JPH06504619A - 細胞接着蛋白質−糖質相互作用の阻害 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

１９、　α１酸糖蛋白質のＮ−結合グリカン付加部位部位を一つまたはそれ以上 有することを特徴とする請求項１１に記載の無細胞有機分子。 ２０、前記蛋白質が抗体であることを特徴とする請求項１７に記載の無細胞有機 分子。 ２１、前記抗体がＩｇＧ１であることを特徴とする請求項２０に記載の無細胞有 機分子。 ２２、前記糖質決定基の存在が前記抗体の補体固定及びＦｃ受容体への結合能を 阻害する請求項２０に記載の無細胞有機分子。 ２３、前記有機分子が複数の前記糖質決定基を有することを特徴とする請求項１ １に記載の無細胞有機分子。 ２４、請求項１１に記載の分子を有する製薬的化合物。 ２５、細胞接着蛋白質に特異的な糖質決定基の結合部位を有する抗体をコードす る精製核酸。 ２６、請求項２５に記載の核酸を有するベクター。 ２７、請求項２６に記載のベクターを有する組み換え細胞。 ２８、担体分子と、細胞接着蛋白質を糖質決定基に結合することができる酵素と の接触を含む、前記蛋白質に特異的な前記糖質が共有結合している担体分子を作 成する方法。 ２９、前記接触が生きている細胞内で起こることを特徴とする請求項２８に記載 の方法。 ３０、前記細胞が真核生物細胞であることを特徴とする請求項２９に記載の方法 。 ３１、前記細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする請求項３０に記載の方法 。 ３２、前記細胞が前記酵素をコードする組み換え細胞であることを特徴とする請 求項２９に記載の方法。 ３３、前記酵素がα（Ｌ　３）フコシルトランスフェラーゼであることを特徴と する請求項３２に記載の方法。 明細書 細胞接着蛋白質−糖質相互作用の阻害 発明の背景 本発明は、細胞接着蛋白質とその糖質リガンドの間の相互作用に対する治療的阻 害に関する。 ＥＬＡＭ−１は、必須の膜接着蛋白質である。この蛋白質は、Ｎ−末端レクチン 関連部分を含む細胞外領域、表皮増殖因子関連繰り返し配列、及び複数の補体制 御蛋白質モチーフを有する（Ｂｅｖｌｌａｃｑｕａ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃ／＃ ｃｅ２４３：１１Ｂ０．１９８９；　５ｔｏｏｌｌａｒｌ　ｅｔ　ａｔ、、　ｅ ｅ１１５８：９０７．１９８９）。ＥＬＡＭ−１は、サイトカイン［Ｌ−１及び 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）　（Ｂｅｖｌｌａｃｑｕａ　ａｔ　ａｔ、、　／’ｒｏ ｔ、　ｉｌ’ｉｌ／、　１ｃｉｄ、　Ｓｃ１．　／、９に発現される。この蛋白 質は、サイトカインにより活性化された内皮細胞への、骨髄球様細胞（例えば、 好中性顆粒球）の接着を媒介する（Ｂｅｖｊｌａｃｑｕａ　ｅｔ　ａｌ、。 ｔｒｏｔ、　／Ｖｊｔ／、　ｋｉｔｌ、　Ｓｒ１．　／、５’／＋＋４：９２３ Ｂ、　１９＋１７）。ＥＬＡＭ−１は、血液と血管壁の接点における炎症及び免 疫現象の制御に関与することが提唱されてきた（　Ｂｅｖ　１ｌａｃｑｕａ　ｅ ｔ　ａｌ、、　、５’ｒ／＃ｃθ２４３＋１１６０．１９８９）。 発明の要旨 一般に、本発明は、細胞接着蛋白質を有する細胞の、当該細胞接着分子に特異的 な糖質決定基を有する分子または細胞への結合を阻害する方法に関する。この方 法には、細胞接着蛋白質を有する細胞に、糖質決定基を有するインヒビタ分子を 接触させる方法が含まれる。 合及び〇−結合のいずれでもよい；インヒビタ分子は複数の５ｌａｌｙｌ　−Ｌ ｅｘ決定基を有する；インヒビタ分子は蛋白質（好ましくはα１酸糖蛋白質）ま たは抗体（好ましくはＩｇＧ１）である；インヒビタ分子は、α１酸糖蛋白質の Ｎ−結合グリカン付加部位を一つまたはそれ以上有する；インヒビタ分子は可溶 性である。 関連する態様において本発明は、５ｊａｌｙｌ　−Ｌ、ｅｘ決定基を有する有機 分子を治療上有効な量患者に投与することを含むヒト患者の炎症の軽減に関する 。 好適な実施例において、有機分子は複数の５ｌａｌｙｌ−Ｌｅｘ決定基を有する ；　５ｅａｌｙｌ−Ｌｅｘ決定基はＮ−結合または〇−結合のいずれかである； 有機分子は蛋白質（好ましくはα１酸糖蛋白質）または抗体（好ましくはｆｇＧ ｌ）である；有機分子は可溶性である。 他の関連する態様において本発明は、ＥＬＡＭ−１を有する細胞と第二の細胞ま たは蛋白質との間の相互作用を阻害するインヒビタ分子を同定する方法に関する 。この方法には、ＥＬＡＭ−１を有する細胞を候補インヒビタ分子及び第二の細 胞または蛋白質に接触させて当該ＥＬＡＭ−１を有する細胞と第二の細胞または 蛋白質とのアフィニティ複合体を形成させ、このアフィニティ複合体の形成を減 少させる分子がインヒビタ分子であると同定する方法が含まれる。第二の細胞ま たは蛋白質は、５ｉａｌｙｌ−ＬｅＸ決定基を有することが望ましい。 さらに他の関連する態様において本発明は、特異的結合対の第一メンバーが特異 的結合対の第二メンバーに結合するのを阻害する方法に関し、これには、抗体の 補体への固定能及びＦ　受容体への結合能を阻害する糖質部分と共有結合してい る前記第一のメンバーに特異的な抗体に、当該第一メンバーを接触させる方法が 含まれる。 足回である；　５ｉａｌｙｌ　−Ｌｅｘ決定基はＮ−結合または〇−結合のいず れがである；抗体は、α１酸糖蛋白質のＮ−結合グリカン付加部位を一つまたは それ以上有する。 他の態様において本発明は、細胞接着蛋白質に特異的な糖質決定基が共有結合し ている無細胞存機分子に関する。 はＮ−結合または〇−結合のいずれかである；有機分子は蛋白質（好ましくはα １酸糖蛋白質）または抗体（好ましくはＩｇＧ１）である；インヒビタ分子は、 糖蛋白質のＮ−結合グリカン付加部位を一つまたはそれ以上有する；有機分子は 複数の糖質決定基を有する。 更に本発明は、細胞接着蛋白質に特異的な糖質決定基の結合部位を有する抗体を コードする精製核酸；このような核酸を含むベクター；及びこのようなベクター を含む組み換え細胞に関する。 最後に本発明は、細胞接着蛋白質に特異的な糖質が共有結合している担体分子を 作製する方法に関し、この方法には、糖質決定基を蛋白質に結合させる能力を有 する酵素を担体分子に接触させる方法が含まれる。 好適な実施例においては、生きている細胞中で接触を行なう；細胞は真核細胞で あり、哺乳類細胞であることが望ましい：細胞は、酵素をコードするＤＮＡを含 有する組み換え細胞である；酵素は、α（１，３）フコシルトランスフェラーゼ （ｆｕｃｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）である。 ゛細胞接着蛋白質°とは、細胞表面上に／／７　ｙ／ｙｏ状態のある時点で現れ 、第二の細胞表面の蛋白質（例えば、糖質リガンドを有する蛋白質）との特異的 な相互作用を媒介する蛋白質を意味する。゛糖質決定基°とは、細胞表面に存在 しくｌｊｙ／ｙｏ状態のある時点で）、ある特異的な様式で蛋白質（例えば細胞 接着蛋白質（例えば第二の細胞表面に存在する）と相互作用する一つまたはそれ 以上の糖質基ををする部分を意味する。”セレクチン゛とは、レクチン様領域、 上皮細胞増殖因子様領域、システィンを多く含む一連の繰り返し配列、あるいは 、膜内外領域及び短い細胞質テイルを有するという構造的特徴がある細胞性の接 着分子族のメンバーを意味する。″炎症°とは、損傷、または物理的、化学的若 しくは生物学的媒体による異常な刺激に応答して、患部血管及び隣接する組織内 において起こる細胞学的及び組織学的反応からなる病理学的過程を意味する。″ 特異的結合対゛とは、第−及び第二のメンバーを含む、互いに特異的な親和性を 有するいかなる分子対をも意味する。特異的結合対の例には受容体とリガンド（ 例えば、細胞Ｒ’ｌｔｍ白質とこれらの糖質リガンド）が含まれる。°精製核酸 °とは、天然では結合している他の配列から分離された核酸を意味する。“Ｎ− 結合２とは、蛋白質のアスパラギン残基のアミド窒素に結合していることを意味 する。“〇−結合“とは、蛋白質のセリン、スレオニンまたはヒドロキシリジン 残基の水酸基酸素に結合していることを意味する。 実施例 ４、

