DE2411207A1

DE2411207A1 - Verfahren zur fermentativen herstellung von l-phenylalanin

Info

Publication number: DE2411207A1
Application number: DE19742411207
Authority: DE
Inventors: Hitoshi Enei; Hiroshi Matsui; Takayasu Tsuchida; Fumihiro Yoshinaga
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1973-03-12
Filing date: 1974-03-08
Publication date: 1974-09-19
Also published as: FR2221518A1; DE2411207C2; JPS5121079B2; FR2221518B1; GB1440879A; JPS49116294A

Description

Priorität: 12. März 1973, Japan, Nr. 28 728/1973

Verfahren zur fermentativem ⁱiei)stellung_von L-Phen^rlalanin

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch Fermentation.

L-Phenylalanin, das nachstehend kurz als Phenylalanin bezeichnet wird) wurde als Nahrungsmittelzusatz und in der medizinischen. Forschung verwendet.

Es ist ein fermentatives Verfahren zur Erzeugung von Phenylalanin mit Hilfe einer auxotrophen Mutante von Hicrococcus glutamious mit Tyrosinbedarf bekannt, mit welchem Phenylalanin in einem Währmedium angereichert werden kann (bekanntgemachte Japanische Patentanmeldung 634-5/1962). Es ist außerdem bekannt, daß eine Mutante von ßrevibacterium oder Corynobacterium, die resistent gegen Phenylalanin-Analoge ist, höhere Mengen an Phenylalanin bildet (US-PS 3 66o 235). lter bei dem bekannten Verfahren verwendete beste Stamm war eine Mutante von Corynebacterium, die resistent gegenüber Phenylalanin-Analoga war und für ihr Wachstum Tyrosin benötigte. Diese Mutante bildete 1,68· g/dl Phenylalanin aus 15 g/dl Saccharose (DT-OS 2 137 o71),

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Es wurde nun gefunden, daß eine stark erhöhte Menge an Phenylalanin mit Hilfe einer neu aufgefundenen Mutante von Brevibacterium gebildet werden kann, die resistent gegen Tryptophan-Analoge und Phenylalanin-Analoge ist und für ihr Wachstum Tyrosin benötigt.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Phenylalanin durch Züchtung einer L-Fhenylalanin-bildenden tiutante eines Elternstammes von Brevibacterium, die Resistenz gegen Phenylalanin-Analoge hat, unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Permentationsmedium bis zur Anreicherung einer wesentlichen Menge an L-Phenylalanin in dem Medium und Gewinnen des angereicherten L-Phonylalanins aus dem Permentati onsmedium. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mutantenstamm von Brevibacterium verwendet, der befähigt ist, auf einem Kulturmedium zu wachsen, das die zur Hemmung des Wachstums des Elternstamme3 ausreichende Menge an Tryptophan-Analogen enthält und der befähigt ist, auf einem Kulturmedium zu wachsen, das ausreichend Phenylalanin-Analoge enthält, um das Wachstum des Elternstammes zu hemmen, und der für sein Wachstum L-Tyrosin benötigt.

Die zur Herstellung der erfindungsgemäß geeigneten Mutantenstämme angewendeten Mutationsmethoden sind übliche Methoden, wie Bestrahlen von Zellen der Elternstämme mit Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlung oder Gammastrahlung in mutagenen Dosen, oder Behandlung mit Natriumnitrit, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin oder Diäthylsulfatlösung, die als chemische mutagene Mittel bekannt sind.

Die Methoden zur Selektion der erfindungsgemäß geeigneten Mutanten aus den bestrahlten bzw. behandelten Elternstämmen sind •ebenfalls üblich* Das heißt, die Tyrosin benötigende Mutante kann mit Hilfe der Übertragungsmethode (lieplica-Methode, J. Bacteriol. ££, 399 (1952)) isoliert werden. Gegen Phenylalanin-Analöge oder Tryptophan-Analoge resistente Mutanten können ausgeeondert werden, Indem die behandelten Stämme auf einem Me-

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diura gezüchtet werden, das auareichend Phenylalanin-Analoge oder Tryptophan-Analoge enthält, um das Wachstum der Elternstämme zu hemmen.

