise erhalten. Die Ausbeute betrug 65% des ur sprünglich in der Kulturbrühe vorhandenen Phenylalanins.

Beispiel 4

Brevibacterium lactofermentum AJ 3437 wurde 16 Stunden unter Schütteln bei 31,5°C in einem wäßrigen Kultur medium gezüchtet, das pro 100 ml 3 g Glucose, 0,1 g KH₂PO₄, 0,04 g MgSO₄ · 7H₂O, 1 mg FeSO₄ · 7H₂O, 1 mg MnSO₄ · 4H₂O · 4H₂O, 40 mg L- Tyrosin, 40 mg DL-Methionin, 5 ml Sojaprotein-Säurehydrolysat, 10 µg Biotin, 30 µg Thiamin · HCl und 0,2 g Harnstoff enthielt.

Dann wurde ein wäßriges Kulturmedium hergestellt, das pro 100 ml 0,4 g Ammoniumacetat, 0,4 g Natriumacetat, 0,1 g KH₂PO₄, 0,04 g MgSO₄ · 7H₂O, 1 mg FeSO₄ · 7H₂O, 1 mg MnSO₄ · 4H₂O, 40 mg L-Tyrosin, 40 mg DL-Methionin, 5 ml Sojaprotein-Säurehydroly sat, 10 µg Biotin, 30 µg Thiamin · HCl und 0,2 g Harnstoff enthielt, und der pH-Wert des Mediums wurde auf 7,0 eingestellt. 300 ml- Proben des wäßrigen Mediums wurden in einen 1-Liter-Fermenter gegeben, mit Dampf sterilisiert und mit 15 ml der vorstehend angegebenen Kulturbrühe angeimpft.

Die Fermentation wurde bei 31,5°C unter Rühren mit 1200 Upm und mit einer Belüftung mit 300 ml/min durchgeführt. Nach 3stündiger Züchtung wurden 70%ige Essigsäure und gasförmiges Ammoniak zugeführt, so daß der pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 7,7 eingestellt wurde. Nach 48stündiger Züchtung hatte AJ 3437 57 g Essigsäure verbraucht und 2,01 g/100 ml (g/dl) Phenylalanin gebildet.

Beispiel 5

Die in Beispiel 2 beschriebenen Mikroorganismen werden in glei cher Weise wie in Beispiel 3 gezüchtet. Dabei reicherten sich in der Fermentationsbrühe die in Tabelle 7 gezeigten Mengen an Phenylalanin an.

Stamm
angereichertes Phenylalanin

(g/100 ml)
Nr. 2247
0,00
AJ 3698	2,01

Beispiel 6

Brevibacterium lactofermentum AJ 3436 und AJ 3437 wurde bei 30°C während 18 Stunden unter Schütteln in einem wäßrigen Kulturmedium gezüchtet, das pro 100 ml (dl) 3 g Glucose, 0,1 g KH₂PO₄, 0,04 g MgSO₄ · 7H₂O, 1 mg FeSO₄ · 7H₂O, 1 mg MnSO₄ · 4H₂O, 5 ml Sojaprotein-Säurehydrolysat, 20 µg Biotin, 30 µg Thiamin · HCl und 0,3 Harnstoff enthielt.

Dann wurde ein wäßriges Kulturmedium hergestellt, das pro 100 ml (dl) 1,5 Äthylalkohol, 0,5 g (NH₄)₂SO₄, 0,1 g KH₂PO₄, 0,04 g MgSO₄ · 7H₂O, 1 mg FeSO₄ · 7H₂O, 2 ml Sojaprotein-Säurehy drolysat, 40 mg L-Tyrosin, 40 mg DL-Methionin, 20 µg Biotin, 30 µg Thiamin-HCl enthielt, und dessen pH-Wert auf 7,2 einge stellt wurde.

300 ml des wäßrigen Kulturmediums wurden in einen 1-Liter-Fer menter gegeben und mit 15 ml der vorstehend angegebenen Kultur brühe angeimpft und unter Rühren und Belüftung bei 31°C gehal ten.

Während der so durchgeführten Fermentation wurde der pH- Wert des Mediums mit gasförmigem Ammoniak auf 7,0 bis 7,5 ein gestellt, und die Konzentration von Äthanol in dem Medium wur de bei 0,1 g/dl gehalten, indem von Zeit zu Zeit Äthanol zuge führt wurde.

Nach 48stündiger Züchtung hatte AJ 3437 1,95 g/dl Phenylala nin in der Fermentationsbrühe angereichert.

Claims

1. L-Phenylalanin bildende Mutanten Brevibacterium flavum FERM BP-1316, Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1317 und Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1071.

2. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Phenyl alanin durch Züchtung einer Mutante von Brevibacterium unter aeroben Bedingungen in einem wässerigen Fermen tationsmedium bis zur Anreicherung einer wesentlichen Menge von L-Phenylalanin in dem Medium und Gewinnung des angereicherten L-Phenylalanins aus der Fermentations brühe, dadurch gekennzeichnet, daß man eine L-Phenylalanin bildende Mutante gemäß Anspruch 1 verwen det.