DE2819148A1 - Verfahren zur herstellung von 4-formyl- 2-amino-buttersaeure - Google Patents

Verfahren zur herstellung von 4-formyl- 2-amino-buttersaeure

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DE2819148A1 DE19782819148 DE2819148A DE2819148A1 DE 2819148 A1 DE2819148 A1 DE 2819148A1 DE 19782819148 DE19782819148 DE 19782819148 DE 2819148 A DE2819148 A DE 2819148A DE 2819148 A1 DE2819148 A1 DE 2819148A1
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Shigeru Nakamori
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Description

2819U8
DA-13 130
BESCHREIBUNG
Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 4-Formyl--2-amino-buttersäure (die nachstehend auch als I1ABS bezeichnet wird) durch !Fermentation.
PABS kann als Ausgangsmaterial für die Herstellung von . Tryptophan (entsprechend der veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Fr. 14661/1973) verwendet werden.
Als fermentative Methoden zur Herstellung von 4-Pormyl-2-amino-Buttersäure waren Verfahren "bekannt, wonach eine L-Prolin benötigende Mutante von Escherichia coli (Biochim. Biophys. Acta., 104, S. 397 (1965) oder Salmonella typhimurium (J. Bacteriol., 118, S. 928 (1974) PABS in dem Kulturmedium bilden, die in diesen Kulturmedien angereicherten Mengen an PABS sind jedoch nicht ausreichend hoch.
Es ist daher erforderlich, eine wirksamere und wirtschaftlichere Methode zur Herstellung von 4-Pormyl-2-amino-buttersäure aufzufinden und zur Verfügung zu stellen.
Erfindungsgemäß wurden nun ausgezeichnete 4-Pormyl-2-aminobuttersäure bildende Mutanten aus den zugrundeliegenden Elternstämmen des Genus Brevibaeterium und Corynebacterium erzeugt und es wurde ein Verfahren zur Herstellung von PABS zur Verfügung gestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine zur Bildung von PABS befähigte Mutante des Genus Brevibaeterium oder Corynebacterium in einem Kulturmedium gezüchtet wird, bis eine wesentliche Menge an PABS in dem
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Kulturmedium angereichert ist, und die gebildete FABS aus dem Kulturmedium gewonnen wird.
!lach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird nur das L-Isomere von 4-Formyl-2-amino-buttersäure gebildet und es ist daher äußerst günstig, diese L-FABS als Ausgangsmaterial für die Herstellung von L-Tryptophan einzusetzen.
Die bei dem erfindungsge^^en Verfahren verwendeten Mieroorganismen sind Mutanten von Elternstämmen des Genus Brevibacterium oder Corynebacterium. Am stärksten bevorzugt werden Mutanten, die für ihr Wachstum L-Prolin benötigen. Geeignet sind außerdem Mutanten, die durch die Mutation verursachte zusätzliche charakteristische Eigenschaften haben, wie Ir-Qrnithin-Bedarf und Resistenz gegen Antagonisten von L-Prolin, wie 3,4-Dehydroprolin oder Antagonisten von L-Arginin, wie Arginin-hydroxamat.
Zu repräsentativen Beispielen für Mutanten, die zur Bildung von FABS befähigt sind, gehören folgende Stämme:
Brevibacterium flavum AJ 11139 (FERM-P 4032), HRRL B-Il.292 Brevibacterium lactofermentum AJ 11243, NRRL B-Il.293 Corynebacterium glutamicum AJ 11244, KRRL B-Il.294 Brevibacterium flavum AJ 11245, BRRL B-Il.295
Die ersten drei erwähnten Stämme sind Mutanten, die L-Prolin für ihr Wachstum benötigen und der letzte Stamm ist eine Mutante, die zum Wachstum L-Prolin und L-Isoleucin benötigt und resistent gegenüber 500-"/ml Sulfaguanidin und 3.000y-/ml DL-3,4-Dehydroprolin ist.
Die Elternstämme der erfindungsgemäßen Mutanten gehören dem Genus Corynebacterium oder Brevibacterium an und die am stärksten bevorzugten Elternstämme sind L-Glutaminsäure bildende Bakterien der angegebenen beiden Genera, wie Brevibacterium divaricatum ATCC 14020, Brevibacterium flavum AICC 14067,
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869,
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Brevibacterium roseum ATCC 13825,
Brevibacterium saccharolytieum ATCC I4O66, Corynebacterium acetoacidophiltun ATCC 13870, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium glutamicuia und Corynebacterium lilitun ATCC 15990.
Übliche Methoden für die Mutation, wie das Behandeln der Zellen der Elternstämme mit N-Methyl-IT'-nitro-lT-nitrosoguanidin, können angewendet werden, um die erfindungsgemäßen Mutantenstämme aus den vorstehend genannten Elternstämmen zu erzeugen.
Die Kulturmedien, in denen die erfindungsgemäßen Mutanten vermehrt werden, sind an sieh üblich und enthalten Kohlenstoffquellen, Stickstoff-Quellen, anorganische Ionen und erforderlichenfalls organische Spurennährstoffe, wie Vitamine oder Aminosäuren. Wenn L-Prolin "benötigende Mutanten gezüchtet werden, so werden L-Prolin oder zur Substitution von !-Prolin geeignete Verbindungen dem Kulturmedium zugesetzt. Vorzugsweise enthalten die Kulturmedien zusätzlich Reduktionsmittel, wie NaHSO3.
Bevorzugte Kohlenstoff-Quellen sind beispielsweise Kohlenhydrate, wie Glucose, !Fructose und Saccharose, Alkohole, wie Äthanol, Glycerin und Sorbit, sowie organische Säuren, wie Essigsäure und höhere Fettsäuren.
Zu geeigneten Stickstoff-Quellen gehören beispielsweise wäßriges Ammoniak, gasförmiges Ammoniak, Ammoniumsalze und Harnstoff.
Als anorganische Ionen können Magnesiumionen, Calciumionen, Eisen-Ii-Ionen, Manganionen, Kalitunionen, Phosphationen und andere dem Kulturmedium zugefügt werden, wenn dies bevorzugt
Wenn dem Kulturmedium L-Glutaminsäure zugesetzt wird, so wird manchmal die Ausbeute an I1ABS erhöht.
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Die Züclitung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, wobei der pH-Wert des Kulturmediums auf pH 4 - 10 eingestellt wird und die Temperatur des Mediums bei 20 - 400C gehalten wird.
!lach 20 - 100 Stunden dauernder Züchtung ist 4-I1OrEIy 1-2-aminobuttersäure in dem Kulturmedium angereichert. Die in der resultierenden Kulturflüssigkeit angereicherte 51ABS kann in üblicher Weise gewonnen werden, wie durch Adsorption an einem Kationen-Austauscher-Harz und Elution mit 0,1 nHCl.
Beis-pjel 1
Ein wäßriges Kulturmedium wurde hergestellt, das pro Deziliter 10 g Glucose, 6,0 g (HH4J2SO4, 0,1 g KH2PO4, 0,8 g JIgSO4.7HgO, 1,0 mg PeSO4.7H2O, 1,0 mg MnSO4.4H2O, 45 pg Biotin, 100 jug Thiamin.HCl, 1,0 ml Sojabohnenprotein-Hydrolysat, 25 mg L-Prolin und 5 g OaCO5 enthielt. Das Medium wurde mit KOH auf pH 7,0 eingestellt, 20 ml -Anteile des wäßrigen Kulturmediums wurden in 500 ml - Schüttelkolben gegeben und zur Sterilisation erhitzt.
Jede der in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführten Mutanten wurde in das Medium eingeimpft und die Züchtung erfolgte unter Schütteln bei 300C während 48 Stunden. In den gebildeten Kulturflüssiglceiten wurden die in Tabelle 1 gezeigten Mengen an I1ABS aufgefunden.
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Tabelle 1
verwendete Mutanten angereicherte PABS (mg/ml)
AJ 11139 2,60
AJ 11243 1,35
AJ 11244 1,28
Beispiel 2
Es wurde das in Beispiel 1 gezeigte wäßrige Kulturmedium, dem jedoch außerdem 15 mg/dl L-Isoleucin zugesetzt wurden und in welchem die 10 g/dl Glucose durch 10 g/dl Saccharose ersetzt wurden, verwendet. Brevibacterium flavum AJ 11245 wurde in diesem wäßrigen Kulturmedium in gleicher Weise wie in Beispiel 1 gezüchtet.
Nach 24 Stunden von Beginn der Züchtung wurde NaHSO- in einer Menge von 1 g/dl dem Kulturmedium zugesetzt und die Züchtung wurde dann weitere 24 Stunden fortgesetzt. In der erhaltenen Kulturflüssigkeit war PABS in einer Menge von 15,0 mg/ml angereichert.
Ein Liter der Kulturflüssigkeit von AJ 11245 wurde in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellt und die Zellen wurden durch Zentrifugieren aus der Kulturflüssigkeit entfernt. Die so erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde auf pH 2,0 angesäuert, auf 300 ml eingedampft und durch eine mit "Dowex"-50X4 in der H+-Porm gefüllte Säule geleitet.
Die Säule wurde mit Wasser und dann mit 0,01 nHCl gewaschen und die an dem Harz adsorbierte PABS wurde mit 0,5 nHCl eluiert. Das Eluat wurde getrocknet, wohei 10,3 g pulverförmige 4-Pormyl-2-amino-buttersäure erhalten wurde.
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Claims (4)

SCHIFF ν. FUN ER STREHL SCHÜBEL-HOPF EBB1NGHAUS MARIAHILFPLATZ 2 & 3, MÖNCHEN 9O POSTADRESSE: POSTFACH 95 O1 60, D-8O0O MÜNCHEN 95 KARL LUDWIG SCHIFF QIPL. CHEM. DR. ALEXANDER V. FÜNER DIPL. ING. PETER STREHL DIPL. CHEM. DR. URSULA SCHÜBEL-HOPF DIPL. ΙΝβ. DIETER EBBINGHAUS TELEFON (O89) 48 SO 64 TELEX 5-23 665 AURO D TELEGRAMME AUROMARCPAT MÜNCHEN AJINOMOTO CO., INC. 2. Mai 1978 DA-13 130 Verfahren zur Herstellung von 4-ilormyl-2-amino-buttersäure PATENTANSPRÜCHE
1. !"Verfahren zur fermentativen Herstellung von 4-I1OrHIy 1-2-
amino-buttersäure, dadurch gekennzeichnet , daß man eine zur Bildung von 4-]?ormyl-2-amino-buttersäure befähigte Mutante des Genus Brevibacterium oder Corynebacterium in einem Kulturmedium züchtet, "bis eine wesentliche Menge an 4-]?ormyl-2-amino-buttersäure angereichert ist, und die angereicherte 4-S1ormyl-2-amino-buttersäure aus dem Kulturmedium gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet', daß man eine Mutante der Spezies
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Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactoferinentum oder Corynebacteriuin glutamicum zueiltet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutante Brevibacterium flavum HRRL B-Il.292, Brevibacterium lactofermentum NRRL B-Il.293, Brevibacterium flavum ijERL B-Il.295 oder Corynebacterium glutamicum NRRL B-Il.294 einsetzt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Kulturmedium ein Reduktionsmittel zusetzt.
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DE19782819148 1977-05-02 1978-05-02 Verfahren zur herstellung von 4-formyl- 2-amino-buttersaeure Withdrawn DE2819148A1 (de)

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