Die Resistenz einer Mutante gegen die .analogen der Aminosäuren wird bestimmt, indem das relative Wachstum der Mutante auf einem diese Aminosäure-Analogen enthaltenden Medium mit dem des Elternstammes verglichen wird. Das relative w'achstum ist das Verhältnis des Wachstums auf dem Medium, das die Analogen der Aminosäuren enthält, zu dem Wachstum auf einem Medium, das frei von den Analogen der Aminosäuren ist.

Die Analoga von Phenylalanin, gegen welche die erfindungsgemäß verwendeten Stämme resistent üind, haben folgende allgemeine Eigenschaften und sind allgemein als Antagoni£3ten zu Phenylalanin bekannt:

1. Sie sind Phenylalanin-analoge Verbindungen. 2* Sie hemmen das Wachstum von Mikroorganismen. 3. Die Hemmung wird durch das Vorliegen von Phenylalanin in dem Medium mehr oder weniger beseitigt.

Zur Zeit bekannte Phenylalanin-Analoge, welche die vorstehend angegebenen Eigenschaften aufweisen, sind β-Amino-ß-phenylpropioneaure, o-Fluorphenylalanin, m-Pluorphenylalanin, p-ß Fluorphenylalanin, ß-2-Thienylalanin, ß-3-Thienylalanin, ß-2-Furylalanin, ß-J-^urylalanin, o-Aminophenylalanin, p-Aminophenylaianin, m-Aminophenylalanin, oL-Amino-ß-phenyläthansulfonat, ß-2-Pyrrolalanin, 1-Cyclopenten-i-alanin, 1-Cyclohexen~1-älanin, ß-4-Pyridinylalanin, ß-4-Pyrazolalanin, p-Nitrophenylalanin, ß-4-Thiazolalanin, Cyclohexylalanin, 2-Amino-4-methyl-4-hexensäure, s-(1,2*-Dichlorvinyl)-cystein, o-Chlorphenylalanin, m-Chlorphenylalanin, p-Ohlorphenylalanin, o-Bromphenylälanin, m-Bromphenylalanin, p-Bromphenylalanin, m-Fluortyrosin, 3-Nitrotyrosin und 3-Jodtyroisin.

Zur Zeit bekannte Tryptophan-Analoge sind folgende Verbindungen:

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6-Methyltryptophan, 4—Methyltryptophan, Naphthylalanine, Indolacrylsäure, Naphthylacrylsäure, ß -(2-Benzothienyl)-alanin, Styrylessigsäure, <x-Aiaino-β-5-(indazol)-propionsäure, 5-Fluortryptophan, 6-Fluortryptophan, ^--l'luortryptophan und 7-Azatryptophan.

Solche Tryptophan-Analoge haben die nachstehenden allgemeinen Merkmale und sind allgemein als Antagonisten von Tryptophan bekannt .

1. Sie sind Verbindungen, die Tryptophan analog sind.

2. Sie hemmen das Wachstum von Mikroorganismen.

3. Die Hemmung wird durch das Vorliegen von Tryptophan in dem Medium mehr oder weniger beseitigt.

Gewöhnlich ist eine Mutante, die gegen eines der Phenylalanin-Analoga resistent ist, auch gegen einige der anderen Phenylalanin-analogen Verbindungen resistent, und eine Mutante, die resistent gegen eines der Tryptophan-Analoga ist, ist auch gegen einige andere Tryptophan-Analoga resistent.

Die Nährmedien, die mit Hilfe der erfindungsgemäß verwendeten Mutanten-Stamme fermentiert werden, sind als solche üblich und enthalten assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und !Stickstoff, zum Wachstum der Mutanten benötigtes L-Tyrosin, anorganische Salze und erwünschte organische Spurennährstoffe, wie Vitamine und Aminosäuren. Zu assimilierbaren Kohlenstoffquellen gehören beispielsweise Glucose, Fructose, Saccharose,Stärkehydrolysate, Melassen, Äthanol, Propanol, Glycerin, Essigsäure, Benzoesäure, Propionsäure und höhere Fettsäuren.

