JP2003144181A - セレクチンリガンド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】セレクチンのリガンドをコードしている核酸お
よび該リガンのタンパク質部分に対する抗体、およびセ
レクチンリガンドの存在を測定するための方法の提供。 【解決手段】リガンドをコードしている核酸およびそれ
らを製造するための方法および手段、さらに循環白血球
の内皮細胞に対する過剰な結合と関連する徴候または症
状を処置するための方法の提供であって、そのような処
置を必要とする患者にセレクチンの糖タンパク質リガン
ドを投与する方法の提供。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は内皮性セレクチンリガンドに関する。さらに本
発明はこれらのリガンドをコードしている核酸、および
それらを製造するための方法および手段に関する。

【０００２】背景および関連技術の説明 リンパ球は、正常組織の炎症ならびに例えば慢性関節リ
ウマチおよび他の自己免疫疾患において発生する病理学
的な組織損傷の媒介物質である。免疫系の抗原性の各種
機能を十分に活用するために、脊椎動物は場所の異なる
生物の領域へ多様な抗原特異性を有するリンパ球を分配
させるための機構を進化させてきた〔Butcher, E. C.,
Curr. Top. Micro. Immunol. 128, 85 (1986)； Gallat
inら, Cell 44, 673 (1986)； Woodruffら, Immunol. T
oday 10, 23 (1989)； Yednockら,Adv. Immunol. 44. 3
13 (1989)〕。

【０００３】この機構には、細胞が最も高い移動性を有
する血液と、隔離されて加工された抗原とリンパ球が出
会うリンパ系器官の間のリンパ球の連続的な再循環が含
まれる。

【０００４】血液から第二のリンパ系器官、例えばリン
パ節（ＬＮ）および腸関連のバイヤー斑（ＰＰ）へのリ
ンパ球の交通は、高内皮細静脈（ＨＥＶ）の分化された
内皮細胞との接着性相互作用により開始されることは以
前から認められていた〔Bergら, Immunol. Rev. 108, 5
(1989)； DuijvestijnおよびHamann, Immunol. Today
10, 23 (1989)； Woodruffら, Annu. Rev. Immunol. 5,
201 (1987)； YednockおよびRosen, Adv. Immunol.44,
313 (1989)； Stoolman, Cell 56, 907 (1989)〕。リ
ンパ球のりンパ系器官−選択的な移動または「回帰（ho
ming）」の大きな部分がＨＥＶに対するリンパ球の器官
−特異的な結合により指図されていることは、多くの証
拠により示されている〔Butcher(1986), 上記〕。作用
上、ＨＥＶとの器官−選択的相互作用の基礎となってい
るリンパ球−関連分子は「回帰レセプター」と称され、
一方で同種の内皮分子は「ＨＥＶリガンド」として知ら
れている〔Gallatinら(1986), 上記；Rosen, Curr. Opi
n. Cell. Biol. 1, 913 (1989)〕。内皮性ＨＥＶリガン
ドは異なるリンパ系器官に対して特徴的であると仮定さ
れており、これらは各クラスのリンパ系器官に入るリン
パ球数の調節を担っていることが提唱されている〔Butc
her, Am. J. Pathol. 136, 3 (1990)〕。リンパ球交通
の基礎となっている詳細な分子機構の特徴付けは科学的
および臨床的な見地の両方から興味あるものであるが、
これは正常および病原性の両形態の白血球炎症において
同様の接着性の過程が関与しているかもしれないからで
ある〔Watsonら, Nature 349, 164-167 (1991)〕。

【０００５】回帰レセプターの中で、最も詳細に研究さ
れているものは末梢リンパ節回帰レセプター（pnＨＲ）
と最初に称されたレセプターである。このレセプター
は、ネズミの系においてＭＥＬ−１４モノクローナル抗
体（mAb）すなわち約９０kDの白血球表面抗原（gp９０
^MELと称される）を認識することが見いだされた抗体に
より最初に定義された〔Gallatinら, Nature 303, 30
(1983)〕。この抗体は、Ｓtamper-Woodruffインビトロ
接着試験において末梢および腸間膜リンパ節のＨＥＶに
対するリンパ球の接着をブロックすることおよびインビ
ボでリンパ節への移動を妨げることが見いだされた。gp
９０^MELに対する回帰機能は、界面活性剤により可溶化
された可溶性の組換え型のレセプターがＬＮ上のリンパ
球に対する接着部位を選択的にブロックすることができ
るがＰＰＨＥＶ上の接着部位をブロックする事ができな
いという発見により明確に示された〔GeoffroyおよびRo
sen,J. Cell. Biol. 109, 2463 (1989)〕。

【０００６】ネズミおよびヒトgg９０^MELレセプターを
コードしているｃＤＮＡの分子クローニングにより、細
胞外アミノ末端にカルシウム−型（Ｃ−型）レクチンド
メインを有し、続いてＥＧＦモチーフ、補体結合活性を
有するタンパク質において見いだされるモチーフに関連
した２つの補体調節モチーフ、トランスメンブラン・ド
メインおよび短い細胞質ゾルの尾部を有するトランスメ
ンブランタンパク質が明らかになった〔Laskyら, Cell
56, 1045 (1989)； Siegelmanら, Science (Wash., D.
C.)243, 1165 (1989)； Siegelmanら, Proc. Nat1. Aca
d. Sci. USA 86, 5562 (1989)； Tedderら, J. Exp. Me
d. 170 (1) 123 (1989)； Tedderら, J.Immunol. 144,
532 (1989)； Bowenら, J. Cell Biol. 109, 421 (198
9)； Cameriniら, Nature 342 (6245), 78 (1989)；共
に出願中の出願番号315,015(1989年2月23日提出)； WO
91/08298(1991年6月13日発行)〕。

【０００７】他の研究者らは好中球接着に関係する別の
分子を同定した。内皮性白血球接着分子ＥＬＡＭ−１と
称されるこの分子は誘導性接着分子であり、その役割は
炎症部位に隣接する細静脈内皮細胞への好中球の接着を
媒介することであろうと提案された〔Bevilacquaら, Pr
oc. Nat1. Acad. Sci. USA84, 9238 (1989)； Hession
ら, Proc. Nat1. Acad. Sci. USA87 (5), 1673 (199
0)〕。

【０００８】血小板のアルファ穎粒に含まれるタンパク
質の研究により、さらに穎粒膜タンパク質−１４０（Ｇ
ＭＰ−１４０）、血小板活性化依存性穎粒外膜タンパク
質（ＰＡＤＧＥＭ）またはＣＤ６２と様々に称される接
着分子の発見が導かれた〔McEverら, J. Biol. Celm, 2
59, 9799 (1984)； Bonfantiら, Blood73, 1109 (198
9)； Hattoriら, J. Biol. Chem. 264 (14), 7768 (198
9)〕。このレセプターをコードしているｃＤＮＡ配列はJ
ohnstonら〔Ce1156,1033(1989)〕により決定された。

【０００９】アミノ酸配列の比較により、これらの３つ
の接着分子は非常に極だった注目に値する様式で関連し
ていることが明らかになった。これらの共通のモザイク
構造はカルシウム依存性レクチンまたは炭水化物−結合
モチーフ、上皮増殖因子様（ＥＧＦ）モチーフ、および
変動数の補体調節（ＣＲ）モチーフからなる。これらの
モチーフを順に結合することにより、ＬＥＣ−ＣＡＭ
〔レクチンＥgf補体調節−細胞接着分子（Lectin Egf C
omplement regulatory-Cell Adhesion Molecule）〕と
いう名称が白血球内皮細胞接着分子のこの新しいファミ
リーに対して与えられている〔Stoolman, Cell 56:907
(1989)〕。また、このファミリーに対して「セレクチ
ン」という名称が適用されている〔Bevilacquaら, Scie
nce 243:1160(1989)； Gengら, Nature 343:757 (199
0)〕。

【００１０】細胞接着分子のＬＥＣ−ＣＡＭまたはセレ
クチンのファミリーの３つの構成員は：Ｌ−セレクチン
〔末梢リンパ節回帰レセプター（pnＨＲ）、ＬＥＣ−Ｃ
ＡＭ−１、ＬＡＭ−１、gp９０^MEL、gp１００^MEL、gp１
１０^MEL、ＭＥＬ−１４抗原、Leu−８抗原、ＴＯ−１抗
原、ＤＲＥＧ抗原としても知られる〕、Ｅ−セレクチン
（ＬＥＣ−ＣＡＭ-２、ＬＥＣＡＭ−２、ＥＬＡＭ−
１）およびＰ−セレクチン（ＬＥＣ−ＣＡＭ-３、ＬＥ
ＣＡＭ−３、ＧＭＰ−１４０、ＰＡＤＧＥＭ）である。
これらのレセプターを以下において「セレクチン」と称
する。セレクチンファミリー構成員およびそれらをコー
ドしている遺伝子の構造は図１および２にそれぞれ示
す。単純な単糖、例えばマンノース−６−ホスフェート
（Ｍ６Ｐ）およびフルクトース−１−ホスフェートがネ
ズミおよびヒトリンパ球の末梢リンパ節（pln）ＨＥＶ
との相互作用をブロックし得るという発見〔Stoolman
ら, J.Cell Biol. 96, 722 (1983)； Stoolmanら, J. C
ell Biol. 99, 1535 (1984)；Stoolmanら, Blood 70, 1
842 (1987)〕により、Ｌ−セレクチンにより認識される
内皮性リガンドが炭水化物を基本とするものであること
が示された。一連の実験において、RosenらはplnＨＥＶ
に対するリンパ球の回帰レセプター依存性結合が広スペ
クトルのシアリダーゼによるインビトロまたはインビボ
処理のどちらかにより完全に破壊されることを示した
〔Rosenら, Science( Wash., D.C.) 228、1005 (1985)；
Rosenら, J.Immunol. 142, 1895 (1989)〕。この酵素
はオリゴ糖から末端シアル酸残基を選択的に除去するか
ら、これらの結果はシアル酸が認識に対する重要な成分
であることを強く示唆した。

【００１１】続いてＬ−セレクチンにより認識される内
皮性分子の性質が、ヒトＩｇＧ１重鎖のヒンジ、ＣＨ２
およびＣＨ３領域に結合させたＬ−セレクチンの細胞外
ドメインからなる独特の組換えキメラを用いて精査され
た〔キメラについてはW0 91/08298（１９９１年６月１
３日発行）およびリンパ節高内皮細静脈の接着性リガン
ドに対するプローブとしてのその使用についてはWatson
ら, J. Cell Biol. 110, 2221 (1990)を参照〕。このい
わゆるレセプター−免疫グロブリンキメラを用いた最初
の実験により、このキメラが末梢および腸間膜リンパ節
−特異的ＨＥＶリガンドに接着し得ることが細胞ブロッ
クおよび免疫組織化学の実験において示された〔Watson
ら(1990), 上記〕。このＨＥＶリガンドの免疫組織化学
的な認識はシアリダーゼによるリンパ節切片の処理によ
り完全に破壊され、これにより、Ｌ−セレクチンにより
認識される炭水化物の構成成分はシアル酸様のものであ
ることが示され、さらにＬ−セレクチン介在性接着にお
けるレクチンドメインの重要性が強調された〔Rosenら,
Science (Wash. D. C.) 228, 1005-1007 (1985)；Rose
nら(1989), 上記およびTrueら, J. Cell Biol. 11, 275
7-2764 (1990)〕。これらの結果により、Ｌ−セレクチ
ン−免疫グロブリンキメラのplnＨＥＶリガンドに対す
る特異性が示され、このリガンドが回帰レセプター−介
在性細胞接着に必須の炭水化物残基を表わすことが確か
められた。

【００１２】最近の一連の文献により、Ｅ−セレクチン
リガンドも炭水化物の特性を有することが確認された。
広範囲の研究方法を採用しているいくつかの実験室で、
Ｅ−セレクチンリガンドはシアリルLewis^x（sＬex）と
して知られている炭水化物またはＣＤ６５もしくはＶＩ
Ｍ−２〔NeuAca２-３Galb１-４（Fuca１-３）GlcNAcb
１〕として知られている密接に関連した構造であること
が結論付けられた。Loweら〔Cell 63, 475(1990)〕は非
骨髄細胞をa１,３/４フコシルトランスフェラーーゼで
トランスフェクションしてＥ−セレクチンに対するリガ
ンド活性を生じさせたが、これはSlex決定基の発現と相
関していた。Goeltzら〔Cell 63 (6), 1349 (1990)〕
は、骨髄細胞中の実際のＥＬＡＭ−１リガンド合成に関
与していると思われるa１,３フコシルトランスフェラー
ゼを同定しクローン化した。より直接的な研究方法を用
いて、Phillipsら〔Science 250(4984), 1130 (1990)〕
およびWalzら〔Science 250(4984), 1132 (1990)〕はSl
ex−含有糖コンジュゲートまたはSlexに対する抗体のど
ちらかによるＥ−セレクチン依存性接着の阻害を示すこ
とができた。リガンド活性におけるシアル酸およびフコ
ース部分両方の重要な関与がこれらの実験において示さ
れた。最終的にTiemeyerら〔Proc. Nat1. Acad.Sci. US
A (1991)〕は、固相アッセイにおいてＥ−セレクチンに
よりトランスフェクションした細胞に対してリガンド活
性を有するいくつかの骨髄−由来の糖脂質を精製した。
精製されたＥ−セレクチン結合糖脂質の質量分光分析に
より、活性に必要な最小構造はＮ−アセチルグルコサミ
ン上にa１,３−結合したフコースを含有している第二の
内部Ｎ−アセチルラクトサミン単位を有するシリル化ラ
クトサミン（ＣＤ６５）であることが明らかになった。
Slex決定基の場合と同様に、シアル酸およびフコースの
両方が推定リガンドの結合活性に対して必須であった。

【００１３】また、Ｐ−セレクチンに対するリガンドの
同定においても進展があった。Larsenら〔Cell 63, 467
(1990)〕は、骨髄細胞上のＰ−セレクチンリガンドの重
要な成分としてLex決定基〔Galb１-４（a１−３Fuc）Gl
cNAc〕を示唆している。しかし、シアル酸も完全なリガ
ンド活性に対して、おそらくa２,３結合において必要と
される〔Corralら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1
72, 1349 (1990)； Mooreら, J. Cell Bio1. 112, 491
(1991)〕。Ｐ−セレクチンに対するリガンドはＥ−セレ
クチンに対するリガンドと同じであるかまたは非常に似
ている可能性があるが、これは特に両セレクチンが非常
に似た範囲の細胞種に結合するからである〔Poneyら, P
roc. Nat1. Acad. Sci. USA 88, 6224 (1991)〕。

【００１４】セレクチン構造における著しい相同性なら
びに既に示されたリガンドにおける類似性により、これ
らリガンドは関連しているが微妙に異なる構造を有する
ものと示唆される。

【００１５】本発明の目的は、セレクチンリガンドを精
製するための方法を提供することである。

【００１６】本発明の別の目的は、精製されたセレクチ
ン、特にＬ−セレクチンのリガンドを提供することであ
る。

【００１７】本発明のさらに別の目的は、セレクチン糖
タンパク質リガンドをコードしている核酸配列を提供す
ることである。

【００１８】他の目的は、セレクチンリガンドのアミノ
酸配列を決定すること、およびこれらリガンド上の（Ｏ
−およびＮ−結合性）グリコシル化部位を同定すること
である。さらに他の目的は、天然には見られないセレク
チンリガンドのアミノ酸配列および／またはグリコシル
化変異体の製造を可能にすることである。

【００１９】さらに別の態様において本発明は、炭水化
物を基本とするセレクチンリガンドの決定基に類似した
セレクチン阻害物質を設計する方法を提供する。

【００２０】本発明のこれらおよび他の目的は当業者に
は明らかであろう。

【００２１】発明の要旨 ＨＥＶ−関連リガンドについての本発明者らの最初の分
析は、ＨＥＶ代謝の独特の態様を利用するものであっ
た。Andrewsらによる初期の研究〔J. Cell Sci.57, 277
(1982)〕により、本来の位置のＨＥＶは大量の無機ス
ルフェートを高分子中に取り込むという点において特徴
的であることが示された。ゆえに、本発明者らは器官培
養において³⁵Ｓ−硫酸塩でラベルされたリンパ節から無
機硫酸塩−ラベル化物質を沈殿させるＬ−セレクチン−
ＩｇＧキメラの能力を分析した。顕著な５０kD成分およ
び比較的弱い９０kD分子（SgP⁵⁰およびＳgp⁹⁰）がリン
パ節から沈殿したが、これらは試験した他のどの器官に
おいても存在しなかった。Ｌ−セレクチン−ＩｇＧキメ
ラを用いたこれらの成分の沈殿はカルシウム−依存性で
あり、ＭＥＬ−１４ mAbおよび特異的な炭水化物の両
方に感受性であることが示された。この反応は、硫酸塩
一ラベル化タンパク質のシアリダーゼによる処理または
炭水化物ポリマーであるフコイジンを反応中に含めるこ
とにより完全に阻害することができた。最終的に、pln
ＨＥＶのいわゆる「血管性アドレシンス（addressin
s）」と選択的に反応してリンパ球に対する接着をブロ
ックするＭＥＣＡ−７９と称するモノクローナル抗体が
両成分を沈殿させた。予備的な生化学的分析により、〜
５０kDおよび〜９０kDのＬ−セレクチンリガンドはトリ
プシン−感受性の糖タンパク質であり、主にＯ−結合性
の鎖を含んでいることが明らかになった〔Imaiら, J. C
ell Bio1. 113, 1213(1991)を参照〕。Ｏ−結合性鎖の
発見は、Ｏ−結合性領域が細胞表面糖タンパク質を非常
に拡張された堅い構造にし〔Jentoftら, Trends in Bio
chem Sci. 15, 291 (1990）〕、従って認識機能を発揮
するためにそれを理想的に配置することが明らかである
ので重要である。フコース、硫酸塩およびシアル酸がこ
れらの分子のＯ−結合性鎖において見られ、フコースは
シアル酸と同様に完全なリガンド活性にとって必要であ
ると考えられている。

【００２２】Ｌ−セレクチンにより認識される内皮性リ
ガンドの性質をさらに特徴付けるために、本発明者らは
硫酸化した〜５０kDＨＥＶ糖タンパク質をＬ−セレクチ
ン−ＩｇＧキメラを用いてアフィニティー精製するとい
う新規な研究方法を採用した。精製した糖タンパク質を
Ｎ末端アミノ酸配列決定法に供し、この配列情報を利用
してこのＬ−セレクチンリガンドのタンパク質成分をコ
ードしているｃＤＮＡをクローン化した。このｃＤＮＡ
は、Ｌ−セレクチンのレクチンドメインに炭水化物を提
供する足場として機能するらしいＯ−結合に富む（ムチ
ン様）新規な糖タンパク質をコードすることが見いださ
れた。実験の詳細ならびにこの発見およびその説明は実
施例中に提供する。

【００２３】本発明は、セレクチンリガンドをコードし
ているヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関
する。

【００２４】好ましくは、該核酸分子は図４に示すアミ
ノ酸配列を有するタンパク質をコードしているヌクレオ
チド配列の相補体にハイブリダイズし得るヌクレオチド
配列からなる。

【００２５】別の態様において、該核酸分子は図４に示
すアミノ酸配列と約４０％より大きい相同性を有するア
ミノ酸配列を有するセレクチンリガンドタンパク質をコ
ードしているヌクレオチド配列からなる。

【００２６】さらに別の態様において、該核酸分子は以
下の（ａ）〜（ｃ）からなる群がら選択される： （ａ）天然のセレクチンリガンド遺伝子のコード化領域
由来のヌクレオチド配列を有しているｃＤＮＡクロー
ン； （ｂ）（ａ）のクローンに低ストリンジェンシー条件下
でハイブリダイズし得るＤＮＡ配列；および （ｃ）セレクチン分子の天然に存在するリガンドの生物
学的性質を有する糖タンパク質をコードする（ａ）およ
び（ｂ）の任意のＤＮＡ配列の遺伝的変異体。

【００２７】さらに本発明の核酸分子は免疫グロブリン
定常ドメインをコードしているヌクレオチド配列を含ん
でいてよい。

【００２８】別の態様において本発明は、発現媒体であ
って、該媒体で形質転換された宿主細胞により認識され
る制御配列に機能的に結合されたセレクチンリガンド、
好ましくはＬ−セレクチンリガンドをコードしているヌ
クレオチド配列を含む発現媒体に関する。

【００２９】また別の態様において、本発明は上記の発
現媒体で形質転換された宿主細胞および該形質転換宿主
細胞を培養してセレクチンリガンドを発現させる方法に
関する。

【００３０】さらに別の態様において、本発明はセレク
チン分子の天然に存在するリガンドの生物学的性質を有
するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関す
る。該ポリペプチドは内皮細胞表面糖タンパク質の細胞
外領域を含んでいてよい。別の態様において、該ポリペ
プチドはＳgp５０またはＳgp９０である。

【００３１】本発明のポリペプチドは、好ましくはセレ
クチン−結合部分をそのレセプターに供することが可能
な立体構造を有するアミノ酸配列を含む。

【００３２】特定の態様において、前述のポリペプチド
は図４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコード
しているヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズし
得る核酸によりコードされるアミノ酸配列を含む。

【００３３】さらに特定の態様において、上記のポリペ
プチドは同じ動物種の天然に存在する他のタンパク質を
実質的に含まない天然のセレクチンリガンドである。

【００３４】さらに別の態様において、本発明は上に定
義したポリペプチドであって、さらに免疫グロブリン定
常ドメイン配列を含むポリペプチドに関する。

【００３５】他の態様において本発明は、上に定義した
ポリペプチド（糖タンパク質セレクチンリガンド）を、
対応するセレクチンレセプターのその天然リガンドに対
する結合を有効にブロックする量で非毒性の薬学的に許
容し得る賦形剤と共に含む組成物に関する。

【００３６】別の態様において、本発明は循環白血球の
内皮細胞への過剰な結合と関連した徴候または症状を治
療する方法であって、そのような治療を必要とする患者
に、循環白血球上のＬ−セレクチンレセプターのその内
皮リガンドに対する結合をブロックするに有効な量で上
に定義したポリペプチドを投与することからなる方法に
関する。

【００３７】また別の態様において、本発明はセレクチ
ンリガンドのタンパク質部分に対して免疫反応性の抗体
に関する。好ましい抗体は各々のセレクチンリガンドと
結合するが、他の任意の既知のリガンドとは実質的に交
差−反応せず、セレクチンリガンドのそのレセプターに
対する結合を妨げるであろう。抗−セレクチンリガンド
抗体は固定化することができ、この形態では、例えば本
発明のセレクチンリガンドの検出または精製に有用であ
る。

【００３８】さらに別の態様において、本発明は以下の
方法からなるセレクチンリガンドの存在を測定するため
の方法に関する： ａ）セレクチンリガンドをコードしている核酸または該
核酸の相補鎖を核酸の試験サンプルにハイブリダイズさ
せるか；または ｂ）セレクチンリガンドをコードしている核酸に基づく
プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い；そし
て ｃ）セレクチンリガンドの存在を測定する。

【００３９】さらに別の態様において、本発明はセレク
チンリガンドを精製するための方法であって、対応する
セレクチンおよび免疫グロブリン重鎖配列を含むキメラ
に該リガンドを吸収させることからなる方法を提供す
る。

【００４０】さらに本発明はセレクチン−結合部分を対
応するセレクチンに供する方法であって、セレクチンリ
ガンド糖タンパク質のタンパク質コアに該部分を結合さ
せることによる方法に関する。

【００４１】Ｉ．定義 「セレクチンリガンド」の用語およびその文法的な変化
形は、セレクチン分子の天然に存在するリガンドと共通
する質的な生物学的性質を有するポリペプチドを指すの
に用いる。

【００４２】本明細書中の「生物学的性質」は、セレク
チン分子の天然に存在するリガンドまたはその任意の結
果物により直接または間接的に発揮されるインビボでの
エフェクターまたは抗原性の機能または活性を意味す
る。エフェクター機能にはレセプター結合、あらゆる酵
素活性または酵素変調活性、あらゆる担体結合活性、あ
らゆるホルモン活性、細胞外マトリックスまたは細胞表
面分子への細胞の接着を促進または阻害するあらゆる活
性、またはあらゆる構造的な役割が含まれる。抗原性の
機能とはセレクチン分子の天然に存在するリガンドに対
して生成させた抗体と交差反応し得るエピトープまたは
抗原性部位の保持を本質的に意味する。

【００４３】「生物学的に活性な」セレクチンリガンド
はセレクチン分子の天然に存在するリガンドのエフェク
ター機能を共有し、これはさらに抗原性機能を有するこ
ともあるがその必要はない。

【００４４】本発明の目的のために定義したセレクチン
リガンドは、好ましくはセレクチンに結合する質的な能
力を有し、セレクチンのレクチンドメインにその炭水化
物を供することができるＯ−結合に富むムチン型の棒状
の構造を有する配列を含む。

【００４５】さらに好ましい態様において、セレクチン
リガンドは図４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
をコードしているヌクレオチド配列の相補鎖と（低スト
リンジェンシー条件下で）ハイブリダイズし得るヌクレ
オチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む。

【００４６】セレクチンリガンドのタンパク質コアのア
ミノ酸配列は、図４に示すアミノ酸配列と好ましくは約
４０％相同より大きく、より好ましくは約６０％相同よ
り大きく、さらに好ましくは約７０％相同より大きく、
またさらに好ましくは約８０％相同より大きく、そして
最も好ましくは少なくとも約９０％相同である。

【００４７】「相同」とは、配列を整列させて必要なら
最大パーセントの相同を得るために間隙を導入した後に
図４に示すアミノ酸配列中の残基と同一の候補アミノ酸
配列中の残基の百分率と定義される。

【００４８】「セレクチンリガンド」の用語は、セレク
チン分子の天然に存在するリガンドが保持する生物学的
性質を質的に保有し、かつ好ましくはそれらのレセプタ
ーに結合する質的な能力を有するならば、天然のセレク
チンリガンドのアミノ酸およびグリコシル化変異体なら
びにその誘導体、例えば共有結合修飾により得られる誘
導体を特に包含する。

【００４９】該用語は、安定な血漿タンパク質に融合さ
せたセレクチンの天然に存在するリガンドと共通した生
物学的性質を有するアミノ酸配列を含む糖タンパク質を
特に包含する。

【００５０】「安定な血漿タンパク質」とは通常は約３
０から約２０００残基を有するタンパク質であり、その
天然の環境において循環中の長い半減期、すなわち約２
０時間より大きな半減期を示すタンパク質である。適当
かつ安定な血漿タンパク質の例として免疫グロブリン、
アルブミン、リポタンパク質、アポリポタンパク質およ
びトランスフェリンが挙げられる。天然に存在するセレ
クチンリガンドと共通する質的な生物学活性を有するア
ミノ酸配列は、通常Ｃ末端で安定な血漿タンパク質配
列、例えば免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合され
る。

【００５１】「免疫グロブリン」の用語は通常軽鎖また
は重鎖を含むポリペプチドであって両方が通常は天然の
“Ｙ”配置にジスルフィド結合されたものを示すが、そ
れらの間の他の結合（それらの四量体または集合体を含
む）は本発明の範囲内にある。

【００５２】免疫グロブリン（Ｉｇ）およびその特定の
変異体は既知であり、多くは組換え細胞培養において製
造されている。例えば、米国特許4, 745, 055；EP256,
654； Faulknerら, Nature 298: 286 (1982)； EP 120,
694； EP 125, 023； Morrison, J. Immun. 123: 793
(1979)； Kohlerら, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA77:2
197 (1980)； Rasoら, Cancer Res. 41:2073 (1981):Mo
rrisonら, Ann. Rev. Immunl.2:239 (1984)； Morriso
n, Science 229:1202 (1985)；Morrisonら, Proc. Nat'
l.Acad. Sci. USA81:6851 (1984)； EP 255, 694； EP
266, 663；およびW088/03559を参照。また、再分類され
た免疫グロブリン鎖が知られている。例えば、米国特許
4, 444, 878； W0 88/03565； およびEP 68, 763および
それらの中で引用されている文献を参照。リガンド結合
タンパク質−安定な血漿タンパク質キメラおよび特にＬ
−セレクチン−免疫グロブリンキメラは、例えばW0 91/
08298（１９９１年６月１３日発行）中に開示されてい
る。本発明のキメラにおける免疫グロブリン部分はＩｇ
Ｇ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ、
ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得ることがで
きるが、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３が好ましい。

【００５３】セレクチン、例えばＬ−セレクチンの結合
は、Imaiら〔J. Cell Biol. 113, 1213 (1991)〕により
本質的に開示されているように、例えば放射ラベル化
（例えば³⁵Ｓ−ラベル化）リガンドの固定化レセプター
−免疫グロブリンキメラに対する結合を可溶性の阻害物
質の存在または不在下で測定することによりアッセイす
ることができる。別法としてまたはさらに、各々のレセ
プターを発現している細胞に対する接着を用いてリガン
ドの結合をアッセイすることができる。例えば、ＥＬ−
４細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ３９）はその表面に高レベル
のＬ−セレクチンを発現することが知られており、ゆえ
にＬ−セレクチンリガンドに対する細胞接着アッセイに
おいて用いることができる。接着細胞は乳酸デヒドロゲ
ナーゼ活性により定量することができる〔Bradleyら,
J, Cell. Biol. 105, 991 (1987)〕。

【００５４】「…をコードしている核酸分子」、「…を
コードしているＤＮＡ配列」および「…をコードしてい
るＤＮＡ」の用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデ
オキシリボヌクオチドの順序または配列を示す。これら
のデオキシリボヌクオチドの順序によりポリペプチド鎖
に沿ったアミノ酸の順序が決定される。このようにして
ＤＮＡ配列はアミノ酸配列をコードする。

【００５５】核酸またはタンパク質と関連して用いる
「単離された」という用語は、その天然の供給源におい
て通常伴なわれる少なくとも１つの汚染性核酸またはタ
ンパク質から同定および分離された核酸またはタンパク
質を指す。単離された核酸またはタンパク質は天然に見
られるものとは異なる形または配置で存在する。しか
し、セレクチンリガンドをコードしている単離された核
酸には、核酸が天然細胞の染色体位置とは異なる位置に
あるか、またはその他では天然に見られるＤＮＡ配列と
は異なる配列と境界を接しているセレクチンリガンドを
通常発現している細胞中の核酸が含まれる。

【００５６】「低ストリンジェンシー条件」は、２０％
ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０mM ＮａＣｌ、１５
mMクエン酸三ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム
（pH７．６）、５×Denhardt溶液、１０％硫酸デキスト
ラン、および２０μg/mlの変性勇断サケ精子ＤＮＡから
なる溶液中、３７℃で一晩のインキュベーションとその
後の１×ＳＳＣ中、約５０℃でのフィルターの洗浄をい
う。

【００５７】核酸は、別の核酸配列と機能的な関係にな
るよう配置されているとき「機能的に結合」されてい
る。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮ
Ａは、もしそれがポリペプチドの分泌に関係するプレタ
ンパク質として発現されるならポリペプチドをコードし
ているＤＮＡに機能的に結合されており；プロモーター
またはエンハンサーは、もしそれが配列の転写に影響を
及ぼすならコード化配列に機能的に結合されており；ま
た、リボソーム結合部位はもしそれが翻訳を容易にする
ように配置されるならコード化配列に機能的に結合され
ている。「機能的に結合」とは、通常、結合されたＤＮ
Ａ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合には隣接し
ており読み取り相内にあることを意味する。しかし、エ
ンハンサーは隣接している必要はない。結合は都合のよ
い制限部位での連結により行う。もしそのような部位が
存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドアダプター
またはリンカーを常法に従い用いる。

【００５８】「複製可能な発現媒体」および「発現媒
体」の用語は、通常二本鎖の外来ＤＮＡ片をその中に挿
入することができるＤＮＡ片を示す。外来ＤＮＡは異種
ＤＮＡとして定義され、これは宿主細胞中には天然には
見られないＤＮＡである。この媒体を用いて外来または
異種ＤＮＡを適当な宿主細胞中に移入する。宿主細胞中
で媒体が宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製することが
できたなら、媒体およびその挿入された（外来）ＤＮＡ
のいくつかのコピーを生成することができる。さらに、
該媒体は外来ＤＮＡのポリペプチドヘの翻訳を可能にす
る必要成分を含む。このようにして、外来ＤＮＡがコー
ドする多くのポリペプチド分子を迅速に合成することが
できる。

【００５９】本発明の文脈において、「細胞」、「セル
ライン」および「細胞培養物」の表現は交換可能に用い
られ、このような表示の全ては子孫を含む。さらに全て
の子孫が意図的または偶然の突然変異により、ＤＮＡ内
容において正確に同一ではないこともあることは理解さ
れるであろう。元の形質転換細胞においてスクリーニン
グしたときに同じ機能または生物学的性質を有する突然
変異子孫が包含される。

【００６０】「形質転換された宿主細胞」および「形質
転換された」の用語は細胞へのＤＮＡの導入を意味す
る。細胞は「宿主細胞」と称され、原核細胞または真核
細胞であってよい。通常の原核宿主細胞にはE. coliの
様々な株が含まれる。通常の真核宿主細胞は哺乳動物、
例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞またはヒト胎児
腎臓２９３細胞である。導入されるＤＮＡは通常挿入さ
れたＤＮＡ断片を含有するベクターの形態にある。導入
されるＤＮＡ配列は宿主細胞と同じ種からまたは宿主細
胞とは異なる種から得てよく、また、一部の外来ＤＮＡ
と一部の同族ＤＮＡを含有しているハイブリッドＤＮＡ
配列であってもよい。

【００６１】「連結」は２つの核酸フラグメントの間に
ホスホジエステル結合を形成させる過程を意味する。Ｄ
ＮＡフラグメントを共に連結するために、それらの末端
は適合性でなければならない。いくつかの場合におい
て、末端はエンドヌクレアーゼ消化の後に直接適合性と
なるであろう。しかし、エンドヌクレアーゼ消化の後に
通常生成する付着末端を最初に平滑末端に変換して連結
用にそれらを適合性にすることが必要になることもあ
る。平滑末端にするために、ＤＮＡを適当な緩衝液中、
１５℃で少なくとも１５分間、約１０単位のＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノウフラグメントまたはＴ４ ＤＮＡ
ポリメラーゼを４つのデオキシリボヌクレオチド三リン
酸の存在下で用いて処理する。次いで該ＤＮＡをフェノ
ール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精
製する。共に連結すべきＤＮＡフラグメントを約等モル
量で溶液に入れる。さらに該溶液は、ＡＴＰ、リガーゼ
緩衝液、およびＴ４ＤＮＡリガーゼなどのりガーゼをＤ
ＮＡ０．５μg当たり約１０単位で含むであろう。ＤＮ
Ａをベクター中に連結するときには、ベクターをまず適
当な制限エンドヌクレアーゼを用いて線状にする。次い
で線状にされたフラグメントを細菌性アルカリホスファ
ターゼまたは子ウシ腸ホスファターゼで処理して連結工
程中の自己一連結を防ぐ。

【００６２】「アミノ酸」および「複数のアミノ酸」の
用語は、天然に存在する全てのＬ−α−アミノ酸を意味
する。この定義はノルロイシン、オルニチン、およびホ
モシステインを含むことを意図している。アミノ酸は一
文字または三文字表記のどちらかにより識別される： Ａｓｐ Ｄ アスパラギン酸 Ｉｌｅ Ｉ イソロイシン Ｔｈｒ Ｔ トレオニン Ｌｅｕ Ｌ ロイシン Ｓｅｒ Ｓ セリン Ｔｙｒ Ｙ チロシン Ｇｌｕ Ｅ グルタミン酸 Ｐｈｅ Ｆ フェニルアラニン Ｐｒｏ Ｐ プロリン Ｈｉｓ Ｈ ヒスチジン Ｇｌｙ Ｇ グリシン Ｌｙｓ Ｋ リシン Ａｌａ Ａ アラニン Ａｒｇ Ｒ アルギニン Ｃｙｓ Ｃ システイン Ｔｒｐ Ｗ トリプトファン Ｖａｌ Ｖ バリン Ｇｌｎ Ｑ グルタミン Ｍｅｔ Ｍ メチオニン Ａｓｎ Ｎ アスパラギン。

【００６３】これらアミノ酸はその側鎖の化学的組成お
よび性質により分類することができる。これらは大きく
は２つのグループ、荷電および非荷電のグループに分類
される。これらのグループの各々はアミノ酸をより正確
に分類するためにサブグループに分割される： Ｉ．荷電アミノ酸 酸性残基：アスパラギン酸、グルタミン酸 塩基性残基：リシン、アルギニン、ヒスチジン

【００６４】II．非荷電アミノ酸 親水性残基：セリン、トレオニン、アスパラギン、グル
タミン 脂肪族残基：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、
イソロイシン 非極性残基：システイン、メチオニン、プロリン 芳香族残基：フェニルアラニン、チロシン、トリプトフ
ァン。

【００６５】「改変」、「アミノ酸配列の改変」、「変
異体」および「アミノ酸配列変異体」は、セレクチン、
例えばＬ−セレクチンのリガンドの天然の配列と比較し
たときにそのアミノ酸配列においていくらかの相違を有
する分子を意味する。通常、変異体は天然のセレクチン
リガンドと少なくとも７０％の相同性を有するであろう
が、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少
なくとも約９０％の天然セレクチンリガンドとの相同性
を有するであろう。本発明の範囲内にあるアミノ酸配列
変異体は、天然セレクチンリガンドのアミノ酸配列内の
特定の位置に置換、欠失、および／または挿入を有す
る。置換による変異体は、天然の配列において少なくと
も１個のアミノ酸残基が除去されて同じ位置に異なるア
ミノ酸が挿入されたものである。置換は１個（分子中の
唯一のアミノ酸が置換される）であってよく、また、多
数（同じ分子中で２またはそれ以上のアミノ酸が置換さ
れる）であってもよい。

【００６６】リガンドの性質における大きな変化は、電
荷および／または構造において天然のアミノ酸とは有意
に異なる側鎖を有するアミノ酸と置換することにより得
ることができる。この型の置換はポリペプチドの背骨構
造および／または置換領域における分子の電荷または疎
水性に影響を及ぼすことが予想されるであろう。

【００６７】電荷および／または構造が天然分子と似て
いる側鎖を有するアミノ酸と置換することにより、リガ
ンドの性質の穏やかな変化が予想される。保存的置換と
称されるこの型の置換は、ポリペプチドの背骨構造また
は置換領域における分子の電荷もしくは疎水性のどちら
も大きく改変されることは予想されないであろう。

【００６８】挿入変異体は、天然セレクチンリガンド配
列中の特定位置のアミノ酸に直接隣接して１またはそれ
以上のアミノ酸が挿入された変異体である。アミノ酸に
直接隣接してとは、アミノ酸のα−カルボキシまたはα
−アミノ官能基のどちらかに結合されることを意味す
る。その挿入は１またはそれ以上のアミノ酸であってよ
い。通常、この挿入は１または２個の保存的アミノ酸か
らなるであろう。挿入部位に隣接するアミノ酸に電荷お
よび／または構造が似ているアミノ酸は保存的であると
定義される。また、本発明は挿入部位に隣接するアミノ
酸とは実質的に異なる電荷および／または構造を有する
アミノ酸の挿入を包含する。

【００６９】欠失変異体は、天然のセレクチンリガンド
アミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が除
去された変異体である。通常、欠失変異体は１または２
個のアミノ酸が分子の特定の領域において欠失されてい
るであろう。

【００７０】本発明のセレクチンリガンドのタンパク質
コアの必須の役割は、セレクチンレセプターにより認識
される特異的な炭水化物構造を各々のレセプターに対し
て提供することである。

【００７１】従って、Ｌ−セレクチンリガンドアミノ酸
配列の２つの高度にＯ−グルコシル化された、セリンお
よびトレオニンに富む領域（図４中のアミノ酸４２〜６
３およびアミノ酸９３〜１２２）内のあらゆる改変は、
タンパク質の他の領域における変化よりもリンパ球一高
内皮細静脈相互作用に対して一層有意な効果を有するこ
とが予想される。以下に示すように、高度Ｏ−グルコシ
ル化領域は、セリンおよびトレオニン残基に接着した多
数のＯ−結合性炭水化物リガンドが白血球表面局在化Ｌ
−セレクチンのレクチンドメインに対して適切に提供さ
れるのを可能にし、これにより炭水化物依存性の接着相
互作用を媒介する、堅い剛直な「瓶洗いブラシ」構造を
得るのに必須である。これらの領域内の改変は、レセプ
ター結合活性が対応する天然リガンドのものとは有意に
異なるであろう分子を与える結果になることが予想され
る。

【００７２】本発明の糖タンパク質リガンドには、フコ
ース、シアル酸および陰イオン性成分、好ましくはＯ−
結合性炭水化物成分として硫酸エステルが含まれ、そし
てシアル酸と同様にフコースおよび硫酸エステルが完全
なリガンド活性のために必要であると考えられる。

【００７３】本発明の糖タンパク質リガンドの具体的な
炭水化物成分の例は以下のように表記することができ
る： NeuNAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc NeuNAcA2-3Galβ1-4GlcNAcB1-3GalB1-4(FucA1-4(FucA1-
3)GlcNAc。

【００７４】「ノーザンブロット分析」は、既知のプロ
ーブ、例えばオリゴヌクオチド、ＤＮＡフラグメント、
ｃＤＮＡまたはそのフラグメント、またはＲＮＡフラグ
メント等にハイブリダイズするＲＮＡ配列を同定するた
めに用いられる方法である。該プローブは³²Ｐなどの放
射性同位元素を用いて、またはビオチン化により、また
は酵素を用いてラベルする。分析すべきＲＮＡは、当分
野で周知の標準的な方法を用いて〔例えばSambrookら,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York:
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989のセクシ
ョン7.39〜7.52に開示されているように〕、通常アガロ
ースまたはポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により
分離し、ニトロセルロース、ナイロン、または他の適当
な膜に移し、プローブとハイブリダイズさせる。

【００７５】「オリゴヌクレオチド」は、既知の方法に
より〔例えばホスホトリエステル、亜リン酸、またはホ
スホルアミダイト化学、EP 266, 032（１９８８年５月
４日発行）に開示されているような固相法を用いて、ま
たはFroehlerら, Nucl. Acids Res. 14, 5399 (1986)に
より開示されているデオキシヌクレオシドＨ−ホスファ
ネート中間体を経て〕、化学的に合成される短い一本ま
たは二本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。次いで
それらをポリアクリルアミドゲルで精製する。

【００７６】本明細書中で用いる「ポリメラーゼ連鎖反
応」または「ＰＣＲ」の方法は、通常核酸、ＲＮＡおよ
び／またはＤＮＡの微量の特定断片を、米国特許番号4,
683,195（１９８７年７月２８日発行）およびCurrent P
rotocols in Molecular Biology, Ausubelら編, Greene
Publishing Associates and Wiley-Interscience 199
1, Volume 2, Chapter15に記載されているように増幅さ
せる方法を指す。

【００７７】「形質転換」は、ＤＮＡが複製可能である
ようにＤＮＡを染色体外成分としてまたは染色体組込み
により生物に導入することを意味する。

【００７８】「トランスフェクション」は、任意のコー
ド化配列が実際に発現されるか否かを問わず宿主細胞に
よる発現ベクターの取り込みを意味する。

【００７９】「処置」、「処置する」の用語およびその
文法的な変化形は最も広い意味で用い、ある種の所望で
ない徴候または状態を予防および改善することを含む。

【００８０】「気相微量配列決定」は以下の方法に基づ
いて行った。精製したタンパク質を、１２０Ａ ＰＴＨ
アミノ酸アナライザーを装着したモデル４７０Ａ Appl
iedBiosystems気相シークェンサーを用いて自動化エド
マン分解により直接配列決定したか、または様々な化学
物質または酵素を用いて消化した後に配列決定した。Ch
rom Perfectデータシステム（Justice Innovations, Pa
lo Alto, CA）を用いてＰＴＨアミノ酸をまとめた。配
列の解釈はＶＡＸ １１／７８５ Digital Equipment
CorporationコンピューターでHenzelら〔J. Chromatogr
aphy 404, 41 (1987)〕の開示のように行った。いくつ
かの場合においては、ＨＰＬＣ分画の一部を５〜２０％
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ＰＶＤ
Ｆ膜（ProBlott, ABI, Foster CIty, CA）に電気移動さ
せてクーマシー・ブリリアント・ブルーで染色する〔Ma
tsudaira, P. J., Biol. Chem.262,10035(1987)〕。特
定のタンパク質をＮ末端配列決定のためにプロットから
切り出した。内部タンパク質配列を決定するために、Ｈ
ＰＬＣ分画を真空下で乾燥し（SpeedVac）、適当な緩衝
液中に再懸濁し、臭化シアン、リシン−特異的酵素Ｌｙ
ｓ−Ｃ（Wako Chemicals, Rickmond, VA）またはＡｓｐ
−Ｎ（Boehringer Mannheim, Indianapolis,Ind.）で消
化した。消化後、得られたペプチドを混合物として配列
決定するか、または０．１％TFA中のプロパノール勾配
で展開したＣ４カラムのＨＰＬＣにより分離した後に上
記のように配列決定する。

【００８１】本明細書中で用いる「モノクローナル抗
体」は実質的に同種の抗体の群がら得られる抗体を意味
する。すなわち少量で存在することがある天然の可能な
突然変異体を除いて、群を構成している個々の抗体が同
一である群がら得られる抗体を示す。ゆえに修飾語句
「モノクローナル」は、別個の抗体の混合物ではないと
いう抗体の特徴を示す。

【００８２】本発明の範囲内に含まれるモノクローナル
抗体は、起源の種または免疫グロブリンのクラスもしく
はサブクラス名称を問わず、抗−セレクチンリガンド抗
体の可変（超可変を含む）ドメインと定常ドメインのス
プライスによって製造されるハイブリッドおよび組換え
抗体（例えば「ヒト化」抗体）を含み（その一方だけが
セレクチンリガンドに対して指向性である）、軽鎖と重
鎖または１つの種から得た鎖と別の種から得た鎖のスプ
ライスによる抗体、または異種タンパク質との融合体、
ならびに抗体フラグメント〔例えば、Fab、F（ab'）₂お
よびFv〕を含む〔Cabillyら, 米国特許番号4, 816, 56
7； Mage & Lamoyi, Monoclonal Antibody Production
Techniques and Applications中,pp.79-97 (Marcel Dek
ker, Inc., NewYork, 1987)〕。

【００８３】従って、修飾語句「モノクローナル」はそ
のような実質的に同種の抗体の群がら得られる抗体の特
徴を示すものであり、任意の特定方法による抗体の製造
を必要とすると解釈すべきではない。

【００８４】II．一般的方法 Ａ．セレクチンリガンドをコードしているＤＮＡの入手 セレクチンリガンドをコードしているＤＮＡは、セレク
チンリガンドに対するmＲＮＡを保持し、かつそれを検
出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製さ
れる任意のｃＤＮＡライブラリーから入手することがで
きる。ゆえにＬ−セレクチンリガンド遺伝子は、（腸間
膜または末梢）リンパ節から調製されたｃＤＮＡライブ
ラリーから得ることができる。他のセレクチンリガンド
をコードしている遺伝子は他のｃＤＮＡライブラリーか
ら類似の方法で調製することができる。

【００８５】ライブラリーを、所望の遺伝子またはそれ
によりコードされるタンパク質を同定するために設計さ
れたプローブを用いてスクリーニングする。ｃＤＮＡ発
現ライブラリーのための適当なプローブには、通常、所
望のタンパク質を認識して特異的に結合するモノおよび
ポリクローナル抗体；同一または異なる種由来のセレク
チンリガンドｃＤＮＡの既知または推測の部分をコード
する長さが約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチド；お
よび／または同一もしくは類似の遺伝子をコードする相
補的または相同のｃＤＮＡまたはそれらのフラグメント
が含まれる。

【００８６】セレクチンリガンド、例えばＬ−セレクチ
ンリガンドをコードしている遺伝子を単離するための別
の手段は、Sambrookら, 上記のセクション１４またはCu
rrent Protocolsin Molecular Biology,上記のChapter
１５中に開示されているようにポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）法を使用するものである。

【００８７】また別の方法は、所望のセレクチンリガン
ドをコードしている遺伝子をEngelsら〔Agnew. Chem. I
nt. Ed. Engl. 28, 716 (1989)〕が開示している方法の
うちの１つを用いて化学的に合成するものである。これ
らの方法にはトリエステル、亜リン酸エステル、ホスホ
ルアミダイトおよびＨ−ホスホネート法、ＰＣＲおよび
他の自動プライマー法、および固相支持体上でのオリゴ
ヌクレオチド合成が含まれる。これらの方法は遺伝子の
全核酸配列が既知であるかまたは暗号鎖に対して相補的
な核酸の配列が利用可能である場合に用いることがで
き、または別法では標的アミノ酸配列が既知であるなら
ば、各アミノ酸残基に対する既知のそして好ましい暗号
残基を用いて可能性のある核酸配列を推測することがで
きる。

【００８８】本発明の実施のために好ましい方法は、注
意深く選択されたオリゴヌクレオチド配列を用いて様々
な組織、好ましくは哺乳動物リンパ節高内皮細静脈（Ｌ
−セレクチンリガンド）、または骨髄細胞（Ｅ−セレク
チンおよびＰ−セレクチンリガンド）由来のｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングするものである。好ましい
哺乳動物の中には、ヒトおよび次の順の構成員が含まれ
る：ウシ、ヒツジ、ウマ、ネズミおよび齧歯動物。

【００８９】プローブとして選択されるオリゴヌクレオ
チド配列は、偽陽性が最小限になるよう十分に明白な十
分な長さのものであるべきである。実際のヌクレオチド
配列は、通常セレクチンリガンド（例えばＬ−セレクチ
ンリガンド）の保存的または高度に相同なヌクレオチド
配列または領域に基づいている。

【００９０】上述の方法を用いるハイブリダイゼーショ
ンにより、図４に示すＤＮＡを用いて他のセレクチンリ
ガンドをコードしているＤＮＡを単離するかまたはＬ−
セレクチンリガンドをコードしているＤＮＡを別の動物
種から単離することができる。好ましい動物は哺乳動
物、特にヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、ネコ、イヌおよび
齧歯動物であり、とりわけヒト、ウシ、ラットおよびウ
サギである。

【００９１】Ｂ．アミノ酸配列変異体の構築 本発明のセレクチンリガンドのアミノ酸配列変異体は、
好ましくは野生型セレクチン、例えばＬ−セレクチンリ
ガンドのタンパク質コアをコードするＤＮＡ配列を突然
変異させることにより構築する。通常、ＤＮＡの特定の
領域または部位が突然変異誘発の標的となり、ゆえにこ
れを行うのに用いられる常法は部位特異的突然変異誘発
と称される。突然変異はＤＮＡ修飾酵素、例えば制限エ
ンドヌクアーゼ（特定の位置でＤＮＡを切断する）、ヌ
クレアーゼ（ＤＮＡを分解する）および／またはポリメ
ラーゼ（ＤＮＡを合成する）を用いて行う。

【００９２】１．単純欠失および挿入 Sambrookら（上記）のセクション１５．３に開示されて
いるように、ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化とそ
れに続く連結を欠失を生じさせるのに用いることができ
る。この方法を使用するために、外来ＤＮＡをプラスミ
ドベクターに挿入するのが好ましい。外来（挿入され
た）ＤＮＡおよびベクターＤＮＡの両方の制限地図が利
用可能でなければならないか、または、外来ＤＮＡおよ
びベクターＤＮＡの配列が既知でなければならない。外
来ＤＮＡはベクターには存在しない独特の制限部位を有
していなければならない。次いで適当な制限エンドヌク
レアーゼを用い酵素の製造者により示された条件下で、
外来ＤＮＡにおいてこれらの独特の制限部位の間でこれ
を消化することにより欠失を行う。用いられる制限酵素
が平滑末端または適合性末端を造るなら、Sambrookら
（上記）のセクション１．６８に開示されているように
該末端をバクテリオファージＴ４ ＤＮＡリガーゼなど
のりガーゼを用いて混合物を１６℃で１〜４時間、ＡＴ
Ｐおよびリガーゼ緩衝液の存在下でインキュベートする
ことにより共に直接連結することができる。該末端が適
合性でないならば、それらをまずＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレノウフラグメントまたはバクテリオファージＴ４
ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑にしなければならな
いが、その両方は消化されたＤＮＡの突出している一本
鎖末端を充填するために４つのデオキシリボヌクオチド
三リン酸を必要とする。別法では、該末端をヌクレアー
ゼ、例えばヌクレアーゼＳ１またはヤエナリヌクレアー
ゼを用いて平滑化することができる（その両方はＤＮＡ
の突出している一本鎖を短く切り込むことにより機能す
る）。次いで該ＤＮＡをリガーゼを用いて再連結する。
得られる分子は欠失変異体である。

【００９３】Sambrookら（上記）のセクション１５．３
に開示されているように類似の方法を用いて挿入変異体
を構築することができる。外来ＤＮＡの独特の制限部位
（複数の部位）での消化の後に、オリゴヌクレオチドを
外来ＤＮＡが切断された部位に連結する。該オリゴヌク
レオチドは挿入すべき所望のアミノ酸をコードするよう
に設計され、さらに指向性の連結が可能となるように消
化された外来ＤＮＡ末端と適合性の５′および３′末端
を有する。

【００９４】 ２．オリゴヌクレオチドー介在性突然変異誘発 オリゴヌクレオチドー指向性突然変異誘発は本発明の置
換変異体を製造するための好ましい方法である。また、
それを用いて本発明の欠失および挿入変異体を都合よく
製造することができる。この方法はAdelmanら〔DNA, 2:
183 (1983)〕により開示されているように当分野で周知
である。

【００９５】通常、少なくとも２５ヌクレオチドの長さ
のオリゴヌクレオチドを用いてｔ−ＰＡ分子中の２また
はそれ以上のヌクレオチドを挿入、欠失または置換す
る。最適のオリゴヌクレオチドは、突然変異をコードし
ているヌクレオチドの両側に完全に対合する１２〜１５
のヌクレオチドを有するであろう。これによりオリゴヌ
クレオチドが一本鎖ＤＮＡ鋳型分子に正しくハイブリダ
イズすることが確実になる。該オリゴヌクレオチドは、
例えばCreaら〔Proc. Nat'l. Acad. Sci, USA, 75:5765
(1978)〕により開示されているように当分野で周知の
方法を用いて容易に合成される。

【００９６】ＤＮＡ鋳型分子は、野生型のｃＤＮＡｔ−
ＰＡ挿入物を有するベクターの一本鎖の形態である。一
本鎖鋳型は、バクテリオファージＭ１３ベクター（市販
品として入手可能なＭ１３mp１８およびＭ１３mp１９ベ
クターが適当である）またはVeiraら〔Meth. Enzymol.,
153:3 (1987)〕により開示されている一本鎖ファージ
複製起点を含有するベクターのどちらかから得られるベ
クターによってのみ生成させることができる。従って、
一本鎖の鋳型を得るために、突然変異を起こすべきｃＤ
ＮＡ ｔＰＡをこれらのベクターの１つに挿入しなけれ
ばならない。一本鎖鋳型の製造はSambrookら（上記）の
セクション４．２１〜４．４１に開示されている。

【００９７】天然のセレクチンリガンド配列に突然変異
を起こさせるために、適当なハイブリダイゼーション条
件下でオリゴヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡ鋳型分子にア
ニーリングさせる。次いでＤＮＡ重合酵素、通常はE. c
oliＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを添加
する。この酵素はオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て利用して突然変異含有ＤＮＡ鎖の合成を完了させる。
ゆえに、一方のＤＮＡ鎖がベクター中に挿入された天然
のセレクチンリガンドをコードし、第二のＤＮＡ鎖が同
じベクター中に挿入されたセレクチンリガンドの突然変
異形をコードするようにヘテロ二本鎖分子が形成され
る。次いで、このヘテロ二本鎖を適当な宿主細胞、通常
はE. coli ＪＭ１０１などの原核生物中に導入する。細
胞を増殖させた後に、アガロースプレート上にプレート
し、３２−Ｐで放射ラベルされたオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いてスクリーニングしてタンパク質コア内
において突然変異したセレクチンリガンドを含有するコ
ロニーを同定する。これらのコロニーを選択し、ＤＮＡ
を配列決定して、分子のタンパク質コア中の突然変異の
存在を確認する。

【００９８】１を越えるアミノ酸が置換された突然変異
体をいくつかの方法のうちの１つで得ることができる。
アミノ酸がポリペプチド鎖中において共に近接して位置
しているなら、所望のアミノ酸置換の全てをコードする
１個のオリゴヌクレオチドを用いて同時に突然変異させ
ることができる。しかし、アミノ酸が互いに距離を置い
て位置している（例えば、１０を越えるアミノ酸により
分離されている）なら、全ての所望の変化をコードする
１個のオリゴヌクレオチドを得ることは比較的困難であ
る。その代わりに、２つの別法のうちの１つを用いるこ
とができる。第一の方法においては、置換すべき各アミ
ノ酸に対して別のオリゴヌクレオチドを生成させる。次
いでそのオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ＤＮＡに同時
にアニーリングさせると、その鋳型から合成された第二
のＤＮＡ鎖は全ての所望のアミノ酸置換をコードするで
あろう。もう一つの方法は、所望の突然変異体を製造す
るために２またはそれ以上の突然変異誘発の繰り返すこ
とからなる。初回は１個の突然変異について述べたもの
と同様である：天然のセレクチンリガンドのタンパク質
コアをコードしているＤＮＡを鋳型として用い、最初の
所望のアミノ酸置換コードしているオリゴヌクレオチド
をこの鋳型にアニーリングさせ、次いでヘテロ二本鎖Ｄ
ＮＡ分子を得る。二回目の突然変異誘発は初回の突然変
異誘発において製造された突然変異されたＤＮＡを鋳型
として用いる。ゆえに、この鋳型はすでに１またはそれ
以上の突然変異を含んでいる。次いで、別の所望のアミ
ノ酸置換をコードしているオリゴヌクレオチドをこの鋳
型にアニーリングさせると、この時に得られるＤＮＡ鎖
は初回および二回目の突然変異誘発の両方から生じた突
然変異をコードしている。この得られたＤＮＡを第三回
目以降の突然変異誘発における鋳型として用いることが
できる。

【００９９】３．ＰＣＲ突然変異誘発 さらにＰＣＲ突然変異誘発が本発明のセレクチンリガン
ドのアミノ酸変異体を製造するのに適している。以下の
記載はＤＮＡについて示すものであるが、本法はＲＮＡ
にも適用できることは理解されるところである。通常Ｐ
ＣＲ法とは以下の方法を意味する。ＰＣＲにおいて少量
の鋳型ＤＮＡを出発物質として用いる場合には、鋳型Ｄ
ＮＡ中の対応する領域とは配列が若干異なるプライマー
を用いて、プライマーが鋳型と異なっている位置でのみ
鋳型配列と異なる比較的大量の特異的なＤＮＡフラグメ
ントを得ることができる。突然変異をプラスミドＤＮＡ
中に導入するために、プライマーのうちの１つを突然変
異の位置と重なりかつその突然変異を含むように設計す
る。他のプライマーの配列はプラスミドの対立鎖の配列
の一部と同一でなければならないが、この配列はプラス
ミドＤＮＡに沿った任意の場所に位置させることができ
る。しかし、最終的にプライマーにより囲まれたＤＮＡ
の全増幅領域を容易に配列決定し得るように、その第二
のプライマーの配列は第一の配列から２００ヌクレオチ
ド以内に位置させるのが好ましい。上記の様にプライマ
ー対を用いるＰＣＲ増幅により、プライマーにより指定
された突然変異の位置において、また、鋳型のコピーは
いくらか誤る傾向があるので他の位置において異なるＤ
ＮＡフラグメントの一群が得られる。

【０１００】生成物質に対する鋳型の比率が非常に低い
ならば、生成物ＤＮＡフラグメントの大部分が所望の突
然変異を含む。この生成物質を用いて通常のＤＮＡ法に
よりＰＣＲ鋳型として働いたプラスミド中の対応する領
域を置き換える。別々の位置における突然変異は、突然
変異体である第二のプライマーを用いるか、または異な
る変異体プライマーを用いて二回目のＰＣＲを行って２
つの得られたＰＣＲフラグメントを３部分（またはそれ
以上）連結においてベクターフラグメントに同時に連結
することにより同時に導入することができる。

【０１０１】Ｃ．複製可能なベクターへのＤＮＡの挿入 本発明の（天然または変異体）セレクチンリガンドをコ
ードしているｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを、さらにク
ローニングまたは発現を行うために複製可能なベクター
に挿入する。多くのベクターが利用可能であり、適当な
ベクターの選択は、１）ＤＮＡ増幅（クローニング）に
用いるのかまたは発現のために用いるのか、２）ベクタ
ーに挿入すべきＤＮＡのサイズ、３）ベクターにより形
質転換すべき宿主細胞に依存するであろう。各々のベク
ターは、その機能および適合性である宿主細胞に依存す
る様々な成分を含む。通常のベクター成分には、以下に
示す１またはそれ以上の成分が含まれるがそれらに限定
はされない：シグナル配列、複製起点、１またはそれ以
上のマーカー遺伝子、エンハンサー成分、プロモーター
および転写終結配列。特定のベクターを、適合性である
宿主細胞と合わせて以下に記載する。

【０１０２】標準的な組換えＤＮＡ法を用いて加工なベ
クターを製造する。単離されたプラスミドおよびＤＮＡ
フラグメントを切断、加工し、特定の順序で共に連結し
て所望のベクターを得る。

【０１０３】適当な緩衝液中で適当な制限酵素または酵
素群を用いてＤＮＡを切断する。通常、約２０μlの緩
衝溶液中で約１〜２単位の適当な制限酵素と共に約０．
２〜１μgのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを使
用する（適当な緩衝液、ＤＮＡ濃度、およびインキュベ
ーション時間および温度は制限酵素の製造者により特定
されている）。通常、インキュベーション時間は３７℃
で約１または２時間で十分であるが、いくつかの酵素は
もっと高い温度を必要とする。インキュベーション後
に、フェノールおよびクロロホルムの混合液で消化溶液
を抽出することにより酵素および他の混入物質を除去
し、エタノール沈殿によりＤＮＡを水性分画から回収す
る。

【０１０４】ＤＮＡフラグメントを共に連結して機能性
ベクターを得るために、ＤＮＡフラグメントの末端を互
いに適合性にしなければならない。いくつかの場合にお
いて、該末端はエンドヌクレアーゼ消化の後に直接適合
性であろう。しかし、通常はエンドヌクレアーゼ消化に
より得られる付着末端を最初に変換して平滑末端として
連結のために適合性のものとする必要がある。末端を平
滑化するために、該ＤＮＡを適当な緩衝液中、１５℃で
少なくとも１５分間、４つのデオキシヌクレオチド三リ
ン酸の存在下に１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩのクレ
ノウフラグメント（Klenow）で処理する。次いでフェノ
ールークロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精
製する。

【０１０５】ＤＮＡゲル電気泳動を用いて、切断された
ＤＮＡフラグメントをサイズ−分離して選択することが
できる。該ＤＮＡをアガロースまたはポリアクリルアミ
ドマトリックスのどちらかの中で電気泳動することがで
きる。マトリックスの選択は分離すべきＤＮＡフラグメ
ントのサイズに依存するであろう。Sambrookら（上記）
のセクション６．３０〜６．３３に開示されているよう
に、電気泳動後に、該ＤＮＡをマトリックスから電気溶
離により抽出するか、または、低−融解アガロースをマ
トリックスとして用いた場合には、アガロースを融解さ
せてそれからＤＮＡを抽出する。

【０１０６】共に連結すべきＤＮＡフラグメント（連結
すべき各フラグメントの末端が適合性となるよう適当な
制限酵素で予め消化されている）を溶液中において約等
モル量で存在させる。また該溶液はＡＴＰ、リガーゼ緩
衝液およびＴ４ＤＮＡリガーゼなどのりガーゼをＤＮＡ
０．５μg当たり約１０単位で含むであろう。ＤＮＡフ
ラグメントをベクターに連結しようとするときには、該
ベクターを最初に適当な制限エンドヌクレアーゼで切断
することにより線状にし、次いで細菌性アルカリホスフ
ァターゼまたは子ウシ腸アルカリホスファターゼのどち
らかでホスファターゼ処理する。これにより連結工程中
のベクターの自己−連結を防ぐ。

【０１０７】連結後、挿入された外来遺伝子を含むベク
ターを適当な宿主細胞中に導入する。形質転換された細
胞を抗生物質、通常はテトラサイクリン（tet）または
アンピシリン（amp）上での増殖により選択するが、該
細胞はそれらに対してベクター上のtetおよび／またはa
mp耐性遺伝子の存在のために耐性となっている。連結混
合物が真核性宿主細胞に導入されたときには、形質転換
された細胞を上記のＤＨＦＲ／ＭＴＸ系により選択する
ことができる。形質転換された細胞を培養増殖させ、次
いでプラスミドＤＮＡ（プラスミドは所望の外来遺伝子
に連結されたベクターを意味する）を単離する。次いで
このプラスミドＤＮＡを制限酵素地図作成および／また
はＤＮＡ配列決定により分析する。ＤＮＡ配列決定は、
通常、Messingらの方法〔Nucleic Acids Res., 9:309
(1981)〕またはMaxamらの方法〔Methods of Enzymolog
y, 65:499 (1980)〕のどちらかにより行う。

【０１０８】Ｄ．宿主細胞の選択および形質転換 本発明の糖タンパク質リガンドの炭水化物成分は、レセ
プターの認識およびレセプター結合にとって必須であ
る。従って、タンパク質をグリコシル化された形態で発
現する真核宿主細胞が本発明のリガンドの発現のために
好ましい。しかし、タンパク質をグリコシル化しない原
核生物、例えばE. coliにおける発現もまた実行可能で
ある。非グリコシル化タンパク質を後に例えば以下に詳
述する化学的および／または酵素的な方法によりグリコ
シル化することができる。

【０１０９】１．真核多細胞生物 多細胞生物は本発明を実施するための宿主として好まし
い。無脊椎動物および脊椎動物細胞両方の培養が許容で
きるが、脊椎動物細胞の培養、とりわけ哺乳動物の培養
が好ましい。適当なセルラインの例には、ＳＶ４０によ
り形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ株（COS-7, ATCC CRL
1651）；ヒト胎児腎臓株２９３Ｓ〔Grahamら, J. Gen.
Virol., 36:59 (1977)〕；ベビーハムスター腎臓細胞
（BHK, ATCC CCL 10）；チャイニーズハムスター卵巣細
胞〔UrlabおよびChasin, Proc .Natl. Acad. Sci USA,
77:4216 (1980)〕；マウスセルトリ細胞〔TM4, Mather,
Biol. Reprod., 23:243 (1980)〕；サル腎臓細胞（CVI
-76, ATCC CCL 70）；アフリカミドリザル腎臓細胞（VE
RO-76, ATCC CRL-1587）；ヒト頸癌細胞（HELA, ATCCCC
L 2）；イヌ腎臓細胞（MDCK, ATCC CCL 34）；バッファ
ローラット肝臓細胞（BRL 3A, ATCC CR； 1442）；ヒト
肺細胞（W138, ATCC CCL 75）；ヒト肝臓細胞（Hep G2,
HB 8065）；マウス乳腫瘍細胞（MMT 060562, ATCC CCL
51）；ラット肝癌細胞〔HTC, MI. 54, Baumannら, J.
Cell Biol., 85:1 (1980)〕；およびＴＲＩ細胞〔Mathe
rら, Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44 (1982)〕が含
まれる。これらの細胞の発現ベクターには、通常（もし
必要ならば）、複製起点、発現すべき遺伝子の前に位置
するプロモーター、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプラ
イス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結部位の
ためのＤＮＡ配列が含まれる。

【０１１０】哺乳動物の発現ベクターにおいて用いられ
るプロモーターはウイルス起源であることが多い。これ
らのウイルス性プロモーターは通常ポリオーマウイル
ス、アデノウイルス２由来であり、シミアン・ウイルス
４０（ＳＶ４０）であることが最も多い。ＳＶ４０ウイ
ルスは初期および後期プロモーターと称される２つのプ
ロモーターを含む。これらの両プロモーターは、ウイル
スの複製起点をも有する１つのＤＮＡフラグメントとし
てウイルスから容易に得られるから特に有用である〔Fi
ersら, Nature, 273:113 (1978)〕。また、HindIII部位
からウイルス複製起点中のBglＩ部位へと伸長する約２
５０bpの配列を含むならば、より小さいまたはより大き
いＳＶ４０ＤＮＡフラグメントを用いることができる。

【０１１１】別法では、外来遺伝子と天然に結合されて
いるプロモーター（相同なプロモーター）を、形質転換
のために選択した宿主セルラインと適合性である場合に
用いることができる。

【０１１２】複製起点を外性の供給源、例えばＳＶ４０
または他のウイルス（例えばポリオーマ、アデノ、ＶＳ
Ｖ、ＢＰＶ）から得てクローニングベクターに挿入する
ことができる。別法では、複製起点を宿主細胞染色体複
製機構から得ることができる。外来遺伝子を含有してい
るベクターを宿主細胞染色体中に組込むときには、後者
が十分であることが多い。

【０１１３】十分な量のセレクチンリガンドを形質転換
された細胞培養物から製造することができる。しかし、
第二のＤＮＡコード化配列の使用により産生レベルを増
すことができる。第二のコード化配列は通常、酵素ジヒ
ドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を含む。通常、野生
型の形態のＤＨＦＲは化学物質メトトレキセート（ＭＴ
Ｘ）により阻害される。細胞中のＤＨＦＲ発現のレベル
は培養宿主細胞に添加されたＭＴＸの量に依存して変化
するであろう。ＤＨＦＲを第二配列として特に有用なも
のにする別の特徴は、これが形質転換された細胞を同定
するための選択マーカーとして使用し得ることである。

【０１１４】ＤＨＦＲの２つの形態が第二の配列として
の使用のために利用可能であり、それらは野生型ＤＨＦ
ＲおよびＭＴＸ一耐性ＤＨＦＲである。特定の宿主細胞
中で用いられるＤＨＦＲの型は、宿主細胞がＤＨＦＲ欠
失であるか否か（それが非常に低いレベルのＤＨＦＲを
内性的に産生するか、または機能的なＤＨＦＲを全く産
生しないか）に依存する。ＤＨＦＲ−欠失セルライン、
例えばUrlaubおよびChasin〔Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA) 77:4216 (1980)〕により開示されているＣＨＯセ
ルラインを野生型ＤＨＦＲコード化配列で形質転換す
る。形質転換後に、これらのＤＨＦＲ欠失セルラインは
機能的ＤＨＦＲを発現し、栄養分ヒポキサンチン、グリ
シンおよびチミジンを欠く培養培地中で増殖させること
ができる。非形質転換細胞はこの培地中では生存しない
であろう。

【０１１５】ＤＨＦＲのＭＴＸ−耐性型は、ＭＴＸ感受
性の機能的ＤＨＦＲの正常量を内性的に生産する宿主細
胞において、形質転換された宿主細胞を選択する手段と
して用いることができる。ＣＨＯ−Ｋ１セルライン（Ａ
ＴＣＣ番号ＣＬ ６１）はこれらの特徴を有しており、
ゆえにこの目的のための有用なセルラインである。ＭＴ
Ｘの細胞培養培地への添加により、ＭＴＸ一耐性ＤＨＦ
ＲをコードしているＤＮＡで形質転換された細胞のみの
増殖が可能となるであろう。非形質転換細胞はこの培地
中で生存することができないであろう。

【０１１６】本発明の変異体を製造するために用いられ
る哺乳動物の宿主細胞を種々の培地中で培養することが
できる。市販品として入手可能な培地、例えばHam's
Ｆ１０（Sigma）、最少必須培地（〔ＭＥＭ〕, Sigm
a）、ＰＲＭＩ−１６４０（Sigma）、およびダルベッコ
の改良イーグル培地（〔ＤＭＥＭ〕, Sigma）は宿主細
胞の培養に適当である。これらの任意の培地には必要に
応じてホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリ
ン、トランフェリンまたは上皮増殖因子等）、塩（塩化
ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩
等）、緩衝液（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオシド（アデノ
シンおよびチミジン等）、抗生物質（ゲンタマイシン
等）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終濃度で存
在する無機成分として定義される）、およびグルコース
または同等のエネルギー源を追加することができる。ま
た、他のあらゆる必要な追加物を当業者に既知の適当な
濃度で含有させることができる。

【０１１７】２．真核微生物 多細胞性真核生物に加えて、真核微生物、例えば糸状菌
または酵母が本発明の実施に適している。Saccharomyes
cerevisiaeまたは通常のパン酵母が下等真核宿主微生
物の中で最も一般的に用いられる。しかし、他の数多く
の属、種および株が一般に入手可能であり、本発明にお
いて有用である。これらは、例えば、Schizosaccharomy
ces pombe〔BeachおよびNurse, Nature, 290:140 (198
1)；EP139,383（１９８５年５月２日発行）〕；Kluyver
omyces宿主(米国4, 943, 529； Fleerら, 上記)、例え
ば、K. lactis〔MW98-8C, CBS683, CBS4574； Louvenco
urtら, J. Bacteriol., 737 (1983)〕、K. fragilis
（ATCC 12, 424)、K. bulgaricus （ATCC 16, 045)、K.
wickeramii （ATCC 24, 178)；K. waltii （ATCC 56,50
0）、K. drosophilarum （ATCC 36, 906； VandenBerg
ら, 上記）、K. thermotolerans、およびK. marxianus；
yarrowia〔EP 402, 226〕； Pichiapastoris 〔EP 183,
070； Sreekrishnaら, J. BasicMicrobiol., 28: 265-
278 （1988）〕；Candida； Trichodermareesia〔EP 24
4, 234〕； Neurosporacrassa〔Caseら,Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 76:5259 （1979）〕；Schwanniomyces、
例えばSchwanniomyces occidentalis〔EP 394, 538（１
９９０年１０月３１日発行）〕；および糸状菌、例えばN
eurospora、Penicillium、Tolypocladium〔WO 91/00357
（１９９１年１月１０日発行）〕、およびAspergillus宿
主、例えばA. nidulans〔Ballanceら, Biochem. Biophy
s. Res. Commun., 112:284 （1983）； Tilburnら,Gen
e, 26:205 （1983）；Yeltonら, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 81:1470 （1984）〕およびA.niger〔Kellyおよ
びHynes, EMBO J., 4:475 (1985)〕である。酵母ベクタ
ーにおける適当な促進配列には、３−ホスホグリセリン
酸キナーゼ〔Hitzemanら, J. Biol. Chem., 255:2073
(1980)〕または他の解糖酵素〔Hessら, J. Adv. Enzyme
Reg., 7:149 (1968)；Hollandら, Biochemistry, 17:49
00(1978)〕、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−
３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビ
ン酸脱炭酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース
−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ム
ターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメ
ラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコ
キナーゼに対するプロモーターが含まれる。適当な発現
プラスミドの構築において、さらにこれらの遺伝子と結
合されている終止配列を、発現が所望である配列の３′
で発現ベクターに連結させてmＲＮＡのポリアデニル化
および終止をもたらす。増殖条件により転写が制御され
る付加的な利点を有する他のプロモーターは、アルコー
ルデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスフ
ァターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、および上記の
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、お
よびマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素に対
するプロモーター領域である。酵母一適合性プロモータ
ー、複製起点および終止配列を含有しているあらゆるプ
ラスミドベクターが適当である。

【０１１８】３．原核細胞 原核生物は特に大量のＤＮＡの迅速な製造のために、部
位指向性突然変異誘発のために用いられる一本鎖ＤＮＡ
鋳型の製造のために、多くの突然変異体を同時にスクリ
ーニングするために、および得られた突然変異体のＤＮ
Ａ配列決定のために有用である。適当な原核宿主細胞に
は、E. coli Ｋ１２株２９４（ATCC番号31,446）、E. c
oli株Ｗ３１１０（ATCC番号27,325）、E. coli Ｘ１７
７６（ATCC番号31,537）、およびE. coli Ｂが含まれ
る。しかし、他の多くのE. coli株、例えばＨＢ１０
１、ＪＭ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３
９、および他の多くの原核生物の種および属も同様に用
いることができる。

【０１１９】また、原核生物はＤＮＡ配列発現のための
宿主として用いることができる。上に列記したE. coli
株、Bacillus subtilis等のbacilli、他の腸内細菌科例
えばSalmonella typhimuriumまたはSerrati amarcesan
s、および種々のPseudomon asu種の全てを宿主として用
いることができる。

【０１２０】宿主細胞と適合性の種から得たレプリコン
および制御配列を含有しているプラスミドベクターをこ
れらの宿主と共に用いる。該ベクターは通常、複製部
位、形質転換された細胞において表現型選択をもたらす
マーカー遺伝子、１またはそれ以上のプロモーター、お
よび外来ＤＮＡの挿入のためのいくつかの制限部位を含
有しているポリリンカー領域を有する。E. coliの形質
転換のために通常用いられるプラスミドにはpBR３２
２、pUC１８、pUC１９、pUC１１８、pUC１１９およびBl
uescript Ｍ１３が含まれるが、これらの全てはSambroo
kら（上記）のセクション１．１２〜１．２０中に開示
されている。しかし、他の多くの適当なベクターも利用
可能である。これらのベクターはアンピシリンおよび／
またはテトラサイクリン耐性をコードしている遺伝子を
含み、この耐性によりこれらのベクターで形質転換され
た細胞のこれらの抗生物質存在下での増殖が可能にな
る。

【０１２１】原核性ベクターにおいて最も一般的に用い
られるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリ
ナーゼ）およびラクトースプロモーター系〔Changら Na
ture, 375:615 (1978); Itakuraら, Science, 198:1056
(1977);Goeddelら, Nature,281:544 (1979)〕およびト
リプトファン（trp）プロモーター系〔Goeddelら, Nuc
l. Acids Res., 8:4057 (1980); EPO Appl. Publ. No.
36, 776〕、およびアルカリホスファターゼ系が含まれ
る。これらが最も一般的に用いられるが、他の微生物の
プロモーターも用いられており、それらのヌクレオチド
配列に関する詳細は公開されているので、当業者はそれ
らをプラスミドベクター中に機能的に連結することが可
能である〔Siebenlistら, Cell, 20:269 (1980)を参
照〕。

【０１２２】４．分泌系 細胞から通常分泌される多くの真核性タンパク質は、内
因性のシグナル配列をアミノ酸配列の一部分として含
む。この配列は、タンパク質を小胞体およびゴルジ装置
を経て細胞から輸出させることを目的とする。シグナル
配列は通常タンパク質のアミノ末端に位置しており、約
１３から約３６アミノ酸の範囲の長さである。実際の配
列はタンパク質間で異なるが、全ての既知の真核性シグ
ナル配列は少なくとも１の正荷電された残基および１０
〜１５アミノ酸の疎水性の高い部分（通常ロイシン、イ
ソロイシン、アラニン、バリンおよびフェニルアラニン
のアミノ酸に富む）をシグナル配列の中央付近に含む。
シグナル配列はタンパク質の分泌された形態には通常存
在しないが、これはシグナル配列がタンパク質の小胞体
中への移動の間に小胞体上に位置するシグナルペプチダ
ーゼにより切断されるからである。シグナル配列がまだ
結合しているタンパク質は、「プレ−タンパク質」また
はタンパク質の未成熟形と称されることが多い。

【０１２３】しかし、全ての分泌型タンパク質が切断さ
れるアミノ末端シグナル配列を含むわけではない。いく
つかのタンパク質、例えばオボアルブミンはタンパク質
の内部領域に位置するシグナル配列を含む。この配列は
移動中に通常切断されない。

【０１２４】シグナル配列をタンパク質に結合させるこ
とにより、通常細胞質中に見られるタンパク質を分泌の
対象とすることができる。これはシグナル配列をコード
しているＤＮＡをタンパク質をコードしているＤＮＡの
５′末端に連結させて、次いでこの融合タンパク質を適
当な宿主細胞中で発現させることにより容易に行われ
る。シグナル配列を有するタンパク質をコードしている
任意の遺伝子由来の制限フラグメントとしてシグナル配
列をコードしているＤＮＡを得ることができる。ゆえ
に、原核生物、酵母および真核生物のシグナル配列を、
本発明を実施するために使用される宿主細胞の型に応じ
て本発明において用いることができる。遺伝子のシグナ
ル配列部分をコードしているＤＮＡを適当な制限エンド
ヌクレアーゼを用いて切除し、次いで分泌させるべきタ
ンパク質をコードしているＤＮＡに連結する。

【０１２５】機能的なシグナル配列の選択には、シグナ
ル配列の切断およびタンパク質の分泌が起こるようにシ
グナル配列が宿主細胞のシグナルペプチダーゼにより認
識されることが必要とされる。いくつかの真核生物遺伝
子、例えばヒト成長ホルモン、プロインスリンおよびプ
ロアルブミンのシグナル配列部分をコードしているＤＮ
Ａおよびアミノ酸配列は既知であり〔Stryer, Biochemi
stry, W. H. Freemanand Company, New York (1988),
p. 769を参照〕、適当な真核宿主細胞中でシグナル配列
として用いることができる。例えば酸性ホスファターゼ
〔Arimaら, Nuc. AcidsRes., 11:1657 (1983)〕、α−
因子、アルカリホスファターゼおよびインベルターゼな
どの酵母シグナル配列を用いて酵母宿主細胞からの分泌
を指令することができる。例えばＬamＢまたはＯmpＦ
〔Wongら, Gene 68:193 (1988)〕、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡ
またはβ−ラクタマーゼをコードしている遺伝子ならび
に他の遺伝子から得た原核生物のシグナル配列を用い
て、タンパク質を原核細胞から培養培地中に向けること
ができる。

【０１２６】分泌されるようにシグナル配列を含有する
所望のタンパク質を得るための別の方法は、シグナル配
列をコードしているＤＮＡを化学的に合成するものであ
る。この方法では、選択されたシグナル配列をコードし
ているオリゴヌクレオチドの両方の鎖を化学的に合成
し、次いで互いにアニーリングさせて二本鎖を形成させ
る。次いでこの二本鎖オリゴヌクレオチドをタンパク質
をコードしているＤＮＡの５′末端に連結させる。

【０１２７】次いでタンパク質をコードしているＤＮＡ
をそれに連結されたシグナル配列と共に含有している構
築物を適当な発現ベクターに連結させることができる。
この発現ベクターを適当な宿主細胞中に導入して所望の
タンパク質を発現させて分泌させる。

【０１２８】Ｅ．形質転換法 哺乳動物の宿主細胞および固い細胞膜障壁を有していな
い他の宿主細胞の培養物は通常、GrahamおよびVan der
Eb〔Virology, 52:546 (1978)〕により初めに開示さ
れSambrookら（上記）のセクション１６．３２〜１６．
３７に開示されたように修正されたリン酸カルシウム法
を用いて形質転換させる。しかし、細胞中にＤＮＡを導
入するための他の方法、例えばポリブレン〔Kawaiおよ
びNishizawa, Mol. Cen. Biol., 4:1172 (1984)〕、プ
ロトプラスト融合法〔Schaffner, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 77:2163 (1980)〕、電気穿孔法〔Newmannら,
EMBOJ., 1:841 (1982)〕、および核への直接マイクロイ
ンジェクション〔Capecchi,Cell, 22:479 (1980)〕を用
いてもよい。

【０１２９】酵母宿主細胞は通常、Hinnen〔Proc. Nat
l.Acad. Sci. USA, 75:1929 (1978)〕が開示しているよ
うにポリエチレングリコール法を用いて形質転換させ
る。

【０１３０】Ｆ．宿主細胞の培養 本発明のセレクチンリガンドを製造するために用いられ
る哺乳動物宿主細胞は様々な培地中で培養することがで
きる。市販品として入手可能な培地、例えばハムのＦ１
０（Sigma）、最少必須培地（ＭＥＭ、Sigma）、ＲＰＭ
Ｉ−１６４０（Sigma）、またはダルベッコの改良イー
グル培地（ＤＭＥＭ、Sigma）がそのような宿主細胞を
培養するのに適当である。さらに、HamおよびWallace,
Meth. Enz.58, 44(1979)；BarnesおよびSato, Anal. Bi
ochem. 102, 255 (1980)；米国特許番号4,767,704；4,6
57,866；4,927,762；または4,560,655；W0 90/03430；W
O87/00195；米国特許Re. 30,985に開示されているいず
れかの培地を宿主細胞のための培養培地として用いるこ
とができる。これら全ての培地には必要に応じてホルモ
ンおよび／または他の増殖因子（例えばインスリン、ト
ランフェリン、および／または上皮増殖因子）、塩（例
えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およ
びリン酸塩）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオ
シド（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質
（例えばゲンタマイシン^TM）、微量元素（通常マイクロ
モル範囲の最終濃度で存在する無機化合物）、およびグ
ルコースまたは同等のエネルギー源を追加することがで
きる。さらに他のいずれかの必要な追加物質を、当業者
に既知であろう適当な濃度で含有させることができる。
培養条件、例えば温度、pH等は発現用に選択した宿主細
胞について既に用いられている条件であり、当業者には
明白であろう。

【０１３１】Ｇ．グリコシル化変異体 ポリペプチドのグリコシル化は通常Ｎ−結合性またはＯ
−結合性のどちらかである。Ｎ−結合性とはアスパラギ
ン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプ
チド配列、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギ
ン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘはプロリンを除く任意の
アミノ酸である）がアスパラギン側鎖への炭水化物部分
の酵素的な結合のための認識配列である。Ｏ−結合性グ
リコシル化はＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトー
スまたはキシロースの糖のうちの１つのヒドロキシアミ
ノ酸への結合を意味し、このアミノ酸は通常セリンまた
はトレオニンであることがほとんどであるが５−ヒドロ
キシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもＯ−結合性
グリコシル化に関与することができる。

【０１３２】本発明のセレクチンリガンドは優勢なＯ−
結合性グリコシル化部位を特徴とする。これらは、例え
ば該リガンドのアミノ酸配列への１またはそれ以上のセ
リンまたはトレオニン残基の付加またはこれらによる置
換により修飾することができる。容易にするために、改
変は基本的にアミノ酸配列変異体について上述した方法
を用いてＤＮＡレベルでなされるのが普通である。

【０１３３】また、本発明のリガンドヘのグリコシドの
化学的または酵素的な結合を用いて炭水化物置換基の数
または特性を修飾または増大させることができる。これ
らの方法はＯ−結合性（またはＮ−結合性）のグリコシ
ル化を行い得るポリペプチドの生成を必要としない点に
おいて有利である。用いられる結合様式により、糖を
（a）アルギニンおよびヒスチジン、（b）遊離カルボキ
シル基、（c）遊離ヒドロキシル基、例えばシステイン
の遊離基、（d）遊離スルフヒドリル基、例えばセリ
ン、トレオニンまたはヒドロキシプロリンの遊離基、
（e）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシ
ン、またはトリプトファンの残基、または（f）グルタ
ミンのアミド基に結合させることができる。これらの方
法はWO 87/05330（１９８７年９月１１日発行）ならび
にAplinおよびWriston〔CRC Crit. Rev. Biochem., PP.
259-306 (1981)〕に開示されている。

【０１３４】また、セレクチンリガンド上に存在する炭
水化物部分を化学的または酵素的に除去することができ
る。化学的な脱グリコシル化はトリフルオロメタンスル
ホン酸または同等の化合物への暴露を必要とする。この
処理により、結合している糖を除く大部分または全部の
糖の切断の結果が得られ、ポリペプチドは無傷のまま残
る。化学的な脱グリコシル化はHakimuddinら〔Arch. Bi
ochem. Biophys. 259,52 (1987)〕およびEdgeら〔Anal.
Biochem. 118, 131 (1981)〕により開示されている。T
hotakuraら〔Meth. Enzymol. 138, 350 (1987)〕により
開示されているように様々なエンドおよびエキソグリコ
シダーゼにより炭水化物部分を除去することができる。
グリコシル化はDuskinら〔J. Biol. Chem. 257, 3105
(1982)〕により開示されているようにツニカマイシンに
より抑制することができる。ツニカマイシンはタンパク
質−Ｎ−グリコシダーゼ結合の形成をブロックする。

【０１３５】また、適当な宿主細胞を選択することによ
り本発明のセレクチンリガンドのグリコシル化変異体を
製造することができる。酵母は、例えば哺乳動物系のも
のとは大きく異なるグリコシル化を導く。同様に、セレ
クチンリガンドの供給源とは異なる種（例えばハムスタ
ー、ネズミ、昆虫、ブタ、ウシまたはヒツジ）または組
織（例えば肺、肝臓、リンパ球、間葉、上皮）に由来す
る哺乳動物細胞を、異なるグリコシル化（例えば高レベ
ルのマンノースまたは異なる比率のマンノース、フコー
ス、シアル酸およびセレクチン結合に必須の他の糖によ
り特徴付けられる）を導く能力について常法によりスク
リーニングする。

【０１３６】Ｈ．共有結合修飾 天然に存在するセレクチンリガンド分子または該分子と
共通する生物学的性質を有している配列の共有結合修飾
は本発明の範囲内に含まれる。このような修飾は、セレ
クチンリガンドタンパク質の標的化アミノ酸残基を、選
択された側鎖または末端残基と反応し得る有機誘導化剤
と反応させることにより、または選択された組換え宿主
細胞において機能する翻訳後修飾の機構を利用すること
により誘導されるのが普通である。得られた共有結合誘
導体は生物学的活性のために重要な残基の同定を目的と
するプログラムにおいて有用であり、セレクチンリガン
ドのイムノアッセイのために、または組換え糖タンパク
質のイムノアフィニティー精製のための抗−セレクチン
リガンド抗体の製造のために有用である。例えば、ニン
ヒドリンとの反応後のタンパク質の生物学的活性の完全
な不活性化は、少なくとも１個のアルギニルまたはりシ
ル残基がその活性に必須であることを示すものであり、
その後に、選択された条件下で修飾された個々の残基を
修飾されたアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントの
単離により同定する。そのような修飾は当分野での通常
の技術範囲内にあり、多くの実験を行うことなく実施さ
れる。

【０１３７】二官能性物質による誘導化は、セレクチン
リガンド糖タンパク質とポリペプチドとの分子内集合体
を製造するために、ならびにセレクチンリガンド糖タン
パク質をアッセイまたはアフィニティー精製において使
用するための水不溶性支持体マトリックスまたは表面に
架橋するために有用である。さらに、鎖間架橋の研究に
より高次構造に関する直接的な情報が得られるであろ
う。通常用いられる架橋剤には１，１−ビス（ジアゾア
セチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ二価性イ
ミドエステルおよび二価性マレイミドが含まれる。メチ
ル−３−〔（Ｐ−アジドフェニル）ジチオ〕プロピオイ
ミデート等の誘導化剤により、光の存在下で架橋を形成
し得る光による活性化が可能な中間体が得られる。別法
では、臭化シアン活性化炭水化物などの反応性の水不溶
性マトリックスおよび米国特許番号3, 959, 642; 3, 96
9, 287; 3, 691, 016; 4, 195, 128; 4, 247, 642; 4,
229, 537; 4, 055, 635; および4, 330, 440に開示され
ている系反応性基質をタンパク質の固定化および架橋に
用いる。

【０１３８】ある種の翻訳後修飾が、発現されたポリペ
プチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果生じる。グ
ルタミニルおよびアスパリギニル残基は翻訳後に脱アミ
ド化されて対応するグルタミルおよびアスパルチル残基
となることが多い。別法では、これらの残基を穏やかな
酸性条件下で脱アミド化する。これらの残基のどちらの
形態も本発明の範囲内にある。

【０１３９】他の翻訳後修飾にはプロリンおよびリシン
のヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒド
ロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒ
スチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化が含まれる〔T.
E. Creighton, Proteins: Sturucture and Molecular
Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco,PP.
79-86 (1983)〕。

【０１４０】他の誘導体は非タンパク質性ポリマーに共
有結合させた本発明の新規なペプチドからなる。通常こ
の非タンパク質性ポリマーは親水性合成ポリマー、すな
わち天然には見いだされないポリマーである。しかし、
天然に存在して組換えまたはインビトロ法により製造さ
れるポリマーは、天然から単離されるポリマーであるか
ら有用である。親水性ポリビニルポリマー、例えばポリ
ビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンは本発明
の範囲内にある。特に有用なポリマーはポリビニルアル
キレンエーテル、例えばポリエチレングリコール、ポリ
プロピレングリコールである。

【０１４１】セレクチンリガンドを様々な非タンパク質
性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロ
ピレングリコールまたはポリオキシアルキレンに米国特
許番号4, 640, 835; 4, 496, 689; 4, 301, 144; 4, 67
0, 417; 4, 791, 192または4, 179, 337に示されている
方法で結合させることができる。

【０１４２】セレクチンリガンドを、例えばコアセルベ
ーション法または界面ポリマー化により製造されたマイ
クロカプセル中、コロイド状薬物供給システム（例え
ば、リボソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロ
エマルジョン、ナノ−粒子およびナノカプセル）中、ま
たはマクロエマルジョン中に捕捉することができる。こ
のような方法はRemington's Pharmaceutical Sciences,
16th Edition, Osol, A., 編(1980)に開示されてい
る。

【０１４３】Ｉ．セレクチンリガンドと安定な血漿タン
パク質のキメラセレクチンリガンド配列を上に定義した
安定な血漿タンパク質配列に結合することができる。安
定な血漿タンパク質の配列は、例えば免疫グロブリン定
常ドメイン配列であってよい。得られる分子は通常セレ
クチンリガンド−免疫グロブリンキメラと称される。

【０１４４】好ましい態様においては、セレクチンに対
する結合部位を含む配列のＣ末端を免疫グロブリン（例
えば免疫グロブリンＧ₁）のエフェクター機能を有して
いる抗体のＣ末端部分（具体的にはFcドメイン）のＮ末
端に融合させる。全重鎖定常領域をセレクチン結合部位
を含有している配列に融合させることが可能である。し
かし、より好ましくは、パパイン切断部位のすぐ上流の
ヒンジ領域（これはＩｇＧ Ｆｃを化学的に定義するも
のであり；重鎖定常領域の最初の残基を１１４としたと
きの残基２１６〔Kobetら, 上記〕、または他の免疫グ
ロブリンの類似の部位）を起点とする配列をこの融合に
おいて用いる。特に好ましい態様においては、セレクチ
ン結合部位を含有しているアミノ酸配列を、ＩｇＧ₁、
ＩｇＧ₂またはＩｇＧ₃重鎖のヒンジ領域およびＣ_H２お
よびＣ_H３またはＣ_H１、ヒンジ、Ｃ _H２およびＣ_H３ドメ
インに融合させる。融合がなされる正確な部位は重要で
はなく、最適部位は通常の実験により決定することがで
きる。

【０１４５】J．セレクチンリガンドの精製 セレクチンリガンドは組換え細胞培養物から既知の方
法、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸
抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ
ー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、イムノ
アフィニティークロマトグラフィーおよびレクチンクロ
マトグラフィーにより回収および精製することができ
る。本発明の範囲内にある他の既知の精製法は抗−セレ
クチンリガンド抗体を用いた逆層ＨＰＬＣクロマトグラ
フィーを利用するものであり、これは本発明のリガンド
の精製に有用である。

【０１４６】特にＬ−セレクチンリガンドの精製のため
に開発されたとりわけ有利な精製法を実施例１に記載す
る。この方法は、組換え法により製造された独特のセレ
クチンレセプター−免疫グロブリンキメラ（Ｌ−セレク
チン−ＩｇＧと称する）を利用するものであり、この方
法により対応する（スルフェート−ラベル化）リガンド
を沈殿させることができる。

【０１４７】Ｋ．治療用組成物 本発明のセレクチンリガンドを用いて対応するセレクチ
ンレセプターの天然リガンドに対する結合をブロックす
ることができる。例えばＬ−セレクチンリガンドは内皮
細胞上の天然リガンドに対する循環白血球上のＬ−セレ
クチンレセプターの結合を効果的にブロックする。この
性質は循環白血球の内皮細胞に対する過剰な結合と関係
する徴候または症状、例えば慢性関節リウマチ、乾癬、
多発性硬化症等と関係する炎症を治療するのに有用であ
る。

【０１４８】本発明のセレクチンリガンドを既知の方法
に従い製剤化して薬学的に有用な組成物を製造すること
ができ、これにより該リガンドを薬学的に許容し得る担
体と混合する。適当な担体およびその配合は、Remingto
n's Pharmaceutical Sciences〔16th ed., 1980, Mack
Publishing Co., Osloら編〕に開示されている。通常こ
れらの組成物は該リガンドの有効量、例えば約０．５〜
約１０mg/mlの量を、患者に対する効果的な投与に適当
な薬学的に許容し得る組成物を製造するための適当な量
の担体と共に含むであろう。該リガンドは非経口的に、
または有効な形態で血流への放出を確保する他の方法に
より投与することができる。

【０１４９】本発明を実施するために用いられる該リガ
ンドの臨床投与に特に適した組成物には、無菌性水溶液
または無菌性の水和可能な粉末、例えば凍結乾燥タンパ
ク質が含まれる。薬学的に許容し得る塩の適当量をさら
に製剤中に用いて製剤を等張にするのが普通である。

【０１５０】本発明の薬学的な組成物の投与法および所
望の薬物濃度は、予定した特定の使用に依存して変化さ
せることができる。

【０１５１】Ｋ．モノクローナル抗体 モノクローナル抗体は実質的に同種の抗体の一群、すな
わち少量で存在することがある可能な天然の突然変異体
を除いて、その群を構成している個々の抗体が同一であ
る群がら得られる。ゆえに、修飾語句「モノクローナ
ル」は別個の抗体の混合物ではないという抗体の性質を
示す。

【０１５２】例えば本発明のモノクローナル抗体は最初
にKohlerおよびMilstein〔Nature 256:495 (1975)〕に
より開示されたハイブリドーマ法を用いて作成するかま
たは組換えＤＮＡ法〔Cabillyら, 米国特許番号4, 816,
567〕により作成することができる。

【０１５３】ハイブリドーマ法においては、マウスまた
は他の適当な宿主動物（例えばハムスター）をセレクチ
ンリガンドタンパク質を用いて皮下、腹腔内、または筋
肉内経路により免疫し、免疫に用いたタンパク質に特異
的に結合するであろう抗体を産生するかまたは産生させ
得るリンパ球を誘導する。別法では、リンパ球をインビ
トロで免疫することができる。次いで適当な融合剤、例
えばポリエチレングリコールを用いてリンパ球を骨髄腫
細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を得る〔Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, p
p. 59-103 (Academic Press, 1986)〕。

【０１５４】このようにして調製されたハイブリドーマ
細胞は、非融合の親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害
する１またはそれ以上の物質を好ましくは含む適当な培
養培地にまいて増殖させる。例えば、もし親骨髄腫細胞
がヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）酵素を欠失してい
るなら、ハイブリドーマのための培養培地は通常ヒポキ
サンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含み（ＨＡ
Ｔ培地）、これらの物質がＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖
を妨げる。

【０１５５】好ましい骨髄腫細胞は、効率良く融合し、
選択された抗体−産生細胞による安定かつ高レベルの抗
体の発現を支持し、そしてHAT培地等の培地に感受性の
細胞である。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞株はネ
ズミ骨髄腫株であり、例えばSalk Institute Cell Dist
ribution Center〔San Diego, California USA〕から入
手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍
に由来する株およびAmerican Type Culture Collection
〔Rockville, Maryland USA〕から入手可能なＳＰ−２
細胞である。さらに、ヒト骨髄腫およびマウスーヒトヘ
テロ骨髄腫細胞株がヒトモノクローナル抗体の製造に対
して開示されている〔Kozbor, J. Immunol.133:3001 (1
984), Brodeurら, Monoclonal Antlbody Production Te
chniquesand Application, PP. 51-63 (Marcel Dekker,
Inc., New York, 1987)〕。

【０１５６】ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培
地をTNFR１に対して指向性のモノクローナル抗体の産生
についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細
胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性
を、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ、例えばラ
ジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素一結合免疫吸
収測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定する。

【０１５７】対応するリガンドの結合に対するモノクロ
ーナル抗体の親和性は、例えばMunson & Pollard〔Ana
l. Biochem. 107:220 (1980)〕のスキャッチャード分析
により測定することができる。

【０１５８】所望の特異性、親和性、および／または活
性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定し
た後に、そのクローンを限界希釈法によりサブクローン
化して常法により増殖させる。Goding, Monoclonal Ant
ibodies: Principles and Practice, pp. 59-104(Acade
mic Press, 1986)。この目的のために適当な培養培地に
は、例えばダルベッコの改良イーグル培地またはＲＰＭ
Ｉ-１６４０培地が含まれる。さらに、このハイブリド
ーマ細胞をインビボで動物の腹水腫瘍として増殖させる
ことができる。

【０１５９】サブクローンにより分泌されたモノクロー
ナル抗体を培養培地、腹水液、または血清から通常の免
疫グロブリン精製法、例えばプロテインＡ−セファロー
ス、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル
電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィ
ーにより適当に分離する。

【０１６０】本発明のモノクローナル抗体をコードして
いるＤＮＡは常法を用いて（例えば、ネズミ抗体の重鎖
および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合し得
るオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容
易に単離され配列決定される。本発明のハイブリドーマ
細胞は該ＤＮＡの好ましい供給源として都合がよい。Ｄ
ＮＡを単離したなら、発現ベクター中に配置することが
でき、次いでこれを他の状態では免疫グロブリンタンパ
ク質を製造しない宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄
腫細胞中にトランスフェクションして、組換え宿主細胞
中でモノクローナル抗体の合成を行う。さらに該ＤＮＡ
を、例えばヒト重鎖および軽鎖定常領域に対するコード
化配列を相同なネズミ配列の代わりに用いることにより
〔Morrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851 (198
4)〕、または免疫グロブリンコード化配列に非−免疫グ
ロブリンポリペプチドに対するコード化配列の全てまた
は一部を共有結合させることにより修飾することができ
る。このようにして、本発明の抗−セレクチンリガンド
モノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」ま
たは「ハイブリッド」抗体を製造する。

【０１６１】通常、このような非−免疫グロブリンポリ
ペプチドを本発明の抗体の定常ドメインの代わりに用い
るか、またはそれらを本発明の抗体の１つの抗原−結合
部位の可変ドメインの代わりに用いて、セレクチンリガ
ンドに対する特異性を有する１つの抗原一結合部位と異
なる抗原に対する特異性を有するもう１つの抗原−結合
部位からなるキメラの二価の抗体を創製する。

【０１６２】さらに、キメラまたはハイブリッド抗体は
合成タンパク質化学において既知の方法、例えば架橋剤
を必要とする方法を用いてインビトロで製造することが
できる。例えば、ジスルフィド交換反応を用いるかまた
はチオエーテル結合を形成させることによりイムノトキ
シンを構築することができる。この目的のための適当な
試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル−４−メ
ルカプトブチルイミデートが含まれる。

【０１６３】診断に応用するために、通常本発明の抗体
を検出可能な部分でラベル化する。検出可能な部分は直
接的にまたは間接的に検出可能なシグナルを生成し得る
任意のものであってよい。例えば、検出可能な部分は放
射性同位元素（例えば³Ｈ、^{1 4}Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓまたは¹²⁵
Ｉ）、蛍光または化学発光化合物（例えばフルオロセイ
ンイソチオシアネート、ローダミンまたはルシフェリ
ン）；放射性同位元素ラベル（例えば¹²⁵Ｉ、³²Ｐ、¹⁴
Ｃまたは³Ｈ）、または酵素（例えばアルカリホスファ
ターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはホースラディシュ
ペルオキシダーゼ）であってよい。

【０１６４】抗体を検出可能な部分に個別に結合させる
ための当分野で既知のあらゆる方法を用いることができ
るが、これにはHunterら〔Nature 144:945 (1962)〕;Da
vidら〔Biochemistry 13:1014 (1974)〕；Painら〔J. I
mmunol. Meth. 40:219 (1981)〕；およびNygren〔J. Hi
stochem. And Cytochem. 30:407 (1982)〕により開示さ
れた方法が含まれる。

【０１６５】本発明の抗体は既知のアッセイ法、例えば
競合的結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッ
セイ、および免疫沈降アッセイにおいて用いることがで
きる。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Tec
hniques, pp. 147-158 (CRCPress, Inc., 1987)。

【０１６６】競合的結合アッセイは、限定量の抗体との
結合に対して試験サンプル分析物（セレクチンリガン
ド）と競合するラベル化標準（セレクチンリガンドであ
るかまたはその免疫学的に反応性の部分）の能力に依存
する。試験サンプル中のセレクチンリガンド量は抗体に
結合される標準の量と逆比例する。結合される標準の量
の測定を容易にするために抗体を通常競合の前または後
に不溶化するが、これにより抗体に結合された標準およ
び分析物は未結合のままの標準および分析物から簡便に
分離することができる。

【０１６７】サンドイッチアッセイは２つの抗体の使用
を含み、各々は検出すべきタンパク質の異なる免疫原性
の部分、またはエピトープに結合することができる。サ
ンドイッチアッセイにおいては、試験サンプル分析物は
まず固体支持体上に固定化された抗体により結合され、
その後に第二抗体が分析物に結合し、このようにして不
溶性の３部分複合体を形成する（David & Green, 米国
特許番号4, 376, 110）。該第二抗体は検出可能な部分
でそれ自体ラベルする（直接サンドイッチアッセイ）か
または検出可能な部分でラベルされた抗−免疫グロブリ
ン抗体を用いて測定することができる（間接サンドイッ
チアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つの
型はＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合の検出可能な
部分は酵素である。以下の限定のためのものではない実
施例により本発明をさらに詳しく説明する。

【０１６８】III．実施例 実施例１ Ｌ−セレクチンにより認識される内皮細胞上
の表面糖タンパク質の同定 この実施例により、組換えＬ−セレクチンが選択的にリ
ンパ節由来の³⁵ＳＯ₄−ラベル化巨大分子に結合するこ
とを示す。具体的には、２つの硫酸化、フコシル化およ
びシアリル化糖タンパク質を同定した。

【０１６９】Ａ．³⁵Ｓ−硫酸塩による器官の代謝ラベル
化 腸間膜または末梢（頸部、上腕、腋窩）のリンパ節を８
〜１６週齢の雌性ＩＣＲマウスから集めた。Ager〔J. C
ell Sci., 87:133 (1987)〕の方法に従い、リンパ節を
カミソリ刃を用いて切断して１mm厚さの薄片とし、この
薄片（通常、湿重量０．２g）を２５mM ＨＥＰＥＳ、
１００U/mlペニシリンＧ、１００μg/mlストレプトマイ
シン、および２００μＣｉの担体不含の〔³⁵Ｓ〕硫酸ナ
トリウム（ＩＣＮ Biochemicals Inc., Costa Mesa, C
A）を含有しているＲＰＭＩ１６４０（１ml）中に懸濁
した。３７℃で４時間のインキュベーションの後に、こ
の薄片をDulbeccoのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中でよ
く洗浄し、次いで氷上においてPotter-Elvehjemホモジ
ナイザーを用いて溶解緩衝液〔１mM ＰＭＳＦ、１％
（v/v）アプロチニン、１０μg/mlペプスタチン、０．
０２％ＮａＮ₃を含むＰＢＳ中２％トリトンＸ−１０
０〕（１ml）中でホモジナイズした。溶解は震盪器上４
℃で１時間続けた。溶解物を１０，０００×g、４℃で
１時間遠心分離した。この上清にＥＤＴＡを最終濃度２
mMで加え、Affi-GelプロテインＡ（２５０μlの圧縮さ
れたビーズ、BioRad Laboratories, Richmond, CA）と
共に４℃で一晩震盪することにより上清を事前浄化し
た。

【０１７０】Ｂ．Ｌ−セレクチン−ＩｇＧビーズに吸着
された成分の同定 Affi-GelプロテインＡ（パック化ビーズ１０μl）をＬ
−セレクチン−ＩｇＧ〔WO 91/08298（１９９１年６月
１３日発行）〕、ＣＤ４-ＩｇＧ〔Caponら, Nature 33
7:525 (1989)に従い製造〕またはヒトＩｇＧ(Calbioche
m, LaJolla, CA）のいずれか（３０μl）と共にＰＢＳ
（１ml）中にて４℃で一晩インキュベートした。このビ
ーズ（Ｌ−セレクチン−ＩｇＧビーズ、ＣＤ４−ＩｇＧ
ビーズおよびhuＩｇＧ−ビーズと称する）をＰＢＳ中で
３回および溶解緩衝液で１回洗浄した。ＣＤ４−ＩｇＧ
およびhuＩｇＧビーズを対照として用いた。

【０１７１】上記セクションＡに記載した事前に浄化さ
れた溶解物を１０，０００×gで１０秒間遠心分離し、
上清にＣａＣｌ₂を最終濃度５mMで加え、この上清を直
ちにＬ−セレクチン−ＩｇＧビーズ、ＣＤ４−ＩｇＧビ
ーズまたはhuＩｇＧ−ビーズと混合し（通常パック化ビ
ーズ１０μl当たり事前浄化された溶解物２００μl）、
震盪器上４℃で４時間インキュベートした。このビーズ
を溶解緩衝液で６回洗浄し、新しい試験管に移し、溶解
緩衝液でもう１回洗浄した。

【０１７２】Ｌ−セレクチン−ＩｇＧビーズに結合した
物質をＳＤＳ中、２−メルカプトエタノールの存在下で
煮沸することにより可溶化し、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル（９または１０％）上で電気泳動し、ＥＮＴＥ
ＮＳＩＦＹまたはＥＮ³ＨＡＮＣＥ（ＮＥＮ）を用いた
蛍光間接撮影法に供した。蛍光間接撮影法により、５０
kDの成分はＥＮ³ＨＡＮＣＥよりもＥＮＴＥＮＳＩＦＹ
を用いて一層拡散する傾向があった。再沈殿実験におい
て、マーカーとしての予め染色された標準（BioRad、高
範囲）と共にＳＤＳ−可溶化サンプルを７．５％ＳＤＳ
ゲル上で電気泳動した。予め染色したオボアルブミン
（４９．５kD）を位置マーカーとして用いることにより
ゲル上の５０kDの回りの領域を切り出し、そのタンパク
質を６０mAで一晩、Laemmli溶離緩衝液中に電気溶離（B
ioRad model 422）した。溶出液を濃縮し、緩衝液をCen
tricon ３０ユニット（Amicon, Danvers, MA）によりＰ
ＢＳ中の１０mM ＣＡＨＰＳに交換し、次いで上記の様
にＬ−セレクチン−ＩｇＧビーズ、ＣＤ４-ＩｇＧビー
ズまたはhuＩｇＧ−ビーズと共にインキュベートした。
粗溶解物の分析のために、事前浄化された溶解物（２０
０μl）を冷アセトン（８０％v/v）で沈殿させ、次いで
上記の様に電気泳動に供した。

【０１７３】Ｌ−セレクチン−ＩｇＧビーズは拡散した
５０kD成分（見かけの分子量範囲は５０kD〜５８kD）を
〔³⁵Ｓ〕−硫酸塩ラベル化腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）ま
たは末梢リンパ節（ＰＮ）から沈殿させた。さらに、約
９０kD（８３kD〜１０２kD）のバンド（硫酸塩導入の点
からみて比較的少量）が、ほとんどの分析において観察
された。対照の沈殿において、ＣＤ４−ＩｇＧおよびhu
ＩｇＧ−ビーズは溶解物中に５０kD主成分または９０kD
成分を認識しなかった。粗溶解物を直接分析した場合
に、他のいくつかのバンドの中で５０kD成分が主要な構
成成分を示した。さらに〔³⁵Ｓ〕硫酸塩rラベル化およ
びＬＨＲ ＩｇＧでの沈殿のための同一の実験法を多く
の器官に適用することにより、５０kD成分の組織分布を
調べた。リンパ組織の中で、末梢リンパ節および腸間膜
リンパ節のみが５０kDおよび９０kDバンドを示し、バイ
アー斑、脾臓、および胸腺は両方に対して陰性であっ
た。また非−リンパ器官、例えば腎臓、肝臓、大脳およ
び小脳は完全に陰性であった。

【０１７４】Ｌ−セレクチン−ＩｇＧビーズはカルシウ
ムが存在する場合に５０kD成分を沈殿させたが、カルシ
ウム不在の場合には沈殿させなかった。さらに相互作用
の特異性をＭＥＬ−１４ mAbを用いて調べた。Ｌ−セ
レクチン−ＩｇＧビーズをこの抗体と予めインキュベー
トすることにより５０kDバンドの該ビーズヘの結合は完
全にブロックされたが、クラスを一致させた対照の抗体
（抗−ＣＤ４５）では全く効果がなかった。フコイジン
はＬ−セレクチン−ＩｇＧビーズによる５０kD成分の沈
殿を完全にブロックしたが、一方で対照の多糖（コンド
ロイチン硫酸B、コンドロイチン硫酸A、ケラタン硫酸）
は完全に不活性であった。さらに、ＰＰＭＥの存在は５
０kDバンドの強度を顕著に減少させたが、比較的高濃度
が必要であった。対照の酵母マンナン（mnn２）は同じ
濃度で全く効果がなかった。小量の９０kDバンドのＬ−
セレクチン−ＩｇＧビーズによる沈殿もカルシウム依存
性であり、ＭＥＬ−１４mAbにより阻害可能であり、そ
してフコイジンおよびＰＰＭＥによりブロックされた。

【０１７５】最後に、糖タンパク質のシアリダーゼ処理
により、Ｌ−セレクチン−ＩｇＧによる結合が阻害され
ることが見いだされた。ゆえに糖タンパク質上のシアル
酸は明らかに結合のために必須である。この結果はセレ
クチンとそのリガンドの間の相互作用の先の特徴付けと
一致する。

【０１７６】実施例２ クローニングおよび配列決定の
ための５０kD Ｌ−セレクチンリガンドの精製 実施例１に記載した実験により、Ｌ−セレクチン−Ｉｇ
Ｇキメラは末梢および腸間膜リンパ節により産生される
〜５０kD硫酸化内皮リガンドの生物学的な特徴付けのた
めに利用し得ることが示された。追加の実験により、末
梢リンパ節（ＰＬＮ）を器官培養物中に入れたときにこ
のリガンドが容易に培地中へと放散されることが示され
ている〔S. Watson−未公開の観察結果〕。ゆえに、配
列決定のためのＬ−セレクチンリガンドの精製における
最初の工程はネズミＰＬＮによる大量の培養培地の製造
であった。劇的な精製を可能にした第二の観察は、〜５
０kD硫酸化Ｌ−セレクチンリガンドが培養培地のクロロ
ホルム−メタノールによる処理の後に可溶性であったこ
とである。この工程により硫酸化リガンドの＞３５０倍
の精製が行われた。次の精製工程は小麦麦芽凝集素アフ
ィニティーカラムからなり、これはこのリガンド中の炭
水化物の見かけの高含量を利用するものであった。最終
精製工程ではＬ−セレクチン−ＩｇＧキメラアフィニテ
ィーカラムを利用して該リガンドを精製した。この最終
工程により、〜５０kD領域内に含まれる物質がＬ−セレ
クチンに比較的高い親和性で結合し得る糖タンパク質に
対応するであろうことが確認された。

【０１７７】腸間膜または末梢（頸部、上腕、腋窩）リ
ンパ節を８〜１６週齢の雌性ＩＣＲマウスから集めた。
マウスを処置してその腸間膜リンパ節を除去した。通
常、培養培地の１バッチを３０匹のマウスの腸間膜節か
ら作製した。時には、さらに少数（全リンパ節重量の約
５％）の末梢リンパ節を加えた。この節をカミソリ刃を
用いて約１mm厚さの薄片に切断し、この薄片を２５mM
ＨＥＰＥＳ緩衝液、１U/mlペニシリンおよび１μg/mlス
トレプトマイシンを追加した１００ml細胞培養ボトル中
の標準的な細胞培養培地ＲＰＭＩ-１６４０（１ml）に
加えた。培地と節の比は６ml/３０腸間膜リンパ節であ
った。

【０１７８】培養ボトルを３７℃インキュベーター中に
置いた。４時間後、培地を１５ml円錐形試験管中に注い
で５００×gで１０分間遠心分離し、大きな組織破片を
除去した。この上清を再び１５ml Corex試験管中、２
０，０００×gで１５分間遠心分離した。得られた上清
をまずNitexスクリーンを通して注ぎ、遠心分離の間に
ペレット化しない脂肪質の粒子を除去し、次いで液体窒
素を用いて急速凍結して−２０℃で保存した。

【０１７９】タンパク質精製計画をモニターする目的の
ために、³⁵ＳＯ₄−ラベル化Ｓgp５０を上述の様に調製
した培養培地に加えた。この物質は上述の培養培地１ml
中の５マウス腸間膜リンパ節を０．５mＣｉＮａ³⁵ＳＯ₄
（ＩＣＮ）でラベルすることにより調製した。４時間
後、細胞培養培地を除去してミクロ遠心機中で１０分間
遠心分離した。その上清を除去して１００μl圧縮プロ
テインＡ−アガロースビーズ（Zymed Corp.）に加える
ことにより事前浄化し、４℃で一晩震盪した。事前浄化
された培地を、Antibodies．ALaboratoryManual（198
8）HarlowおよびLane, Cold Spring Harbor Laboratory
の５２２〜５２３ページに概説されている方法に従い、
１ml圧縮プロテインＡ−アガロース（Zymed）当たり１
０mgのＬ−セレクチン−ＩｇＧで調製した３mlの共有架
橋結合されたＬＥＣ−ＩｇＧ−プロテインＡ−アガロー
ス（ＬＥＣ×プロテインＡ−アガロース）カラムに加え
た。カラムを６時間から一晩Ｌ−セレクチン×プロテイ
ンＡ−アガロースと共に震盪した後に、１０容量のダル
ベッコのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄し、
精製された物質（ＧｌｙＣＡＭとしても知られる５０kD
Ｌ−セレクチンリガンド）をＰＢＳ中の４mM ＥＤＴ
Ａ（１０ml）で溶離した。この物質をCentricon３０（A
miconCorp.）上で濃縮して最終容量を約１００μlにし
た。約６０，０００cpmの物質が得られた。

【０１８０】微量配列決定分析のための精製タンパク質
を製造するために、４バッチ（約１２０マウス）の培養
培地（２４ml）を解凍した。５０μlの³⁵ＳＯ₄−ラベル
化Ｓgp５０（３２，０００cpm）を加えた。９容量（２
１６ml）のクロロホルム：メタノール（２：１）を加え
て５０ml円錐形試験管中で３０分間室温で震盪し、５０
０×gで２０分間遠心分離した。上部の水層を集め、
「界面」層を再度遠心分離してできるだけ多くの水層を
抽出した。このクロロホルム：メタノール抽出を繰り返
した。水層を見るために、約２０mlのＰＢＳを加えた。
水層を集めて、残留したクロロホルム：メタノールは水
層を１リットルのビーカーに入れて換気フード中の温水
浴中で３時間撹拝することにより蒸発させた。次に、以
下において＜Ｃ：Ｍ（「クロロホルム：メタノール分配
後」）と称されるこの物質をＰＢＳに対して４時間透析
した。同様の製造において、１３８５倍の精製がなされ
た。１９２００cpmを有する透析された＜Ｃ：Ｍを４ml
の小麦麦芽凝集素（ＷＧＡ）−アガロースゲル（Vector
Laboratories）と共に４℃で一晩震盪した。このゲル
をカラム中に集め、ＰＢＳ（４０ml）で洗浄し、ＰＢＳ
中の０．２Ｍｎ−アセチルグルコサミンで溶離した。同
様の実験において、さらに４．４倍の精製がなされた。
マウス６０匹に相当する約１５０００cpmを含有してい
るこの物質をCentricon ３０上で濃縮し、標準的なLae
mmliの方法の下で１０％ＳＤＳ−ゲル上を流した。同様
の実験において、ＬＥＣ×プロテインＡ−アガロース上
での最終精製により全体で６０６０６倍の精製が得られ
た。次いで該タンパク質をBioRadミニプロッター（２５
０mA定電流で２時間）においてProBlott膜（APPlied Bi
osystems Incorp.）上に電気プロットした。この膜（プ
ロット）を製造者の勧めに従いクーマシーR-２５０で染
色し、汚れを除いた。このプロットを風乾してオートラ
ジオグラフィーをKodak ＸＡＲフィルムを用いて行っ
た。

【０１８１】次いで精製された物質を気相微量配列決定
に供した。

【０１８２】実施例３ タンパク質配列決定 ポリペプチド配列は、実施例２に記載したように精製し
た物質の気相微量配列決定により決定した。Ｌ−セレク
チン−ＩｇＧアフィニティーカラムから溶離されたタン
パク質を１０％ＳＤＳ−ゲル上で流し、Problott膜（Ap
plied Biosystems Inc.）上に電気プロットし、クーマ
シーＲ２５０で染色し、汚れを除いた。このプロットを
風乾してKodak ＸＡＲフィルムに露出して硫酸塩ラベ
ル化リガンドの位置を検出した。ゲルのこの領域を切り
出して気相微量配列決定にかけた。配列決定は本質的に
上記に記載したように行った。

【０１８３】ポリペプチド配列決定により、約５pMレベ
ルで明白な２５アミノ酸の範囲が明らかになった（図３
Ｂ）。

【０１８４】実施例４ 〜５０kD Ｌ−セレクチンリガ
ンドのｃＤＮＡクローニングおよび配列分析 ネズミ末梢リンパ節ｃＤＮＡライブラリーはInvitro Ge
n ｃＤＮＡライブラリーキットおよびネズミ末梢リンパ
節から単離されたポリＡ＋ＲＮＡを用いて構築した。重
複したオリゴヌクレオチドプローブのプールは、Ｎ末端
配列の９〜１７残基（ＱＭＫＴＱＰＭＤＡ）から哺乳動
物コドン使用規則を基にして選択された縮重したコドン
を用いて得た。コドンはＣＡＧ、ＡＴＧ、ＡＡＧ、ＡＡ
Ａ、ＡＣＡ、ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＴ、ＣＣ
Ｃ、ＧＡＴまたはＧＡＣであった。ＧＣのみを５′Ａｌ
ａコドンのために用いた。２６−merオリゴヌクレオチ
ドをポリヌクレオチドキナーゼにより³²Ｐラベル化し、
１，０００，０００のgＴ１０バクテリオファージを２
０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０mM Ｃａｃｌ、
１５mMクエン酸三ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウ
ム（pH７．６）、５×Denhardt溶液、１０％硫酸デキス
トランおよび２０μg/mlの変性して勇断したサケ精子Ｄ
ＮＡを含む２０プレートから得た複製ニトロセルロース
フィルターに４２℃で一晩ハイブリダイズさせた。この
フィルターを１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、４２℃で
２回３０分間洗浄して−７０℃で一晩オートラジオグラ
フィーを行った。１個の複製物の陽性ファージをプラー
ク精製し、Eco Ｒ１挿入物をｐＧＥＭベクター中にサブ
クローン化した。両鎖の全ヌクレオチド配列はSequenas
eキットによるスーパーコイン（supercoin）配列決定に
より得た。In situハイブリダイゼーションおよびノー
ザンブロット分析のために、ポリＡ尾部を欠いているポ
リメラーゼ連鎖反応フラグメントを合成し、次いでｐＧ
ＥＭベクター（ＰＲＯＭＥＧＡ）中にサブクローン化し
た。コード化ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を図４に示
す。該クローンは１５１アミノ酸からなる１個の読み取
り枠を有する短い（約６００bp）ｃＤＮＡを含んでい
た。「Kozak box」（ＣＣＡＣＣＡＴＧＡ）は最初のコ
ード化メチオニンの回りに見られた〔Kozak, M. CellBi
ology 115:887 (1991)〕。このメチオニンに続いて、タ
ンパク質の分泌経路への移動のためのシグナル配列とし
て機能すると思われる１９アミノ酸の長い疎水性の高い
配列が存在した。この領域に続いてＬ−セレクチン−Ｉ
ｇＧ結合物質のＮ末端配列決定により決定された配列と
ほとんど正確に対応している配列が存在する。このシグ
ナル配列がプロセシングされた１３２アミノ酸タンパク
質はセリンおよびトレオニンに非常に富み、これらの残
基に対応する約２９％のコード化アミノ酸を有してい
た。

【０１８５】おそらくもっと重要であろうが、これらの
セリンおよびトレオニン残基は糖タンパク質の２つの領
域に密集していることが見いだされた（図３Ｄ）。領域
１（残基４２〜６３）は１２個のセリンまたはトレオニ
ンを含む（〜５５％）ことが見いだされた一方、領域１
１（残基９３〜１２２）は１４個のセリンまたはトレオ
ニン残基を含む（〜４８％）ことが見いだされた。これ
らの領域内で、セリンおよびトレオニン残基は通常２、
３または４つの群に密集していることが見いだされた。
このタンパク質はシステイン残基を欠き、１個の可能性
のあるＮ−結合性グリコシル化部位（残基１１５〜１１
７）が存在していた。システイン残基の欠如は、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル上の硫酸塩−ラベル化リガン
ドの移動度がジスルフィド還元剤の不在により影響され
ないことを示した以前のデータ（S. ImaiおよびS. Rose
n未公開の観察結果）と一致していた。さらに１個の可
能性のあるＮ−結合性部位は、以前に示された〜５０kD
リガンド上のＮ−グリカナーゼ（glycanase）−感受性
の炭水化物側鎖が少数であることと一致した。最終的
に、プロセシングされたタンパク質の分子量は〜１４，
１５４kDであることが見いだされた。単離されたＬ−セ
レクチンリガンドの分子量は〜５０kDであるから、この
結果により〜７０kDの糖タンパク質の塊りはＯ−結合性
炭水化物であることが示され〔CarrawayおよびHull, Bi
oAssays 10(4), 117-121 (1989)〕、結果は単離された
糖タンパク質をクーマシーブルーで染色することができ
ないことと一致する。

【０１８６】このｃＤＮＡによりコードされるタンパク
質のＣ末端を調べることにより、穏やかな疎水性領域が
明らかとなったが、明らかなトランス−メンブラン・ア
ンカーリングモチーフはなかった。この領域がホスファ
チジルイノシトール（ＰＩ）尾部の付加を支配している
シグナルに対応する可能性がある一方で、リンパ節切片
のホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩ
ＰＬＣ）による処理ではリガンドを内皮細胞から除去し
ないようである（M. Simger, S. Watson, R. Mebius−
未公開の観察結果）。この結果は〜５０kDリガンドがP
１尾部を用いて細胞表面と結合する可能性の反証を挙げ
るものではないが、これは他の可能性のある細胞表面へ
の結合がこの糖タンパク質により利用されているかもし
れないことを示唆する。両親媒性ヘリックスを探索する
プログラムを用いてＣ末端の２１アミノ酸を調べること
により、この糖タンパク質のＣ末端は非常に重要な両親
媒性ヘリックスをコードしていることが明らかになった
（図３Ｃ）が、この可能性のあるヘリックス領域の１つ
の面は非極性残基を含んでおり、また他の面は極性残基
を含んでいる〔J. Mol. Biol. 81:155 (1984)〕。

【０１８７】実施例５ ペプチドに対する抗体の製造 単離されたｃＤＮＡがＬ−セレクチンリガンドのタンパ
ク質の背骨に対応する配列をコードすることを最終的に
証明するために、本発明者らは単離されたリガンドｃＤ
ＮＡのヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列か
ら得られるペプチドをApplied Biosystemsペプチド合成
装置上で製造した。Ｎ−末端（ＣＡＭ０１：ＬＰＳＫＤ
ＥＬＱＭＫＴＣ）、タンパク質の中央領域（ＣＡＭ０
２：ＣＫＥＰＳＩＦＲＥＥＬＩＳＫＤ）、およびタンパ
ク質のＣ末端（ＣＡＭ０５：ＣＩＩＳＧＡＳＲＩＴＫ
Ｓ）に由来するペプチドを、付加した下線システイン残
基を介して鍵穴カサガイ（keyhole limpet）のヘモシア
ニンに結合させ、ウサギに注射し、続いて通常の免疫実
験を行った。免疫前の血清および接種されて追加免疫さ
れたウサギから得た血清を集め（ここでウサギポリクロ
ーナル抗ペプチド血清をＣＡＭ０１、ＣＡＭ０２、ＣＡ
Ｍ０５と称する）、各血清を、上記の様にＬ−セレクチ
ン−ＩｇＧキメラに結合させることにより精製した硫酸
塩ラベル化Ｌ−セレクチンリガンドを免疫沈降させるそ
の能力について試験した。

【０１８８】クローン化タンパク質がＬ−セレクチンＩ
ｇＧキメラを用いて培養培地から精製された³⁵Ｓ−ラベ
ル化物質と同じであることを証明するために、Ｌ−セレ
クチン−ＩｇＧ精製³⁵Ｓ−ラベル化物質の免疫沈降を行
った。２つの別々の実験について以下の方法を用いた。
免疫沈降ビーズの調製のために、２５μlパック化プロ
テインＡ−セファロースビーズ（Zymed Laboratories）
＋２５μlウサギ血清＋３５０μl ＰＢＳをミクロ遠心
管中で共に４℃で３時間震盪させる。各試験管をＰＢＳ
で３回洗浄して非結合免疫グロブリンを除去すると、２
５μlのビーズのみが残る。約６，０００cpmのＬ−セレ
クチン−ＩｇＧ精製³⁵Ｓ−ラベル化物質を含有している
ＰＢＳ（６０μl）を加える。これを１５分ごとに試験
管を軽く動かしながら氷上で３時間インキュベートす
る。３時間後、ミクロ遠心管を回転させてビーズをペレ
ット化する。上清（４５μl）を取り去り、４×Laemmli
サンプル緩衝液（１５μl）と混合してＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ分析のために煮沸する。ペレット化されたビーズをＰ
ＢＳで３回洗浄し、新しい試験管に移し、上清を静かに
デカンテーションして試験管中に最終容量４５μlを残
す。４×Laemmliサンプル緩衝液（１５μl）を加えてＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために煮沸する。このＳＤＳゲル
は還元条件下で流した。免疫グロブリン重鎖は還元条件
下では５０kDで流出し、ラベルされたバンドを圧縮す
る。この実験において免疫前の血清はいずれも該ラベル
と相互作用しないが、一方でＣＡＭ０１およびＣＡＭ０
５は部分的な効果を有し、ＣＡＭ０２は該バンドを完全
に免疫沈降させる。この実験を以下の差異のもとにＣＡ
Ｍ０２について繰り返した。該ゲルを５０kDバンドが圧
縮されないように非還元条件下で流した（本発明者らは
還元条件下のＳＤＳゲルにおいてＬ−セレクチン−Ｉｇ
Ｇ精製³⁵Ｓ−ラベル化物質が移動性を変化させないこと
を事前に確認していた）。さらに、１つの試験管につい
て、抗体−抗原相互作用の特異性を示すために、ＣＡＭ
０２抗体を被覆したビーズを１mg/mlＣＡＭ０２ペプチ
ドと氷上で３０分間予めインキュベートした。最終的
に、同様の実験計画を用いてCaltagが作成したＬ−セレ
クチンのＣ末端ペプチドに対する無関係な対照ペプチド
抗体〔ＲＯＳＹ（ロージー）１Ｂと称する〕も試験し
た。両ゲルをEnhance（New England Nuclear）を用いた
蛍光間接撮影法に供し、Kodak Xarフィルムを用いてオ
ートラジオグラフィーを行った。ＣＡＭ０２はＬ−セレ
クチン−ＩｇＧ精製³⁵Ｓ−ラベル化物質を完全に免疫沈
降させ、ＣＡＭ０２免疫前およびＲＯＳＹ １Ｂは効果
を有さない。遊離のＣＡＭ０２ペプチドは特異的な免疫
沈降をブロックする。この結果を図５ＡおよびＢに示
す。

【０１８９】実施例６ Ｌ−セレクチンリガンドの発現 図６は〜５０kD Ｌ−セレクチンリガンドをコードして
いるmＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。図６Ａに
おいて見られるように、mＲＮＡはポリＡ＋分画中にコ
ードされており、〜０．７kDの分離したバンドに対応す
る。このバンドの鮮明度は有意なレベルの別のＲＮＡス
プライシングの反証となっており、単離されたリガンド
クローンを用いたネズミＰＬＮ ｃＤＮＡライブラリー
の再スクリーニングにより、他のいかなるスプライスさ
れた形態のメッージも明らかにされていない。リンパ節
により排出される領域での炎症応答の誘導により、リガ
ンドをコードしているmＲＮＡの量の相対的な減少が示
されており、これはおそらく新しく移動しているリンパ
球由来のポリＡ＋mＲＮＡの大きな寄与によるものであ
ろう。この結果はリガンドが炎症の間、ＰＬＮ ＨＥＶ
中に劇的に誘導されるようではないことを示すが、この
実験から量的な結論を出すのは困難である。異なる領域
のリンパ節におけるこのmＲＮＡの発現を調べることに
より、本発明者らが調べた全ての領域のＰＬＮにおいて
これが発現されていることが示された（図６Ｂ）。

【０１９０】多くの異なるリンパ系および非リンパ系組
織におけるＬ−セレクチンリガンドをコードしているm
ＲＮＡの発現の分析により、この配列は非常に組織−特
異的な方法で発現されていることが明らかである。図６
Ｃは該リガンドに対応するmＲＮＡが腸間膜および末梢
リンパ節の両方において強力に発現されることを示す。
これは、硫酸塩−ラベル化リガンドがこれらの２つの器
官においてのみ発現されることが見いだされた以前の実
験と一致する。さらにこのメッセージは肺において有意
なレベルで、そしてバイアー斑において非常に低いレベ
ルで発現される。このmＲＮＡは多くの非リンパ系器官
においては検出不可能であり、他の２つのリンパ系器
官、脾臓および胸腺において見いだされない。この後者
の結果により、リガンドが脈管構造のサブセット、すな
わち末梢リンパ系組織において見られるＨＥＶにおいて
のみ有意に発現され得ることが強く示唆される。

【０１９１】該リガンドmＲＮＡがＨＥＶにおいて発現
されることを証明するために、in situハイブリダイゼ
ーションを行った。既述の方法〔Wilcoxら, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 86:2839 (1989)〕を用いてin situ
ハイブリダイゼーションによりリガンド発現について組
織を分析した。末梢リンパ節およびバイアー斑を有する
小腸の切片をマウスから採収し、パラホルムアルデヒド
中に固定化し、次いでスクロースに浸した。組織をＯＣ
Ｔ化合物（Miles Scientific）中に埋め込み、イソペン
タン中で凍結させて８ミクロン切片に切断した。この切
片をVectabond被覆化スライド（Vector Laboratories）
上に解凍−固定した。³⁵Ｓ−ラベル化ＲＮＡプローブは
既述の方法（Meltonら1984）を用いてセンスおよびアン
チセンス方向で生成させた。ハイブリダイゼーションの
ために、切片を４％パラホルムアルデヒド（１０分
間）、プロテイナーゼＫ（１μg/ml、１０分間）で順に
処理し、続いて１００μlのハイブリダイゼーション緩
衝液（５０％ホルムアミド、０．０３Ｍ ＮａＣｌ、２
０mM トリス−ＨＣｌ、５mM ＥＤＴＡ、１×Denfardt
溶液、５％デキストラン硫酸、１０mMジチオトレイトー
ル）を用いて４２℃で２時間プレハイブリダイゼーショ
ンした。プローブを最終濃度８×１０６cpm/mlで加え、
次いで５５℃で一晩インキュベーションした。スライド
を１０mM βメルカプトエタノール（ＢＭＥ）、１mM
ＥＤＴＡを含む２×ＳＳＣで洗浄し、続いて３０分間の
処理（２０μg/mlで３０分間）をした。ＥＤＴＡおよび
ＢＭＥを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェン
シー洗浄を５５℃で２時間行った。スライドを０．５×
ＳＳＣ中で洗浄し、エタノールの濃度を上昇させること
により脱水し、真空乾燥した。スライドをＮＴＢ２核乳
剤（Kodak）中に浸し、５週間まで感光させた。スライ
ドを現像し、ヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色
した。陰性対照はセンスプローブを有する一連の切片の
ハイブリダイゼーションからなっていた。図７に見られ
るように、単離されたリガンドｃＤＮＡクローンにより
コードされているアンチセンス鎖は末梢リンパ組織のＨ
ＥＶに明らかにハイブリダイズするが、センス鎖はいか
なる有意なハイブリダイゼーションも示さない。この結
果によりリガンドｃＤＮＡに対応するmＲＮＡはＨＥＶ
細胞により合成され、腸間膜およびＰＬＮのこの領域へ
のＬ−セレクチンリガンドの局在性を示している以前の
免疫組織化学的なデータと一致することが明白に示され
る。

【０１９２】本明細書中に開示されるデータは、Ｌ−セ
レクチンに対する内皮性リガンドが独特のムチン型糖タ
ンパク質であるという仮説と一致する。定義によりムチ
ンは、セリン／トレオニンに富むタンパク質であり、そ
の分子量は主にