DE2417336C3

DE2417336C3 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin, L-Asparaginsäure, L-AIanin, L-Valin, L-Leucin und L-Arginin

Info

Publication number: DE2417336C3
Application number: DE2417336A
Authority: DE
Inventors: Ryoichi Maebashi Gunma Katsumata; Mamoru Kawasaki Kohata; Kiyoshi Sagamihara Nakayama; Tadaaki Tokio Nomura; Yoshitake Machida Tokio Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1973-04-10
Filing date: 1974-04-09
Publication date: 1979-09-06
Also published as: DE2417336A1; US3907641A; GB1446987A; DE2417337C3; FR2225517B1; DE2417337B2; US3907637A; JPS49125590A; FR2225520B1; CA1023291A; JPS5039153B2; DE2417337A1; FR2225520A1; GB1452688A; CA1023292A; DE2417336B2; FR2225517A1

Description

Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren auf biotechnischem Wege unter Verwendung entweder von Wildstämmen oder Mutanten von Mikroorganismen in einem Kohlenhydrate, Kohlenwasserstoffe und organische Säuren als Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium bekannt. In den letzten Jahren wurde versucht. Alkohole, wie Methanol und Äthanol, zur Fermentation zu verwenden. Besondere Beachtung wurde Methanol geschenkt, da Methanol nicht nur billig zugänglich ist, sondern bei Fermentationsverfahren auch leicht zu handhaben ist. In den US-Patentschriften 37 07 441 und 37 08 395 ist die Verwendung von Alkoholen zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin vorgeschlagen: es sind jedoch weder praktische noch konkrete Verfahrensbeispiele offenbart. In der US-PS 35 95 751 ist die Herstellung von L-Lysin aus Äthanol unter Verwendung eines Stammes der Gattungen Corynebacterium, Brevibactcrium, Arthrobacter, Bacillus und Nocardia beschrieben. In der US-PS 36 63 370 ist ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Glutaminsäure aus Methanol unter Verwendung bestimmter Stämme der Gattungen Methanomonas, Protaminobacter und Microcyclus beschrieben. In der britischen Patentschrift 12 10 770 ist die Züchtung von Hefen in einem Methanol enthaltenden Nährmedium zur Herstellung von Mikrobenzellen sowie bestimmter Aminosäuren beschrieben. Schließlich ist in der japanischen Patentveröffentlichung 25 273/70 beschrieben, daß bei der Züchtung von Stämmen der Gattungen Achromobacter und Pseudomorias unter Verwendung von Methanol als Kohlcnstoffquelle Aminosäuren im Nährmedium angereichert werden. Die bekannten Aminosäurebildner aus Methanol sind jedoch unbefriedigend, da sie entweder eine zu geringe Produktivität aufweisen oder die Zahl der herzustellenden Aminosäuren zu gering ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Aminosäuren der eingangs genannten Art zu schaffen, bei dem diese Aminosäuren in beträchtlichen Mengen in einem Methanol als Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium gebildet werden. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem Befund, daß eine neue Mutante, die sich von Protaminobacter thiaminophagus ATCC 21 371 ableitet, die in der US-PS 36 63 370 beschrieben ist, sich durch eine verbesserte Aminosäiireproduktion aus

zeichnet.

Gegenstand der Erfindung ist der in den Ansprüchen definierte Gegenstand.

Die erfindungsgemäß verwendete Mutante Protaminobacter thiaminophagus K-217 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland V. SL A, unter der Nummer ATCC 21 927 hinterlegt und steht der Öffentlichkeit zur Verfügung. Diese Mutante wurde durch Screening einer Population von Protaminc-bacter thiamonophagus ATCC 21 371 isoliert.