Zu assimilierbaren Stickstoffquellen gehören organische und anorganische stickstoffhaltige Substanzen, wie Nitrate, Ammoniumsalze, gasförmiges Ammoniak, Ammoniumhydroxidlösung und Harnstoff.

Zum Erzielen einer guten Ausbeute an Phenylalanin wird die Fer-

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mentation, aerob unter Belüftung und/oder Rühren durchgeführt. Die besten Ausbeuten werden bei einer Regelung des pH-Wertes innerhalb des Bereiches von 5 bis 9 erzielt. Der gewünschte pH-Wert kann aufrechterhalten werden, indem gasförmiges oder wässriges Ammoniak oder organische öäuren dem Medium von Zeit zu Zeit zugesetzt werden. Einige dieser Verbindungen können auch zur Zuführung von assimilierbarem Stickstoff dienen. Wenn die Fermentation bei 24- bis 37°C durchgeführt wird, hat die Konzentration an Phenylalanin in der Kulturbrühe innerhalb 2 bis ? Tagen ihren Maximalwert erreicht.

Das in der Fermentationsbrühe angereicherte Phenylalanin kann durch übliche Methoden gewonnen werden, wie durch Entfernen der Zellen durch Filtration oder Zentrifugieren, Leiten der Brühe über ein Ionenaustauscherharz und Ausfällen am isoelektrischen Punkt von Phenylalanin. Das in der Brühe vorliegende Phenylalanin wird durch biologischen Test unter Verwendung von Leuconostoc citrovorum bestimmt.

Die folgenden Mutanten wurden aus Brevibacterium lactofermentum Nr. 2256, ATGG 13869, mit 2^o f/ml N-Aiethyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin erzeugt:

AJ 3435 (FM P-1912) : Tyr~,

AJ 3436 (FERM P-1913) : Tyr", PFP^R

AJ 3432'(FERM P-1844) : Tyr", MT^ß

AJ 3437 (FEM Ρ-19Ί4) : Tyr"*, PFP^R, MT^R AJ 3699 (FERM P-24-76) : Tyr*", Trp", Met", PFP¹¹, MT^ß

Tyr~": benötigt Tyrosin

Trp""i benötigt Tryptophan

Met"": benötigt Methionin

PFP : resistent gegen p-Fluorphenylalanin

MT : resistent gegen 5-Methyltryptophan

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Ein wässriges Kulturmedium wurde hergestellt, das 2o g/l Glucose, 2,o g/l Harnstoff, 1,5 g/l (NH^)₂SO₄, 1,o g/l KH₂PO₄, 3,0 g/l K₂IIPO₄, o,1 g/l MgSO₄-7H₂O, 50/^g/l Biotin, 100 ^ig/l Thiamin.HCl, 1,5 g/l L-Tyrosin, o,3 g/l L-Methionin, 1o mg/1 FeGO₄.7H_o0, 1o mg/1 MnSU₄.7H₂O und o,1 g/l L-Tryptophan enthielt, und dessen pH-Wert auf 7,ο eingestellt war. 3 Proben des wässrigen Mediums von je 3 ml wurden zusammen mit den in Tabelle 1 angegebenen Mengen p-Fluorphenylalanin in 1o ml-Re-

n agenzgläser gegeben. Das Medium wurde mit I5 x Ιο' Zellen des Mikroorganismus angeimpft, der vorher in dem Grundmedium suspendiert worden war, und die Züchtung wurde 24- Stunden bei 3o°C durchgeführt.