【図面の簡単な説明】

界面 図１は、ＩｇＧ１の配列、及びＮ−結合グルカン付加部位を作製するために設計 した変異を示している。 図２は、α−ＥＬＡＭ−１抗体の、一連のＥＬＡＭ−１サブフラグメント及びＥ ＬＡＭ−１融合蛋白質との結合能を示したグラフである：図３は、ＥＬＡＭ−１ −ＩｇＧ１融合蛋白質の領域構造を示している；図４は、一連の哺乳類細胞系の 、ＥＬＡＭ−１−ＩｇＧ１融合蛋白質への結合度を示したグラフである； 図５は、一連の哺乳類細胞系の、細胞表面分子、ＣＤ１５、ＣＤ６３、または５ ｌａｌｙｌ−Ｌｅｘに対する抗体への結合度を示したグラフである；図６は、ノ イラミニダーゼ処理された骨髄球ａｍ胞の、ＥＬＡＭ−１またはα−ＣＤ１５抗 体への結合を示したグラフである；図７は、ａ　−５ｆａｌｙｌ−Ｌｅｘ抗体に よる、ＥＬＡＭ−１を有する細胞の接着の阻害を示したグラフである； 図８は、骨髄球様細胞のＥＬＡＭ−１への結合に対する、羊水由来の５（ａｌｙ ｌ−ＬｅＸ決定基の影響を示したグラフである；図９は、／／７　ｙ／ｌμでフ コシル化されたαｌ酸糖蛋白質のＥＬＡＭ−１への結合能を示したグラフである ； 図１０は、５ｌａｌｙＩ−Ｌｅｘの細胞表面における発現に対する！Ｌ−１及び ［Ｌ−８の影響を示したグラフである； 図１１は、骨髄球様細胞のＥＬＡＭ−１への接着に対するＩＬ−１及びＩＬ−８ の影響を示したグラフである。 複数の５ｌａｌｙｌ−ＬａＸ決定基を有する抗体実施例の一つにおいて、本発明 は、イムノグロブリン分子のＣＨ２部分をマスクしこれにより補体固定及びＦ　 受容体の結合を阻害する一つまたはそれ以上の糖質側鎖を有する抗体に関する。 このような抗体は、細胞または蛋白質の間の望ましくない相互作用を阻止し、ま たは、一般にいかなる２つの分子（そのうち一つは、抗体により特異的に認識さ れる決定基を有する）の間の相互作用をも阻止するのに有用である。糖質部分が 補体固定とＦ　受容体の結合を引き起こすイムノブロブリン領域をブロックする ため、このような抗体は、抗体を用いる治療法に多く見られる望ましくない副作 用（すなわち、補体固定とＦ　受容体の結合に起因する副作用）を起こさない。 糖質基は、望ましくない補体固定とＦ　受容体の結合を阻害するだけではなく、 糖質リガンド−細胞接着蛋白質の相互作用を拮抗的に阻害する機能を有すること が望ましい。糖質基がこの機能を有する場合、抗体は一般にその特異性に起因す る機能を発揮することはなく、単に糖質基の担体として働く。 糖質側鎖が５ｌａｌｙｌ−ＬａＸ決定基を含む一連の分子については、以下に記 載する。 ５（ａｌｙｌ−ＬａＸ決定基は、通常、これを存する細胞（例えば、好中球）と ＥＬＡＭ−１蛋白質を有する細胞（例えば、内皮細胞、例えば血管壁内部を覆っ ているもの）の間の相互作用を促進するよう作用する。この相互作用を分断する ことにより、治療を行うことができる。例えば、組織損傷に引き続いて起きる炎 症（例えば、心筋梗塞、または、乾１またはリュウマチ様関節炎の特徴的症状） を最低限に抑える場合などに使用できる。 ＩｇＧ１分子は、発生期には５ｌａｌｙｌ　−Ｌｅｘ側鎖を有していない。Ｎ− 結合グリカン付加部位が、ＮＸＳ／Ｔ　（Ｎはアスパラギン、Ｓはセリン、Ｔは スレオニン、Ｘはプロリン以外のアミノ酸のいずれか）であることがよく知られ ているため、このような５ｌａｌｙｌ−Ｌｅｘ側鎖結合部位をいくつか有する分 子を設計した。ＩｇＧ１配列（図１）を解析することにより、最低５か所のＮ− 結合グリカン付加部位を分子中の効果的な位置に導入することが可能であり、こ れにより補体固定及びＦ　受容体の結合が阻害されることが判明した。これらの 部位（すなわち、アミ）酸残基２７４．２８７．２９５．３２２、及び３３５が ら始まる部位）は、ｈ−結合グリカンの付加に好適な部位であるが、これらの部 位だけが候補になり得るわけではない；以下の基準を参考にして、他の有用な部 位を同定しＩｇＧ１配列に取り込ませることができる：　（１）イムノグロブリ ン分子のＣＨ２領域（ずなわち補体固定及びＦ。受容体の結合に関与する分子部 分）に位置する部位であることが好ましい；　（２）疎水的特性から、イムノグ ロブリン分子の外側に存在すると推定され、これにより糖質側鎖の結合に関与す る酵素に接近できる配列領域に位置する部位であること；　（３）アミノ酸−欠 配列の変更が最低限に抑えられ、これによりアミノ酸の推定二次構造の変更も最 低限である領域に位置する部位であること。例えば、Ｎ−結合グリカン付加部位 とアミノ酸が一つだけ異なる天然の部位は、アミノ酸配列に二か所の変更が必要 である部位よりも好ましい。 さらに、荷電または極性が類似するアミノ酸で置換することにより、Ｎ−結合グ リカン付加部位を作製することが好ましい（例えば、荷電していないアミノ酸同 士を置換する）。組み換えにより、一つまたはそれ以上のＮ−結合グリカン付加 部位を、ＩｇＧ１をコードする配列に導入することができる；このような配列（ すなわち、５ｉａｌｙ１−ＬｅＸ部分が結合する抗体分子をコードする配列）は 、ＩｇＧ　１−５ｌａｌｙｌ−ＬｅｘまたはＩｇＧ１−Ｌｅｘと呼ばれる。 ５ｉａｌｙｌ−Ｌｅｘを有する特定のＩｇＧ１分子は以下の通り作製した。Ｉｇ Ｇ１遺伝子は公に入手可能であり、その配列を図１（配列番号＝１）に示す。標 準的なｌｊｙ／ｌｒｏ部位突然変異導入法により遺伝子を変異させ、一つまたは それ以上のＮ−結合グリカン付加部位を導入する（例えば、上記に記載し、図１ の天然配列の上部に示した；配列番号：２）。次いで、真核生物細胞中で蛋白質 を発現するよう設計したベクター（例えば、Ｇ１１ｌｌｅｓ　ｅｔ　ａｔ、、米 国特許第４，６６３．２８１号（本発明の参考文献として取り入れられている） を参照）に遺伝子を挿入する。真核生物宿主細胞は哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ または１ｅｃｌｌ細胞）であることが好ましく、ＩｇＧ１−ＬｅＸをコードする 変異させた配列を有する発現ベクターを、標準的な手法を用いて、一過性または 安定なトランスフェクションにより宿主細胞に導入する。α（１，３）フコシル トランスフェラーゼ（抗体分子の糖鎖形成部位に、５ｌａｌｙｌ−ＬｅＸ基を結 合させることができる）を発現するベクターも同様に、このような宿主細胞に（ 一過性または安定に）トランスフェクトする。α（Ｌ　３）フコシルトランスフ ェラーゼ遺伝子は、ＩｇＧ１−Ｌｅｘをコードするベクターとは異なるベクター により発現してもよく、または、共通のベクターに両遺伝子を導入し、発現させ ることもできる。