Als Nährmedium kann im erfindungsgemäßen Verfahren jedes synthetische oder natürliche Nährmedium verwendet werden, sofern es Methanol als iCohlenstoffquelle, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen, Vitamine und wachstumsfördernde Nährstoffe in entsprechender Konzentration enthält

Methanol, das als Hauptkohlenstoffquelle verwendet wird, erzeugt bisweilen eine Wachstumshemmung der Mikroorganismen, wenn es in hohen Konzentrationen im Nährrnedium vorliegt. Vorzugsweise wird die Konzentration des Methanols im Medium unter einem Wert von etwa 3 Prozent (Volumen/Volumen) gehalten. Gute Ergebnisse können erhalten werden, wenn ein Nährmedium eingesetzt wird, das zu Beginn eine niedrige Konzentration von beispielsweise 0,5 bis 3 Prozent (Volumen/Volumen) Methanol enthält und die Züchtung unter kontinuierlichem Einspeisen von Methanol in einer Menge von 0,3 bis 0,6 Prozent (Volumen/Volumen), bezogen auf das Volumen des Mediums und pro Stunde oder absatzweise in einer Menge von 0,5 bis 2 Prozent (Volumen/Volumen), bezogen auf das Nährmedium zu jedem Zeitpunkt und in dem Maße eingespeist wird, wie das Methanol vom Mikroorganismus verbraucht wird.

Als Stickstoffquelle können Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat und Ammoniumnitrat, Ammoniak oder Harnstoff verwendet werden. Ferner können Casaminosäure, Penton und Hefeextrakt als Stickstoffquelle verwendet werden. Diese organischen Verbindungen natürlicher Herkunft enthalten Vitamine und andere wachstumsfördernde Stoffe, die deshalb wirkungsvoll die 2'üchtungsdauer vermindern und die Bildung der Aminosäuren fördern, wenn sie in geringen Mengen dem Medium als Sticksioffquelle einverleibt werden. Ferner können anorganische Verbindungen, wie Kaliumphosphate, Magnesiumsulfat, Eisen- und Magnesiumsalze verwendet werden. Der im erfindungsgemSien Verfahren verwendete Stamm Protaminobacter thiaminophagus K-217 (ATCC 21 927) benötigt für sein Wachstum Thiamin. Deshalb müssen dem Nährmedium Thiamin oder Produkte natürlicher Herkunft einverleibt werden, die Thiamin enthalten.

Die Züchtung wird im allgemeinen 2 bis 5 Tage unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von 20 bis 40⁰C durchgeführt. Zur Erzielung hoher Ausbeuten wird der pH-Wert des Nährmediums während der Züchtung bei 4 bis 9, vorzugsweise um den Neutralpunkt gehalten. Der pH-Wert kann durch Zusatz, von Calciumcarbonat, verschiedenen Pufferlösungen oder alkalischen Lösungen eingestellt werden.

Nach beendeter Züchtung werden die Zellen aus der Kulturbrühe abfiltriert, und aus dem Filtrat werden die gebildeten Aminosäuren in an sich bekannter Weise abgetrennt und isoliert, ?.. B. durch Behandlung mit einem lonenaustauscherharz, und beispielsweise durch Umkristallisation gereinigt.

Das Beispiel erläutert die Erfindune.

Beispiel

Protaminobacter thiaminophagus K-217 (FERM-P Nr. 2021: ATCC 21 927) wird in 10 ml eines Vorkulturmediums der nachstehend aufgeführten Zusammensetzung in einem Reagensglas überimpft und 20 Stunden unter Schütteln bei 30°C gezüchtet:

Methanol	2OmI
(NH₄J₂SO₄	6g
KH₂PO₄	2g
K₂HPO₄	7g
MgSO₄ · 7 H₂O	0,5 g
FeSO₄ · 7 H₂O	10 mg
MnSO₄ ■ 4 H₂O	8 mg
Thiamin-hydrochlorid	era
Biotin	10 μ_Β
Hefeextrakt	0,1g
Phenolrot (pK-indikator)	10 mg
Wasser auf	1 Liter
(pH-Wert 7,2)

