JPH07507679A - セレクチンリガンド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 セレクチンリガンド 発明の分野 本発明は内皮性セレクチンリガンドに関する。さらに本発明はこれらのリガンド をコードしている核酸、およびそれらを製造するための方法および手段に関する 。

背景および関連技術の説明 リンパ球は、正常組織の炎症ならびに例えば慢性関節リウマチおよび他の自己免 疫疾患において発生する病理学的な組織損傷の媒介物質である。免疫系の抗原性 の各種機能を十分に活用するために、を椎動物は場所の異なる生物の領域へ多様 な抗原特異性を有するリンパ球を分配させるための機構を進化させてきた［Ｂｕ ｔこの機構には、細胞が最も高い移動性を有する血液と、隔離されて加工された 抗原とリンパ球が出会うリンパ系器官の間のリンパ球の連続的な再循環が含まれ る。

血液から第二のリンパ系器官、例えばリンパ節（ＬＮ）および腸関連のバイヤー 斑（Ｐ　Ｐ）へのリンパ球の交通は、高内皮細静脈（ＲＥＶ）の分化された内皮 細胞とンバ系器官−選択的な移動または「回帰（ｈｏｓｉｎｇ）Ｊの大きな部分 がＲＥＶに対するリンパ球の器官−特異的な結合により指図されていることは、 多くの証拠により示されている［Ｂｕｔｃｈｅｒ　（１９８６）、　ｆ起］。作 用上、ＨＥＶとの器官−選択的相互作用の基礎となっているリンパ球−関連分子 は「回帰レセプター」と称され、一方で同種の内皮分子はｒＨＥＶリガンド」と して知られている［Ｇａ１ｌａｔｉｎら（１９８６）、上ｉｉｄ；　Ｒｏｓｅｎ 、　Ｃｕｒｒ、０ｐｉｎ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　１．９１３　（１９８９）］ 。内皮性ＨＥＶリガンドは異なるリンパ系器官に対して特徴的であると仮定され ており、これらは各クラスのリンパ系器官に入るリンパ球数の調節を担っている ことが提唱されている［Ｂｕｔｃｈｅｒ、’Ａｍ、Ｊ、Ｐａｔｈｏ１．１３６． ３　（１９９０）］。リンパ球交通の基礎となっている詳細な分子機構の特徴付 けは科学的および臨床的な見地の両方から興味あるものであるが、これは正常お よび病原性の両形態の白血球炎症において同様の接着性の過程が関与しているか もしれないからである［Ｗａｔｓｏｎら、匣胆勘灸呻、　１６４−１６７　（１ ９９１）］。

回帰レセプターの中で、最も詳細に研究されているものは末梢リンパ節回帰レセ プター（ｐｎＨＲ）と最初に称されたレセプターである。このレセプターは、ネ ズミの系においてＭＥＬ−１４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）すなわち約９０ｋ Ｄの白血球表面抗原（ｇｐ９０ＭＥ’と称される）を認識することが見いだされ た抗体により最初に定義された［Ｇａ１ｌａｔｉｎら、　Ｎａｔｕｒｅ　３０３ ．３０　（１９８３）］。この抗体は、Ｓ　ｔａｍｐｅｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆイ ンビトロ接着試験において末梢および腸間膜リンパ節のＨＥＶに対するりニッパ 球の接着をブロックすることおよびインビボでリンパ節への移動を妨げることが 見いだされた。ｇｐ　９　Ｑ　Ｍ　ｔ　Ｌに対する回帰機能は、界面活性剤によ り可溶化された可溶性の組換え型のレセプターがＬＮ上のリンパ球に対する接着 部位を選択的にブロックすることができるがＰＰＨＥＶ上の接着部位をブロック すネズミおよびヒトｇｐ　９　Ｑ　Ｍ　ｔ　ＬレセプターをコードしているｃＤ ＮＡの分子クローニングにより、細胞外アミノ末端にカルシウム−型（Ｃ−型） レクチンドメインを有し、続いてＥＧＦモチーフ、補体結合活性を有するタンパ ク質において見いだされるモチーフに関連した２つの補体調節モチーフ、トラン スメンブラン・ドメインおよび短い細胞質ゾルの尾部を有するトランスメンブラ ンタンパク質が明ら２４５）、　７８　（１９８９）；共に出願中の出願番号３ １５．０１５（１９８９年２月２３日提出）；　ｔｏ　９１１０８２９ｇ（１９ ９１年６月１３日発行）］。

池の研究者らは好中球接着に関係する別の分子を同定した。内皮性白血球接着分 子ＥＬＡＭｉと称されるこの分子は誘導性接着分子であり、その役割は炎症部位 に隣接する細静脈内皮細胞への好中球の接着を媒介することであろうと提案血ｔ ］＼板のアルファ顆粒に含まれるタンパク質の研究により、さらに顆粒膜タンパ ク質−１４０（Ｇ〜ＩＰ−１４０）、血小板活性化依存性顆粒外膜タンパク質（ ＰＡＤＧＥＭ）またはＣＤ６２と様々に称される接着分子の発見が導かれた［Ｍ ｃＥｖｅｒアミノ酸配列の比較により、これらの３つの接着分子は非常に極だっ た注目に値する様式で関連していることが明らかになった。これらの共通のモザ イク構造はカルシウム依存性レクチンまたは炭水化物−結合モチーフ、上皮増殖 因子様（ＥＧＦ）モチーフ、および変動数の補体調節（ＣＲ）モチーフからなる 。これらのモチーフを順に結合することにより、ＬＥＣ−ＣＡＭ［レクチンＥｇ ｆ補体調節−細胞接着分子（Ｌｅｃｔｉｎ旦ｇｆ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｒｅ ｇｕｌａｔｏｒｙ−ＣｅｌｌΔｄｈｅｓｉＯｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅ）コという名 称が白血球内皮細胞接着分子のこの新しいファミリーに対して与えら；　Ｇｅｎ ｇら、換す圧灸柊ニア５７　（１９９０）］。

細胞接着分子のＬＥＣ−ＣＡＭまたはセレクチンのファミリーの３つの構成員は ・Ｌ−セレクチンし末梢リンパ節回帰レセプター（ｐｎＨＲ）、ＬＥＣ−ＣＡＭ −１、ＬＡＭ−１、ｇｐ９０ＭＥＬ、　ｇｐｌ　ＯＯ”’、ｇｐｌ、　１０”’ 、ＭＥＬ−１４抗原、Ｌｅｕ−８抗原、Ｔｏ−１抗原、ＤＲＥＧ抗原としても知 られる］、Ｅ−セレクチン（ＬＥＣ−ＣＡＭ−２、ＬＥＣＡＭ−２、ＥＬＡＭ− １）およびＰ−セレクチン（ＬＥＣ−ＣＡＭ−３、ＬＥＣＡＭ−３、ＧＭＰ−１ ４０、ＰＡＤＧＥＭ）である。

これらのレセプターを以下において「セレクチン」と称する。セレクチンファミ リー構成員およびそれらをコードしている遺伝子の構造は図１および２にそれぞ れ示す。単純な単糖、例えばマンノース−６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ）およびフ ルクトース−１−ホスフェートが不ズミおよびヒトリンパ球の末梢リンパ節（ｐ ｉｎ）Ｈ水化物を基本とするものであることが示された。一連の実験において、 ＲｏｓｅｎらはｐｌｎＨＥ　Ｖに対するリンパ球の回帰レセプター依存性結合が 広スペクトルのンアリダーゼによるインビトロまたはインビボ処理のどちらかに より完全に破壊さ選択的に除去するから、これらの結果はシアル酸が認識に対す る重要な成分であることを強く示唆した。

続いてＬ−セレクチンにより認識される内皮性分子の性質が、ヒトＩｇＧ１重鎖 のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に結合させたし一セレクチンの細胞外ドメイ ンからなる独特の組換えキメラを用いて精査された［キメラについてはＷＯ９１ １０８２９ｇ（１９９１年６月１３日発行）およびリンパ節高内皮細静脈の接着 性リガンドに対するプローブとしてのその使用についてはＷａｔｓｏｎら、　Ｊ 、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１１０．２２２１　（１９９０）を参照］。このいわ ゆるレセプター−免疫グロブリンキメラを用いた最初の実験により、このキメラ が末梢および腸間膜リンパ節−特異的ＲＥＶリガンドに接着し得ることが細胞ブ ロックおよび免疫組織化学の実験において示されたｆｆａｔｓ。

ｎら（１９９０）、　ｆ起］。このＲＥＶリガンドの免疫組織化学的な認識はシ アリダーゼによるリンパ節切片の処理により完全に破壊され、これにより、Ｌ− セレクチンにより認識される炭水化物の構成成分はシアル酸様のものであること が示され、さらにＬ−セレクチン介在性接着におけるレクチンドメインの重要性 が強調された［Ｒｏｓｅｎら、　５ｃｉｅｎｃｅ　（Ｗａｓｈ、Ｄ、Ｃ，）　２ ２８．　１００５−１００７　（１９８５）；　Ｒｏｓｅｎら（１９８X）、上 起およびＴｒｕｅら、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、旦、　２７５７−２７６４　 （１９９０月。これらの結果により、Ｌ−セレクチンー免疫グロブリンキメラの ｐｌｎＨＥ　Ｖリガンドに対する特異性が示され、このリガンドが回帰レセプタ ー−介在性細胞接着に必須の炭水化物残基を表わすことが確かめられた。

最近の一連の文献により、Ｅ−セレクチンリガンドも炭水化物の特性を有するこ とが確認された。広範囲の研究方法を採用しているいくつかの実験室で、Ｅ−セ レクチンリガンドはシアリルＬｅｖｉｓ”（ｓＬｅｘ）として知られている炭水 化物またはＣＤ６５もしくはＶＩＭ−２［ＮｅｕＡｃａ２−３０ａｌｂｌ−４（ Ｆｕｃａｌ−３）ＧｌｃＮＡｃｂｌｌとして知られている密接に関連した構造で あることが結論付けられた。

Ｌ　ｏｗｅら［Ｃｅ１ｌ　６３．４７５　（１９９０）］は非骨髄細胞をａｌ、 ３／４フコノルトランスフエラーゼでトランスフェクノヨンしてＥ−セレクチン に対するリガンド活性を生じさせたが、これは５ｌｅｘ決定基の発現と相関して いた。Ｇｏｅｌｔｚら［Ｃｅ１ｌ　６３　（６）。

１３４９　（１９９０）］は、骨髄細胞中の実際のＥＬＡＭ−１リガンド合成に 関与していると思われるａｌ、３フコンルトランスフエラーゼを同定しクローン 化した。より直接的な研究方法を用いて、ｐｈｉｌｌｉｐｓら［該Ｍ迎３卑（４ ９８４）、　１１３０　（１９９０）］およびＷａｌｚら［５ｃｉｅｎｃｅ　２ ５０（４９８４）、　１１３２　（１９９０）］は５ｌｅｘ−含有糖コンンユゲ ートまたは５ｌｅｘに対する抗体のどちらかによるＥ−セレクチン依存性接着の 阻害を示すことができた。リガンド活性におけるシアル酸およびフコース部分両 方の重要な関与がこれらの実験において示された。最終的にＴ　ｉｅｍｅｙｅｒ ら［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄクノヨンした細胞に対してリガンド活性 を有するい（っかの骨髄−由来の糖脂質を精製した。精製されたＥ−セレクチン 結合糖脂質の質量分光分析により、活性に必要な最小構造はＮ−アセチルグルコ サミン上に８１，３−結合したフコースを含有している第二の内部Ｎ−アセチル ラクトサミン単位を有するシリル化ラクトサミン（ＣＤ６５）であることが明ら かになった。５ｌｅｘ決定基の場合と同様に、シアル酸およびフコースの両方が 推定リガンドの結合活性に対して必須であった。

また、Ｐ−セレクチンに対するリガンドの同定においても進展があった。Ｌａｒ ｓｅｎら［Ｃｅ１ｌ　６３．４６７　（１９９０）］は、骨髄細胞上のＰ−セレ クチンリガンドの重要な成分としてＬｅｘ決定基［Ｇａ１ｂｌ−４（ａｌ−３Ｆ ｕｃ）ＧｌｃＮＡｃｌを示唆している。

しかし、シアル酸も完全なリガンド活性に対して、おそら＜ａ２，３結合におい て−セレクチンに対するリガントと同じであるかまたは非常に似ている可能性が あるが、これは特に両セレクチンが非常に似た範囲の細胞種に結合するからであ る［Ｐｏ１ｌｅｙら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８８． 　６２２４　（１９９１）コ。

セレクチン構造における著しい相同性ならびに既に示されたリガンドにおける類 似性により、これらリガンドは関連しているが微妙に異なる構造を有するものと 示唆される。

本発明の目的は、セレクチンリガンドを精製するための方法を提供することであ る。

本発明の別の目的は、精製されたセレクチン、特にＬ−セレクチンのリガンドを 提供することである。

本発明のさらに別の目的は、セレクチン糖タンパク質リガンドをコードしている 核酸１列を提供することで−ある。

他の目的は、セレクチンリガンドのアミノ酸配列を決定すること、およびこれら リガンド上の（Ｏ−およびＮ−結合性）グリコジル化部位を同定することである 。

さらに他の目的は、天然には見られないセレクチンリガンドのアミノ酸配列およ び／またはグリコジル化変異体の製造を可能にすることである。

さらに別の態様において本発明は、炭水化物を基本とするセレクチンリガンドの 決定基に類似したセレクチン阻害物質を設計する方法を提供する。

本発明のこれらおよび他の目的は当業者には明らかであろう。

発明の要旨 ＨＥＶ−関連リガントについての本発明者らの最初の分析は、ＨＥＶ代謝の独特 の態様を利用するものであった。Ａ　ｎｄｒｅｗｓらによる初期の研究［Ｊ、Ｃ ｅ１ｌ　Ｓｃｉ、　５中に取り込むという点において特徴的であることが示され た。ゆえに、本発明者らは器官培養において３５Ｓ−硫酸塩でラベルされたリン パ節から無機硫酸塩−ラベル化物質を沈殿させるし一セレクチンー１ｇＧキメラ の能力を分析した。顕著な５０ｋＤ成分および比較的弱い９０ｋＤ分子（Ｓｇｐ ５０およびＳｇｐ”）がリンパ節から沈殿したが、これらは試験した他のどの器 官においても存在しなかった。Ｌ−セレクチンー１ｇＧキメラを用いたこれらの 成分の沈殿はカルシウム−依存性であり、ＭＥＬ−１４ｍＡｂおよび特異的な炭 水化物の両方に感受性であることが示された。この反応は、硫酸塩−ラベル化タ ンパク質のシアリダーゼによる処理または炭水化物ポリマーであるフコイジンを 反応中に含めることにより完全に阻害することができた。最終的に、ｐｌｎＨＥ 　Ｖのいわゆる「血管性アドレシンス（ａｄｄｒｅｓｓｉｎｓ）Ｊと選択的に反 応してリンノ（球に対する接着をプロ・ツクするＭＥＣＡ−７９と称するモノク ローナル抗体が両成分を沈殿させた。予備的な生化学的分析により、〜５ＱｋＤ および〜９ＱｋＤのＬ−セレクチンリガンドはトリプシンー感受性の糖夕〉バク 質であり、主に〇−結合性の鎖を含んでいることが明らかになった［Ｉｍａｉら 、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１１３．１２１３　（１９９１）を参照］。〇 −結合性鎖の発見は、〇−結合性領域が細胞表面糖タンパク質を非常に拡張され た堅い構造にし［Ｊｅｎｔ。

ｆｔら、　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｓｃｉ、　１５．２９１　（ １９９０）コ、従って認識機能を発揮するためにそれを理想的に配置することが 明らかであるので重要である。フコース、硫酸塩および／アル酸がこれらの分子 の〇−結合性鎖において見られ、フコースはシアル酸と同様に完全なリガンド活 性にとって必要であると考えられている。

Ｌ−セレクチンにより認識される内皮性リガンドの性質をさらに特徴付けるため に、本発明者らは硫酸化した〜５０ｋＤ　ＨＥＶ糖タンパク質をＬ−セレクチン ーＩｇＧキメラを用いてアフィニティー精製するという新規な研究方法を採用し た。精製した糖タンパク質をＮ末端アミノ酸配列決定法に供し、この配列情報を 利用してこのし一セレクチンリガンドのタンパク質成分をコードしているｃＤＮ Ａをクローン化した。このｃＤＮＡは、Ｌ−セレクチンのレクチンドメインに炭 水化物を提供する足場として機能するらしい〇−結合に富む仏チン様）新規な糖 タンパク質をコードすることが見いだされた。実験の詳細ならびにこの発見およ びその説明は実施例中に提供する。

本発明は、セレクチンリガンドをコードしているヌクレオチド配列を含む単離さ れた核酸分子に関する。

好ましくは、該核酸分子は図４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコード しているヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列か らなる。

別の態様において、該核酸分子は図４に示すアミノ酸配列と約４０％より大きい 相同性を有するアミノ酸配列を有するセレクチンリガンドタンパク質をコードし ているヌクレオチド配列からなる。

さらに別の態様において、該核酸分子は以下の（ａ）〜（Ｃ）からなる群から選 択される。

（ａ）天然のセレクチンリカンド遺伝子のコード化領域由来のヌクレオチド配列 を有しているｃＤＮＡクローン； （ｔ＋）　（ａ）のクローンに低ストリンジエンシー条件下でノ翫イブリダイズ し得るＤＮＡ配列、および （Ｃ）セレクチン分子の天然に存在するりガントの生物学的性質を有する糖タン パク質をコードする（ａ）および（ｂ）の任意のＤＮＡ配列の遺伝的変異体。

さらに本発明の核酸分子は免疫グロブリン定常ドメインをコードしているヌクレ オチド配列を含んでいてよい。

別の態様において本発明は、発現媒体であって、該媒体で形質転換された宿主細 胞により認識される制御配列に機能的に結合されたセレクチンリガンド、好まし くはＬ−セレクチンリガンドをコードしているヌクレオチド配列を含む発現媒体 に関する。

また別の態様において、本発明は上記の発現媒体で形質転換された宿主細胞およ び該形質転換宿主細胞を培養してセレクチンリガンドを発現させる方法に関する 。

さらに別の態様において、本発明はセレクチン分子の天然に存在するリガンドの 生物学的性質を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関する。

該ポリペプチドは内皮細胞表面積タンパク質の細胞外領域を含んでいてよい。別 の態様において、該ポリペプチドはＳｇｐ５０またはＳｇｐ９０である。

本発明のポリペプチドは、好ましくはセレクチンー結合部分をそのレセプターに 供することが可能な立体構造を有するアミノ酸配列を含む。

特定の態様において、前述のポリペプチドは図４に示すアミノ酸配列を有するタ ンパク質をコードしているヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズし得る核 酸によりコードされるアミノ酸配列を含む。

さらに特定の態様において、上記のポリペプチドは同じ動物種の天然に存在する 他のタンパク質を実質的に含まない天然のセレクチンリガンドである。

さらに別の態様において、本発明は上に定義したポリペプチドであって、さらに 免疫グロブリン定常ドメイン配列を含むポリペプチドに関する。

他の態様において本発明は、上に定義したポリペプチド（糖タンパク質セレクチ ンリガンド）を、対応するセレクチンレセブターのその天然りガントに対する結 合を有効にブロックする量で非毒性の薬学的に許容し得る賦形剤と共に含む組成 物に関する。

別の態様において、本発明は循環白血球の内皮細胞への過剰な結合と関連した徴 候または症状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、循 環白血球上のＬ−セレクチンレセブターのその内皮リガンドに対する結合をブロ ックするに有効な量で上に定義したポリペプチドを投与することからなる方法に 関する。

また別の態様において、本発明はセレクチンリガンドのタンパク質部分に対して 免疫反応性の抗体に関する。好ましい抗体は各々のセレクチンリガンドと結合す るが、他の任意の既知のりガントとは実質的に交差−反応せず、セレクチンリカ ンドのそのレセプターに対する結合を妨げるであろう。抗−セレクチンリガンド 抗体は固定化することができ、この形態では、例えば本発明のセレクチンリガン トの検出または精製に有用である。