Das relative V/achstum der Mutanten ist in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle

zugesetztes p-F-luor-	relatives	AJ3436	Wachstum	AJ3699
phenylalanin Xp g/ml)	Nr. 2256	100	AJ 34-37	I00
0	I00	100	I00	I00
I00	98	98	I00	I00
2oo	96	95	98	93
4oo	95	9o	9o	87
600	45	83	9o	80
800	0	80	80	75
I000	0	78

Die Resistenz jedes der Stämme Nr. 2256, AJ 3432, AJ 34-37 und AJ 3699 gegenüber 5-Methyltryptophan wurde in analoger Weise bestimmt, wie vorstehend angegeben. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

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Tabelle 2

zugesetztes 5-iJiet'.	relatives	1oo	Wachstum	AJ 3699
\ tryptophan i (jig/ml)	- Nr. 2256;AJ 34-32	1oo	AJ 3437	loo
1 ο	1oo	; 98	loo	loo
I 50	; 85	i 95	loo	98
1oo	0	j 9o	loo	94
2oo	0	j 9o	95	92
3oo	O	95	9o
4oo	O	9o

Die Resistenz (das relative Wachstum) jedes der Stämme Nr. 2256 und AJ 3437 gegenüber dem in Tabelle 3 gezeigten Phenylalanin-Analogen oder Tryptophan-Analogen wurde in gleicher V/eise wie vorstehend bestimmt.

Tabelle 3

UMD	p-Fluorphenylalanin	SAJ 3437	AJ 3437	;	m-Fluorphenyl- alanin	B-Phenyl serin '■_	33	AJ 3437	loo	AJ 3437	3437
0	2256	I00	I00	•	2256 Lj 3437 f	2256	26	I00	loo	loo	loo
5o	loo	I00	I00		I t loo I00 i I00	2o	I00	loo	98 ;	loo
2oo	loo	i 98	98 54 36 17 14	50 j 80	3-Nitrotyrosin	I00 I00 I00 86 71	loo	80 j	98 95 95 86 77
5oo	96	9o		O j 65	2256	9	90 ?
I000	65	78		0 I 4o	I00	0	9o
3ooo	O	4o		0	98	60 {
5000	0	2o		0	80 • 7o 3o 0 0	45
(y7ml)	0	m-Fluortyrosin		0	3-Jodtyrosin (
	2256	2256 IAJ
O	I00	I00
5o	98	9o
2oo 5oo I000 3O00 5000	3o 0 0 0 0	5o 1o 0 0

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[ I ( Ϋ7τΤΐ1 ^\ _	5-Methyl tryptophan	AJ 34-37	6-Fluortryptophan	AJ 34-37	5-Fluortryp-	] AJ
. (. l/ml; ,-	2256 j	loo	2256	loo	topiiai 2256
O \	loo	loo	loo	9o	loo
'. 5o	85	95	5o	85	4-5
i 2oo j	0 i	88' i	0	57	O
5oo j	0 ■	2o I	0	4-3	O
I 1ooo I	0	0 i	O	29	0
3ooo		i	O	23	O
5ooo j	0 i	O	O	"34-37
loo
85
50
14-
15
7
O

Die nachstehenden Mutanten wurden aus Brevibacterium flavum Nr. 224-7, ATGC 14-Ο67, mit Hilfe von 25ο Υ/Ίαΐ N-Methyl-N' -nitro-N-nitrosoguanidin erhalten:

AJ 3695 (FEEM P-24-72)

AJ 3696 (FEEM P-24-73)

AJ 3697 (FEEM P-24-74-)

AJ 3698 (FEBM P-24-75)

Tyr"

PFP

MT

Tyr", MT , PF

Die Eesistenz des Stammes Nr. 224-7 und der Mutanten gegenüber p-Fluorphenylalanin und 5-Methyltryptophan wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabellen 4- und 5 gezeigt.

Tabelle 4-

zugesetztes p-Fluor-	4098	relatives Wachstum	AJ 3696	9	AJ 3698
phenylalanin ty<g/ml)	Nr. 2256	I00	loo
O	I00	_m I00	I00
loo	I00	I00	97
2oo	98	95	95
4-00	84·	98	9o
600	41	83	88
800	0	85	75
Ί000	0
38/081!

— Q —.