III

Die erhaltene Vorkultur wird in einer Menge von jeweils 1 ml in 10 ml eines Nährmediums der gleichen Zusammensetzung in Reagensgläschen überimpl't. Die Züchtung wird 96 Stunden unter Schütteln bei 30⁰C durchgeführt. Nach 24, 48 und 72 Stunden werden jeweils 2 Prozent Methanol zugesetzt. Die Gesamtmenge an Methanol beträgt 6 Prozent. Der pH-Wert der Kulturflüssigkeit wi-d mit I4prozeniiger wäßriger Ammoniaklösung auf einen Wert um den Neutralpunkt eingestellt. Nach beendeter Züchtung haben sich in der Kulturbrühe 0,2 mg/ml L-Asparnginsaure, 0,8 mg/ml L-Alanin, 1,0 mg/ml L-Valin, I,2mg^ml L-Lcucin, 0,7 mg/ml L-Arginin und 0,3 mg/ml L-Lysim (als L-Lysin-hydrochlorid) angesammelt. Nach dem Abtrennen der Mikrobenzellen durch Filtrieren werden die Aminosäuren in an sich bekannter Weise durch lonenaustauschbehand'ung isoliert Aus 1 Liter der Kulturbrühe werden 0,14 g L-Asparaginsäure, 0,48 g L-Alanin, 0,6 g L-Valin, 0,72 g L-Leucin, 0,49 g L-Arginin und 0,21 g L-Lysin erhalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist gegenüber den bekannten Verfahren in mindestens einem der folgenden Punkte überlegen:

1. Größere Produktivität

2. Größere Zahl an gebildeten, verschiedenen Aminosäuren

3. Verwertung des billigen und leicht zu handhabenden Methanols.

Die US-PS 37 07 441 und 37 08 395 betreffen die Herstellung von L-Lysin aus Alkoholen. Jedoch sind die in diesen Verfahren verwendeten Bakterienstämme nicht zu einer Verwertung von Methanol in der Lage, wie aus den nachstehenden Untersuchungsergebnissen hervorgeht.

Die US-PS 35 95 751 betrifft die Bildung von L-Lysin aus Äthanol. Im Gegensatz dazu wird beim anmeldungsgemäßen Verfahren Methanol eingesetzt.

Die US-PS 36 63 370 betrifft die Bi'dung von L-GIutaminsäure aus Methanol. Demgegenüber wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine große Anzahl von Aminosäuren mit Ausnahme von L-Glutaminsäure gebildet.

DieGB-PS 12 10 770 und die japanische Patentveröffentlichung 45/25 273 betreffen die Herstellung von verschiedenen Aminosäuren unter Verwendung von Methanol. Die Ausbeuten an den verschiedenen Aminosäuren unter Verwendung der in diesen Druckschriften angegebenen Stämme sind in folgender Tabelle aufgeführt.

Druckschrül

CiB-I¹S 12 10 770 1

japanische PatentvcrölTent- I
lichung 45/25273 I

Stamm

Pichiii pastoris CBS 7(M

llansenula wickerruimii NRRL YB-4943

l'ichiii haplophyla CBS 2O2S

Achmmobacler mcl.hannlophilii Ii 'I)H
Achromobacter mcl.hanolophila H 91-1
Achromobaclcr mclhanolophila I' 48-3
Achromobacter mclhanolophila Ii 19-2
Achromobactcr mcthanolophila I' 73-1
Pseuilomonas insueta G8-3-2-Pseuilomonas insueta G4-I-2
Pseuilomonas insueta 1-27—3
Achromohiiclcr methunolophila l·' 73-1
Pseuilomonas insucla G8-3-2

Pseuilomonas insueta I·' 27-3
Pscudomonas insueta G 4-1-2
Achromobacter melhanolophila l·' 54-2
Achromobacter melhiinolophila Ii 95-1
Achromobacter methanolophila Ii 91-1

Gebildete Amino-	:n
s;im ι
)Yml	K)(X), Lys 500
CiA	15(X). Thr 5(X)
CiA	3(K)
AIa	800. Viii 5(K)
CiA	310
GA	350
CiA	100
CiA	3(X)
CiA	300
CiA	146
CiA	280
CiA	230
CiA	17
PIlC	466. CiIv 23
CiA	13
Arg	335. I¹Iu- 31
CiA	11.6
l.ys	100
GA	60S
CiA	565
CiA