さらに別の態様において、本発明は以下の方法からなるセレクチンリガンドの存 在を測定するための方法に関する。

ａ）セレクチンリガンドをコードしている核酸または該核酸の相補鎖を核酸の試 験サンプルにハイブリダイズさせるか、またはｂ）セレクチンリガンドをコード している核酸に基づくプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、そして Ｃ）セレクチンリガンドの存在を測定する。

さらに別の態様において、本発明はセレクチンリガンドを精製するための方法で あって、対応するセレク千ンおよび免疫グロブリン重鎮配列を含むキメラに該リ ガンドを吸収させることからなる方法を提供する。

さらに本発明はセレクチンー結合部分を対応するセレクチンに供する方法であっ て、セレクチンリガンド糖タンパク賃のタンパク質コアに該部分を結合させるこ とによる方法に関する。

図面の簡単な説明 図１は、ｃＤＮＡクローニングにより決定されたセレクチン（ＬＥＣ−ＣＡＭ） ファミリー構成員の構造を示す。示したのはＬ−セレクチン、Ｅ−セレクチンお よびＰ−セレクチンの構造である。レクチン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、および 多重性短共通反ｉ１（＋ｎｕｌｔｉｐｌｅ　５ｈｏｒｔ　ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　 ｒｅｐｅａｔｓＸＳ　ＣＲｓ）を、Ｊ　ｏｈｎｓｔｏｎら［Ｃｅ１ｌ　５６．１ ０３３　（１９８９）２により最初にＧＭＰ−１４０について提示された仮定的 なジスルフィド結合と共に示す。また、Ｎ末端配列（後に成熟タンパク質におい て切断される）を疎水性トランスメンプラン・スパニング・アンカー（ＴＭ）お よび細胞質尾部と共に示す。またＰ−セレクチンの他の２つの形態を示すが、一 方はｓｃｒ　−７ドメインを欠失し、もう一方はメンプラン・スパニング・アン カーを欠失している。

図２はセレクチンファミリーの構成員をコードしている遺伝子の構造を示す。

ヒトおよびネズミのし一セレクチン、ヒトＥ−セレクチンおよびヒトＰ−セレク チンをコードしているケノム構造を示す。黒い箱は様々な構造のモチーフをコー ドするエキソン、例えばネズミ遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）、シグナル配列（ ＳＳ）、レクチン（ＬＥＣ）、上皮増殖因子（Ｅ）、短共通反復（ＳＣＲ）、ト ランスメンプラン・アンカー（ＴＭ）および細胞質ドメイン（ＣＤ）、およびこ れらのタン／＜り質コード化ドメインを隔てるイントロンをコードする介在領域 を示す。ヒトにおいては、３つ全てのセレクチン遺伝子は互いに染色体１の長ア ーム上の一部のタンパク質（その全てが異なる数の短いＳＣＲエキソンを含む） をコードしている遺伝子座の近（の２００キロ塩基以内にある。またネズミＬ− セレクチンはネズミ染色体１上であって、ヒト染色体１相同体において見い出さ れる領域と同調の領域中にコードされている。

図３Ａは〜５０ｋＤＬ−セレクチンリガンドの精製およびＮ末端アミノ酸配列を 示す。培養培地からのりガントの精製は後に添加した３５８−ラベル化リガンド によりモニターした。レーンＡ　開始培養培地。レーンＢ：クロロホルム、メタ ノール分配後の水層。レーンＣ：　ＬＥＣ−１ｇＧ結合物質であり、括弧で囲ん だ範囲を気相タンパク質配列決定のために切り出した。レーンＡ−Ｃはクマシー Ｒ−２５０て染色したＰｒｏＢ１ｏｔｔ膜である。レーンＤはレーンＣのオート ラノオグラフである。

図３Ｂ　Ｎ末端アミノ酸配列。

図３ＣＣ末端の２１のアミノ酸を回転（ｗｈｅｅｌ）プログラムにより分析した 。

このプログラムはへリックス領域の円筒部を見下ろしたものを表示し、ヘリック スの周りのアミノ酸残基を示す。非極性のアミノ酸は白抜きの囲みで示し、極性 のアミノ酸は陰をつけた囲みで示す。

図３Ｄ：Ａにおける推定アミノ酸配列から得たバイトロバシー・プロットを示す 。黒丸はセリンまたはトレオニン残基に対応し、白抜きの丸は可能性のある１個 のＮ−結合性グリコシル化部位のＡＳＮである。〜５０ｋＤリガンドの推定され たドメイン構造をシグナル配列（ＳＳ）、〇−結合性領域ＩおよびＩＩならびに Ｃ末端両親媒性ヘリックス領域と共に上に示す。

図４はＬ−セレクチンに対する内皮性リガンドのコアタンパク質のヌクレオチド およびコードされたアミノ酸配列を示す。陰を付けていない囲みは最初のメチオ ニンコドンの周りのＫ　ｏｚａｋ翻訳開始部位を示す。残基２０を起点とする点 線を下に付けたアミノ酸配列は、位置３４のＴ　ＨＲ（Ｎ末端配列ではＭＥ、Ｔ ）を除き、Ｌ−セレクチン精製リガンドのＮ末端配列決定により決定されたアミ ノ酸配列（図３Ｂ）に対応する。推定されたアミノ酸配列中のセリンおよびトレ オニン残基は陰をつけた囲み中に示す。

図５Ａおよび５Ｂは、Ｌ−セレクチン精製した〜５０ｋＤリガンドのペプチド抗 体による免疫沈降を示す。図５Ａおよび５Ｂの説明のための記号は以下の通りで ある・ Ｐ１＝免疫前ＣＡＭＯ１−ビーズ Ｐｓｌ−免疫前ＣＡＭＯ１−免疫沈降後に残った上清１１＝免疫ＣＡＭＯ１−ビ ーズ １２＝免疫ＣＡＭＯ２−ビーズ ＰＥＰ＝遊離のペプチド 図６〜５０ｋＤＬ−セレクチンリガンドをコードしているｍＲＮＡの発現のノー ザンプロット分析。Ａ：全体（ａ）またはポリＡ＋（ｂ、ｃ）ＲＮＡを正常（ａ 、　ｂ）または炎症を起こした（ｃ）末梢リンパ節から単離し、ホルムアルデヒ ドゲル上で泳動し、図４に示したｃＤＮＡを用いたノーザンプロット分析により 分析した。

Ｂ、ポリＡ十ＲＮＡをａ）上腕、ｂ）腋窩、ｃ）りび、ｄ）腋窩およびｅ）全末 梢リンパ節から単離し、Ａ、ＣおよびＤにおいて記述するようにノーザンプロッ トにおいてリガンドｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。ポリＡ＋ＲＮＡをａ）末 梢リンパ節、ｂ）肝臓、Ｃ）バイヤー斑、ｄ）胸腺、ｅ）骨格筋、ｆ）腸間膜リ ンパ節、ｇ）精巣、ｈ）肺、ｉ）心臓、ｊ）牌臓、ｋ）脳および１）腎臓から単 離し、ノーサンプロット上で（Ｃ）Ｌ−セレクチンリガンドに対応するｃＤＮＡ または（Ｄ）ニワトリβアクチンｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。

図７〜５０ｋＤＬ−セレクチンリガンドをコードしているｍＲＮＡの発現のその 場でのハイブリダイゼーション分析。末梢リンパ節切片をＬ−セレクチンリガン ドｃＤＮＡに対応しているアンチセンス（Ａ）またはセンス（Ｂ）ハイブリダイ ゼーションブローブのどちらかとハイブリダイズさせ、洗浄し、感光乳剤に６週 間感光させて現像した。ＲＥＶの形態は細静脈の周りの点線で示す。

図８二〜５０ｋＤセレクチンリガンド構造のモデル。末梢リンパ節ＲＥＶの管腔 表面上の〜５ＱｋＤＬ−セレクチンリガンドの構造についての１つの可能なモデ ルを示す。拡張されたブラン様の領域は、高度に０−グリコジル化された状態に おける〇−結合性領域ＩおよびＩＩに対応する。拡張が少ない領域はＮ末端およ び中央のセリン／トレオニンに乏しいドメインに対応する。このモデルにおいて 膠接着は、極性領域が互いに相互作用してオリゴマーを形成し、ヘリックスの非 極性面が脂質二重層と相互作用するような、Ｃ末端の両親媒性ヘリックス領域の オリゴマー化およびこれらの領域の膜への挿入により行われる。本明細書中に開 示するように、他の多数のモデルもまた等しく存在し得る。

発明の詳細な説明 「セレクチンリガンド」の用語およびその文法的な変化形は、セレクチン分子の 天然に存在するリガンドと共通する質的な生物学的性質を有するポリペプチドを 指すのに用いる。

本明細書中の「生物学的性質」は、セレクチン分子の天然に存在するリガンドま たはその任意の結果物により直接または間接的に発揮されるインビボでのエフェ クターまたは抗原性の機能または活性を意味する。エフェクター機能にはレセプ ター結合、あらゆる酵素活性または酵素変調活性、あらゆる担体結合活性、あら ゆるホルモン活性、細胞外マトリックスまたは細胞表面分子への細胞の接着を促 進または阻害するあらゆる活性、またはあらゆる構造的な役割が含まれる。抗原 性の機能とはセレクチン分子の天然に存在するりガントに対して生成させた抗体 と交差反応し得るエピトープまたは抗原性部位の保持を本質的に意味する。

「生物学的に活性な」セレクチンリガンドはセレクチン分子の天然に存在するり ガントのエフェクター機能を共有し、これはさらに抗原性機能を有することもあ るがその必要はない。

本発明の目的のために定義したセレクチンリガンドは、好ましくはセレクチンに 結合する質的な能力を有し、セレクチンのレクチンドメインにその炭水化物を供 することができる〇−結合に富むムチン型の棒状の構造を有する配列を含む。

さらに好ましい態様において、セレクチンリガンドは図４に示すアミノ酸配列を 有するタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の相補鎖と（低ストリンジ エンシー条件下で）ハイブリダイズし得るヌクレオチド配列によりコードされる アミノ酸配列を含む。

セレクチンリガンドのタンパク質コアのアミノ酸配列は、図４に示すアミノ酸配 列と好ましくは約４０％相同より大きく、より好ましくは約６０％相同より大き く、さらに好ましくは約７０％相同より大きく、またさらに好ましくは約８０％ 相同より大きく、そして最も好ましくは少なくとも約９０％相同である。

「相同」とは、配列を整列させて必要なら最大パーセントの相同を得るために間 隙を導入した後に図４に示すアミノ酸配列中の残基と同一の候補アミノ酸配列中 の残基の百分率と定義される。

「セレクチンリカンド」の用語は、セレクチン分子の天然に存在するリカンドが 保持する生物学的性質を質的に保有し、かつ好ましくはそれらのレセプターに結 合する質的な能力を有するならば、天然のセレクチンリガンドのアミノ酸および グリコジル化変異体ならびにその誘導体、例えば共有結合修飾により得られる誘 導体を特に包含する。

該用語は、安定な血漿タンパク質に融合させたセレクチンの天然に存在するリガ ンドと共通した生物学的性質を有するアミノ酸配列を含む糖タンパク質を特に包 含する。

「安定な血漿タンパク質」とは通常は約３０から約２０００残基を有するタンパ ク質てあり、その天然の環境において循環中の長い半減期、すなわち約２０時間 より大きな半減期を示すタンパク質である。適当かつ安定な血漿タンパク質の例 として免疫グロブリン、アルブミン、リポタンパク質、アポリポタンパク質およ びトランスフェリンが挙げられる。天然に存在するセレクチンリガンドと共通す る質的な生物学活性を有するアミノ酸配列は、通常Ｃ末端で安定な血漿タンパク 質配列、例えば免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。

「免疫グロブリン」の用語は通常軽鎖または重鎮を含むポリペプチドであって両 方が通常は天然の”）“′配置にジスルフィド結合されたものを示すが、それら の間の他の結合（それらの四量体または集合体を含む）は本発明の範囲内にある 。

免疫り七プリン（Ｉｇ）およびその特定の変異体は既知であり、多くは組換え細 胞培養において製造されている。例えば、米国特許４．７４５．０５５：ＥＰ２ ５６．６５４　；　Ｆａｕｌｋｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　２９８：２８６　（１ ９ｇ２）；　ＥＰ　１２０．６９４：　ＥＰ　１２５．０２３；　１ｌｏｒｒｉ ｓｏｎ、ＪAＩｍｍｕｎ。

１２３ニア９３　（１９７９）＋　ＫＱｈｌｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　１ ．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾７７：２１９７　（１９W０）；　Ｒａｓ。

ら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４１：２０７３　（１９８１）：　１ｉｏｒｒｉ ｓｏｎら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｌ、２：２３９　（P９８４） ；　１ｌｏｒｒｊｓｏｎ、５ｃｉｅｎｃｅ　２２９：１２０２　（１９８５）： 　１ｌｏｒｒｉｓｏｎら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　１．　`ｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ 針・６８５１　（１９８４）：　ＥＰ　２５５．６９４；　ＥＰ　２６６．６６ ３；および１０８８１０３５５９を参照。また、再・分類された免疫グロブリン 鎖が知られている。例えば、米国特許４，４４４．８７８；　ｆｏ　８ｇ１０３ ５６５：およびＥＰ　６８．７６３およびそれらの中で引用されている文献を参 照。

リガンド結合タンパク質−安定な血漿タンパク質キメラおよび特にＬ−セレクチ ンー免疫グロブリンキメラは、例えばＷｏ　９１１０８２９８（１９９１年６月 １３日発行）中に開示されている。本発明のキメラにおける免疫グロブリン部分 はＩｇＧ、、ＩｇＧ、、１ｇＧ３またはＩｇＧｓサブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、 ＩｇＤまたはＩｇＭから得ることができるが、ＩｇＧ、または１ｇＧ３が好まし い。

セレクチン、例えばＬ−セレクチンの結合は、Ｉｍａｉら［Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ ｏｌ、　１１３．１２１３　（１９９１）］により本質的に開示されているよう に、例えば放射ラベル化（例えば３５Ｓ−ラベル化）リガンドの固定化レセプタ ー−免疫グロブリンキメラに対する結合を可溶性の阻害物質の存在または不在下 で測定することによりアッセイすることがてきる。別法としてまたはさらに、各 々のレセプターを発現している細胞に対する接着を用いてリガンドの結合をアッ セイすることができる。例えば、ＥＬ−４細胞（ＡＴＣＣＴｌＢ５９）はその表 面に高レベルのし一セレクチンを発現することが知られており、ゆえにＬ−セレ クチンリガンドに対する細胞接着アッセイにおいて用いることができる。接着細 胞は乳酸デヒドロゲナーゼ活性により定量することができる［Ｂｒａｄｌｅｙら 、　Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　１０５．９９１　（１９８７）］。

「・・・をコードしている核酸分子」、「・・・をコードしているＤＮＡ配列ｊ および［・・・をコードしているＤＮＡＪの用語は、デオキシリボ核酸の鎖に１ ９つだデオキシリボヌクオチドの順序または配列を示す。これらのデオキシリボ ヌクオチドの順序によりポリペプチド鎖に沿ったアミノ酸の順序が決定される。

このようにしてＤＮＡ配列はアミノ酸配列をコードする。

核酸またはタンパク質と関連して用いる「単離された」という用語は、その天然 の供給源において通常伴なわれる少なくとも１つの汚染性核酸またはタンパク質 から同定および分離された核酸またはタンパク質を指す。単離された核酸または タンパク質は天然に見られるものとは異なる形または配置で存在する。しかし、 セルラチンリガンドをコードしている単離された核酸には、核酸が天然細胞の染 色体位置とは異なる位置にあるか、またはその他では天然に見られるＤＮＡ配列 とは異なる配列と境界を接しているセルラチンリガンドを通常発現している細胞 中の核酸が含まれる。

「低ストリンンエンンー条件」は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍ ＭＮａＣ］、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐ Ｈ７，６）、５　ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％硫酸デキストラン、および ２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、３７℃で一晩のイン キュベーションとその後の１ｘＳＳＣ中、約５０℃でのフィルターの洗浄をいう 。

（以下、余白） 核酸は、別の核酸配列と機能的な関係になるよう配置されているとき「機能的に 結合」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、も しそれがポリペプチドの分泌に関係するプレタンパク質として発現されるならポ リペプチドをコードしているＤＮＡに機能的に結合されており；プロモーターま たはエンハンサ−は、もしそれが配列の転写に影響を及ぼすならコード化配列に するように配置されるならコード化配列に機能的に結合されている。「機能的に 結合」とは、通常、結合されたＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合 には隣接しており読み取り相内にあることを意味する。しがし、エンハンサ−は 隣接している必要はない。結合は都合のよい制限部位での連結により行う。もし そのような部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたは リンカ−を常法に従い用いる。

「複製可能な発現媒体」および「発現媒体」の用語は、通常二本鎖の外来ＤＮＡ 片をその中に挿入することができるＤＮＡ片を示す。外来ＤＮＡは異種ＤＮＡと して定義され、これは宿主細胞中には天然には見られないＤＮＡである。この媒 体を用いて外来または異種ＤＮＡを適当な宿生細胞中に移入する。宿主細胞中で 媒体が宿主染色体Ｄ　Ｎ　Ａとは独立して複製することができたなら、媒体およ びその挿入された（外来）ＤＮＡのいくつかのコピーを生成することができる。

さらに、該媒体は外来ＤＮＡのポリペプチドへの翻訳を可能にする必要成分を含 む。、このようにして、外来ＤＮＡがコードする多くのポリペプチド分子を迅速 に合成することができる。

本発明の文脈において、「細胞」、「セルライン」および「細胞培養物」の表現 は交換可能に用いられ、このような表示の全ては子孫を含む。さらに全ての子孫 が意図的または偶然の突然変異により、ＤＮＡ内容において正確に同一ではない こともあることは理解されるであろう。元の形質転換細胞においてスクリーニン グしたときに同じ機能または生物学的性質を有する突然変異子孫が包含される。

「形質転換された宿主細胞」および「形質転換された」の用語は細胞へのＤＮＡ の導入を意味する。細胞は「宿生細胞」と称され、原核細胞または真核細胞であ ってよい。通常の原核宿主細胞には旦、９其の様々な株が含まれる。通常の真核 宿主細胞は哺乳動物、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞またはヒト胎児腎 臓２９３細胞である。導入されるＤＮＡは通常挿入されたＤＮＡ断片を含有する ベクターの形態にある。導入されるＤＮＡ配列は宿主細胞と同じ種からまたは宿 主細胞とは異なる種から得てよく、また、一部の外来ＤＮＡと一部の同族ＤＮＡ を含有しているハイブリッドＤＮＡ配列であってもよい。

「連結」は２つの核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成させる過 程を意味する。ＤＮＡフラグメントを共に連結するために、それらの末端は適合 性でなければならない。いくつかの場合において、末端はエンドヌクレアーゼ消 化の後に直接適合性となるであろう。しかし、エンドヌクレアーゼ消化の後に通 常生成する付着末端を最初に平滑末端に変換して連結用にそれらを適合性にする ことが必要になることもある。平滑末端にするために、ＤＮＡを適当な緩衝液中 、１５℃で少なくとも１５分間、約１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ フラグメントまたはＴ４ＤＮＡポリメラーゼを４つのデオキシリボヌクレオチド 三リン酸の存在下で用いて処理する。次いで該ＤＮＡをフェノール−クロロホル ム抽出およびエタノール沈殿により精製する。共に連結すべきＤＮＡフラグメン トを約等モル量で溶液に入れる。さらに該溶液は、ＡＴＰ、リガーゼ緩衝液、お よびＴ４ＤＮＡリガーセなどのりガーゼをＤＮＡ０．５μｇ当たり約１０単位で 含むであろう。ＤＮＡをベクター中に連結するときには、ベクターをまず適当な 制限エンドヌクレアーゼを用いて線状にする。次いで線状にされたフラグメント を細菌性アルカリホスファターゼまたは子ウシ腸ホスファターゼで処理して連結 工程中の自己一連結を防ぐ。

「アミノ酸」および「複数のアミノ酸」の用語は、天然に存在する全てのし一α −アミノ酸を意味する。この定義はノルロイノン、オルニチン、およびホモンス テインを含むことを意図している。アミノ酸は一文字または三文字表記のどちら かにより識別される。

Ａｓｐ　Ｄ　アスパラギン酸　ｌｉｅ　Ｉ　イソロイシンＴｈｒ　Ｔ　）レオニ ン　Ｌｅｕ　Ｌ　ロイノンＳｅｒ　Ｓ　セリン　Ｔｙｒ　Ｙ　チロシンＧｌｕ　 Ｅ　グルタミン酸　Ｐｈｅ　Ｆ　フェニルアラニンＰｒｏ　Ｐ　プロリン　Ｈｉ ｓ　ＨヒスチジンＧｕｙ　Ｇ　グリシン　Ｌｙｓ　Ｋ　リシンＡｌａ　Ａ　アラ ニン　Ａｒｇ　ＲアルギニンＣｙｓ　Ｃシスティン　Ｔｒｐ　Ｗ　）リブトファ ンＶａｌ　Ｖ　バリン　Ｇｉｎ　Ｑ　グルタミンＭｅｔ　Ｍ　メチオニン　Ａｓ ｎ　Ｎ　アスパラギン。

これらアミノ酸はその側鎖の化学的組成および性質により分類することができる 。これらは大きくは２つのグループ、荷電および非荷電のグループに分類される 。これらのグループの各々はアミノ酸をより正確に分類するためにサブグループ に分割される・ ■　荷電アミノ酸 酸性残基　アスパラギン酸、グルタミン酸塩基性残基・リシン、アルギニン、ヒ スチジンＩＩ　非荷電アミノ酸 親水性残基、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン脂肪族残基：グリ シン、アラニン、バリン、ロイノン、イソロイシン非極性残基、ンステイン、メ チオニン、プロリン芳香族残基：フェニルアラニン、チロノン、トリプトファン 。

「改変」、「アミノ酸配列の改変」、「変異体」および「アミノ酸配列変異体」 は、セルラチン、例えばＬ−セルラチンのリガンドの天然の配列と比較したとき にそのアミノ酸配列においていくらかの相違を有する分子を意味する。通常、変 異体は天然のセレクチンリカンドと少な（とも７０％の相同性を有するであろう が、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％の天然 セレクチンリガンドとの相同性を有するであろう。本発明の範囲内にあるアミノ 酸配列変異体は、天然セルクチンリガンドのアミノ酸配列内の特定の位置に置換 、欠失、および／または挿入を有する。置換による変異体は、天然の配列におい て少な（とも１個のアミノ酸残基が除去されて同じ位置に異なるアミノ酸が挿入 されたものである。置換は１個（分子中の唯一のアミノ酸が置換される）であっ てよく、また、多数（同じ分子中で２またはそれ以上のアミノ酸が置換される） であってもよい。

リガンドの性質における大きな変化は、電荷および／または構造において天然の アミノ酸とは有意に異なる側鎖を有するアミノ酸と置換することにより得ること がてきる。この型の置換はポリペプチドの背骨構造および／または置換領域にお ける分子の電荷または疎水性に影響を及ぼすことが予想されるであろう。

電荷および／または構造が天然分子と似ている側鎖を有するアミノ酸と置換する ことにより、リガンドの性質の穏やかな変化が予想される。保存的置換と称され るこの型の置換は、ポリペプチドの背骨構造または置換領域における分子の電荷 もしくは疎水性のどちらも大きく改変されることは予想されないであろう。

挿入変異体は、天然セルクチンリガンド配列中の特定位置のアミノ酸に直接隣接 して１またはそれ以上のアミノ酸が挿入された変異体である。アミノ酸に直接隣 接してとは、アミノ酸のα−カルボキシまたはα−７ミノ官能基のどちらかに結 合されることを意味する。その挿入は１またはそれ以上のアミノ酸であってよい 。通常、この挿入は１または２個の保存的アミノ酸からなるであろう。挿入部位 に隣接するアミノ酸に電荷および／または構造が似ているアミノ酸は保存的であ ると定義される。また、本発明は挿入部位に隣接するアミノ酸とは実質的に異な る電荷および／または構造を有するアミノ酸の挿入を包含する。

欠失変異体は、天然のセルクチンリガンドアミノ酸配列において１またはそれ以 上のアミノ酸が除去された変異体である。通常、欠失変異体は１または２個のア ミノ酸が分子の特定の領域において欠失されているであろう。

本発明のセルクチンリガンドのタンパク質コアの必須の役割は、セルクチンレセ プターにより認識される特異的な炭水化物構造を各々のレセプターに対して提供 することである。

従って、Ｌ−セルクチンリガンドアミノ酸配列の２つの高度にＯ−グルコシル化 された、セリンおよびトレオニンに富む領域（図４中のアミノ酸４２〜６３およ びアミノ酸９３〜１２２）内のあらゆる改変は、タンパク質の他の領域における 変化よりもリンパ球−高内皮細静脈相互作用に対して一層有意な効果を有するこ とが予想される。以下に示すように、高度Ｏ−グルコシル化領域は、セリンおよ びトレオニン残基に接着した多数の〇−結合性炭水化物リガントが白血球表面局 在化し一セレクチンのレクチンドメインに対して適切に提供されるのを可能にし 、これにより炭水化物依存性の接着相互作用を媒介する、堅い剛直な「瓶洗いブ ラシ」構造を得るのに必須である。これらの領域内の改変は、レセプター結合活 性が対応する天然リガンドのものとは有意に異なるであろう分子を与える結果に なることが予想される。

本発明の糖タンパク質リガンドには、フコース、／アル酸および陰イオン性成分 、好ましくは〇−結合性炭水化物成分として硫酸エステルが含まれ、そしてンア ル酸と同様にフコースおよび硫酸エステルが完全なりガント活性のために必要で あると考えられる。

本発明の糖タンパク質すカンドの具体的な炭水化物成分の例は以下のように表記 することができる。

ＮｅｕＮＡｃａ２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃａｌ−３）Ｇ１ｃＮＡｃＮｅｕＮ ＡｃＡ２−３Ｇａｌβ１−４Ｇ１ｃＮＡｃＢｌ−３ＧａｌＢ１−４（ＦｕｃＡｌ −４（ＦｕｃＡｌ−３）ＧｌｃＮＡｃｏ「ノーザンプロット分析」は、既知のプ ローブ、例えばオリゴヌクオチド、ＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡまたはそのフ ラグメント、またはＲＮＡフラグメント等にハイブリダイズするＲＮＡ配列を同 定するために用いられる方法である。、該プローブは３２ｐなどの放射性同位元 素を用いて、またはビオチン化により、または酵素を用いてラベルする。分析す べきＲＮＡは、当分野で周知の標準的な方法を用いて［例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ ａｎｕａｌ、　Ｎｅｗ　x ｏｒｋ：　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐ ｒｅｓｓ、　１９８９のセフ／３ン７．３９〜７．５２に開示されているように ］、通常アガロースまたはポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離し、 ニトロセルロース、ナイロン、または池の適当な膜に移し、プローブとハイブリ ダイズさせる。

「オリゴヌクレオチド」は、既知の方法により［例えばホスホトリエステル、亜 リン酸１．またはホスホルアミダイト化学、ＥＰ　２６６、０３２（１９８８年 ５月４日発行）に開示されているような固相法を用いて、またはＦｒｏｅｈｌｅ ｒら、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４．５３９９　（１９８６）によ り開示されているデオキシヌクレオシドＨ−ホスファネート中間体を経て］、化 学的に合成される短い一本または二本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。次 いてそれらをポリアクリルアミドゲルで精製する。

本明細書中で用いる「ポリメラーゼ連鎖反応」またはｒＰＣＲＪの方法は、通常 核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの微量の特定断片を、米国特許番号４．６８ ３．１９５（１９８７年７月２８日発行）およびＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃ ｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕ５ｕｂｅｌら編、Ｇ ｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅ ｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　１９９１．　Ｖｏｌ浮高■@２゜ Ｃｈａｐｔｅｒ　１５に記載されているように増幅させる方法を指す。

「形質転換」は、ＤＮＡが複製可能であるようにＤＮＡを染色体外成分としてま たは染色体組込みにより生物に導入することを意味する。

「トランスフェクション」は、任意のコード化配列が実際に発現されるか否かを 問わず宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。

「処置」、「処置する」の用語およびその文法的な変化形は最も広い意味で用い 、ある種の所望でない徴候または状態を予防および改善することを含む。

「気相微量配列決定」は以下の方法に基づいて行った。精製したタンパク質を、 １２０Ａ　ＰＴＨアミノ酸アナライザーを装着したモデル４７０　Ａ　Ａｐｐｌ ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ気相シークエンサー気相シークエンニーマン分解 により直接配列決定したか、または様々な化学物質または酵素を用いて消化した 後に配列決定した。

Ｃｈｒｏｍ　Ｐ　ｅｒｆｅｃｔデータシステム（Ｊｕｓｔｉｃｅ　Ｉｎｎｏｖａ ｔｉｏｎｓ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ）を用いてＰＴＨアミノ酸をまとめ た。配列の解釈はＶＡＸ　１１／　７８５　Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｅｑｕｉｐｍｅｎ ｔ　ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎコンピューターでＨｅｎｚｅｌら［Ｊ、Ｃｈｒｏｍ ａｔｏｇｒａｐｈｙ　４０４．４１　（１９８７）］の開示のように行った。い くつかの場合においては、ＨＰＬＣ分画の一部を５〜２０％ＳＤＳポリアクリル アミドゲル上で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（ＰｒｏＢｌｏｔｔ、　ＡＢｌ、　Ｆｏ ｓｔｅｒ　ＣＩｔｙ、　ＣＡ）に電気移動させてクーマシー・ブリリアント・ブ ルーで染色する［Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ、Ｐ、Ｊ、、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　 ２６２．１００３５　（１９８７）］。特定のタンパク質をＮ末端配列決定のた めにプロットから切り出した。内部タンパク質配列を決定するために、ＨＰＬＣ 分画を真空下で乾燥しく５ｐｅｅｄＶａｃ）、適当な緩衝液中に再懸濁し、臭化 シアン、リンンー特異的酵素Ｌｙｓ−Ｃ（ｆａｋｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｒ ｉｃｈｍｏｎｄ、　ＶＡ）またはＡｓｐ−Ｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　Ｉｎｄ、）で消化した。消化後、得 られたペプチドを混合物として配列決定するか、または０．１％ＴＦＡ中のプロ パツール勾配で展開した０４カラムのＨＰＬＣにより分離した後に上記のように 配列決定する。

本明細書中て用いる「モノクローナル抗体」は実質的に同種の抗体の群から得ら れる抗体を意味する。すなわち少量で存在することがある天然の可能な突然変異 体を除いて、群を構成している個々の抗体が同一である群から得られる抗体を示 す。ゆえに修飾語句「モノクローナル」は、別個の抗体の混合物ではないという 抗体の特徴を示す。

本発明の範囲内に含まれるモノクローナル抗体は、起源の種または免疫グロブリ ンのクラスもしくはサブクラス名称を問わず、抗−セルクチンリガンド抗体の可 変（超可変を含む）ドメインと定常ドメインのスプライスによって製造されるハ イブリッドおよび組換え抗体（例えば「ヒト化」抗体）を含み（その一方だけが セルクチンリガンドに対して指向性である）、軽鎖と重鎮または１つの種から得 た鎖と別の種から得た鎖のスプライスによる抗体、または異種タンパク質との融 合体、ならびに抗体フラグメント［例えば、Ｆａｂ、　Ｆ（ａｂ’）２およびＦ ｖ］を含む［Ｃａｂｉｌｔｙら、米国特許番号４．８１６．５６７：　Ｍａｇｅ 　＆　Ｌａｍｏｙｉ９Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃ ｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ中、　ｐ ｐ、　７９−９７　（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、@、　ＮｅＷＹ ｏｒ ｋ、　１９８７）］。

従って、修飾語句「モノクローナル」はそのような実質的に同種の抗体の群がら 得られる抗体の特徴を示すものであり、任意の特定方法による抗体の製造を必要 とすると解釈すべきではない。

セルクチンリガンドをコードしているＤＮＡは、セルクチンリガンドに対する。

ＲＮＡを保持し、かつそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から 調製される任意のｃＤＮＡライブラリーから入手することができる。ゆえにＬ− セルクチンリガンド遺伝子は、（腸間膜または末梢）リンパ節から調製されたＣ ＤＮＡライブラリーから得ることができる。他のセルクチンリガンドをコードし ている遺伝子は他のｃＤＮＡライブラリーから類似の方法で調製することができ る。

ライブラリーを、所望の遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を同定 するために設計されたプローブを用いてスクリーニングする。ｃＤＮＡ発現ライ ブラリーのための適当なプローブには、通常、所望のタンパク質を認識して特異 的に結合するモノおよびポリクローナル抗体、同一または異なる種由来のセルク チンリガンドｃＤＮＡの既知または推測の部分をコードする長さが約２０〜８０ 塩基のオリゴヌクレオチド；および／または同一もしくは類似の遺伝子をコート する相補的または相同のｃＤＮＡまたはそれらのフラグメントが含まれる。

セルクチンリガンド、例えばＬ−セルクチンリガンドをコードしている遺伝子を 単離するための別の手段は、Ｓ　ａｍｂｒｏｏｋら、上記のセクション１４また はＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ｌ１ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ ｌｏｇｙ、よ起のＣｈａｐｔｅｒ　ｌ　５中に開示されているようにポリメラー ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用するものである。

また別の方法は、所望のセルクチンリガンドをコードしている遺伝子をＥｎｇｅ ｌＳら［＾ｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ、Ｉｎｔ、Ｅｄ、Ｅｎｇｌ、　２８．７１６　（ １９８９）］が開示している方法のうちの１つを用いて化学的に合成するもので ある。これらの方法にはトリエステル、亜リン酸エステル、ホスホルアミダイト およびＨ−ホスホネート法、ＰＣＲおよび他の自動プライマー法、および固相支 持体上でのオリゴヌクレオチド合成が含まれる。これらの方法は遺伝子の全核酸 配列が既知であるかまたは暗号鎖に対して相補的な核酸の配列が利用可能である 場合に用いることができ、または別法では標的アミノ酸配列が既知であるならば 、各アミノ酸残基に対する既知のそして好ましい暗号残基を用いて可能性のある 核酸配列を推測することができる。

本発明の実施のために好ましい方法は、注意深く選択されたオリゴヌクレオチド 配列を用いて様々な組織、好ましくは哺乳動物リンパ節高内皮細静脈（Ｌ−セル クチンリガンド）、または骨髄細胞（Ｅ−セルクチンおよびＰ−セルクチンリガ ンド）由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするものである。好ましい 哺乳動物の中には、ヒトおよび次の順の構成員が含まれる：ウシ、ヒツジ、ウマ 、ネズミおよび舊歯動物。

プローブとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、偽陽性が最小限になるよ う十分に明白な十分な長さのものであるべきである。実際のヌクレオチド配列は 、通常セルクチンリガンド（例えばＬ−セルクチンリガンド）の保存的または高 度に相同なヌクレオチド配列または領域に基づいている。

上述の方法を用いるハイブリダイゼーションにより、図４に示すＤＮＡを用いて 他のセルクチンリガンドをコードしているＤＮＡを単離するかまたはＬ−セルク チンリガンドをコードしているＤＮＡを別の動物種から単離することができる。

好ましい動物は哺乳動物、特にヒト、ラン、ヒツジ、ウマ、ネコ、イヌおよび薩 歯動物であり、とりわけヒト、ラン、ラットおよびウサギである。

Ｂ、アミノ酸配列変異体の構築 本発明のセルクチンリガンドのアミノ酸配列変異体は、好ましくは野生型セルク チン、例えばＬ−セルクチンリガンドのタンパク質コアをコードするＤＮＡ配列 を突然変異させることにより構築する。通常、ＤＮＡの特定の領域または部位が 突然変異誘発の標的となり、ゆえにこれを行うのに用いられる常法は部位特異的 突然変異誘発と称される。突然変異はＤＮＡ修飾酵素、例えば制限エンドヌクア ーゼ（特定の位置でＤＮＡを切断する）、ヌクレアーゼ（ＤＮＡを分解する）お よび／またはポリメラーゼ（ＤＮＡを合成する）を用いて行う。

１、単純欠失および挿入 Ｓ　ａｍｂｒｏｏｋら（上記）のセクション１５．３に開示されているように、 ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化とそれに続（連結を欠失を生じさせるのに 用いることができる。この方法を使用するために、外来ＤＮＡをプラスミドベク ターに挿入するのが好ましい。外来（挿入された）ＤＮＡおよびベクターＤＮＡ の両方の開隔地図が利用可能でなければならないか、または、外来ＤＮＡおよび ベクターＤＮＡの配列が既知でなければならない。外来ＤＮＡはベクターには存 在しない独特の制限部位を有していなければならない。次いで適当な制限エンド ヌクレアーゼを用い酵素の製造者により示された条件下で、外来ＤＮＡにおいて これらの独特の制限部位の間でこれを消化することにより欠失を行う。用いられ る制限酵素が平滑末端または適合性末端を造るなら、Ｓ　ａｍｂｒｏｏｋら（上 記）のセクション１６８に開示されているように該末端をバクテリオファージＴ ４　ＤＮＡリカーセなとのりカー七を用いて混合物を１６℃て１〜４時間、ＡＴ Ｐおよびリガーゼ緩衝液の存在下てインキュベートすることにより共に直接連結 することができる。

該末端が適合性でないならば、それらをまずＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフ ラグメンｉ・またはバクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑に しなければならないが、その両方は消化されたＤＮＡの突出している一本鎖末端 を充填するために４つのデオキシリボヌクオチド三リン酸を必要とする。別法で は、該末端をヌクレアーゼ、例えばヌクレアーゼＳ１またはヤエナリヌクレアー ゼを用いて平滑化することができる（その両方はＤＮＡの突出している一本鎖を 短く切り込むことにより機能する）。次いで該ＤＮ、Ａをリガーゼを用いて再連 結する。得られる分子は欠失変異体である。

Ｓ　ａｍｂｒｏｏｋら（上記）のセクション１５．３に開示されているように類 似の方法を用いて挿入変異体を構築することができる。外来Ｄ　Ｉ　Ａの独特の 制限部位（複数の部位）ての消化の後に、オリゴヌクレオチドを外来ＤＮＡが切 断された部位に連結する。該オリゴヌクレオチドは挿入すべき所望のアミノ酸を コードするように設計され、さらに指向性の連結が可能となるように消化された 外来ＤＮＡ末端と適合性の５゛および３°末端を有する。

２　オリゴヌクレオチド−介在性突然変異誘発オリゴヌクレオチド−指向性突然 変異誘発は本発明の置換変異体を製造するための好ましい方法である。また、そ れを用いて本発明の欠失および挿入変異体を都合よく製造することができる。こ の方法はＡｄｅｌｍａｎら［ＤＮＡ、　？：１８３　（１９８３）］により開示 されているように当分野で周知である。

通常、少なくとも２５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを用いてｔ−Ｐ Ａ分子中の２またはそれ以上のヌクレオチドを挿入、欠失または置換する。最適 のオリゴヌクレオチドは、突然変異をコードしているヌクレオチドの両側に完全 に対合する１２〜１５のヌクレオチドを有するであろう。これによりオリゴヌク レオチドが一本鎖ＤＮＡ鋳型分子に正しくハイブリダイズすることが確実になる 。該オリゴヌクレオチドは、例えばＣｒｅａら［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　１．　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ、　７５：５７６５　（１９７８）］により開 示されているように当分野で周知の方法を用いて容易に合成される。

ＤＮＡ鋳型分子は、野生型のｃＤＮＡ　ｔ−ＰＡ挿入物を有するベクターの一本 鎖の形態である。一本鎖鋳型は、バクテリオファージＭ１３ベクター（市販品と して入手可能なＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９ベクターが適当である）ま たはＶｅｉｒａら［Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１５３：３　（１９８７） コにより開示されている一本鎖ファージ複製起点を含有するベクターのどちらか から得られるベクターによってのみ生成させることができる。従って、一本鎖の 鋳型を得るために、突然変異を起こすべきｃＤＮＡ　ｔＰＡをこれらのベクター の１つに挿入しなければならない。一本鎖鋳型の製造はＳ　ａｍｂｒｏｏｋら（ 上記）のセクション４，２１〜４．４１に開示されている。

天然のセルクチンリガンド配列に突然変異を起こさせるために、適当なハイブリ ダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡ鋳型分子にアニーレ ノウフラグメントを添加する。この酵素はオリゴヌクレオチドをプライマーとし て利用して突然変異含有ＤＮＡ鎖の合成を完了させる。ゆえに、一方のＤＮＡ鎖 がベクター中に挿入された天然のセルクチンリガンドをコードし、第二のＤＮＡ 鎖が同じベクター中に挿入されたセルクチンリガンドの突然変異形をコードする ようにヘテロ二本鎖分子が形成される。次いで、このヘテロ二本鎖を適当な宿生 細胞、通常はＥ、ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｍ　１０１などの原核生物中に導入する。細胞 を増殖させた後に、アガロースプレート上にプレートし、３２−Ｐで放射ラベル されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてスクリーニングしてタンパク質コ ア内において突然変異したセルクチンリガンドを含有するコロニーを同定する。

これらのコロニーを選択し、ＤＮＡを配列決定して、分子のタンパク質コア中の 突然変異の存在を確認する。

１を越えるアミノ酸が置換された突然変異体をいくつかの方法のうちの１つで得 ることができる。アミノ酸がポリペプチド鎖中において共に近接して位置してい るなら、所望のアミノ酸置換の全てをコードする１個のオリゴヌクレオチドを用 いて同時に突然変異させることができる。しかし、アミノ酸が互いに距離を置い て位置している（例えば、１０を越えるアミノ酸により分離されている）なら、 全ての所望の変化をコードする１個のオリゴヌクレオチドを得ることは比較的困 難である。その代わりに、２つの別法のうちの１つを用いることができる。第一 の方法においては、置換すべき各アミノ酸に対して別のオリゴヌクレオチドを生 成させる。次いでそのオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニーリ ングさせると、その鋳型から合成された第二のＤＮＡ　饋は全ての所望のアミノ 酸置換をコードするであろう。もう一つの方法は、所望の突然変異体を製造する ために２またはそれ以上の突然変異誘発の繰り返すことからなる。初回は１個の 突然変異について述べたものと同様である：天然のセルクチンリガンドのタンパ ク質コアをコードしているＤＮＡを鋳型として用い、最初の所望のアミノ酸置換 コードしているオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニーリングさせ、次いでヘテ ロ二本鎖ＤＮＡ分子を得る。二回目の突然変異誘発は初回の突然変異誘発におい て製造された突然変異されたＤＮＡを鋳型として用いる。ゆえに、この鋳型はす でに１またはそれ以上の突然変異を含んでいる。次いで、別の所望のアミノ酸置 換をコードしているオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニーリングさせると、こ の時に得られるＤＮＡ鎖は初回および二回目の突然変異誘発の両方がら生じた突 然変異をコードしている。この得られたＤＮＡを第三回目以降の突然変異誘発に おける鋳型として用いることができる。

３、ＰＣＲ突然変異誘発 さらにＰＣＲ突然変異誘発が本発明のセルクチンリガンドのアミノ酸変異体を製 造するのに適している。以下の記載はＤＮＡについて示すものであるが、本性は ＲＮＡにも適用できることは理解されるところである。通常ＰＣＲ法とは以下の 方法を意味する。ＰＣＨにおいて少量の鋳型ＤＮＡを出発物質として用いる場合 には、鋳型ＤＮＡ中の対応する領域とは配列が若干異なるプライマーを用いて、 プライマーが鋳型と異なっている位置でのみ鋳型配列と異なる比較的大量の特異 的なりＮＡフラグメントを得ることができる。突然変異をプラスミドＤＮＡ中に 導入するために、プライマーのうちの１つを突然変異の位置と重なりかつその突 然変異を含むように設計する。他のプライマーの配列はプラスミドの対立鎖の配 列の一部と同一でなければならないが、この配列はプラスミドＤＮＡに沿った任 意の場所に位置させることができる。しかし、最終的にプライマーにより囲まれ たＤＮＡの全増幅領域を容易に配列決定し得るように、その第二のプライマーの 配列は第一の配列から２００ヌクレオチド以内に位置させるのが好ましい。上記 の様にプライマ一対を用いるＰＣＲ増幅により、プライマーにより指定された突 然変異の位置において、また、鋳型のコピーはいくらか誤る傾向があるので他の 位置において異なるＤＮＡフラグメントの一部が得られる。

生成物質に対する鋳型の比率が非常に低いならば、生成物ＤＮＡフラグメントの 大部分が所望の突然変異を含む。この生成物質を用いて通常のＤＮＡ法によりＰ ＣＲ鋳型として働いたプラスミド中の対応する領域を置き換える。別々の位置に おける突然変異は、突然変異体である第二のプライマーを用いるか、または異な る変異体プライマーを用いて二回目のＰＣＲを行って２つの得られたＰＣＲフラ グメントを３部分（またはそれ以上）連結においてベクターフラグメントに同時 に連結することにより同時に導入することができる。

Ｃ０複製可能なベクターへのＤＮＡの挿入本発明の（天然または変異体）セルク チンリガンドをコードしているｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを、さらにクローニ ングまたは発現を行うために複製可能なベクターに挿入する。多くのベクターが 利用可能であり、適当なベクターの選択は、１）ＤＮＡ増幅（クローニング）に 用いるのかまたは発現のために用いるのか、２）ベクターに挿入すべきＤＮＡの サイズ、３）ベクターにより形質転換すべき宿主細胞に依存するであろう。各々 のベクターは、その機能および適合性である宿生細胞に依存する様々な成分を含 む。通常のベクター成分には、以下に示す１またはそれ以上の成分が含まれるが それらに限定はされない・ノブナル配列、複製起点、１またはそれ以上のマーカ ー遺伝子、エンハンサ−成分、プロモーターおよび転写終結配列。特定のベクタ ーを、適合性である宿主細胞と合わせて以下に記載する。

標準的な組換えＤＮＡ法を用いて加工なベクターを製造する。単離されたプラス ミドおよびＤＮＡフラグメントを切断、加工し、特定の順序で共に連結して所望 のベクターを得る。

適当な緩衝液中で適当な制限酵素または酵素群を用いてＤＮＡを切断する。通常 、約２０μｌの緩衝溶液中で約１〜２単位の適当な制限酵素と共に約０．２〜１ μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを使用する（適当な緩衝液、ＤＮＡ 濃度、およびインキュベーション時間および温度は制限酵素の製造者により特定 されている）。通常、インキュベーション時間は３７℃で約１または２時間で十 分であるが、いくつかの酵素はもっと高い温度を必要とする。インキュベーショ ン後に、フェノールおよびクロロホルムの混合液で消化溶液を抽出することによ り酵素および池の混入物質を除去し、エタノール沈殿によりＤＮＡを水性分画か ら回収する。

ＤＮＡフラグメントを共に連結して機能性ベクターを得るために、ＤＮＡフラグ メントの末端を互いに適合性にしなければならない。いくつかの場合において、 該末端はエンドヌクレアーゼ消化の後に直接適合性であろう。しかし、通常はエ ンドヌクレアーゼ消化により得られる付着末端を最初に変換して平滑末端として 連結のために適合性のものとする必要がある。末端を平滑化するために、該ＤＮ Ａを適当な緩衝液中、１５℃で少なくとも１５分間、４つのデオキシヌクレオチ ド三リン酸の存在下に１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメント （Ｋ　ｌｅｎｏｗ）で処理する。次いでフェノール−クロロホルム抽出およびエ タノール沈殿により精製する。

ＤＮＡゲル電気泳動を用いて、切断されたＤＮＡフラグメントをサイズ−分離し て選択することができる。該ＤＮＡをアガロースまたはポリアクリルアミドマト リックスのどちらかの中で電気泳動することができる。マトリックスの選択は分 離すべきＤＮＡフラグメントのサイズに依存するであろう。Ｓ　ａｗ＋ｂｒｏｏ ｋら（上記）のセクション６３０〜６．３３に開示されているように、電気泳動 後に、該ＤＮＡをマトリックスから電気溶離により抽出するか、または、低−融 解アガロースをマトリックスとして用いた場合には、アガロースを融解させてそ れからＤＮＡを抽出する。

共に連結すべきＤＮＡフラグメント（連結すべき各フラグメントの末端が適合性 となるよう適当な制限酵素で予め消化されている）を溶液中において約等モル量 で存在させる。また該溶液はＡＴＰ、リガーゼ緩衝液およびＴ４　ＤＮＡリガー ゼなどのりガーゼをＤＮＡ０．５μｇ当たり約１０単位で含むであろう。ＤＮＡ フラグメントをベクターに連結しようとするときには、該ベクターを最初に適当 な制限エンドヌクレアーゼで切断することにより線状にし、次いで細菌性アルカ リホスファターゼまたは子ウシ腸アルカリホスファターゼのどちらかでホスファ ターゼ処理する。これにより連結工程中のベクターの自己一連結を防ぐ。

連結後、挿入された外来遺伝子を含むベクターを適当な宿主細胞中に導入する。

形質転換された細胞を抗生物質、通常はテトラサイクリン（ｔｅｔ）またはアン ピシリン（ａｍｐ）上での増殖により選択するが、該細胞はそれらに対してベク ター上のｔｅｔおよび／またはａｍｐ耐性遺伝子の存在のために耐性となってい る。連結混合物が真核性宿主細胞に導入されたときには、形質転換された細胞を 上記のＤＨＦＲ／ＭＴＸ系により選択することができる。形質転換された細胞を 培養増殖させ、次いでプラスミドＤＮＡ（プラスミドは所望の外来遺伝子に連結 されたベクターを意味する）を単離する。次いでこのプラスミドＤＮＡを制限酵 素地図作成および／またはＤＮＡ配列決定により分析する。ＤＮＡ配列決定は、 通常、Ｍｅｓｓｉｎｇらの方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　９ ：３０９　（１９８１）］またはＭａｘａｍらの方法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　。

ｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６５：４９９　（１９８０）コのどちらかにより 行う。

（以下、余白） Ｄ　宿主細胞の選択および形質転換 本発明の糖タンパク質リガンドの炭水化物成分は、レセプターの認識およびレセ プター結合にとって必須である。従って、タンパク質をグリコジル化された形態 で発現する真核宿主細胞が本発明のリガンドの発現のために好ましい。しかし、 タンパク質をグリコジル化しない原核生物、例えばＥ、ｃｏｌｉにおける発現も また実行可能である。非グリコリル化タンパク質を後に例えば以下に詳述する化 学的および／または酵素的な方法によりグリコジル化することができる。

１、真核多細胞生物 多細胞生物は本発明を実施するための宿主として好ましい。無を推動物およびを 推動物細胞両方の培養が許容できるが、を推動物細胞の培養、とりわけ哺乳動物 の培養が好ましい。適当なセルラインの例には、ＳＶ４０により形質転換された サル腎臓ＣＶＩ株（ＣＯ３−７，ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５１）　；ヒト胎児腎臓 株２９３　Ｓ　［Ｇｒａｈａｍら、　Ｊ、ＧｅｎＪｉｒｏｌ、、　３６：５９　 （１９７７）］　；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＦＩＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ］０ ）：チャイニーズハムスター卵巣細胞［ＵｒｌａｂおよびＣｈａｓｉｎ、　Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ、　７７：４２１６　（１９８０） ］　ニアウスセルトリ細胞［７Ｍ４．　Ｍａｔｈｅｒ、　Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｒｏ ｄ、、　２３：２４３　（１９８０）］　：す／ＬＪ臓細胞（ＣＶＩ−７６、Ａ ＴＣＣＣＣＬ　７［１）ニア７１，１カミ）’！Ｊサル％ＦＩｌ細胞（ＶＥＲＯ −７６、ＡＴＣＣＣＲＬ（５８７）　；　ｌ：　ト頚癌細胞（ＨＥＬＡ、　ＡＴ ＣＣＣＣＬ　２）　；　イヌ％Ｆ臓細胞（ＭＤＣＫ、　ＡＴＣＣＣＣＬ　３４） 　；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ　３＾、ＡＴＣＣＣＲ：　１４４２） ：ヒト肺細胞（１１３ｇ、　ＡＴＣＣＣＣＬ　７５）　；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ 　Ｇ２．　■Ｂ　８０６５）　；マウス乳腫瘍細胞（ＭＭＴ　０６０５６２．Ａ ＴＣＣＣＣＬ　５１）　；ラット肝癌細胞［ＢＴＣｌＭｌ、５４．　Ｂａ＋ｍａ ｎｎら。

Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　８５：１　（１９８０）］　：およびＴＲＩ細胞 ［Ｍａｔｈｅｒら、＾ｎｎａｌｓ　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　３８３：４４　（１９８２）］が含まれる。これらの細胞の発現ベ クターには、通常（もし必要ならば）、複製起点、発現すべき遺伝子の前に位置 するプロモーター、リポソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル 化部位、および転写終結部位のためのＤＮＡ配列が含まれる。

哺乳動物の発現ベクターにおいて用いられるプロモーターはウィルス起源である ことが多い。これらのウィルス性プロモーターは通常ポリオーマウィルス、アデ ノウィルス２由来てあり、シミアン・ウィルス４０（ＳＶ４０）であることが最 も多い。ＳＶ４０ウィルスは初期および後期プロモーターと称される２つのプロ モーターを含む。これらの両プロモーターは、ウィルスの複製起点をも有する１ つのＤＮＡフラグメントとしてウィルスから容易に得られるから特に有用である ［Ｆｉｅｒｓら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７３：１１３　（１９７８）コ。また、 ＨｉｎｄＩＩＩ部位からウィルス複製起点中のＢｇｌＩ部位へと伸長する約２５ ０ｂｐの配列を含むならば、より小さいまたはより大きいＳＶ４０　ＤＮＡフラ グメントを用いることができる。

別法では、外来遺伝子と天然に結合されているプロモーター（相同なプロモータ ー）を、形質転換のために選択した宿生セルラインと適合性である場合に用いる ことができる。

複製起点を外性の供給源、例えばＳＶ４０または他のウィルス（例えばポリオー マ、アデノ、Ｖ　Ｓ　Ｖ、ＢＰＶ）から得てクローニングベクターに挿入するこ とができる。別法では、複製起点を宿主細胞染色体複製機構から得ることができ る。

外来遺伝子を含有しているベクターを宿主細胞染色体中に組込むときには、後者 が十分であることが多い。

十分な量のセルラチンリガンドを形質転換された細胞培養物から製造することが てきる。しかし、第二のＤＮＡコード化配列の使用により産生レベルを増すこと ができる。第二のコード化配列は通常、酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦ Ｒ）を含む。通常、野生型の形態のＤＨＦＲは化学物質メトトレキセート（ＭＴ Ｘ）により阻害される。細胞中のＤＨＦＲ発現のレベルは培養宿主細胞に添加さ れたＭＴＸの量に依存して変化するであろう。ＤＨＦＲを第二配列として特に有 用なものにする別の特徴は、これが形質転換された細胞を同定するための選択マ ーカーとし、て使用し得ることである。

ＤＨＦＨの２つの形態が第二の配列としての使用のために利用可能であり、それ らは野生型ＤＨＦＲおよびＭＴＸ−耐性ＤＨＦＲである。特定の宿主細胞中で用 いられるＤ　ＨＦ　Ｒの型は、宿主細胞がＤ　ＨＦ　Ｒ欠失であるか否か（それ が非常に低いレベルのＤＨＦＲを内性的に産生ずるか、または機能的なりＨＦＲ を全く産生じないか）に依存する。ＤＨＦＲ−欠失セルライン、例えばＵ　ｒｌ ａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ　［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 （ＵＳＡ）　７７：４２１６　（１９８０）］により開示されているＣＨＯセル ラインを野生型ＤＨＦＲコード化配列で形質転換する。形質転換後に、これらの ＤＨＦＲＨＦ上ルラインは機能的ＤＨＰＲを発現し、栄養分ヒボキサンチン、グ リノンおよびチミジンを欠く培養培地中で増殖させることができる。非形質転換 細胞はこの培地中では生存しないであろう。

ＤＨＦＲのＭＴＸ−耐性型は、ＭＴＸ感受性の機能的ＤＨＦＲの正常量を内性的 に生産する宿生細胞において、形質転換された宿主細胞を選択する手段として用 いることができる。ＣＨＯ−に１セルライン（ＡＴＣＣ番号ＣＬ６１）はこれら の特徴を有しており、ゆえにこの目的のための有用なセルラインである。ＭＴＸ の細胞培養培地への添加により、ＭＴＸ−耐性ＤＨＦＲをコードしているＤＮＡ で形質転換された細胞のみの増殖が可能となるであろう。非形質転換細胞はこの 培地中で生存することができないであろう。

本発明の変異体を製造するために用いられる哺乳動物の宿主細胞を種々の培地中 で培養することができる。市販品として入手可能な培地、例えばＨａｍ’５Ｆ１ ０　Ｃ５ｉｇｍａ）、最少必須培地（［ＭＥＭ］、　Ｓｉｇｍａ）、Ｐ　ＲＭ　 ｌ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベツコの改良イーグル培地（［ＤＭＥ Ｍ］、　Ｓｉｇｍａ）は宿主細胞の培養に適当である。これらの任意の培地には 必要に応じてホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランフェリ ンまたは上皮増殖因子等）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムお よびリン酸塩等）、緩衝液（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオシド（アデノシンおよび チミジン等）、抗生物質（ゲンタマイシン等）、微量元素（通常マイクロモル範 囲の最終濃度で存在する無機成分として定義される）、およびグルコースまたは 同等のエネルギー源を追加することができる。また、他のあらゆる必要な追加物 を当業者に既知の適当な濃度で含有させることができる。

２、真核微生物 多細胞性真核生物に加えて、真核微生物、例えば糸状菌または酵母が本発明の実 施に適している。５ａｃｃｈａｒｏｒｎｙｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは通 常のパン酵母が下等真核宿主微生物の中で最も一般的に用いられる。しかし、他 の数多くの属、種および株が一般に入手可能であり、本発明において有用である 。これらは、例えば、旦ｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ［ ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９０：１４０　（１９８１ ）；@ＥＰ１３９゜ ３８３（１９８５年５月２日発行）］；　Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（米 国４，９４３．５２９ＨＦｌｅｅｒら、よ起）、例えば、バ、　１ａｃｔｉｓ［ Ｍ１９８−３Ｃ，ＣＢ５６８３．　ＣＢ５４５７４：　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ ら、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ戟A。

７３７　（１９＆３）］、バ、　ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、 Ｋ、　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、バ■ ｖｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）；　Ｋ、　ｖａｌｔｉｉ（ＡＴ ＣＣ５６，５００）、バ、　ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（`ＴＣ Ｃ３５，９Ｑ５；　Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇら、よ起）、バ、　ｔｈｅｒｍｏ ｔｏｌｅｒａｎｓ、およびに、　ｍａｒｘｉａｎｕｓ；　ｙａｒｒｏｖｉａ［Ｅ Ｐ　４０２，２２６］；　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ［ＥＰ　１８３，０ ７０：　５ｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ轣AＪ、Ｂａ ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　２８：２６５−２７８　（１９８８）］：　 Ｃａｎｄｉｄａ；　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｉａmＥＰ　２４４゜ ２３４］；　Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ’ｃｒａｓｓａ［Ｃａ５ｅら、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７６：５２５９　（１９V９）］ ；　Ｓ　ｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、例えばＳｃｈｖａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　 ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ［ＥＰ　３９４．５３ｇ（１９９O年１ ０月３１日発行）］；および糸状菌、例えばＮｅｕｒｏｓｐｏｒａＳＰｅｎｉｃ ｉｌｌｉｕｍ、　Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ［１１０９１１００３５７（１９ ９１年１月１０日発行）］、およびＡ　ｓｐｅｒｇｉ　１１ｕｓ宿主、例えば■ ｎ１ｄｕｌａｎｓ［Ｂａ１ｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、 　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　、υ、２：２８４　（１９８R）；　Ｔｉ１ｂｕ ｒ ｎら、　Ｇｅｎｅ、　２６：２０５　（１９８３）ＨＹｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｌ！ＳＡ、８１：１４７０@（１９８ ４）］およびＡ、　ｎｉｇｅｒ［ＫｅｌｌｙおよびＨｙｎｅｓ、　ＥＭＢＯ、し 、　４：４７５　（１９８５）コである。

酵母ベクターにおける適当な促進配列には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ［ ）ｌｉｔｚｅｍａｎら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５５：２０７３　（ １９８０）］または他の解糖酵素［Ｈｅ５ｓら、Ｌ＾ｄｖ、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅ ｇ、、２：１４９　（１９６８）；　Ｈｏ１ｌａｎｄら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ、１７：４９００　（１X７８）］、 例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソ キナーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６− リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルヒン酸キナーゼ、 トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコ キナーゼに対するプロモーターが含まれる。適当な発現プラスミドの構築におい て、さらにこれらの遺伝子と結合されている終止配列を、発現が所望である配列 の３゛で発現ベクターに連結させてｍＲＮＡのポリアデニル化および終止をもた らす。増殖条件により転写が制御される付加的な利点を有する他のプロモーター は、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ１酸性ホスファターゼ、 窒素代謝に関連する分解酵素、および上記のグリセルアルデヒド−３−リン酸デ ヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素に対する プロモーター領域である。酵母−適合性プロモーター、複製起点および終止配列 を含有しているあらゆるプラスミドベクターが適当である。

３　原核細胞 原核生物は特に大量のＤＮＡの迅速な製造のために、部位指向性突然変異誘発の ために用いられる一本鎖ＤＮＡ鋳型の製造のために、多くの突然変異体を同時に スクリーニングするために、および得られた突然変異体のＤＮＡ配列決定のため に有用である。適当な原核宿主細胞には、且ｃｏｌｉＫ１２株２９４　（ＡＴＣ Ｃ番号３ＨＢ１０１、ＪＭｌｏｌ、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９、およ び他の多くの原核生物の種および属も同様に用いることができる。

また、原核生物はＤＮＡ配列発現のための宿主として用いることができる。上に 列記した旦、竺見株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ等のｂａｃｉｌｌｉ 、他の腸内細菌科例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたは Ｓ　ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓａｎｓ、および種々のＰ　ｓｅｕｄｏｍｏｎ ａＳＵ種の全てを宿主として用いることができる。

宿主細胞と適合性の種から得たレプリコンおよび制御配列を含有しているプラス ミドベクターをこれらの宿主と共に用いる。該ベクターは通常、複製部位、形質 転換された細胞において表現型選択をもたらすマーカー遺伝子、１またはそれ以 上のプロモーター、および外来ＤＮＡの挿入のためのいくつかの制限部位を含有 しているポリリンカー領域を有する。旦、９其の形質転換のために通常用いられ るプラスミドにはｐＢＲ３２２、ｐＵｃ１８、ｐＵｃ１９、ｐＵｃ１１８、ｐｕ ｃ１１９およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｍ　１３が含まれるが、これらの全ては Ｓ　ａｍｂｒｏｏｋら（上記）のセクション１１２〜１．２０中に開示されてい る。しかし、他の多（の適当なベクターも利用可能である。これらのベクターは アンピノリンおよび／またはテトラサイクリン耐性をコードしている遺伝子を含 み、この耐性によりこれらのベクターで形質転換された細胞のこれらの抗生物質 存在下での増殖が可能になる。

原核性ベクターにおいて最も一般的に用いられるプロモーターには、β−ラクタ ーセ系が含まれる。これらが最も一般的に用いられるが、他の微生物のプロモー ターも用いられており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細は公開されてい るので、当業者はそれらをプラスミドベクター中に機能的に連結することが可細 胞から通常分泌される多くの真核性タンパク質は、内因性のシグナル配列をアミ ノ酸配列の一部分として含む。この配列は、タンパク質を小胞体およびゴルン装 買を経て細胞から輸出させることを目的とする。シグナル配列は通常タンパク質 のアミノ末端に位置しており、約１３から約３６アミノ酸の範囲の長さである。

実際の配列はタンパク質問で異なるが、全ての既知の真核性シグナル配列は少な くとも１の正荷電された残基および１０〜１５アミノ酸の疎水性の高い部分（通 常ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリンおよびフェニルアラニンのアミノ 酸に富む）をシグナル配列の中央付近に含む。シグナル配列はタンパク質の分泌 された形態には通常存在しないが、これはシグナル配列がタンパク質の小胞体中 への移動の間に小胞体上に位置するシグナルペプチダーゼにより切断されるから である。シグナル配列がまだ結合しているタンパク質は、「プレータンパク質」 またはタンパク質の未成熟形と称されることが多い。

しかし、全ての分泌型タンパク質が切断されるアミノ末端シグナル配列を含むわ けではない。いくつかのタンパク質、例えばオボアルブミンはタンパク質の内部 領域に位置するシグナル配列を含む。この配列は移動中に通常切断されない。

シグナル配列をタンパク質に結合させることにより、通常細胞質中に見られるタ ンパク質を分泌の対象とすることができる。これはシグナル配列をコードしてい るＤＮＡをタンパク質をコードしているＤＮＡの５°末端に連結させて、次いで この融合タンパク質を適当な宿主細胞中で発現させることにより容易に行われる 。シグナル配列を有するタンパク質をコードしている任意の遺伝子由来の制限フ ラグメントとしてシグナル配列をコードしているＤＮＡを得ることができる。

ゆえに、原核生物、酵母および真核生物のシグナル配列を、本発明を実施するた めに使用される宿主細胞の型に応じて本発明において用いることができる。遺伝 子のノブナル配列部分をコードしているＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ を用いて切除し、次いで分泌させるべきタンパク質をコードしているＤＮＡに連 結する。

機能的なシグナル配列の選択には、シグナル配列の切断およびタンパク質の分泌 が起こるようにシグナル配列が宿生細胞のシグナルペブチダーゼにより認識され ることが必要とされる。いくつかの真核生物遺伝子、例えばヒト成長ホルモン、 プロインスリンおよびプロアルブミンのノブナル配列部分をコードしているＤＮ Ａおよびアミノ酸配列は既知であり［５ｔｒｙｅｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ、　Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ 　（１９８８）、　ｐ、７６９を参照コ、適当な真核宿主細胞中でシグナル配− ゼなどの酵母シグナル配列を用いて酵母宿主細胞からの分泌を指令することがで きる。例えばＬａｍＢまたはＯｍｐＦ　［Ｗｏｎｇら、　Ｇｅｎｅ　６８：１９ ３　（１９８８）］、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡまたはβ−ラクタマーゼをコードして いる遺伝子ならびに他の遺伝子から得た原核生物のシグナル配列を用いて、タン パク質を原核細胞から培養培地中に向けることができる。

分泌されるようにシグナル配列を含有する所望のタンパク質を得るための別の方 法は、シグナル配列をコードしているＤＮＡを化学的に合成するものである。

この方法では、選択されたシグナル配列をコードしているオリゴヌクレオチドの 両方の鎖を化学的に合成し、次いで互いにアニーリングさせて二本鎖を形成させ る。次いでこの二本鎖オリゴヌクレオチドをタンパク質をコードしているＤＮＡ の５°末端に連結させる。

次いでタンパク質をコードしているＤＮＡをそれに連結されたシグナル配列と共 に含有している構築物を適当な発現ベクターに連結させることができる。この発 現ベクターを適当な宿主細胞中に導入して所望のタンパク質を発現させて分泌補 乳動物の宿主細胞および固い細胞膜障壁を有していない他の宿主細胞の培養物は 通常、Ｇ　ｒａｈａｍおよびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　５２ ：５４６　（１９７８）］により初めに開示されＳ　ａｍｂｒｏｏｋら（上記） のセクション１６．３２〜１６３７に開示されたように修正されたリン酸カルシ ウム法を用いて形質転換させる。しかし、細胞中にＤＮＡを導入するための他の 方法、例えばポリブレン［ＫａｗａｉおよびＮ１５ｈｉｚａｖａ。

９８２）］、および核ヘノ直接マイクロインジェクション［Ｃａｐｅｃｃｈｉ、 　Ｃｅ１１．２２：４７９　（１９８０）］を用いてもよい。

酵母宿主細胞は通常、Ｈｉｎｎｅｎ［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、　７５：１９２９　（１９７８）］が開示しているようにポリエチレン グリコール法を用いて形質転換させる。

Ｆ、宿主細胞の培養 本発明のセルクチンリガンドを製造するために用いられる哺乳動物宿主細胞は様 々な培地中で培養することができる。市販品として入手可能な培地、例えばノー ムのＦ　１０　（Ｓｉｇｍａ）、最少必須培地（ＭＥＭＳＳｉｇｍａ）、ＲＰＭ Ｉ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、またはダルベツコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ 、　Ｓｉｇｍａ）がそのような宿主細胞を培養するのに適当である。さらに、Ｈ ａｍおよび萱ａｌｌａｃｅ、　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、　５＆　４４　（１９７９） 　；　Ｂａｒｎｅｓおよび５ａｔｏ、＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０２．２ ５５　（１９８０）；米国特許番号４．７６７゜７０４；　４，６５７．８６６ ：　４．９２７．７６２；または４．５６０．６５５：　ｔｏ　９０１０３４３ ０；　ｔｏ　８７１００１９T；米 国特許Ｒｅ、　３０．９８５に開示されているいずれかの培地を宿主細胞のため の培養培地として用いることができる。これら全ての培地には必要に応じてホル モンおよび／または他の増殖因子（例えばインスリン、トランフェリン、および ／または上皮増殖因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウ ム、およびリン酸塩）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばア デノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えばゲンタマイシンＴＭ）、微量元素 （通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物）、およびグルコース または同等のエネルギー源を追加することができる。さらに他のいずれかの必要 な追加物質を、当業者に既知であろう適当な濃度で含有させることができる。培 養条件、例えば温度、ｐＨ等は発現用に選択した宿主細胞について既に用いられ ている条件であり、当業者には明白であろう。

Ｇ　グリコノル化変異体 ポリペプチドのグリコジル化は通常Ｎ−結合性または〇−結合性のどちらがであ る。Ｎ−結合性とはアスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。

トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ〜セリンおよびアスパラギン〜ｘ−トレオ ニン（式中、Ｘはプロリンを除（任意のアミノ酸である）がアスパラギン側鎖へ の炭水化物部分の酵素的な結合のための認識配列である。〇−結合性グリコシル 化はＮ−アセチルカラクトサミン、ガラクトースまたはキノロースの糖のうちの １つのヒドロキシアミノ酸への結合を意味し、このアミノ酸は通常セリンまたは トレオニンであることがほとんどであるが５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒ ドロキシリジンも〇−結合性グリコシル化に関与することができる。

本発明のセルクチンリガンドは優勢な〇−結合性グリコシル化部位を特徴とする 。これらは、例えば該リガンドのアミノ酸配列への１またはそれ以上のセリンま たはトレオニン残基の付加またはこれらによる置換により修飾することができる 。容易にするために、改変は基本的にアミノ酸配列変異体について上述した方法 を用いてＤＮＡレベルでなされるのが普通である。

また、本発明のりガントへのグリコシドの化学的または酵素的な結合を用いて炭 水化物置換基の数または特性を修飾または増大させることができる。これらの方 法は〇−結合性（またはＮ−結合性）のグリコジル化を行い得るポリペプチドの 生成を必要としない点において有利である。用いられる結合様式により、糖を（ ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（Ｃ）遊離ヒド ロキシル基、例えばシスティンの遊離基、（ｄ）遊離スルフヒドリル基、例えば セリン、トレオニンまたはヒドロキシプロリンの遊離基、（ｅ）芳香族残基、例 えばフェニルアラニン、チロノン、またはトリプトファンの残基、または（ｆ） グルタミンのアミド基に結合させることができる。これらの方法はＷｏ　８？１ ０５３３０（１９８７年９月１１日発行）ならびにＡｐｌｉｎおよびｆｒｉｓｔ ｏｎ　［ＣＲＣＣｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　ｐｐ、　２５９ −３０６　（１９８１j］に 開示されている。

また、セルクチンリガンド上に存在する炭水化物部分を化学的または酵素的に除 去することができる。化学的な脱グリコリル化はトリフルオロメタンスルホン酸 または同等の化合物への暴露を必要とする。この処理により、結合している糖を 除く大部分または全部の糖の切断の結果が得られ、ポリペプチドは無傷のまま残 る。化学的な脱グリコ／ル化はＨａｋｉｍｕｄｄｉｎら［＾ｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２５９．５うに様々なエンドおよびエキソグリコンダ ーゼにより炭水化物部分を除去することができる。グリコジル化はＤｕｓｋｉｎ ら［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、　２５７．３１０５　（１９８２）］により開示 されているようにツニカマイノンにより抑制することができる。ツニカマイ／ン はタンパク質−Ｎ−グリコンダーゼ結合の形成をブロックする。

また、適当な宿主細胞を選択することにより本発明のセルクチンリガンドのグリ コノル化変異体を製造することができる。酵母は、例えば哺乳動物系のものとは 大きく異なるグリコジル化を導く。同様に、セルクチンリガンドの供給源とは異 なる種（例えばハムスター、ネズミ、昆虫、ブタ、ウシまたはヒツジ）または組 織（例えば肺、肝臓、リンパ球、間葉、上皮）に由来する哺乳動物細胞を、異な るグリコジル化（例えば高レベルのマンノースまたは異なる比率のマンノース、 フコース、シアル酸およびセルクチン結合に必須の他の糖により特徴付けられる ）を導く能力について常法によりスクリーニングする。

Ｈ１共有結合修飾 天然に存在するセルクチンリガンド分子または該分子と共通する生物学的性質を 有している配列の共有結合修飾は本発明の範囲内に含まれる。このような修飾は 、セルクチンリガンドタンパク質の標的化アミノ酸残基を、選択された側鎖また は末端残基と反応し得る有機誘導化剤と反応させることにより、または選択され た組換え宿主細胞において機能する翻訳後修飾の機構を利用することにより誘導 されるのが普通である。得られた共有結合誘導体は生物学的活性のために重要な 残基の同定を目的とするプログラムにおいて有用であり、セルクチンリガンドの イムノアッセイのために、または組換え糖タンパク質のイムノアフィニティー精 製のための抗−セルクチンリガンド抗体の製造のために有用である。例えば、ニ ンヒドリンとの反応後のタンパク質の生物学的活性の完全な不活性化は、少なく とも１個のアルギニルまたはリシル残基がその活性に必須であることを示すもの であり、その後に、選択された条件下で修飾された個々の残基を修飾されたアミ ノ酸残基を含むペプチドフラグメントの単離により同定する。そのような修飾は 当分野での通常の技術範囲内にあり、多くの実験を行うことな〈実施される。

二官能性物質による誘導化は、セルクチンリガンド糖タンパク質とポリペプチド との分子内集合体を製造するために、ならびにセルクチンリガンド糖タンパク質 をアッセイまたはアフィニティー精製において使用するための水不溶性支持体マ トリックスまたは表面に架橋するために有用である。さらに、鏡開架橋の研究に より高次構造に関する直接的な情報が得られるであろう。通常用いられる架橋剤 には１．１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒ ド、Ｎ−ヒドロキノスクシンイミドエステル、ホモ二価性イミドエステルおよび 二価性マレイミドが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］ ブロビオイミデート等の誘導化剤により、光の存在下で架橋を形成し得る光によ る活性化が可能な中間体が得られる。別法では、臭化シアン活性化炭水化物など の反応性の水不溶性マトリックスおよび米国特許番号３．９５９．６４２；　３ ．９６９．２８７．３．６９１゜０１６；　４．１９５．１２８；　４．２４７ ．６４２：　４．２２９．５３７；　４．０５５．６３５：および４．３３０． ４４０に開示■ れている系反応性基質をタンパク質の固定化および架橋に用いる。

ある種の鮒訳後修飾が、発現されたポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用 の結果生じる。グルタミニルおよびアスパルチル残基は翻訳後に脱アミド化され て対応するグルタミルおよびアスパルチル残基となることが多い。別法では、こ れらの残基を穏やかな酸性条件下で脱アミド化する。これらの残基のどちらの形 態も本発明の範囲内にある。

他の翻訳後修飾にはプロリンおよびリノンのヒドロキシル化、セリルまたはトレ オニル残基のヒドロキシル化のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチノ ン側鎖のα−アミン基のメチル化が含まれる［Ｔ、Ｅ、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　 Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　５ｔｕｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐ ｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、　ｊ　Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、　、　Ｓａｎ　Ｆ ｒａｎｃｉ唐モ潤A　ｐｐ、　７９ −８６　（１９８３）コ。

他の誘導体は非タンパク質性ポリマーに共有結合させた本発明の新規なペプチド からなる。通常この非タンパク質性ポリマーは親水性合成ポリマー、すなわち天 然には見いだされないポリマーである。しかし、天然に存在して組換えまたはイ ンビトロ法により製造されるポリマーは、天然から単離されるポリマーであるか ら有用である。親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールおよび ポリビニルピロリドンは本発明の範囲内にある。特に有用なポリマーはポリビニ ルアルキレンエーテル、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコ ールである。

セルクチンリガンドを様々な非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリ コール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキンアルキレンに米国特許番号 ４．６４０．８３５；　４．４９６．６８９：　４．３０１．１４４；　４．６ ７０．４１７；　４．７９１．１９２または４．１７９．R３７に 示されている方法て結合させることができる。

セルクチンリガンドを、例えばコアセルベーンコン法または界面ポリマー化によ り製造されたマイクロカプセル中、コロイド状薬物供給システム（例えば、リポ ソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ−粒子および ナノカプセル）中、またはマクロエマルジョン中に捕捉することができる。この ような方法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉ ｅｎｃｅｓ、　１６ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　０ｓｏｌ、@Ａ。

、編（１９８０）に開示されている。

■、セレクチンリガンドと安定な血漿タンパク質のキメラセレクチンリガンド配 列を上に定義した安定な血漿タンパク質配列に結合することができる。安定な血 漿タンパク質の配列は、例えば免疫グロブリン定常ドメイン配列であってよい。

得られる分子は通常セルクチンリカンドー免疫グロブリンキメラと称される。

好ましい態様においては、セルクチンに対する結合部位を含む配列のＣ末端を免 疫グロブリン（例えば免疫グロブリンＧＩ）のエフェクター機能を有している抗 体のＣ末端部分（具体的にはＦｃドメイン）のＮ末端に融合させる。全重鎮定常 領域をセルクチン結合部位を含有している配列に融合させることが可能である。

しかし、より好ましくは、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域（これはＩ ｇＧ　Ｆｃを化学的に定義するものであり；重鎖定常領域の最初の残基を１１４ としたときの残基２１６　［Ｋｏｂｅｔら、ヨ起］、または他の免疫グロブリン の類似の部位）を起点とする配列をこの融合において用いる。特に好ましい態様 においては、セルクチン結合部位を含有しているアミノ酸配列を、ＩｇＧ、、１ ｇＧ２またはＩｇＧ３重鎖のヒンジ領域およびＣ，２およびＣＨＩ３またはＣＨ Ｉ、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合させる。融合がなされる正確な 部位は重要ではな（、最適部位は通常の実験により決定することができる。

Ｊ　セルクチンリガンドの精製 セルクチンリガンドは組換え細胞培養物から既知の方法、例えば硫酸アンモニウ ムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフ ィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマ トグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーにより回収および精製すること ができる。本発明の範囲内にある他の既知の精製法は抗−セルクチンリガンド抗 体を用いた逆層ＨＰ　Ｌ　Ｃクロマトグラフィーを利用するものであり、これは 本発明のリカンドの精製に有用である。

特にＬ−セルクチンリガンドの精製のために開発されたとりわけ有利な精製法を 実施例１に記載する。この方法は、組換え法により製造された独特のセルクチン レセブターー免疫グロブリンキメラ（Ｌ−セルクチン−１ｇＧと称する）を利用 するものであり、この方法により対応する（スルフェート−ラベル化）リガンド を沈殿させることができる。

Ｋ、治療用組成物 本発明のセルクチンリカンドを用いて対応するセルクチンレセブターの天然りガ ントに対する結合をブロックすることができる。例えばＬ−セルクチンリガント は内皮細胞上の天然りガントに対する循環白血球上のし一セルクチンレセブター の結合を効果的にブロックする。この性質は循環白血球の内皮細胞に対する過剰 な結合と関係する徴候または症状、例えば慢性関節リウマチ、乾癖、多発性硬化 症等と関係する炎症を治療するのに有用である。

本発明のセルクチンリガンドを既知の方法に従い製剤化して薬学的に有用な組成 物を製造することができ、これにより該リガンドを薬学的に許容し得る担体と混 合する。適当な担体およびその配合は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒｍ ａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ〉口５ｔｈ　ｅｄ、、　１９８０．１ｉａ ｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　０ｓｌｏら編］に開示されている。通 常これらの組成物は該リガンドの有効量、例えば約０．５〜約１０ｍｇ／ｍｌの 量を、患者に対する効果的な投与に適当な薬学的に許容し得る組成物を製造する ための適当な量の担体と共に含むであろう。該リガンドは非経口的に、または有 効な形態で血流への放出を確保する他の方法により投与することができる。

本発明を実施するために用いられる該リガンドの臨床投与に特に適した組成物に は、無菌性水溶液または無菌性の水相可能な粉末、例えば凍結乾燥タンパク質が 含まれる。薬学的に許容し得る塩の適当量をさらに製剤中に用いて製剤を等張に するのが普通である。

本発明の薬学的な組成物の投与法および所望の薬物濃度は、予定した特定の使用 に依存して変化させることができる。

Ｋ、モノクローナル抗体 モノクローナル抗体は実質的に同種の抗体の一部、すなわち少量で存在すること がある可能な天然の突然変異体を除いて、その群を構成している個々の抗体が同 一である群から得られる。ゆえに、修飾語句「モノクローナル」は別個の抗体の 混合物ではないという抗体の性質を示す。

例えば本発明のモノクローナル抗体は最初にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉ ｎ［Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５　（］９７５）］により開示されたハイブリド ーマ法を用いて作成するかまたは組換えＤＮＡ法［Ｃａｂｊｌｌｙら、米国特許 番号４．８１６．５６７］により作成することができる。

ハイブリドーマ法においては、マウスまたは他の適当な宿主動物（例えばハムス ター）をセルクチンリカンドタンパク質を用いて皮下、腹腔内、または筋肉内経 路により免疫し、免疫に用いたタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産 生ずるかまたは産生させ得るリンパ球を誘導する。別法では、リンパ球をインビ トロで免疫することができる。次いで適当な融合剤、例えばポリエチレングリコ ールを用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を得る［Ｇ ｏｄｉｎｇ、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｐｒ１ｎｃｉ ｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、　ｐｐ、５９−１０R　（＾ｃａｄｅｍ ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８６）］。

このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、非融合の親骨髄腫細胞の増殖 または生存を阻害する１またはそれ以上の物質を好ましくは含む適当な培養培地 にまいて増殖させる。例えば、もし親骨髄腫細胞がヒポキサンチングアニンホス ホリボンルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）酵素を欠失してい るなら、ハイブリドーマのための培養培地は通常ヒポキサンチン、アミノプテリ ンおよび壬ミシンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質がＨＧＰＲＴ−欠失細胞 の増殖を妨げる。

好ましい骨髄腫細胞は、効率良く融合し、選択された抗体−産生細胞による安定 かつ高レベルの抗体の発現を支持し、モしてＨＡＴ培地等の培地に感受性の細胞 である。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞株はネズミ骨髄腫株であり、例えば ５ａｌｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｃｅ１ｌ　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　Ｃｅｎ ｔｅｒ　［Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａＵＳＡ］から入手可能 なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来する株およびＡｍｅｒｉ ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　［Ｒｏｃｋｖｉｌ ｌｅ、　ＭａｒｙｌａｎｄＵＳＡ］から入手可能な５Ｐ−２細胞である。さらに 、ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトへテロ骨髄腫細胞株がヒトモノクローナル抗体 の製造に対して開示されてハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地をＴＮＦ ＲＩに対して指向性のモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好まし くは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を 、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩ Ａ）または酵素−結合免疫吸収測定法（ＥＬＩ　ＳＡ）により測定する。

対応するりガントの結合に対するモノクローナル抗体の親和性は、例えばＭｕｎ ｓｏｎ　＆　Ｐｏ１ｌａｒｄ［＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０７：２２０　 （１９８０）］のスキャッチャード分析により測定することができる。

所望の特異性、親和性、および／または活性を有する抗体を産生ずるハイブリド ーマ細胞を同定した後に、そのクローンを限界希釈法によりサブクローン化して 常法により増殖させる。Ｇｏｄｉｎｇ、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏ ｄｉｅｓ：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、　ｐｐ、５９ −１０４　（＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８６）。この目的のために 適当な培養培地には、例えばダルベツコの改良イーグル培地またはＲＰＭＩ−１ ６４０培地が含まれる。さらに、このハイブリドーマ細胞をインビボで動物の腹 水腫瘍として増殖させることがてきる。

サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体を培養培地、腹水液、または 血清から通常の免疫グロブリン精製法、例えばプロティンへ−セファロース、ヒ ドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニ ティークロマトグラフィーにより適当に分離する。

（以下、余白） 本発明のモノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは常法を用いて（例えば、 ネズミ抗体の重鎮および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合し得るオリ ゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に単離され配列決定される。

本発明のハイブリドーマ細胞は該ＤＮＡの好ましい供給源として都合がよい。Ｄ ＮＡを単離したなら、発現ベクター中に配置することができ、次いでこれを他の 状態では免疫グロブリンタンパク質を製造しない宿主細胞、例えばサルＣＯ８細 胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞中にトラン スフエクンヨンして、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を行う。さ らに該ＤＮＡを、例えばヒト重鎮および軽鎖定常領域に対するコード化配列を相 同ペプチドに対するコード化配列の全てまたは一部を共有結合させることにより 修飾することができる。このようにして、本発明の抗−セルクチンリガンドモノ クローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を 製造する。

通常、このような非−免疫グロブリンポリペプチドを本発明の抗体の定常ドメイ ンの代わりに用いるか、またはそれらを本発明の抗体の１つの抗原−結合部位の 可変ドメインの代わりに用いて、セルクチンリガンドに対する特異性を有する１ つの抗原−結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう１つの抗原−結合 部位からなるキメラの二価の抗体を創製する。

さらに、キメラまたはハイブリッド抗体は合成タンパク質化学において既知の方 法、例えば架橋剤を必要とする方法を用いてインビトロで製造することができる 。例えば、ジスルフィド交換反応を用いるかまたはチオエーテル結合を形成させ ることによりイムノトキシンを構築することができる。この目的のための適当な 試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデー トが含まれる。

診断に応用するために、通常本発明の抗体を検出可能な部分でラベル化する。

検出可能な部分は直接的にまたは間接的に検出可能なシグナルを生成し得る任意 のものであってよい。例えば、検出可能な部分は放射性同位元素（例えば３Ｈ， １４Ｃ１！２ｐ、３５８または＋２Ｊ）、蛍光または化学発光化合物（例えばフ ルオロセインイソチオシアネート、ローダミンまたはルシフェリン）：放射性同 位元素ラベル（例えば＋２５１．３２ｐ、　＋４（：または３Ｈ）、または酵素 （例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはホースラディシ ュペルオキシダーゼ）であってよい。

抗体を検出可能な部分に個別に結合させるための当分野で既知のあらゆる方法を 用いることができるが、これには）ｌｕｎｔｅｒら［Ｎａｔｕｒｅ　１４４：９ ４５　（１９６２）コ；　Ｄａｖｉｄら［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３：１ ０１４　（１９７４）］；　Ｐａ１ｎら［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、　４ ０：２１９　（１９W１）］　：お よびＮｙｇｒｅｎ［Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　 ３０：４０７　（１９８２）コにより開示された方法が含まれる。

本発明の抗体は既知のアッセイ法、例えば競合的結合アッセイ、直接および間接 サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイにおいて用いることができる。

Ｚｏｌａ、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｍａｎｕａ ｌ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　ｐｐ、　１４７−１５W　（ＣＲＣＰｒｅ ｓｓ、　Ｉｎｃ、、　１９８７）。

競合的結合アッセイは、限定量の抗体との結合に対して試験サンプル分析物（セ ルクチンリガンド）と競合するラベル化標準（セルクチンリガンドであるかまた はその免疫学的に反応性の部分）の能力に依存する。試験サンプル中のセルクチ ンリカンド量は抗体に結合される標準の量と逆比例する。結合される標準の量の 測定を容易にするために抗体を通常競合の前または後に不溶化するが、これによ り抗体に結合された標準および分析物は未結合のままの標準および分析物から簡 便に分離することができる。

サンドイッチアッセイは２つの抗体の使用を含み、各々は検出すべきタンパク質 の異なる免疫原性の部分、またはエピトープに結合することができる。サンドイ ッチアッセイにおいては、試験サンプル分析物はまず固体支持体上に固定化され た抗体により結合され、その後に第二抗体が分析物に結合し、このようにして不 溶性の３部分後合体を形成する（Ｄａｖｉｄ　＆　Ｇｒｅｅｎ、米国特許番号４ ．３７６、１１０）。

該第二抗体は検出可能な部分でそれ自体ラベルする（直接サンドイッチアッセイ ）かまたは検出可能な部分でラベルされた抗−免疫グロブリン抗体を用いて測定 することができる（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセ イの１つの型はＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合の検出可能な部分は酵素で ある。

以下の限定のためのものではない実施例により本発明をさらに詳しく説明する。

ＴＩＴ　実施例 実施例Ｉ　Ｌ−セルクチンにより認識される内皮細胞上の表面糖タンパク質の同 定 この実施例により、組換えＬ−セルクチンが選択的にリンパ節由来の３５ＳＯイ 一ラベル化巨大分子に結合することを示す。具体的には、２つの硫酸化、フコン ル化および／アリル化糖タンパク質を同定した。

Ａ、ＵＳ−硫酸塩による器官の代謝ラベル化膓開膜または末梢（頚部、上腕、腋 窩）のリンパ節を８〜１６週齢の雌性ＩＣＲマウスから集めた。Ａｇｅｒ　［Ｊ 、Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、、　８７：１３３　（１９８７）］の方法に従い、リンパ 節をカミソリ刃を用いて切断して１ｍｌ１１厚さの薄片とし、この薄片（通常、 湿重量０２ｇ）を２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌペニノリンＧ、１００ μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および２００μＣｉの担体不含の［３５５］硫 酸ナトリウム（ＩＣＮ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ、、　Ｃｏ５ｔａ　 Ｍｅｓａ、　ＣＡ）を含有しているＲＰＭＩ　１６４０（１ｍｌ）中に懸濁した 。３７℃で４時間のインキュベーションの後に、この薄片をＤｕｌｂｅｃｃｏの リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中でよく洗浄し、次いで水上においてＰｏｔｔｅｒ −Ｅｌνｅｈｊｅｍホモンナイザーを用いて溶解緩衝液［１ｍＭ　ＰＭＳＦ、１ ％（Ｖ／Ｖ）アプロチニン、１０　μｇ／ｒａｌペプスタチン、００２％ＮａＮ ３を含むＰＢＳ中２％トリトンＸ　−１００］　（１ｍｌ）中でホモノナイズし た。溶解は震盪器上４℃で１時間続けた。

溶解物を１０．０００ｘｇ、４℃で１時間遠心分離した。この上清にＥＤＴＡを 最Ｈａ度２ｍＭで加え、Ａｆｆｉ−ＧｅｌプロティンＡ（２５０μｌの圧縮され たビーズ、ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃ Ａ）と共に４℃で一晩震盪することにより上清を事前浄化した。

Ｂ、Ｌ−セルクチンーＩｇＧビーズに吸着された成分の同定Ａｆｆｉ−Ｇｅｌｆ ｆミーＧｅｌプロティンーズ１０μｍ）をＬ−セルクチン−１ｇＧ［ｆｏ　９１ １０８２９８（１９９１年６月１３日発行）コ、ＣＤ　４−１　ｇＧ　［Ｃａｐ ｏｎら、複すｕｒｅ　３３７：５２５　（１９８９）に従い製造］またはヒトＩ ｇＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）のいずれか（３０μ ｇ）と共にＰ　Ｂ　Ｓ　（１ｍｌ）中にて４℃で一晩インキユベートした。この ビーズ（Ｌ−セルクチンー１ｇＧビーズ、ＣＤ４−１８Ｇビーズおよびｈｕ　Ｉ 　ｇＧ−ビーズと称する）をＰＢＳ中で３回および溶解緩衝液で１回洗浄した。

ＣＤ４−ＩｇＧおよびｈｕ１ｇＧビーズを対照として用いた。

上記セクションＡに記載した事前に浄化された溶解物を１０．０００　ｘｇで１ ０秒間遠心分離し、上清にＣａＣ１□を最終濃度５ｍＭで加え、この上清を直ち にＬ−セルクチンー１ｇＧビーズ、ＣＤ４−１ｇＧビーズまたはｈｕ　Ｉ　ｇＧ −ビーズと混合しく通常パック化ビーズ１０μｍ当たり事前浄化された溶解物２ ００μｍ）、震盪器上４℃で４時間インキュベートした。このビーズを溶解緩衝 液で６回洗浄し、新しい試験管に移し、溶解緩衝液でもう１回洗浄した。

Ｌ−セルクチンー１ｇＧビーズに結合した物質をＳＤＳ中、２−メルカプトエタ ノールの存在下で煮沸することにより可溶化し、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ル（９または１０％）上で電気泳動し、ＥＮＴＥＮＳＩＦＹまたはＥＮ３ＨＡＮ ＣＥ（ＮＥＮ）を用いた蛍光間接撮影法に供した。蛍光間接撮影法により、５０ ｋＤの成分はＥＮ３ＨＡＮＣＥよりもＥＮＴＥＮＳ　ＩＦＹを用いて一層拡散す る傾向があった。再沈殿実験において、マーカーとしての予め染色された標準（ ＢｉｏＲａｄ１高範囲）と共に５ＤＳ−可溶化サンプルを７６５％ＳＤＳゲル上 で電気泳動した。予め染色したオボアルブミン（４９，５ｋＤ）を位置マーカー として用いることによりゲル上の５０ｋＤの回りの領域を切り出し、そのタンパ ク質を６０＋ｎＡで一晩、Ｌａｅｍｍｌｉ溶離緩衝液中に電気溶離（ＢｉｏＲａ ｄ　ｍｏｄｅｌ　４２２）Ｌ／た。溶出液を濃縮し、緩衝液をＣｅｎｔｒｉｃｏ ｎ　３０　ユニー　ット（八ｍ１ｃｏｎ、　Ｄａｎｖｅｒｓ、　ＭＡ）によりＰ ＢＳ中の１０ｍＭｃＡＨＰｓに交換し、次いで上記の様にＬ−セルクチンー１ｇ Ｇビーズ、ＣＤ４−１ｇＧビーズまたはｈｕｌｇＧ−ビーズと共にインキュベー トした。粗溶解物の分析のために、事前浄化された溶解物（２００μｍ）を冷ア セトン（８０％Ｖ／Ｖ）で沈殿させ、次いて上記の様に電気泳動に供した。

Ｌ−セルクチンー１ｇＧビーズは拡散した５０ｋＤ成分（見かけの分子量範囲は ５０ｋＤ〜５８ｋＤ）を［３５Ｓ］　硫酸塩ラベル化腸間膜リンパ節（ＭＬＮ） または末梢リンパ節（ＰＮ）から沈殿させた。サラニ、約９０ｋＤ（８３ｋＤ〜 １ｏ２ｋＤ）のバンド（硫酸塩導入の点からみて比較的少量）が、はとんどの分 析において観察された。対照の沈殿において、ＣＤ４−ＩｇＧおよびｈｕ　Ｉ　 ｇＧ−ビーズは溶解物中に５０ｋＤ生戎分または９０ｋＤ成分を認識しなかった 。粗溶解物を直接分析した場合に、他のいくつかのバンドの中で５０ｋＤ成分が 主要な構成成分を示した。さらに［３５Ｓ］硫酸塩−ラベル化およびＬＨＲＩｇ Ｇでの沈殿のための同一の実験法を多くの器官に適用することにより、５０ｋＤ 成分の組織分布を調べた。リンパ組織の中で、末梢リンパ節および腸間膜リンパ 節のみが５０ｋＤおよび９０ｋＤハントを示し、バイアー塩、牌臓、および胸腺 は両方に対して陰性であった。また非−リンパ器官、例えば腎臓、肝臓、大脳お よび小脳は完全に陰性であった。

Ｌ−セルクチンー１ｇＧビーズはカルシウムが存在する場合に５０ｋＤ成分を沈 殿させたが、カル／ラム不在の場合には沈殿させなかった。さらに相互作用の特 異性をＭＥＬ−１４ｍＡｂを用いて調べた。１２−セルクチンーＴｇＧビーズを この抗体と予めインキュベートすることにより５ＱｋＤバンドの該ビーズへの結 合は完全にブロックされたが、クラスを一致させた対照の抗体（抗−ＣＤ４５） では全（効果がなかった。フコイ／ンはＬ−セルクチンー１ｇＧビーズによる５ ０ｋＤ成分の沈殿を完全にブロックしたが、一方で対照の多糖（コンドロイチン 硫酸Ｂ１コンドロイチン硫酸、へ、ケラタン硫酸）は完全に不活性であった。さ らに、ＰＰＭＥの存在は５ＱｋＤバンドの強度を顕著に減少させたが、比較的高 濃度が必要であった。対照の酵母マンナン（ｍｎｎ　２　）は同じ濃度で全く効 果がなかった。小量の９０ｋＤバンドのし一セルクチンー１ｇＧビーズによる沈 殿もカルシウム依存性てあり、ＭＥＬ−１４ｍＡｂにより阻害可能であり、そし てフコイジンおよびＰＰＭＨによりブロックされた。

最後に、糖タンパク質のシアリダーゼ処理により、Ｌ−セルクチン−１ｇＧによ る結合が阻害されることが見いだされた。ゆえに糖タンパク質上のシアル酸は明 らかに結合のために必須である。この結果はセルクチンとそのリガンドの間の相 互作用の先の特徴付けと一致する。

実施例２　クローニングおよび配列決定のための５０ｋＤＬ−セルクチンリガン ドの精製 実施例１に記載した実験により、Ｌ−セルクチンー１ｇＧキメラは末梢および腸 間膜リンパ節により産生される〜５０ｋＤ硫酸化内皮リガンドの生物学的な特徴 付けのために利用し得ることが示された。追加の実験により、末梢リンパ節（Ｐ ＬＮ）を器官培養物中に入れたときにこのリガンドが容易に培地中へと放散され ることが示されている［Ｓ、　Ｗａｔｓｏｎ−未公開の観察結果］。ゆえに、配 列決定のためのし一セレクチンリガンドの精製における最初の工程はネズミＰＬ Ｎによる大量の培養培地の製造であった。劇的な精製を可能にした第二の観察は 、〜５０ｋＤ硫酸化し一セレクチンリガンドが培養培地のクロロホルム−メタノ ールによる処理の後に可溶性であったことである。この工程により硫酸化リガン ドの〉３５０倍の精製が行われた。次の精製工程は小麦麦芽凝集素アフィニティ ーカラムからなり、これはこのリガンド中の炭水化物の見かけの高含量を利用す るものであった。最終精製工程ではＬ−セルクチンーＩｇＧキメラアフィニティ ーカラムを利用して該リガンドを精製した。この最終工程により、〜５ＱｋＤ領 域内に含まれる物質がＬ−セルクチンに比較的高い親和性で結合し得る糖タンパ ク質に対応するであろうことが確認された。

腸間膜または末梢（顕部、上腕、腋窩）リンパ節を８〜１６週齢の雌性ＩＣＲマ ウスから集めた。マウスを処置してその腸間膜リンパ節を除去した。通常、培養 培地の１パンチを３０匹のマウスの腸間膜節から作製した。時には、さらに少数 （全リンパ節重量の約５％）の末梢リンパ節を加えた。この節をカミソリ刃を用 いて約１關厚さの薄片に切断し、この薄片を２５ＩＩＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｌＵ ／ｍｌペニシリンおよび１ｄｇ／ｍｌストレプトマイシンを追加した１００ｍ１ 細胞培養ボトル中の標準的な細胞培養培地ＲＰＭＩ−１６４０（１ｍｌ）に加え た。培地と節の比は６ｍｌ／３０腸間膜リンパ節であった。

培養ボトルを３７℃インキュベーター中に置いた。４時間後、培地を１５１１１ １円錐形試験管中に注いで５００　ｘｇで１０分間遠心分離し、大きな組織破片 を除去した。この上清を再び１５ｍ１Ｃｏｒｅｘ試験管中、２０．０００Ｘｇで １５分間遠心分離した。得られた上清をまずＮ　ｉ　ｔｅｘスクリーンを通して 注ぎ、遠心分離の間にペレット化しない脂肪質の粒子を除去し、次いで液体窒素 を用いて急速凍結して一２０℃で保存した。

タンパク質精製計画をモニターする目的のために、３５ＳＱ４−ラベル化Ｓｇｐ ５０を上述の様に調製した培養培地に加えた。この物質は上述の培養培地１ｍｌ 中の５マウス腸間膜リンパ節を０．５＋ｎＣｉ　Ｎａ”５Ｏ４（ＩＣＮ）でラベ ルすることにより調製した。４時間後、細胞培養培地を除去してミクロ遠心機中 で１０分間遠心分離した。その上清を除去して１００μｌ圧縮プロティンＡ−ア カロースビーズ（Ｚｙｍｅｄ　Ｃａｒｐ、　）に加えることにより事前浄化し、 ４℃で一晩震盪した。事前浄化された培地を、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（１９８８）　ＨａｒｌｏｔおよびＬａｎ ｅ、　Ｃａ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの５２２ 〜５２３ページに概説されている方法に従い、１ｍｌ圧縮プロティンＡ−アカロ ース（Ｚｙｍｅｄ）当たり１０ｍｇのし一セルクチンーＩｇＧで調製した３ｍｌ の共有架橋結合されたＬＥＣ−１ｇＧ−プロティンＡ−アガロース（ＬＥＣＸプ ロティンＡ−アガロース）カラムに加えた。カラムを６時間から一晩し−セルク チン×プロティンＡ−アガロースと共に震盪した後に、１０容量のダルベツコの リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄し、精製された物質（ＧｌｙＣＡＭと しても知られる５０ｋＤＬ−セルクチンリガンド）をＰＢＳ中の４ｍＭ　ＥＤＴ Ａ（１０■ｌ）で溶離した。この物質をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　３０　（Ａｍｉｃ ｏｎ　Ｃｏｒｐ、　）上で濃縮して最終容量を約１００μｍにした。約６０．０ ００ｃｐｍの物質が得られた。

微量配列決定分析のための精製タンパク質を製造するために、４バツチ（約１２ ０マウス）の培養培地（２４■ｌ）を解凍した。５０μｍの３５ＳＱ４−ラベル 化ｓｇｐ５０（３２，０００ｃｐｍ）を加えた。９容量（２１６＋ａｌ）のクロ ロホルム：メタノール（２＋　１）を加えて５０ｍ１円錐形試験管中で３０分間 室温で震盪し、５００Ｘｇで２０分間遠心分離した。上部の水層を集め、「界面 」層を再度遠心分離してできるだけ多くの水層を抽出した。このクロロホルム・ メタノール抽出を繰り返した。

水層を見るために、約２０ｍ１のＰＢＳを加えた。水層を集めて、残留したクロ ロホルム：メタノールは水層を１リツトルのビーカーに入れて換気フード中の温 水浴中で３時間撹拌することにより蒸発させた。次に、以下において＜Ｃ：Ｍｆ 「クロロホルム：メタノール分配後」）と称されるこの物質をＰＢＳに対して４ 時間透析した。同様の製造において、１３８５倍の精製がなされた。１９２００ ｃｐｍを有する透析された＜ＣＡＭを４ｍｌの小麦麦芽凝集素（ＷＧＡ）−アガ ロースゲル（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に４℃で一晩震盪 した。このゲルをカラム中に集め、ＰＢＳ（４０■ｌ）で洗浄し、ＰＢＳ中の０ ．２Ｍｎ−アセチルグルコサミンで溶離した。同様の実験において、さらに４． ４倍の精製がなされた。マウス６０匹に相当する約１ｓｏｏｏｃｐｍを含有して いるこの物質をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　３０上て濃縮し、標準的なＬａｅｍｍｌｉ の方法の下で１０％５ＤＳ−ゲル上を流した。同様の実験において、ＬＥＣＸプ ロティンＡ−アガロース上での最終精製により全体で６０６０６倍の精製が得ら れた。次いで該タンパク質をＢｉｏＲａｄミニプロッター（２５０ｍＡ定電流で ２時間）においてＰｒｏＢ１ｏｔｔ膜（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 　Ｉｎｃｏｒｐ、　）上に電気プロットしな。この膜（プロット）を製造者の勧 めに従いクーマシーＲ−２５０で染色し、汚れを除いた。このプロットを風乾し てオートラジオグラフィーをＫｏｄａｋ　ＸＡＲフィルムを用いて行った。

次いで精製された物質を気相微量配列決定に供した。

実施例３　タンパク質配列決定 ポリペプチド配列は、実施例２に記載したように精製した物質の気相微量配列決 定により決定した。Ｌ−セルクチンー１ｇＧアフィニティーカラムから溶離さ■ ５ｌｎｃ、）上に電気プロットし、クーマシーＲ２５０で染色し、汚れを除いた 。このプロットを風乾してＫｏｄａｋ　ＸＡＲフィルムに露出して硫酸塩ラベル 化リガンドの位置を検出した。ゲルのこの領域を切り出して気相微量配列決定に かけた。

配列決定は本質的に上記に記載したように行った。

ポリペプチド配列決定により、約５ｐＭレベルで明白な２５アミノ酸の範囲が明 らかになった（図３Ｂ）。

実施例４〜５０ｋＤＬ−セレクチンリガンドのｃＤＮＡクローニングおよび配列 分析 ネズミ末梢すンパ節ｃＤＮＡライブラリーはＩ　ｎｖｉｔｒｏＧｅｎ　ｃＤ　Ｎ 　Ａライブラリーキットおよびネズミ末梢リンパ節から単離されたポリＡ十ＲＮ Ａを用いて構築した。重複したオリゴヌクレオチドプローブのプールは、Ｎ末端 配列の９〜１７残基（ＱＭＫＴＱＰＭＤＡ）から哺乳動物コドン使用規則を基に して選択された縮重したコドンを用いて得た。コドンはＣＡＧｌＡＴＧ、ＡＡＧ 、ＡＡＡ、ＡＣＡ。

ＡＣＴ、ＡＣＣ，ＣＣＡＳＣＣＴ、ＣＣＣ５ＧＡＴまたはＧＡＣであった。ＧＣ のみを５°Ａｌａコドンのために用いた。２５−ｍａｒオリゴヌクレオチドをポ リヌクレオチドキナーゼにより３２ｐラベル化し、１，０００．０００のｇＴ１ ０バクテリオファージを２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ＩＩＩＭ　Ｃ ａＣ１，１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５ＱｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７ ，６）、５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０μ ｇ／ｎｌの変性して剪断したサケ精子ＤＮＡを含む２０プレートから得た複製ニ トロセルロースフィルターに４２℃で一晩／％イブリダイズさせた。このフィル ターを１ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ中、４２℃で２回３０分間洗浄して一７０℃ で一晩オートラジオ°グラフィーを行った。１個の複製物の陽性ファージをプラ ーク精製し、ＥｃｏＲ１挿入物をｐＧＥＭベクター中にサブクローン化した。側 鎖の全ヌクレオチド配列はＳ　ｅｑｕｅｎａｓｅキットによるスーパーコイン（ ｓｕｐｅｒｃｏｉｎ）配列決定により得た。ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシ ョンおよびノーザンプロット分析のために、ポリＡ尾部を欠いているポリメラー ゼ連鎖反応フラグメシトを合成し、次いでｐＧＥ〜１ベクター（ＰＲＯＭＥＧＡ ）中にサブクローン化した。コード化ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を図４に示す 。該クローンは１５１アミノ酸からなる１個の読み取り枠を有する短い（約６０ ０　ｂｐ）ｃＤＮＡを含んでいた。ｒＫｏｚａｋ　ｂｏｘＪ（ＣＣＡＣＣＡＴＧ Ａ）は最初のコード化メチオニンの回りに見られた［Ｋｏｚａｋ、Ｍ、　Ｃｅ１ ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１１５：８８７　（１９９１）］。このメチオニンに続い て、タンパク質の分泌経路への移動のためのシグナル配列として機能すると思わ れる１９アミノ酸の長い疎水性の高い配列が存在した。この領域に続いてＬ−セ ルクチンー１ｇＧ結合物質のＮ末端配列決定により決定された配列とほとんど正 確に対応している配列が存在する。このシグナル配列がプロセシングされた１３ ２アミノ酸タンパク質はセリンおよびトレオニンに非常に富み、これらの残基に 対応する約２９％のコード化アミノ酸を有していた。

おそらくもっと重要であろうが、これらのセリンおよびトレオニン残基は糖タン パク質の２つの領域に密集していることが見いだされた（図３Ｄ）。領域Ｉ（残 基４２〜６３）は１２個のセリンまたはトレオニンを含む（〜５５％）ことが見 いだされた一方、領域ＩＩ（残基９３〜１２２）は１４個のセリンまたはトレオ ニン残基を含む（〜４８％）ことが見いだされた。これらの領域内で、セリンお よびトレオニン残基は通常２．３または４つの群に密集していることが見いださ れた。このタンパク質はシスティン残基を欠き、１個の可能性のあるＮ−結合性 グリコシル化部位（残基１１５〜１１７）が存在していた。システィン残基の欠 如は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上の硫酸塩−ラベル化リガンドの移動度 がジスルフィド還元剤の不在により影響されないことを示した以前のデータ（Ｓ 、　Ｉ＋ｏａｉおよびＳ、Ｒｏｓｅｎ未公開の観察結果）と一致していた。さら に１個の可能性のあるＮ−結合性部位は、以前に示された〜５０ｋＤリガンド上 のＮ−グリカナーゼ（ｇｌｙｃａｎａｓｅ）　−感受性の炭水化物側鎖が少数で あることと一致した。最終的に、プロセシングされたタンパク質の分子量は〜１ ４．１５４ｋＤであることが見いだされた。単離されたし一セレクチンリガンド の分子量は〜５０ｋＤであるから、この結果により〜７０ｋＤの糖タンパク質の 塊りは〇−結合性炭水化物であることが示され［Ｃａｒｒバク賃をクーマン−ブ ルーで染色することができないことと一致する。

このｃ　Ｄ　ＮＡによりコードされるタンパク質のＣ末端を調べることにより、 穏やかな疎水性領域が明らかとなったが、明らかなトランス−メンプラン・アン カーリングモチーフはなかった。この領域がホスファチジルイノシトール（ＰＩ ）尾部の付加を支配しているシグナルに対応する可能性がある一方で、リンパ節 切片のホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩＰＬＣ）による処理 ではりガントを内皮細胞から除去しないようである（Ｍ、Ｓｉｎｇｅｒ、　Ｓ、 １ａｔｓｏｎ、　Ｒ，Ｍｅｂｉｕｓ　−未公開の観察結果）。この結果は〜５０ ｋＤリガンドがＰＩ尾部を用いて細胞表面と結合する可能性の反証を挙げるもの ではないが、これは他の可能性のある細胞表面への結合がこの糖タンパク質によ り利用されているかもしれないことを示唆する。両親媒性ヘリックスを探索する プログラムを用いてＣ末端の２１アミノ酸を調べることにより、この糖タンパク 質のＣ末端は非常に重要な両親媒性ヘリックスをコードしていることが明らかに なった（図３Ｃ）が、この可能性のあるヘリックス領域の１つの面は非極性残基 を含んでおり、また池の面は極性残基を含んで単離されたｃＤＮＡがＬ−セルク チンリガンドのタンパク質の背骨に対応する配列をコードすることを最終的に証 明するために、本発明者らは単離されたりガントｃＤＮＡのヌクレオチド配列か ら推定されるアミノ酸配列から得られるペプチドをＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓペプチド合成装置上で製造した。Ｎ−末端（ＣＡ　％１ＧＡＳＲＩＴ ＫＳ）に由来するペプチドを、付加した下線システィン残基を介して鍵穴カサガ イ（ｋｅ）・ｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ）のヘモ７アニンに結合させ、ウサギに注 射し、続いて通常の免疫実験を行った。免疫前の血清および接種されて追加免疫 されたウサギから得た血清を集めにこでウサギポリクローナル抗ペプチド血清を ＣＡＭｏｌ、ＣＡＭＯ２、ＣＡＭＯ５と称する）、各血清を、上記の様にＬ−セ ルクチンー１ｇＧキメラに結合させることにより精製した硫酸塩ラベル化し一セ レクチンリガンドを免疫沈降させるその能力について試験した。

クローン化タンパク質がＬ−セルクチンＩｇＧキメラを用いて培養培地から精製 された５５Ｓ−ラベル化物質と同じであることを証明するために、Ｌ−セルクチ ンー１ｇＧ精製３５５−ラベル化物質の免疫沈降を行った。２つの別々の実験に ついて以下の方法を用いた。免疫沈降ビーズの調製のために、２５μｍパック化 プロティンＡ−セフ７０−スビーズ（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） ＋　２５　、ｃｚｌウサギ血清＋３５０μＩ　ＰＢＳをミクロ遠心管中で共に４ ℃で３時間Ｍ盪させる。各試験管をＰＢＳで３回洗浄して非結合免疫グロブリン を除去すると、２５μｍのビーズのみが残る。約６．０００ＣＩ）！！Ｉのし一 セルクチンー１ｇＧ精製３５８−ラベル化物質を含有しているＰＢＳ（６０μｌ ）を加える。これを１５分ごとに試験管を軽く動かしながら水上で３時間インキ ュベートする。３時間後、ミクロ遠心管を回転させてビーズをペレット化する。

上清（４５μｌ）を取り去り、４　Ｘ　Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（１５μ ｌ）と混合して５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために煮沸する。ペレット化されたビー ズをＰＢＳで３回洗浄し、新しい試験管に移し、上清を静かにデヵンテーノヨン して試験管中に最終容量４５μｌを残す。４　Ｘ　Ｌａｅｗｌｉサンプル緩衝液 （１５μｍ）を加えて５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために煮沸する。このＳＤＳゲル は還元条件下で流した。免疫グロブリン重鎮は還元条件下では５０ｋＤで流出し 、ラベルされたバンドを圧縮する。この実験において免疫前の血清はいずれも該 ラベルと相互作用しないが、一方てＣＡＭＯｌおよびＣＡＭＯ５は部分的な効果 を有し、ＣＡＭＯ２は該バンドを完全に免疫沈降させる。この実験を以下の差異 のもとにＣＡＭＯ２について繰り返した。該ゲルを５０ｋＤバンドが圧縮されな いように非還元条件下で流した（本発明者らは還元条件下のＳＤＳゲルにおいて Ｌ−セルクチンーＩｇＧ精製＄８８−ラベル化物質が移動性を変化させないこと を事前に確認していた）。　さらに、１つの試験管について、抗体−抗原相互作 用の特異性を示すために、ＣＡＭＯ２抗体を被覆したビーズを１ｍｇ／ｍｌ　Ｃ ＡＭＯ２ペプチドと水上で３０分間予めインキュベートした。最終的に、同様の 実験計画を用いてＣａｌｔａｇが作成したし一セレクチンのＣ末端ペプチドに対 する無関係な対照ペプチド抗体［ＲＯ５Ｙ（ローン−）ＩＢと称する］も試験し た。両ゲルをＥｎｈａｎｃｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）を用 いた蛍光間接撮影法に供し、Ｋｏｄａｋ　Ｘａｒフィルムを用いてオートラジオ グラフィーを行った。ＣＡＭＯ２はＬ−セルクチンーＩｇＧ精製３５Ｓ−ラベル 化物質を完全に免疫沈降させ、ＣＡＭＯ２免疫前およびＲＯ３Ｙ、ＩＢは効果を 有さない。遊離のＣＡＭＯ２ペプチドは特異的な免疫沈降をブロックする。この 結果を図５ＡおよびＢに示す。

実施例６　Ｌ−セルクチンリガンドの発現図６は〜５０ｋＤＬ−セレクチンリガ ンドをコードしているｌｌＲＮＡのノーザンプロット分析を示す。図６Ａにおい て見られるように、ｍ　ＲＮ　Ａはポリへ十分画中にコードされており、〜０． ７ｋＤの分離したバンドに対応する。このバンドの鮮明度は有意なレベルの別の ＲＮＡスプラインンノン反証となっており、単離されたりカントクローンを用い たネズミＰＬＮ　ｃＤＮＡライブラリーの再スクリーニングにより、池のいかな るスプライスされた形態のメッージも明らかにされていない。リンパ節により排 出される領域での炎症応答の誘導により、リガンドをコードしているＬＩＲＮＡ の量の相対的な減少が示されており、これはおそらく新しく移動しているリンパ 球由来のポリＡ＋ｍＲＮＡの大きな寄与によるものであろう。この結果はりカン トが炎症の間、ＰＬＮＨＥＶ中に劇的に誘導されるよってはないことを示すが、 この実験から量的な結論を出すのは困難である。異なる領域のリンパ節における このｍＲＮＡの発現を調べることにより、本発明者らが調べた全ての領域のＰＬ Ｎにおいてこれが発現されていることが示された（図６Ｂ）。

多くの異なるリンパ系および非リンパ系組織におけるし一セレクチンリガンドを コートしているｍＲＮＡの発現の分析により、この配列は非常に組織−特異的な 方法で発現されていることが明らかである。図６Ｃは該リガンドに対応するｍＲ ＮＡが腸間膜および末梢リンパ節の両方において強力に発現されることを示す。

これは、硫酸塩−ラベル化リガンドがこれらの２つの器官においてのみ発現され ることか見いだされた以前の実験と一致する。さらにこのメツセージは肺におい て有意なレベルで、そしてバイアー斑において非常に低いレベルで発現される。

このｍＲＮＡは多（の非リンパ系器官においては検出不可能であり、他の２つの リンパ系器官、牌臓および胸腺において見いだされない。この後者の結果により 、リガンドが脈管構造のサブセット、すなわち末梢リンパ系組織において見られ るＲＥＶにおいてのみ有意に発現され得ることが強く示唆される。

該リガンドｍＲＮＡがＨＥＶにおいて発現されることを証明するために、ｉｎ　 ｓｉ発現について組織を分析した。末梢リンパ節およびバイアー斑を有する小腸 の切片をマウスから採収し、パラホルムアルデヒド中に固定化し、次いでスクロ ースに浸した。組織をＯＣＴ化合物（Ｍｉｌｅｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に 埋め込み、イソベンクン中で凍結させて８ミクロン切片に切断した。この切片を Ｖｅｃｔａｂｏｎｄ被覆化スライド（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）上に解凍−固定した。ｓｓｃ、−ラベル化ＲＮＡプローブは既述の方法（Ｍｅ ｌ　ｔｏｎら１９８４）を用いてセンスおよびアンチセンス方向で生成させた。

ハイブリダイゼーションのために、切片を４％パラホルムアルデヒド（１０分間 ）、プロテイナーゼＫ（１μｇ／ｍｌ、１０分間）で順に処理し、続いて１００ μｍのハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド、０．０３Ｍ　Ｎａ Ｃ１，２０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ１．ｏｎＭ　ＥＤＴＡ、１ｘＤｅｎｆａｒｄｔ 溶液、５％デキストラン硫酸、１０ｍＭンチオトレイトール）を用いて４２℃で ２時間プレハイブリダイゼーションした。プローブを最終濃度８　Ｘ　１０　＠ ｃｐｓ／ｍｌで加え、次いで５５℃で一晩インキュベーションした。スライドを １０ｍＭβメルカプトエタノール（ＢＭ　Ｅ　）、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む２Ｘ ＳＳＣで洗浄し、続いて３０分間の処理（２０Ｍｇ／ｍｌで３０分間）をした。

ＥＤＴＡおよびＢＭＥを含む０．ｌＸ５ＳＣからなる高ストリンジェノンー洗浄 を５５℃で２時間行った。スライドを０．５ＸＳＳＣ中で洗浄し、エタノールの 濃度を上昇させることにより脱水し、真空乾燥した。

スライドをＮＴＢ２核乳剤（Ｋｏｄａｋ）中に浸し、５週間まで感光させた。ス ライドを現像し、ヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色した。陰性対照はセ ンスプローブを有する一連の切片のハイブリダイゼーションからなっていた。図 ７に見られるように、単離されたリガンドｃＤＮＡクローンによりコードされて いるアンチセンス鎖は末梢リンパ組織のＨＥＶに明らかにハイブリダイズするが 、センス鎖はいかなる有意なハイブリダイゼーションも示さない。この結果によ りリガンドｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡはＨＥＶ細胞により合成され、腸間膜お よびＰＬＮのこの領域へのし一セレクチンリガンドの局在性を示している以前の 免疫組織化学的なデータと一致することが明白に示される。

本明細書中に開示されるデータは、Ｌ−セルクチンに対する内皮性リガンドが独 特のムチン型糖タンパク質であるという仮説と一致する。定義によりムチンは、 られる高いセリンおよびトレオニン含量は、タンパク質の高度なグリコジル化（ 分子量で〜７０％）と−緒になって、リガンド上の炭水化物の大部分が実際にＯ −結合性であることを示唆し、〜５０ｋＤの硫酸化ＰＬＮリカンドのＮ−グリカ ナーゼ耐性を示している以前の実験が確認された。〇−−合性炭水化物がＬ−セ ルクチンのレクチンドメインにより媒介される接着性相互作用に直接関係するよ うであるという事実は、本明細書中で開示されるタンパク質の背骨の役割が炭水 化物の提供のための骨格としてのものであるらしいことを示唆する。ゆえに、こ のタンパク質は組織−特異的な方法でＬ−セルクチンのレクチンドメインに炭水 化物を提供するために機能する新規な型の細胞接着分子を表す。このように、こ の「骨格」の局所での発現がリンパ球群の局所交通の結果を与えるのであろう。

セルクチンへの炭水化物提供のための骨格としてのムチン様糖タンパク質の使用 は、ムチン構造について現在知られていることとの関連の上で見たときに意味を 持つ。ムチン等の高度な〇−結合性糖タンパク質の構造の以前の研究により、こ れらの分子が高度に拡張された、いくらか棒状の分子である傾向があることが明 らかになっている。例えば、白血球表面のムチン・ロイコシアリン（シアロホリ ン、ＣＤ　４３　）　（Ｃｙｓｔｅｒら、　１９９１．上記；　Ｆｕｋｕｄａ　 １９９１．上記）は固い棒状構造を形成することが示されており、他のムチンの 物理化学的分析により同様の棒状構バク質、例えば崩壊促進因子（ＤＡＦ）およ び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプターは、グリコカリンクスを介してレ セプターを広げるように機能し得る棒状のドメインを形成するらしい高度な〇− −合性ドメインを細胞表面の近（に有するＱｅｎｔｏｆｔ　１９９１．上記）。

この棒状構造はまさに、セルクチンのレクチンドメインに炭水化物を提供するこ とを役割とする分子について予想されるであろう構造である。図６に図示したモ デルに示すように、Ｌ−セルクチンリガンドはＨＥＶの管腔中に拡張する「瓶洗 いブラ／」として考えることができる。これにより、リンパ球表面に局在化して いるし一セレクチンのレクチンドメインに多数の〇−結結合性炭水化ソリガンド ブラシの荒毛）が適切に提供され、このようにして内皮細胞への接着を媒介する 。リガンド上の２つのドメインへのこれらの炭水化物の見かけ上の密集は、リン パ球−ＨＥＶ接着性相互作用の結合親和力を高めるために多価の様式でそれらが 提供され得ることを示唆している。即ち、Ｌ−セルクチンリガンドのムチン様の 性質は、拡張された棒状のプラットホームを介して多価の炭水化物リガンドをＬ −セルクチンのレクチントイインに提供するように機能し得るてあろう。的確に 言えば、これは免疫系における細胞接着の新しい機構を規定するものであろう。

本明細書中で開示された発現分析により、Ｌ−セルクチンにより媒介される局所 のリンパ球交通の調節がリガンドｍＲＮＡの組織特異的発現によるものであろう と示唆される。本発明者らは、Ｌ−セルクチンを介するリンパ球−ＨＥＶ相互作 用を媒介しているとして以前に記載された組織のみがリガンドに対する高レベル のｍＲＮＡを発現することを見いだしたが、バイアー斑における非常に低しベ銀 ユ５．２０１　（１９８７）］。これらの結果は、局所の交通は少なくとも一部 分において本明細書中に開示した該リガントｍＲＮＡの転写活性化により制御さ れているという可能性と一致し、外因性因子はリガンド遺伝子の転写を制御する ことによりＬ−セルクチンー介在性接着を調節し得ることを示している。もちろ ん該リガンドのタンパク質の背骨はＬ−セルクチン接着を媒介するには不十分て あり、この背骨上に見られる炭水化物リカンドの作成に関与するグリコリルー［ ・ランスフェラーゼを制御している遺伝子も転写調節されているかもしれない。

この後者の可能性は、非−ＨＥＶ細胞において本明細書中に開示したｃＤＮＡの 発現により産生されるリガンド糖タンパク質の活性を調べることにより現在試験 可能である。

別レベルの調節が、適当なし一セレクチンー特異的炭水化物側鎖を〜５０ｋＤリ ガンドが受容する一方で他の〇−結合性糖タンパク質が受容しない機構に関係し ているのかもしれない。本明細書中に開示される■、−セレクチンリガンドが慢 性または急性の炎症部位において異所的に発現され、リンパ球または好中球の交 通ンＦｍＲＮ　Ａの発現はこのような調節可能な異所性の発現を示すものである 可能性がある。

本明細書中に開示される〜５０ｋＤのリガンドがタンパク質−炭水化物相互作用 を介してＬ−セルクチンに容易に接着することは明らかであるが、このリガンド が内皮細胞表面と結合する機構は明らかにすべきものとして残されている。本発 明において見いだされた急速な放散は器官培養物の人工産物であり得たが、該リ ガンドの活性な放散型がウノ（Ｊ、　Ｇｉ　Ｉｂｅｒｔ−未公開観察結果）また はネズミ（Ｓ、　Ｗａｔｓｏｎ−未公開観察結果）血清から精製し得ることを示 している他のデータはこのリガンドがインビボで放散され得ることを示している 。他の多（の細胞表面接着が見いだされており、多くの場合においてこの放散は 生理学的に重要であるらしい。本明細書中に報告したリガンドの急速な放散は、 ＨＥＶの管腔表面との比較的ゆるい結合を示す。このような結合の１つは上記の 両親媒性ヘリックスによる媒介が可能であり、図８に示すモデルで説明すること ができた。このヘリックス領域は膜に架橋して同時に膜の接着およびリガンドの オリゴマー型の形成を媒介することができた。該リガンドがオリゴマー化し得る ことはゲル濾過実験の間に見いだされた０’、　ＩｍａｉおよびＳ、　Ｒｏｓｅ ｎ−未公開観察結果）。池の多くのタンパク質は両親媒性ヘリックスを膜結合お よび孔形成のために利用することが見いだされ９８４）］、ゆえにこのドメイン はＬ−セルクチンリガンドの場合に同様の様式で機能し得る可能性がある。別の 仮説は、両親媒性ヘリックスが内皮細胞表面とより堅固に結合されている別のタ ンパク質と弱い相互作用をし得るというものである。

また、該リガンドは現在不明の様式でグリコカリックス中に組み込まれてる可能 性がある。最後の可能性は、Ｌ−セルクチンレクチンドメインに結合するいくつ かのＨＥＶリガンドが存在し、そのうちのいくつかは、例えばＩｍａｉらＥ（１ ９９１）。

内皮細胞表面と堅固に結合されており、そして他のものは本明細書中に開示され る〜５０ｋＤリガンドの様に放散されるというものである。

本明細書中に開示したムチン様内皮性リガンドとモノクローナル抗体ＭＥＣＡ７ ９により定義される既に報告されているタンパク質の群［ｐｌｎ”アドレンンス ”ＳＩｍｍｕｎｏｌ、Ｒｅｖ、　１０８：５　（１９９１）］の間の関係は明ら かにすべきものとして残されている。Ｉ　ｍａｉら［（１９９１）、上記］は本 明細書中に開示したリガンドがＭＥＣＡ　７９抗体（未知の炭水化物決定基に結 合する抗体）により認識されることを既に示したが、５ｔｒｅｅｔｅｒら［（１ ９８８ｂ）、上記］およびＢｅｒｇら［（１９９１）、上記］は多くの他の糖タ ンパク質もこの炭水化物様エピトープを発現するらしいことを示している。

したがって、Ｌ−セルクチンのレクチンドメインに炭水化物を提供する他の内皮 性糖タンパク質が存在する可能性がある。ゆえに本明細書中に報告したムチン様 リガンドに特異的なモノクローナル抗体の開発は、Ｌ−セルクチンー介在性の交 通のための接着性リガンドとして木精タンパク質と他のものの相対的な寄与の評 価を可能にするであろうから、非常に重要であろう。

〜５０ｋＤのし一セレクチンリガンドは免疫系における細胞接着に関与する分子 の４番目の型である。１）白血球インテグリン、２）そのリガンド、免疫グロブ リン（Ｉｇ）スーパーファミリー構成員、３）セルクチン、および４）〜５０ｋ ＤＬ−セレクチンリガンド。該インテグリン、Ｉｇスス−−ファミリー構成員、 およびセルクチンの全ては種々の関連の分子を含んでいるファミリーからなるこ とが見いだされている。本明細書中に開示したりガントの特徴のゆえに、本発明 者らはこの出願中に用いた扱いにくい名称をより記述的な用語であるＧＬＹＣＡ ＭＩ　ＥＣＬ　ＹＣＯＳｙｌａｔｉＯｎ　ｄｅｐｅｎｄａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ａｄ ｈｅＳｉＯｎ　Ｍａｌｅｃｕｌｅ（グリコシル化依存性細胞接着分子）］と置き 換えることを提案する。

上記に特に好ましい態様について示しているが、本発明はそのように限定されな いことは理解されるであろう。当業者は、開示された態様に対して本発明の全体 の概念から逸脱ことな（種々の修飾を行うことができるであろう。このような全 ての修飾は本発明の範囲内にあることが意図されている。

ＦＩＧ、　５Ａ Ｐ２　Ｐ２　１２　１２　Ｉ２４ＰＥＰ１２＋ＰＥＰロージ−ロージ一旦　ペレ ット旦ペレット旦　ペレット旦　ペレットＦＩＧ、５Ｂ ＦＩＧ、６Ａ　、ｂ　。

Ｑ、７Ｓｔｈ−一、 ＦＩＧ、６Ｂ　−ｂ　ｃｄ− ｍ−ｍａａｐ−１ ａｂｃｄｅｆｇｈｉｊｋｌ −−・・− ＦＩＧ、　６Ｇ ａｂｃｄｅｆｇｈｉｊｋｌ ＦＩＧ、　６Ｄ ＦＩＧ、　７Ａ ＦＩＧ、　７Ｂ 国悴慣審舖牛 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｈ２１１０４Ｂ　８ ６１５−４ＣＣＯ７Ｋ　１４／７８　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　５／１０ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４Ｂ２１１０８　９１６１−４Ｂ ／／　Ａ６１Ｋ　３９／３９５　Ｄ　９２８４−４Ｃ（Ｃ１２Ｎ　５／１０ Ｃ１２Ｒ１：９１） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） ９４５５−４Ｃ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ 、ＪＰ （７２）発明者　ラスキー、ローレンス・エイアメリカ合衆国カリフォルニア９ ４９６５、ソーサリト、スター・ルート・ボックス４６０番 Ｉ Ａ６１Ｋ　３７１０２　ＡＢＥ ＤＵ （Ｃ１２Ｎ　５１００　Ｂ Ｃ１２Ｒ１：９１） （７２）発明者　イマイ、°ヤスユキ アメリカ合衆国カリフォルニア９４１２２、サン・フランシスコ、ロックスレー ・アベニュー１７２番、ナンバー・スリー （７２）発明者　ローゼン、ステイーブン・ディーアメリカ合衆国カリフォルニ ア９４１００、サン・フランシスコ、クレイトン・ストリート８２８番 （７２）発明者　シンガー、マーク・ニスアメリカ合衆国カリフォルニア９４７ ０３、バークレイ、グランド・ストリート１９１５番

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．セレクチンリガンドをコードしているヌクレオチド配列を含む単離された核 酸分子。
2. ２．セレクチンレセプターにより認識される炭水化物構造を有する糖タンパク質 をコードしているヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の核酸分子。
3. ３．図４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしているヌクレオチド 配列の相補体にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の 核酸分子。
4. ４．図４に示すアミノ酸配列と約４０％より大きい相同性を有するアミノ酸配列 を有するセレクチンリガンドタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含 む請求項１に記載の核酸分子。
5. ５．以下からなる群から選択される請求項１に記載の核酸分子；（ａ）天然のセ レクチンリガンド遺伝子のコード化領域由来のヌクレオチド配列を有するｃＤＮ Ａクローン； （ｂ）（ａ）のクローンに低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る ＤＮＡ配列；および （ｃ）セレクチン分子の天然に存在するリガンドの生物学的性質を有する糖タン パク質をコードする（ａ）および（ｂ）のいずれかのＤＮＡ配列の遺伝的変異体 。
6. ６．Ｌ−セレクチンリガンドをコードしているヌクレオチド配列を含む請求項１ に記載の核酸分子。
7. ７．図４に示すヌクレオチド配列のコード化領域、またはＬ−セレクチン分子の 天然に存在するリガンドの生物学的性質を有する糖タンパク質をコードするその 遺伝的変異体を含む請求項６に記載の核酸分子。
8. ８．免疫グロブリン定常ドメインをコードしているヌクレオチド配列をさらに含 む請求項１に記載の核酸分子。
9. ９．免疫グロブリンがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、Ｉｇ Ｅ、ＩｇＤまたはＩｇＭである請求項８に記載の核酸分子。
10. １０．図４に示すヌクレオチド配列のコード化領域に機能的に結合されたプロモ ーターをさらに含む請求項７に記載の核酸分子。
11. １１．発現媒体により形質転換された宿主細胞により認識される制御配列に機能 的に結合されたＬ−セレクチンリガンドをコードしているヌクレオチド配列を含 む発現媒体。
12. １２．請求項１１に記載の発現媒体で形質転換された宿主細胞。
13. １３．真核細胞である請求項１２に記載の宿主細胞。
14. １４．哺乳動物細胞である請求項１３に記載の宿主細胞。
15. １５．ヒト胎児腎臟セルライン２９３Ｓ由来である請求項１４に記載の宿主細胞 。
16. １６．請求項１２に記載の宿主細胞を適当な培養培地中で培養してＬ−セレクチ ンリガンドを発現させる方法。
17. １７．該Ｌ−セレクチンリガンドを培養物から回収することをさらに含む請求項 １６に記載の方法。
18. １８．セレクチン分子の天然に存在するリガンドの生物学的性質を有するアミノ 酸配列を含む単離されたポリペプチド。
19. １９．セレクチンレセプターにより認識される炭水化物構造を有する糖タンパク 質を含む請求項１８に記載のポリペプチド。
20. ２０．セレクチンレセプターに対するセレクチン−結合部分の提供が可能な立体 構造を有するアミノ酸配列を含む請求項１８に記載のポリペプチド。
21. ２１．棒状構造を有するムチン様糖タンパク質である請求項２０に記載のポリペ プチド。
22. ２２．Ｌ−セレクチンに結合する能力を有する請求項２１に記載のポリペプチド 。
23. ２３．硫酸化、フコシル化およびシアリル化された糖タンパク質である請求項２ １に記載のポリペプチド。
24. ２４．Ｓｇｐ５０またはＳｇｐ９０である請求項２３に記載のポリペプチド。
25. ２５．図４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしているヌクレオチ ド配列の相補体に低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸によ りコードされるアミノ酸配列を含む請求項２１に記載のポリペプチド。
26. ２６．該低ストリンジェンシー条件が、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５ ０ｍＭ　ＮａＣ１、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウ ム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％硫酸デキストラン、およ び２０μｇ／ｍ１変性および剪断化サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、３７℃で一 晩のインキュベーションである請求項２５に記載のポリペプチド。
27. ２７．天然に存在する同じ動物種の他のタンパク質を実質的に含まない天然のセ レクチンリガンドである請求項２１に記載のポリペプチド。
28. ２８．免疫グロブリン定常ドメイン配列をさらに含む請求項１８に記載のポリペ プチド。
29. ２９．対応するセレクチンレセプターのその天然リガンドに対する結合をブロッ クするに有効な量の請求項１８に記載のポリペプチドを、非毒性の薬学的に許容 し得る賦形剤と共に含む組成物。
30. ３０．循環白血球上のＬ−セレクチンレセプターの、内皮細胞上の天然リガンド ヘの結合をブロックするに有効な量でＬ−セレクチンリガンドを含む請求項２９ に記載の組成物。
31. ３１．循環白血球の内皮細胞に対する過剰な結合と関連する徴候または症状を処 置するための方法であって、そのような処置を必要とする患者に、請求項１８に 記載のポリペプチドを、循環白血球上のＬ−セレクチンレセプターの内皮細胞性 リガンドヘの結合をブロックするに有効な量で投与することからなる方法。
32. ３２．該糖タンパク質を非毒性の薬学的に許容し得る賦形剤を含む医薬製剤とし て投与する請求項３１に記載の方法。
33. ３３．抗炎症性または抗新生物薬の投与をさらに含む請求項３２に記載の方法。
34. ３４．セレクチンリガンドのタンパク質部分に対して免疫反応性の抗体。
35. ３５．該リガンドがＬ−セレクチンリガンドである請求項３４に記載の抗体。
36. ３６．以下からなるセレクチンリガンドの存在を測定するための方法；ａ）セレ クチンリガンドをコードしている核酸またはそのような核酸の相補体を核酸の試 験サンプルにハイプリダイズさせるか；またはｂ）セレクチンリガンドをコード している核酸に基づくプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い；そして ｃ）セレクチンリガンドの存在を測定する。
37. ３７．対応するセレクチンおよび免疫グロブリン重鎖配列を含むキメラを使用す ることからなるセレクチンリガンドを精製するための方法。
38. ３８．対応するセレクチンにセレクチン−結合部分を提供するための方法であっ て、請求項１９に記載のポリペプチドに該部分を結合させることからなる方法。