哺乳類細胞は、５ｌａｌｙｌ−ＬｅＸ生産に必要なすべての前 駆体を提供するため、ＩｇＧ１−Ｌｅｘの合成に特に有用である。 α（１，３）フコシルトランスフェラーゼのｃＤＮＡは、Ｌｏｖｅ　ｅｔ　ａｌ 　、（１’ｅ／／且４７５．１９９０　）　Ｃ：Ｓｅ載されている。このｃＤＮ Ａにコードされるａ　（Ｌ　３）フコシルトランスフェラーゼ酵素はシアリル化 された前駆体分子を認識し、Ｎ−アセチルグルコサミン側鎖にα（Ｌ　３）また はα（１，４）結合フコース部分を付加する・５ｉａｌｙｌ−ＬａＸ決定基はα （１，３）結合により特徴付けられており、このため、Ｌｏｖｅ　（ｓｕｐｒａ 　）のα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ酵素は、５ｉａｌｙｌ−Ｌｅｘ が付加された目的の分子と、α（１，４）結合フコースを存する生産物の両方を 生成する。このａ（１，４）結合フコースを有する生産物はＥＬＡＭ−１への結 合活性を持たないが、５ｌａｌｙｌ−Ｌｅｘが付加された分子の作用を阻害する ことはなく、また、他の望ましくない副作用を起こすこともない。しがし、α（ １，３）フコース結合のみを触媒するα（Ｌ　３）フコシルトランスフェラーゼ を使用すれば、より効果的にＩ　ｇ　Ｇ　１−５ｉａｌｙｌ−Ｌｅｘを生産でき る。このような哺乳類の酵素は存在するため、そのｃＤＮＡは以下の通り単離す ることができるａ骨髄球様細胞系（例えば、ＨＬ−６０）から単離したｍＲＮＡ を用いて調製したｃＤＮＡライブラリーを、例えばｙｒ　Ｈ３Ｍ　（Ｓｉｓｓｏ ｎｓ　ｅｔ　ａｔ、、　ｈｚｔｕｒｅｒ３３１：６２４．１９１１８；＾ｒｕｆ ’ｆｏ　ａｎｄ　５ｅｅｄ、　ｌ’ｒｏｅ、　＃／／、　Ｉｃ１ｕｆ、　５’ｃ ／、　／、５’／Ｊ１４：W５７３．１９８７　） のような哺乳類細胞発現ベクターに挿入し、哺乳類細胞系、好ましくはＣＯ３７ 細胞にトランスフェクトした（Ｓｅｅｄ　ａｎｄ　Ａｒｕｆｆｏ、　ｌ’ｒｏｃ 、　、ｈｌ／、　１ｃｍ’、　ｊｅｔゾ、　ｔｓｉ１１４：３３８５．１９８７ により記載の通り）。適切なｃＤＮＡクローンは、ＡｒｕｆＴｏ　ａｎｄ　５ｅ ｅｄ、５ｕｐｒ虹５ｅｅｄ　ａｎｄ＾ｒｕｆｆｏ、５ｕｐｒ虹及び米国特許第３ ７９，０７６号（本発明の参考文献に取り入れられている）に記載されたイムノ セレクチン法で単離する。 トランスフェクトされた細胞を回収し、モノクローナル抗体ＰＭ−８１（抗−〇 ＤＩ　５　；Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｖｅｓｔ　Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ）　、　ＦＭＣ Ｉ　３　（抗−ＣＤ　１　５　；　５ｅｒａ−Ｌａｂ／Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｃｈ ｅｓｉｃａｌ　ａｎｄ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｖｅｓｔｂｕｒｙ、　ＮＹ　 ）　、ＭＣ−１（抗−ＣＤＩ５　；５ｅｒａ−Ｌａｂ、　Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、　 ＮＹ）及びＶＩＭＢ＜抗−ＣＤ６５）とともにインキュベートする。インキュベ ート（例えば、１時間）の後、ＰＢＳ中２％Ｆｉｃｏｌｌのクッシヨンを通して 遠心分離することにより細胞と遊離の抗体を分離し、マウス■ｇＭに対するヤギ 抗体（アフィニティ精製標品）を塗布したプラスチック皿上にのせる（後述の通 り）。接着細胞を回収し、エビソームＤＮＡを含有するＨｉｒｔ上清を調製する 。精製した旧ｒｔ上清ＤＮＡを用いて標準的な手法により大腸菌（大腸菌ＭＣ１ ０６１／ｐ３が好ましい）を形質転換し、標準的な方法で、アンンビシリン及び テトラサイクリンに耐性なコロニーを選択する。抗生物質耐性コロニーをプール しく例えば、−晩、塩酸スペクチノマイシンを添加するなどにより）、プラスミ ドを増幅させる。その結果得られる培養物を、標準的な方法により、スフェロプ ラスト及びＣ０Ｓ７細胞に融合したスフェロプラストに変換する（例えば、５ｅ ｅｄ　ａｎｄ　Ａｒｕｆｒｏ、５ｕｐｒａ；参照）。細胞をインキュベートしく 好ましくは２〜３日）、次いで、上述の抗体に接触させる。好ましくはスフェロ プラスト融合と“パニング（ｐａｎｎｌｎｇ　）　”　（すなわち、上述の方法 ）を２回行ない、最終回のパニングｃｐａｎｎｉｎｇ　）の結果得られた細菌細 胞を回収し、これらからプラスミドＤＮＡを調製する。このｃＤＮＡは、酵素、 すなわちα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ（目的のＣＤ１５及びＣＤ６ ５決定基、すなわち５（ａｌｙｌ−ＬａＸ決定基を出現させる）をコードする。 α（１，３）フコシルトランスフェラーゼ及びＩｇＧ１−Ｌｅｘを発現する（そ のため、５ｌａｌｙｌ−ＬａＸ決定基を有するＩｇＧ１分子を生産する）宿主細 胞を標準的な方法で増殖させ、プロティン八カラムに対するアフィニティまたは 他の抗体単離及び精製方法に基づいて、細胞溶菌液からＩｇＧ１−ＬｅＸ蛋白質 をｆｆｉ製する。 例えば生理食塩水のような適当な担体中に懸濁し、−回または複数回、静脈注射 により患者に投与する。最も好ましくは、内皮細飽上のすべてのＥＬＡＭ−１結 合部位を飽和するのに十分量のＩｇＧ１−Ｌｅｘを供給する。そのための用量は 、だいたい０．１ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上である。好ましい用量は０．　１〜 ２゜Ｏｍ　ｇ　／　ｋ　ｇの範囲である。 に静脈注射して投与することができる（すなわち、好ましくは、細胞ＥＬＡＭ− １結合部位をすべて飽和するのに十分な用量、例えば０．１ｍｇ／ｋｇまたはそ Ｐ　−５ｌａｌｙｌ−Ｌｅｘを使用することができる。このような障害の後、血 管壁の内側を覆っている内皮細胞はその表面にＥＬＡＭ−１を発現し、無処置の 場合、表面に５ｊａｌｙｌ−Ｌｅｘを有する好中球が、この上うなＥＬＡＭ−１ を有する内皮細胞に結合し、炎症を引き起こす。５１ａｌｙｌ−Ｌｅｘを有する 分子により処置すると、外来好中球と心臓に近接した血管内皮細胞の間の相互作 用を拮抗的に阻害することに−ＬｅＸのような化合物は、上述のとおり、慢性炎 症の症状を育する疾病（例えば、り二つマチ性関節炎、乾１、または尋常性天庖 癒）の治療に使用することができる。 衷鼠塾 以下の実験により、ｓｉａｌｙｌ−Ｌｅｗｉｓ　Ｘ　（ｓｌａｌｙｌ−Ｌｅｘ） 決定基がＥＬＡＭ−１と相互作用し、ＥＬＡＭ−１を存する内皮細胞への結合を 促進することが示された。これらの例は本発明を説明するためのものであり、こ れに限定されることはない。 ＥＬＡＭ−１による５ｉａｌｙｌ　−Ｌｅｘ決定基の認識精粒疎結合活性に必要 なＥＬＡＭ−１領域は、二種のモノクローナル抗−ＥＬＡＭ−１抗体：Ｈ１８／ ７Ｃ活性化内皮への白血球の接着を効果的に阻止する）及びＨ４／１８　（活性 化内皮への白血球の接着を阻止しない）　（Ｐｏｂｅｒ　ｅｔ　ａｔ、。 ＡＭ−１（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃ／＃ｒθ２４３：１１６ ０．１９８９）に含有されたｃＤＮＡにより発現させた。図２に示す蛋白質を作 製するため、ポリメラーゼチェインリアクシタンによりＥＬＡＭ−１ｃＤＮＡの カルボキシル末端を削除した。ＰＣＨによる削除のためのプライマー配列は、Ｂ ｅｖｉｌａｃｑｕａらによる全長ＥＬＡＭ−１配列Ｃ３ｃ、／ｍｔｅ２４虹ＬＬ ８０．１９１１９）に基づき設計した。ＥＬＡＭ−１ｃＤＮＡ断片を作製した後 、標準的な手法により、ＣＤ７ｃＤＮＡの膜内外及び細胞内コーディング部分（ すなわち、ＡｒｕｆＴｏ　ａｎｄ　５ｅｅｄ、　ＩＩＩＩ、）６：３３１３．１ ９１＋７に記載されたＣＤ７ｃＤＮＡの塩基５０１〜１２３６）に融合した。そ の結果生じる融合物を有するプラスミドを、ＣＯ８細胞にトランスフェクトした 。モノクローナル抗体に対する反応性は、ＡｒｕｆＴｏ　ｅｔ　ａｌ、　ｔ’ｅ ／／　［ｆｌ：１３０３．１９９０の方法により固定し透過させた（ｐｅｒｍｅ ａｂｊｌｌｚｅｄ　）細胞を、間接的免疫蛍光顕微鏡で観察して決定した。この 解析結果を図２に示す。これらは、図示した構築物の３〜６個の独立した単離物 のトランスフェクションの代表例である。図２は、Ｈ１ｇ／７結合にはレクチン 関連部分及びＥＧＦ繰り返し領域が必要であるが、Ｈ４／１８反応性にはこれら に加えて、最初の３種の補体制御蛋白質繰り返し因子が必要であることを示して いる。Ｌは、レクチン関連繰り返し部分を示している。ＥＧＦは、ＥＧＦ関連繰 り返し部分を示している。ＣＲ１〜ＣＲ６は、補体調節蛋白質因子を示している 。 Ｈ１８／７に対する結合部位をさらに特定するために、ＥＬＡＭ−１ｃＤＮＡの 断片を、関連したＬ　ｅ　Ｈ８（ＬＥＣＣＡＭ−１）　ｃ　ＤＮＡ　（Ｃａｓｅ ｒｌｎｌ　ｅｔ　ａｌ、。 ｉＶｔｌｗｅ　３４２ニアｇ、　１９８９）の対応する断片と置換した。Ｌｅｕ ８　（ＬＥＣＣＡＭ−１）／ＥＬＡＭ−１キメラは、レクチン領域内に保存され たＢｇ±１１部位（すなわち、ＥＬＡＭ−１ｃＤＮＡ配列の塩基４５４及びＬｅ ｕ８ｃＤＮＡ配列の塩基４７５）において組み換えた制限酵素切断断片から作製 した。図２に示した通り、抗原性決定基に結合したＨ　１８／７は、主に、ＥＬ ＡＭ−ルクチン領域の最初の７５％に局在していた。上述の結果（すなわち、Ｈ １８／７が、先端を削除したＥＬＡＭ−１に結合するためには、レクチン様領域 及びＥＧＦ繰り返し様領域の両方が必要であること）と併せて、ＥＧＦ関連繰り 返し因子は、レクチン領域の構造を形作る役割を担っている可能性を示唆してい る。 エピトープマツピングにより示唆されたレクチン−糖質相互作用の可能性を研究 するために、ＥＬＡＭ−１の細胞外領域をコードするｃＤＮＡ断片と、ヒトＩｇ Ｇ１　（ＡｒｕｆＴｏ　ａｔ　ａｌ、（’ｅ／／　６１：１３０３．１９９０： 図３）の主要部分（すなわちＣＨ２及びＣＨ３領域）をコードするゲノム断片の 融合物から、可溶性ＥＬＡＭ−１蛋白質キメラを調製した。ＥＬＡＭ−１−Ｉ　 ｇＧ１キメラは、以下の通り調製した。ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＴＡＣＴＡＣＴ ＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＧＣＣＧＡＴＧＧＴＣＴＣＣＧＧＧＣ（配列番号二３）及 びＣＣＡＧＡＴＡＴＡＣＧＣＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴ ＴＡＴＴ　（配列番号：４）の配列を存し、ＥＬＡＭ−１のスプライスドナー／ カルボキシル末端及び挿入ｃＤＮＡの上流のベクタ一部分にそれぞれ対応する合 成オリゴヌクレオチドは、標準的な手法により調製した。これらのオリゴヌクレ オチドを用い、ＥＬＡＭ−１ｃＤＮＡ発現ベクターであるｐＥＬＡＭ−１を鋳型 としてポリメラーゼチェインリアクシタンを行なって、１８００ｂｐの断片を取 得した。この断片をＸｈｏｌとＥｃ。 Ｒ１で消化して、Ｘｈｏｌ／ＥｃｏＲＩで消化した発現ベクターπＨ３Ｍ　（Ａ ｒｕｆＴｏ　ａｎｄ　５ｅｅｄ　Ｐｒｏｃ、　ａｔ／、　Ｉｃ１ｒｄ、　、９ｔ ゾ、　／、５’／８４：８５７３．１９１１７　＞中にサブクローj ングした。Ｘｈｏｌ及びＳｃａｌで消化して、サブクローニングされた断片を切 り出し、Ｘｈｏｌ／５ｃａｒで消化したｒｇ０１発現プラスミド（Ａｒｕｆｒｏ 　ｅｔ　ａｌ、　Ｃｅ／／６１：１３０３．１９９０に記載）に連結した。その 結果得られた構築物をＣＯ８細胞にトランスフェクトしＣ３ｅｅｄ　ａｎｄ　Ａ ｒｕｆＴｏ　ｔｒｏｔ、　＃／ノ、　ｋｉ／−Ｓｃ、／、　／、９１８４：３３ ６５、１９８７に記載の通り）、目的の蛋白質（ＥＬＡＭ−Ｒｇと命名）を＾ｒ ｕｆｆ。 Ｅｌｔａｌ、らの方法（ｆｆ、ｙ／／８１：１３０３．１９９０）に従って、プ ロティンＡ−アガロースニ吸着させた後溶出することにより上清から回収した。 最初の構築物と、ＰＣＲにより増幅された断片の大部分（すなわち、ＥＬＡＭ− １配列の塩基１〜１４６４）が相捕的な制限酵素消化断片と組み換わっている（ 増幅中に起こり得る変異を避けるため）改変体は、同等の結合活性を示した。可 溶性蛋白質は、ジスルフィド結合した二量体の形をとっており、これは、おそら く、主要部分のシスティン残基（活性型イムノグロブリンのｈｅａｖｙ　ｃｈａ ｉｎ間の結合に関与している）により媒介されているものと思われる。 骨髄球様細胞が可溶性ＥＬＡＭ−１に結合するかどうかを決定するために、ヤギ ー抗−ヒトＩｇＧ抗体をあらかじめ塗布したプラスチック製の皿を、ＥＬＡＭ− Ｒｇを発現している上清と共にインキュベートした。これらの実験は以下の通り 行なった。採取したばかりの全血にヘパリンを添加し、Ｆｉｃｏｌ　ｌ／５ｏｄ ｉｕ■ｄｌａｔｒ［ｚｏａｔｅ（Ｍｏｎｏ−Ｐｏｌｙ　Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　Ｍ ｅｄｉｕｍ、　Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌｅｓ、　ＭｃＬｅａｎ、　ＶＡ jを通して、 ８００Ｘｇで２０分間遠心分離することにより、ヒト顆粒球を単離した。細胞系 は＾麿ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏｔ　１ｅｃｔｌｏｎ　（ Ａ　Ｔ　ＣＣ）から入手し、ＡｒｕｆＴｏ　ａｎｄ　５ｅｅｄ　（／’ｒｏｃ、 　、ｉ’１ｉｔ１１．　Ｉｃｉ／、　、！；ｃ、／、　／８１８４：８５７３． １９８７　）により記載された通り、１０％ウシ胎児血清を含有するＩＭＤＭ中 で保存した。ＥＬＡＭ−Ｒｇの付着は、細菌培養皿（Ｆａｌｃｏｎ　ｔｏｏｇ、 　Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｌａｂｗａｒｅ、　Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｐ ａｒｋ、　ＮＪ　）■ で行なった。この皿に、アフィニティ精製したヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体（Ｏｒｇ ａｎ。 ｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ／Ｃａｐｐｅ１．　Ｍａｌｖｅｒｎｅ　Ｐ＾）を５０ｍＭ　 Ｔｒｆｓ−ＨＣＩ、ｐＨ９，５中で１０μｇ／ｍｌの濃度で最低一時間付着させ 、次いで、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ ＰＢＳ；１３７ｍＭ　ＮａＣ１゜２．７ｍＭ　ＫＣＩ、４．３ｍＭ　Ｎａ　ＨＰ Ｏ４７Ｈ２０，１，４ｍＭ　ＫＨ２２℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳを 用いて洗浄し、２２℃で１０分間細胞（１０６細胞）を上層し、次いでＰＢＳを 用いて３回洗浄した。単位面積あたりの皿における付着細胞を、接眼鏡の網線を 参考にしながら計測し、以下のとおり評価した：　＞１００細胞は、＋＋＋十十 ；　１００〜７５細胞は、＋十＋＋　；７５〜５０細胞は、＋＋十；　５０〜２ ５細胞は、＋＋；２５〜１０細胞は、十。 値はすべて、３連の実験の平均値である。 処理されたプラスチックは、骨髄球様細胞系ＨＬ６０及びＴＨＰＩと同様、顆粒 球をも特異的に結合する能力を有した（図４）。造血由来（すなわち、Ｕ９３７ 及びＨ８Ｂ−２）及び非造血由来（すなわち、ＷＩＤＲ）の他の細胞系も共にＥ ＬＡＭ−１を塗布したプラスチックに結合することが判明した（図４）。ＣＤ８ 融合蛋白質（ＡｒｕｆＴｏ　ｅｔ　ａｌ、　ｒｙ／±１３０３．１９９０）を塗 布した皿は、顆粒球または試験したいずれの細胞系に対してもほとんどアフイニ テイを示さなかった（　１’ｒｏｃ、　７；ｆｒ／、　ｌｃ、ｔ／、　３ｄ、　 ／Ｓｌｈ：９２３Ｂ、１９８７　）表面の表現型と結合能を関連づけるために、 上述の細胞系との反応性について、既知の顆粒球糖質抗原を認識する種々のモノ クローナル抗体をスクリーニングした。５Ｘ１０５細胞を、以下の抗体（腹水と してのものは１：２５０希釈、精製７、１９８３　）　、Ｃ３ＬＥＸ−１（抗− ５ｉａｌｙｌ−Ｌｅｘ；　Ｐｕｋｕｓｈｊｍａ　ｅｔ　ａｌ、、　ｌ’ｍｃｅｒ ｆ’［ｇＧ＋Ｉ　ｇＡ＋［ｇＭ抗体（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｌｋａ／Ｃａｐ ｐｅｌ、　１４ａｌｖｅｒｎｅ、　ＰＡ）と共にインキュベートした。 この結果を図５に示す。細かい点線はネガティブコントロール（−次抗体なりを 示す；太い点線、抗−ＣＤ１５　ｍＡｂ；実線、抗−ＣＤ６３　ｍＡｂ；及び破 線、抗−ｓｉａｌｙｌ−ＬｅｘｍＡｂ、本発明で使用したＵ９３７系は、Ｔｅｒ ａｓａｋｌ　ａｎｄ　ｃｏｖｏｒｋｅｒｓ（Ｆｕｋｕｓｈｌｗａ　ｅｔ　ａｌ、 、（”１ｘｅｒｌｔｙｓ、　４４：５２７９．１９８４　）が試験した関連Ｕ９ ３７と異なり、　５ｉａｌｙｌ−Ｌｅｘ決定基を欠損していた。初期検索がら、 ＥＬＡＭ−１接着能は、ＣＤ１５決定基（すなわち、Ｌｅｘ、またはラクト−Ｎ −フコベ１　ＮｅｕＡｃｌｌｌ　ＦｕｃｎｏｒＬｃｎＯｓｅ６Ｃｅｒ；Ｍａｃｈ ｅｒｅｔａｌ、、）ＥＬＡＭ−１接着能とＣＤ１５の存在の関連性を更に詳細に 試験するために、ＣＤ１５を有する細胞を、末端５ｌａｌｙｌ基を切断する酵素 として知られているノイラミニダーゼで処理した。ＨＬ６０細胞（１０６／プレ ート）を、４１．５ｍＵのノイラミニダーゼ（ＶＩｂｒ［ｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ 由来、タイプＩ　Ｉ　、Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ。 Ｎｏ）存在下及び非存在下で、５０μｌの０．１５Ｍ　ＮａＣ１，４ｍＭ　Ｃａ ｃｔ２．ｐＨ５，５中において３７℃、１時間インキュベートした。細胞をＰＢ Ｓを用いて３回洗浄し、ＥＬＡＭ−ＲｇまたはＰＭ−８１のいずれかを塗布した 皿への付着を上述の通り評価した。ＥＬＡＭ−Ｒｇについては上述の通り、精製 ＰＭ−８１抗体については５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ９，５中で１０μ ｇ／ｍｌを皿に塗布した。付着試験は上述の通り行なった。図６に示した結果は コントロールに対するパーセントで示しており、３回の独立した実験における３ 連の結果の平均値に対する平均上標準偏差から計算した。 図６は、ＥＬＡＭ−１接着能とＣＤ１５の存在の関連性が不完全であることを示 している。なぜならば、細胞をノイラミニダーゼで消化することによりＥＬＡＭ −１への接着は阻止されるが、固定化抗−ＣＤ１５抗体への接着は増加したがら である。 ＣＤ１５に関係し、ノイラミニダーゼに対して感受性を有することから、ＣＤ１ ５糖質抗原のシアリル化型が、代表的な生理学的ＥＬＡＭ−１リガンドである可 能性が示唆された。この仮説を試験するために、Ｃ３ＬＥＸ１モノクローナル抗 体について、ＨＲ６０細胞がＥＬＡＭ−Ｒｇに接着するのを阻止する能力を測定 した。１０６ＨＬ６０細胞をＣ９ＬＥＸＩ　（ＰＢＳ中１：５０）と共に氷上で ３０分間インキュベートし、次いでアフィニティ精製したヤギ抗−マウスＩｇＭ 抗体（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ／Ｃａｐｐｅｌ、　Ｍａｌｙｅｒｎｅ、 　ＰＡ）とＰＢＳ中２０μｇ／ｍｌで３０分間交差させ、２％ホルムアルデヒド （ＰＢＳ中）を用いて２２℃２０分間固定した。細胞をＰＢＳ／１％グリシン中 で３回洗浄し、ＥＬＡＭ−１−Ｒｇを塗布した皿と共に上述の通りインキュベー トした。図７のデータ（コントロールに対するパーセントで示した）は、３回の 独立した実験における３連の結果の平均±標準偏差を表している。 図７は、５ｉａｌｙｌ　−Ｌｅｘの表面密度と、ＥＬＡＭ−Ｒｇを塗布したプラ スチックに結合した細胞の単位面積あたりの個数の順序が非常によく相関するこ とを示している。さらに、抗−５ｌａｌｙｌ−Ｌｅｘ抗体は骨髄球様細胞がＥＬ ＡＭ−１に接着するのを完全に阻害したが、抗−ＣＤ６５及び抗−ＣＤ１５抗体 は同一の条件下で活性を示さなかった。 Ｃ９ＬＥＸＩ抗体により認識される糖質エピトープは、構造的に特徴づけられて いる糖脂質（抗体と反応する）に共通するモチーフに基づき、ＮｅｕＮＡｃα２ −３Ｇａｌβ１−４　（Ｆｕｃαｌ　３）ＧＩｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌであると 報告されている（Ｐｕｋｕｓｈ（ｓａ　ｅｔ　ａｌ、、　１ｕｙｃｔｒｒ　ｌｅ ｓ、　４４：５２７９．１９８４　）　ｏ好中性顆粒球のフコシル化うクトサミ ノグリカンの化学的解析から、Ｌｅｘ（ＣＤ　１５）及び５ｉａｌｙｌ　−Ｌｅ ｘ決定基が主に、アスパラギン結合グリカンの４本の突起（これらの各鎖は、種 々のα（Ｌ　３）−結合フコースによる置換を有するポリ（Ｎ−アセチルラクト サミン）鎖から出来ている）上に存在することが示されてきた（Ｆｕ血清学的証 拠からも支持された（Ｆｕｋｕｓｈ　ａｔ　ａｌ、、　ｊ、　ｌｌｏ／、　ｌ” １ｗ、　２５９：１０５１１．１９８４：　Ｐｕｋｕｓｈ　ｅｔ　ａｌ、、　ｌ ”１ｔｙｃｅｒｌｅｓ、　４５：３７１１　）　ｏこのように、これまでに同定 されているすべての顆粒球の構造において、５ｌａｌｙｌ−Ｌｅｘ基の還元側残 基はガラクトースでＲＰ−Ｂ１である。抗体Ｃ５ＬＥＸＩが結合を阻止するにも かかわらず、ＥＬＡＭ−１により認識される構造は、Ｃ３ＬＥＸＩにより認識さ れる構造よりも複雑である可能性がある。ＥＬＡＭ−１結合に必要な最低限のグ リカン構造を確立するために、化学的に特徴づけられた５ｌａｌｙｌ−Ｌｅｘ決 定基を有するグリカンについて、そのＥＬＡＭ−１認識性を評価した。 羊水は、顆粒球細胞表面とは大きく異なる環境で見出される、よく調べられた５ ｌａｌ　ｙｌ　−ＬｅＸ決定基の取得源の一つである。５ｆａｌｙｌ−ＬｅＸ決 定基を有する羊膜ムチンの糖質は、３−置換Ｎ−アセチルグルコサミンにβ１− ６結合しており、これは、ポリペプチドの主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ）に、セリン またはスレオニンへの〇−結合により直接結合している（Ｈａｎｊｓｃｈ　ｅｔ 　ａｔ、、　ＱｔｒｌｚｏＪｙｔｌｒ、　ｌｅｓ、　１７１１：２３．１９８１ １）。 羊水由来の５ｉａｌｙｌ−Ｌｅｘ決定基の、骨髄球様細胞が固定化ＥＬＡＭ−１ に結合するのを阻止する能力を試験した。ヒト羊水（ＨＡＦ）は、精製せずに遠 心限外濾過（分画分子Ｊｕｌ　ＯＯｋＤ　ａ　１　；　Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　１ ００．　ＡｓＩｃｏｎ、　Ｄａｎｖｅｒｓ　ＨＡ　）による分画を行なうか、ま たは、フェノール抽出後、４Ｍ塩酸グアニジン中でサイズ排除クロマトグラフィ （ｓｉｚｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ｃｈｒｏｗａｔｏｇｒａ″”ｐｈｙ：　５ｅ ｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００ＨＲ）による分画を行なうことにより（Ｈａｎｊｓ ｃｈ　ｅｔ　ａｔ、、　（’ｙｌｔｏｉＢｌｒ、　ｉｅｓ、　１７８：２９．１ ９８８の方法に従った）ムチンを精製するかのいずれかで使用した。このような ムチンは、約１５０μｇ／ｍｌの蛋白質濃度で使用した。ＥＬＡＭ−Ｒｇを塗布 したプラスチックへの結合は上述の通り行なった。図８の結果（コントロールに 対するパーセントで示した）は、２回の独立した実験における３連の結果の平均 である。 図８より、顆粒球グリカンと羊水ムチンは類似していないにもかかわらず、精製 羊水ムチンが、分画していない羊水（全活性は、ムチンを大量に含む高分子分画 中に含まれると思われる）と同様に、骨髄球様細胞の固定化ＥＬＡＭ−１への結 合を効果的に阻止することを示している。 ５ｌａｌｙｌ　−ＬｅＸ決定基の他の取得源として、フ叶ル化α　酸糖蛋白質（ αｌ−ＡＧＰ）がある（Ｂｌｏｕ　ｅｔ　ａｌ、、　ｌｌ１ｏｃｕｔ、　１Ｕｏ ｐＡｙｓ、　１ｃｌｉ、　９１３：３０１１．１９ＪＩ７：　Ｖｌ■■ ｕｓｚｅｓｋｌ　ｅｔ　ａｌ、、　ｍ５ｌｅ１１．２３８：３９０．１９１１ｇ ）　６ヒトαｔ　Ａ　Ｇ　Ｐの化学的解析により、Ｎ−結合グリカンの少分画に はフコースが存在するが（Ｓｃｈｓｌｄ　ａｔ　ａｌ、ｔカ’ｏｃＪＩｔ、カ迭 乾ｒｓ、　Ｉｃ１ｉ、　／／／　：２９１．１９７７；　Ｐｏｕｒｎｅｔ　ｅｔ 　ａｌ、、　１ＺＩｏｃｉｔｙｌｓｌ窒凾P ７：５２０Ｂ、　１９７ｇ）　、アシアロ蛋白質が、抗−ＣＤ１５抗体の結合を 少なくとも部分的に阻止することが示された（Ｃｏｏｌ　ｅｔ　ａｌ、、ｔｗ、 　、／、　／ｌｚｍｏ／、　１３：３０８．１９Ｊ１３；　Ｔｅｔｔｅｒｏｏ　 ｅｔ　ａｌ、、　７ｗ、　ｊ、　／１ｔｔｔｓｏ／、　１４二ＩＱｌ１９．１９ １１４）　ｏ　２００　ｐ　ｇ／ｍ　ｌの`白 質により、ＨＬ６０細胞のＥＬＡＭ−１（プラスチックに付着）への結合が若干 （３５±９％）減少した。 ／ｙ　ｙｔｔｒｏで調製した。５ｉａｌｙｌ−Ｌｅｘ決定基の生合成は、特異的 なα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ（Ｃａｓｐｂｅｌｌ　ｅｔ　ａｔ、 、　／ｙ／／３５：３０３．１９８３：　Ｃａ５ｐｂｅｌｌｌ　ｅＬ　ａｌ、、 ）、　１１０／、　ｌ”／ｙｅｔ　２５９：１１２０１１．１９８４）により制 御されている。この酵素は、末端Ｎ−アセチルラクトサミンまたはその３−シア リル付加物のＮ−アセチルグルコサミン部分にフコースを付加する；遺伝学的及 び生化学的に異なる特異的α（Ｌ　３）フコシルトランスフェラーゼは、アシア リル前駆体にのみフコースを付加することが知られている（Ｐｒｌｅｅｌｓ　ｅ ｔ　ａｔ、、　ｌ’ｔｔｒ、　ｊ、　１１０ｃｉｌｅｔ　１３０：３４７、１９ ８３；　Ｍｕｒａｓａｔｓｕ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｆｔｔｒ、）’、　１１０ｃＪ ｅｔ　１５７：７１．１９８Ｂ　）、第三のフコシルトランスフェラーゼは、シ アリル化されていない基質についてα（１，３）及びα（１，４）結合の両方を 形成することが知られている（Ｐｒｉｅｅｌｓ　ｅｔ　ａｌ、、　、／。 カ’ｏ／、　ｔ”ｌｅｚ、　２５６：１０４５６．１９ＪＩＩ：　Ｌｏｖｅ　ｅ ｔ　ａｔ、、ユｎｆｒａ）　＋ｌ　ａ　（２，３）シアリルトランスフェラーゼ がフコシル化されたＮ〜ルアセチルラクトサミンすなわちＣＤ１５）を認識でき ないため（）Ｉｏｌｍｅｓ　ａｔ　ａｌ、＋ノ、　Ｉｌ’ｏ／、　ｌ’／ｙｅｔ 　２６１：３７３７．１９８６　）、　５ｌａｌｙｌ−Ｌｅｘ決定基の生合成の 後、シアリル化され、ついでフコシル化される。 シアリル化された前駆体及びシアリル化されていない前駆体からそれぞれ５ｊａ ｌｙｌ−ＬｅＸを形成する。 羊水フコシルトランスフェラーゼをアフィニティクロマトグラフィにより単離し 、この酵素のα、−ＡＧＰからＥＬＡＭ−１リガンドへの変換能を以下の通り評 価した。α（１，３）フコシルトランスフェラーゼは、Ｈａｎｉｓｃｈ　ｅｔ　 ａｌ、　（１’、ｗｌｐｏｉｌｌｔｌｒ、　／’ｉｓ、　＋７１１：２３．１９ ８８）及びＭＨｓａｋｏｓ　ｅｔ　ａｌ　、　（１１／ｃ１．１ｋｓｉ、　／ｈ ｐ、狽凾狽凵|，９ｅｙ／ｗ ３６９：８６１．１９８８　）により２賊された方法で、濃縮した羊水からフェ ツイン−アゴ０−スクロマトグラフイを用いて単離した。２５ｍＭ　Ｔｒｔｓ− ＨＣＩ　ｐＨＣＡ不溶性物質に取り込まれた。取り込まれなかった標識は遠心限 外濾過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　１０．＾−１ｃｏｎ、　Ｄａｎｖｅｒｓ　ＨＡ） により除去した。１：５希釈の標識物質２０μｌ、または１：５希釈の同様の組 成の反応液（標識ＧＤＰ−フコースを含まない）１０μｌを、プラスチック皿（ 上述の通り）若しくは９６穴マイクロタイタープレート（Ｐａｌｃｏｎ　３９１ １．　Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　０ｘｎａｒｄ、　Ｃ＾）に吸着さ せた。ウェルを１βｇ／ｍｌのＥＬＡＭ−ＲｇまたはＣＤ８−Ｒｇと共に２２℃ で一時間インキユベートし、ＰＢＳで洗浄し、放射性ヨウ素で処理したヤギ抗− ヒトＩｇＧ抗体（ＯｕＰｏｎｔ／ＮＥＮ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｍ＾）と共に更に １時間インキュベートした。洗浄後、標識抗体の結合をガンマカウンター中で測 定した。図９に示した結果は、４連の結果の平均上標準偏差で表し、２回の独立 した実験の代表値である。 図９は、ＧＤＰ−７コース存在下でフコシルトランスフェラーゼと共にインキュ ベートしたα　−ＡＧＰが、α　−ＡＧＰ単独またはＧＤＰ非存在下で酵素：： 共にインキュベートしたα　−ＡＧＰの場合と比較して、著しく多くのＥＬＡＭ −Ｒｇを結合することを示している。 アジア０蛋白質のフコシル化されていない末端はβ（１−４）　、β（１−２） またはα（１−６）のいずれかでマンノースに結合したＮ−アセチルラクトサミ ン基から構成されているが、アジア０〜α−ＡＧＰのフコシル化グリカンは末端 構造Ｇａｌβ（１−４）−ＣＦｕｃａ　（１−３））ＧＩ　ｃＮＡｃβ（１−４ ）Ｍａｎを有している（Ｐｏｕｒｎｅｔ　ｅｔ　ａｌ、、　ｌｌ’ｏｃｉｌｅＭ ｓｔ瞠５２０６．１９７８）　ｏこのため、あらかじめ存在したα、−ＡＧＰの ５ｊａｌｙｌ　−Ｌｅｘ決定基、またはＮ−アセチルグルコサミンへのフコシル 付加物候補のいずれもガラクトースに結合することはできなかった。これらの結 果は、ムチンが〇−結合したグリカンが、ＥＬＡＭ−１結合を阻害することと共 に、５ｌａｌｙｌ−ＬｅｘどうしのグルーピングがＥＬＡＭ−１に対してかなり のアフィニティを有することを示している。しがし、より強固なＥＬＡＭ−１結 合が、顆粒球上の５Ｉａｌｙｌ−ＬｅＸ決定基に近接する残基によって促進され るのか、または近接度に関与する立体的因子によって促進されるのかは未だ解明 されていない。 ＩＬ−８による、骨髄球様細胞のＥＬＡＭ−１への接着の阻止ＩＬ−１処理され た内皮細胞からＩＬ−８が放出されると、顆粒球が、ＩＬ−１により誘導された 内皮に結合できなくなることが報告されている（ＧＩ＊ｂｒｏｎｅ　ｅｔ　ａｔ 、、　ｌｃ／＃ｃｅ２４６：１６０１．１９ｇ９　）　、　ｓ＋ａｌｙｌ−Ｌｅ Ｘ表面抗原の発現に対するＩＩ。 −１及びＩＬ−８の影響は以下の通り測定した。ｇｔｉ球を、ＩＬ−１β（１０ ｎｇ／ｍ　ｌ　；　Ｐｅｐｒｏ　Ｔｅｃｈ、　Ｒｏｃｋ　）ｌｉｆｔ、　ＮＪ） またはＩＬ−８（２５ｎｇ／ｍｌ　；Ｐｅｐｒｏ　Ｔｅｃｈ、　Ｒｏｃｋ　）１ １１１．　ＮＪ　）と共に３７℃で２０分間インキュベートし、３回洗浄した後 、ＣＤ　１５　（ＰＭ−８１）　、　ＣＤ６５　（Ｖ　Ｉ　Ｍ２）　＊タハ５ｌ ａｌｙｌ−Ｌｅｘ（ＣＳＬＥＸＩ）（上述）のいずれかに対するモノクローナル 抗体と共に氷上でインキュベートした。図１０に示す結果は、フロー血球計算法 により決定した比平均蛍光強度（ＭＦＩ）（サイトヵイン無添加で平行してイン キュベートした顆粒球のＭＦＩに対するパーセントで示している）であり、４回 の実験の代表的な大きく減少させないことを示している。 ＩＬ−８に接触された顆粒球から回収した上清の、ＥＬＡＭ−１への結合を阻止 する能力を試験するために、顆粒球（５Ｘ１０７／ｍｌ）をＩＬ−１またはＩＬ −８（上述の濃度）と共に３７℃で１時間インキュベートした。遠心分離の後上 浦を回収し、ＥＬＡＭ−Ｒｇを塗布した皿と共にインキュベートした。３０分後 に細胞を添加し、上述の通りに結合を測定した。１０μｇのアフィニティ精製つ サギ抗−マウスＩｇＭを吸着させたプロティンＡアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ 、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　Ｎｏ）　４０　ＩＩと免疫吸着させ、次いで、５μ ｌのＣ３ＬＥＸＩ腹水と免疫吸着させた。Ｃ３ＬＥＸＩとのインキュベートを行 なわないこと以外は同様に調製したビーズをコントロールとした。ビーズをＰＢ Ｓで洗浄し、上清と共に４℃で１時間インキュベートした。その結果を図１１に 示す。結果は、サイトカイン無添加である以外は同様の条件下でインキュベート した場合の上清存在下での結合数に対するパーセントで表している。データは、 ３回の独立した実験における３連の測定の平均上標準偏差で示している。 図１１は、Ｉ　Ｌ−８で処理したがＩＬ−１では処理しない顆粒球培養液から回 収した上清は、ＨＬ６０細胞の固定化ＥＬＡＭ−１への接着を阻害し、また、こ の阻害は、上清を固相Ｃ３ＬＥＸＩに吸着させることにより特異的に解除される が、免疫吸着マトリクスのみに吸着させても解除されないことを示している。 その他の実施例 その他の実施例は、特許請求の範囲に含まれる。例えば、本発明には、補体への 結合能が低く、付着する糖質側鎖によりＦ　受容体を結合するいかなる抗体も含 まれる；上述の通り、これらには、治療に有効な糖質類の担体としてのみ使用さ れる抗体や、免疫学的特異性を有するため有用性の高い抗体（例えば、ＭＹ９０ ４、Ｔｏｄｄ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許第４，８４０，７９３号）（これらは、 細胞−細胞相互作用を拮抗的に阻害する）が含まれる。Ｎ−結合グリカン付加部 位が、アスパラギン（Ｎ）　、Ｘ　（Ｘはプロリン以外のいかなる残品でもよい ）、セリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）であることがよく知られているため、 当業者は、このような部位を任意の個数有し、よって糖質側鎖を任意の個数有す る分子を設計することができる。例えばノーｙ／ｌ／−０部位突然変異導入法に より、抗体配列に糖鎖形成部位を取り入れることができる。 害するのに使用でき、このため心筋梗塞の治療に有用である。フィブリンや凝固 カスケード蛋白質の一つのような蛋白質に対する抗体は、血栓の形成阻害に有用 である。一般に、治療的用法の有効性が提唱されている抗体または実証されてい る抗体（抗−Ｍｏ−１及び抗−ＣＤ１４を含むがこれに限定されない）はいずれ も、糖質部分を付加して補体の固定及びＦ　受容体の結合をできなくすることに より改良される。この特性は、例えば、イムノグロブリン融合蛋白質（例えば、 期を延長する。これらの融合蛋白質は患者の体内において、より寿命が長いため 、異物抗原としてより認識されやすく、このため、その蛋白質が患者のＦ　受容 体結合及び補体固定機構を回避するために特に有効である。 細胞または蛋白質の間の相互作用を阻止する目的に対しては、他のいかなる適切 な担体分子をも使用することができる。一般に、蛋白質は血清中での半減期が比 較的長いため好ましい。担体蛋白質の部類の一つに、アルブｉン（例えば、ウシ 血清アルブメンまたはヒト血清アルブメン）、トランスフェリン、またはα−２ マクログロブリンなどの血清蛋白質がある。担体蛋白質は、グリカン付加部位を 内在する場合もあり、また、例えば、部位特異的変異導入法により担体蛋白質の ＤＮＡ配列に部位を導入することもできる（上述の通り）。蛋白質はど好ましく はないが、担体分子は脂質でもよい。一つまたはそれ以上の糖質部分（例えば、 ５ｉａｌｙｌ−Ｌｅｘ決定基）が結合している脂質は、リポソームとして標的細 胞壁（例えば、内皮細胞壁）に輸送される。リポソームは、細胞または、蛋白質 の相互作用を阻止し、また薬物を適切な作用部位に輸送するのに使用される。 ＥＬＡＭ−１に加え、他の細胞接着分子は、上述の通り担体分子に適切な糖質認 識部分結合することにより阻害されるであろう。このような細胞接着分子には、 ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、Ｉ　ＣＡＭ−１、ＰＡＤＧＥＭ、Ｍｅ　＋−１４、Ｌ ＡＭ−１、ｃａｄｈｅｒｌｎ、細胞−ＣＡＭ、またはＮ−ＣＡＭが含まれるがこ れに限定されるものではない。結合されうる他のグリカンには、Ｎ−結合グリカ ン、〇−結合グリカン、ＧＭＰ−１４０、Ｌｅｕ８０．及びフォスファチジルイ ノシトールリン酸グリカンが含まれるがこれに限定されるものではない。グリカ ン付加シグナルが既知の場合、それを生体担体分子のＤＮＡ配列に上述の通り導 入することができる。また、正確な部位は未知だが、いくつかの天然分子におけ るこのような付加部位の一般的な領域が既知である場合、その領域を含有するＤ ＮＡ断片（天然分子をコードする配列に由来する）を、目的の担体分子のＤＮＡ 配列（例えば、ＩｇＧ１またはα、−ＡＧＰをコードする配列）中にクローニン グすることができる。 糖質部分を有する担体分子の生産は、細胞内、好ましくは酵母以外の真核生物細 胞内で行なうことができる。哺乳類細胞、例えば哺乳類細胞系は特に適切な宿主 である。これらの細胞は必要な前駆体を一般に合成し、また、糖質結合に関与す る酵素を生産するか、または生産するよう組み換えることができる。５ｌａｌｙ ｌ　−Ｌｅｘ決定基の結合には、ＣＨＯ及びＩｅｃｌｌのような哺乳類細胞系が 特に適している。また、糖質部分を、ノ゛ｊｙｔｔｒａ、例えば細胞外で、担体 分子に結合させることができる。その−例として、α−（１，３）フコシルトラ ンスフェラーゼを固相支持体（例えば、カラム）に結合し、担体分子の適切な部 位への５ｉａｌｙｌ−ＬｅＸ基の結合を促進する条件下で、固定化フコシルトラ ンスフェラーゼ中に目的担体分子を通すことができる。 １”ｌＧ、　１（ＰＡＦＩ７３０Ｆ５）ＦＩＧ、　１　（ＰＡＲＴ　４０Ｆ　５ ）ＦＩＧ、１　（ＰＡ日Ｔ５０Ｆ５） ｇｌｌｌ ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、　５ コントロールＣ３ＬＥＸ−Ｉ　ＣＤ１５−ＰＭ８１　ＣＤ６５−ＶＩＭ２ＦＩＧ 、　７ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９５ 　ＡＢＥ　Ｄ　９２８４−４ＣＣＯ７Ｋ　１５／１４　８５１７−４ＨＣ１２Ｎ 　５／１０ １５／１３　ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４ＢＧＯＩＮ　３３１５３　Ｖ　８３１０− ２Ｊ３３１５６６　９０１５−２Ｊ ３３／６８　７０５５−２Ｊ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、　ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（Ｂ Ｆ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、Ｔ Ｇ）、ＡＴ、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ、　Ｄ Ｋ。 ＥＳ、ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＣ， ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　ＮＯ，ＰＬ、ＲＯ、ＳＤ、ＳＥ、ＳＵ Ｉ

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．ＥＬＡＭ−１を有する細胞と候補インヒビタ分子と第二の細胞若しくは蛋白 質との接触と、前記ＥＬＡＭ−１を有する細胞と前記第二の細胞または蛋白質と の間のアフィニティ複合体の形成と、前記アフィニティ複合体の形成を減少させ る分子を前記インヒビタ分子として同定する同定と、を含む、ＥＬＡＭ−１を有 する細胞と第二の細胞または蛋白質の間の相互作用を阻止するインヒビタ分子の 同定方法。
2. ２．前記第二の細胞または蛋白質がｓｉａｌｙ１−ＬｅＸ決定基を有することを 特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ３．患者体内における、特異的な結合対の第一のメンバーの、前記特異的な結合 対の第二のメンバーへの結合が特徴である疾病の治療に使用する抗体であって、 この抗体は前記第一メンバーに特異的であり、また、前記抗体の補体固定及びＦ ｃ受容体への結合能を阻害する糖質部分に共有結合している抗体。
4. ４．第一のメンバーが蛋白質であることを特徴とする請求項３に記載の抗体。
5. ５．第二のメンバーが蛋白質であることを特徴とする請求項３に記載の抗体。
6. ６．前記抗体が複数の前記糖質部分に共有結合していることを特徴とする請求項 ３に記載の抗体。
7. ７．前記糖質部分がｓｉａｌｙ１−ＬｅＸ決定基であることを特徴とする請求項 ３に記載の抗体。
8. ８．前記ｓｉａｌｙ１−ＬｅＸ決定基がＮ−結合していることを特徴とする請求 項７に記載の抗体。
9. ９．前記ｓｉａｌｙ１−ＬｅＸ決定基がＯ−結合していることを特徴とする請求 項７に記載の抗体。
10. １０．前記抗体がα１酸糖蛋白質のＮ−結合グリカン付加部位部位を一つまたは それ以上有することを特徴とする請求項３に記載の抗体。
11. １１．細胞接着蛋白質に特異的な糖質決定基が共有結合している、無細胞有機分 子。
12. １２．前記細胞接着蛋白質がセレクチンであることを特徴とする請求項１１に記 載の無細胞有機分子。
13. １３．前記セレクチンがＥＬＡＭ−１であることを特徴とする請求項１２に記載 の無細胞有機分子。
14. １４．前記糖質決定基がｓｉａｌｙ１−ＬｅＸであることを特徴とする請求項１ １に記載の無細胞有機分子。
15. １５．前記ｓｌａｌｙ１−ＬｅＸ決定基がＮ−結合していることを特徴とする請 求項１４に記載の無細胞有機分子。
16. １６．前記ｓｉａｌｙ１−ＬｅＸ決定基がＯ−結合していることを特徴とする請 求項１４に記載の無細胞有機分子。
17. １７．前記有機分子が蛋白質であることを特徴とする請求項１１に記載の無細胞 有機分子。
18. １８．前記蛋白質がα１酸糖蛋白質であることを特徴とする請求項１７に記数の 無細胞有機分子。
19. １９．α１酸糖蛋白質のＮ−結合グリカン付加部位部位を一つまたはそれ以上有 することを特徴とする請求項１１に記載の無細胞有機分子。
20. ２０．前記蛋白質が抗体であることを特徴とする請求項１７に記載の無細胞有機 分子。
21. ２１．前記抗体がｌｇＧ１であることを特徴とする請求項２０に記載の無細胞有 機分子。
22. ２２．前記糖質決定基の存在が前記抗体の補体固定及びＦｃ受容体への結合能を 阻害する請求項２０に記載の無細胞有機分子。
23. ２３．前記有機分子が複数の前記糖質決定基を有することを特徴とする請求項１ １に記載の無細胞有機分子。
24. ２４．請求項１１に記載の分子を有する製薬的化合物。
25. ２５．細胞接着蛋白質に特異的な糖質決定基の結合部位を有する抗体をコードす る精製核酸。
26. ２６．請求項２５に記載の核酸を有するベクター。
27. ２７．請求項２６に記載のベクターを有する組み換え細胞。
28. ２８．担体分子と、細胞後者蛋白質を糖質決定基に結合することができる酵素と の接触を含む、前記蛋白質に特異的な前記糖質が共有結合している担体分子を作 成する方法。
29. ２９．前記接触が生きている細胞内で起こることを特徴とする請求項２８に記載 の方法。
30. ３０．前記細胞が真核生物細胞であることを特徴とする請求項２９に記載の方法 。
31. ３１．前記細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする請求項３０に記載の方法 。
32. ３２．前記細胞が前記酵素をコードする組み換え細胞であることを特徴とする請 求項２９に記載の方法。
33. ３３．前記酵素がα（１、３）フコシルトランスフェラーゼであることを特徴と する請求項３２に記載の方法。