Fortsetzung

Druckschrift

Versuch

Stamm Gebildete Aminosäuren

y/m\

japanische PatentveröiTentlichung 45/25273

3 3 3 3 3 4

5 5 5

Anmerkung: GA: Glutaminsäure

Lys: Lysin

Thr: Threonin

AIa: Alanin

VaI: Valin

Phe: Phenylalanin

Asp: Asparaginsäure

Achromobacter methanolophila F 36-1 Achromobacter methanolophila E 19-2 Achromobacter methanolophila F 73-1 Pseudomonas insueta F 27-3
Pseudomonas insueta G 8-3-2
Pseudomonas insueta F 27-3

Achromobacter methanolophil;i E 19-2 Achromobacter methanolophüa F 73-1

Achromobacter methanolophila F 54-2 Achromobacter methanolophila F 48-3 Pseudomonas insucia F 27-3

GIy: Glycin

Arg: Arginin

lic- Isoleucin

Leu: Leucin

Pro: Prolin

Tyr: Tyrosiii

Ser: Serin

GA

AIa 117, He 45,

Leu 125, Thr 11,

Pro 17, Tyr

VaI 314, Pro 23,

Tyr

I Im 82, Leu 171,

AIa Ser VaI

In Tabelle I sind die Ausbeuten nach Beispiel 1 des erfindungsgemäßen Verfahrens den gemäß den Verfahren der vorgenannten Druckschriften erhaltenen Ausbeuten gegenübergestellt.

Tabelle I	Ausbeuten	(y/m\)
	Beispiel I	bekannte Verfahren
Aminosäuren	200	_
L-Asparaginsäurc	800	117, 187, 3(X)
L-Alanin	1000	136,314, 5(X)
L-VaMn	12(X)	125. 171
L-Lcucin	7(X)	13
L-Arginin	300	11,6 500
L-Lysin

Aus Tabelle I ergibt sich, daß man beim erfindungsgemäßen Verfahren höhere Ausbeuten an L-Asparaginsäure, L-Alanin, L-Valin, L-Leucin und L-Arginin als bei den Verfahren der vorgenannten Druckschriften erhält.

Verwendete Stämme Ferner wurden folgende aus den US-PS 37 07 441 und 08 395 bekannten Stämme in bezug auf ihre Aminosäurebildung in einem Methanol enthaltenden Nährmedium untersucht:

Brevibacterium flavum ATCC 2147? Corynebactcrium acctoglutamicum ATCC 21491 Microbacterium ammoniaphilum ATCC 21490 Micrococcus glutumicus ATCC 21492

Hrcvibactcrium flavum LT-I ATCC 21528 Brevibacterium flavum T-301 ATCC 21529 Coryncbactcrium glulamicum BL-25 ATCC 21526 Corynebacterium glutamicum T-135 ATCC 21527 Coryncbacterium glutamicum RL-9 ATCC 21543 Coryncbactcrium glutamicum l.Y-32-6 ATCC 21544 US-PS 3707441

US-PS 37 08

Diese Stämme wurden in 10 ml des Anzuchtmediums gemäß Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung Stunden bei 30°C ohne Schütteln gezüchtet. Es wurde festgestellt, daß sirh in der Gärflüssigkeit keine Aminosäuren anreicherten. Dies bedeutet, daß die vorgenannten Stämme nicht zu einer Verwertung von Methanol in der Lage sind.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von

L-Lysin, L-Asparaginsäure, L-Alanin, L-Valin, ■; L-Leucin und L-Arginin, dadurch gekennzeichnet, daß man Protaminobacter thiaminophagus K-217 (ATCC 21 927) in einem Methanol als Kohlenstoffquelle, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen, Vitamine und wachstumsfördernde Nährstoffe in entsprechender Konzentration enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei Temperaturen π von 20 bis 40⁰C durchführt.