Tabelle

zugesetztes 5-fdethyltryptophan (üg/ml)

5o

1oo

2oo

4oo
5oo

Wachstum

Hr. 2247 AJ 3697

1oo

1oo
1oo
95 83 75
28

AJ 3698

1oo 98 94 8o 68 3o 12

B_e_i_s_2_i_e_l 3

Ein wässriges Kulturmedium wurde hergestellt, das pro 1oo ml 13 g Glucose, 1,o g (WH₄)₂30₄, o,15 g KH₃PO₄, o,4 g MgSO₄^H₂O, 5,o ^g Biotin, 2o^(g Thiamin'HCl, 1,o mg ]?eS0₄«7H₂0, 1,o mg MnS0₄»7H₂0, 4o mg L-Tyrosin, 4o mg DL-Methionin, 3,0 ml Sojaprotein-Säurehydrolysat, 1,2 g Fumarsäure, o,3 ml Essigsäure, 5,o g Galciumcarbonat und o,1 g/l L-Tryptophan enthielt, und auf einen pH-Wert von 7,ο eingestellt. 2o ml-Proben des wässrigen Kulturmediums wurden in 5oo ml-Kolben gegeben, mit vorher gezüchteten Mutanten gemäß Tabelle 6 angeimpft und unter Schütteln 72 Stunden bei 3o°C gezüchtet.

Tabelle 6

Stamm	angereichertes Phenyl
	alanin (g/100 ml)
Nr. 2256	0,00
AJ 3435	o,42
AJ 3436	o,71
AJ 3432	1,74
AJ 3437	2,2o
AJ 3699	2,31

•Aus den Kulturen von Brevibacterium lactofermentum AJ 3437 und

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AJ 3699 wurde Phenylalanin in kristalliner Form durch Zentrifugieren Jeder Kulturbrühe zur Entfernung von Zellen und anderen Feststoffen, Leiten der zellfreien Flüssigkeit über ein Ionenaus tausche rhar ζ Diaion GK-1, Eluieren des adsorbierten Phenylalanine mit IiH^OH und Einstellen des pH-^;,Verts des Eluats auf den isoelektrischen Punkt von Phenylalanin, pH 5»5> in an sich. bekannter Weise erhalten. Lie Ausbeute betrug 65 % des ursprünglich in der Kulturbrühe vorhandenen Phenylalanine.

Beispiel

Brevibacterium lactofermentum AJ 3436 und AJ 34-37 wurden 16 Stunden unter Schütteln bei 31,5°C in einem wässrigen Kulturmedium gezüchtet, das pro 1oo ml 3 g Glucose, o,1 g o,o4 g HgSO^·7Η₂0, 1 mg FeSO₄^H₂O, 1 mg HnSO^·4Η₂0, 4o mg L-Tyrosin, 4o mg DL-Methionin, 5 nil Sojaprotein-Säurehydrolysat, 1o TBiotin, 3o JTThiamin»HCl und o,2 g Harnstoff enthielt.

Dann wurde ein wässriges Kulturmedium hergestellt, das pro I00 ml 0,4 g Ammoniumacetat, o,^ g Natriumacetat, o,1 g KHpPO^,, o,o4g MgSO^.7H₂O, 1 mg FeSO^·7H₃O, 1 mg MnSO₄'4-H₂O, 4-o mg L-Tyrosin, 4-o mg DL-Methionin, 5 ml Sojaprotein-Säurehydrolysat, 1o Γ Biotin, 3o t Thiamin'HGl und o,2 g Harnstoff enthielt, und der pH-V/ert des Mediums wurde auf 7*ο eingestellt. 3oo ml-Proben des wässrigen Mediums wurden in einen 1-Liter-Jermenter gegeben, mit Dampf sterilisiert und mit 15 ml der vorstehend angegebenen Kulturbrühe angeimpft.

Die Fermentation wurde bei 31»5°G unter Rühren mit 1.2oo Upm und mit einer Belüftung mit 3oo ml/min, durchgeführt. Nach. 3-stündiger Züchtung wurden 7o %-ige Essigsäure und gasförmiges Ammoniak zugeführt, so daß der pH-Wert im Bereich von 7»ο bis 7,7 eingestellt wurde. Nach 4-8-stündiger Züchtung hatte AJ 3437 ,57 g Essigsäure verbraucht und 2,o1 g/1oo ml (g/dl) Phenylalanin verbraucht. In der gleichen Zeit verbrauchte AJ 3436 3o g Essigsäure und reicherte o,75 g/100 ml Phenylalanin an.

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Die in Beispiel 2 beschriebenen Mikroorganismen werden in gleicher Weise wie in Beispiel 3 gezüchtet. Dabei reichern sich in der Fermentationsbrühe die in Tabelle 7 gezeigten Mengen an Phenylalanin an.

Tabel. Ie 7

	. 224-7	angereichertes	Phenyl-
ot	3695	alanin (g/1oo	ml)
Nr	3696	0,00
AJ	3697	o,23
AJ	3698	1,2ο
AJ	1,4·ο
AJ	2,o1

Brevibacterium lactofermentum AJ 34-36 und AJ 34-37 wurden bei 3o°C während 18 Stunden unter Schütteln in einem wässrigen Kulturmedium gezüchtet, das pro 1oo ml (dl) 3 6 Glucose, o,1 g IiH₂PO₄, o,o4- g MgSO₄·7H₂O, 1 mg FeSO₄^H₂O, 1 mg MnSO₄-4-H₂O, 5 ml Sojaprotein-Säurehydrolysat, 2οΓ Biotin, 3οΓ Thiamin'HGl und o,3 Harnstoff enthielt.

Dann wurde ein wässriges Kulturmedium hergestellt, das pro 1oo ml (dl) 1,5g Äthylalkohol, o,5 g (NH^)₂SO₄, o,1 g o,o4· g MgSO₄^H₂O, 1 mg FeSO^·7H₂O, 2 ml Sojaprotein-Säurehydrolysat, 4-o mg L-Tyrosin, 4-o mg DL-Iviethionin, 2o Γ Biotin, 3o T Thiamin-HCl enthielt, und dessen pH-Y/ert auf 7»2 eingestellt wurde.

3oo ml des wässrigen Kulturmediums wurden in einen 1-Liter-Fermenter gegeben und mit 15 ml der vorstehend angegebenen Kulturbrühe angeimpft und unter Rühren und Belüftung bei 31⁰G gehalten.

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V/ährend der so durchgeführten Fermentation wurde der pH-Wert dos Mediums mit gasförmigem Ammoniak auf 7,0 bis 7»5 eingestellt, und die Konzentration von Äthanol in dem Medium wurde bei o,1 g/dl gehalten, indem von Zeit zu Zeit Äthanol zugeführt wurde.

Nach 4-8-stündiger Züchtung hatte AJ 34-37 1,95 g/dl Phenylalanin in der Fermentationsbrühe angereichert, während AJ 34-36 °>83 g/dl Phenylalanin angereichert' hatte.

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Claims

/"T) Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Phenylalanin durch Züchtung einer' Mutante von Brevibacterium unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Fermentationsmedium bis zur Anreicherung einer wesentlichen Menge von L-Phenylalanin in dem Medium und Gewinnung des angereicherten L-Phenylalanins aus der Fermentationsbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß man eine L-Phenylalanin-bildende Mutante von Brevibacterium verwendet, die resistent gegen die Wachstumshemmung durch Tryptophan-Analoge und/oder Phenylalanin- Analoge ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mutante von Brevibacterium lactofermentum oder Brevibacterium flavum verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mutante von Brevibacterium verwendet, die resistent gegenüber 5-Methyltryptophan ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch g ekennzeichnet, daß man eine Mutante von Brevibacterium verwendet, die resistent gegen p-Fluorphenylalanin ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4-, dadurch gekennzeich.net, daß man eine Mutante verwendet, die außerdem für ihr Wachstum L-Tryptophan benötigt«

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6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutante Brevibacterium lactofermentum FEHM F-1914, Brevibacterium lactof ermentum FERM P-24-76 oder Brevibacterium flavum FEIM P-2475 verwendet.

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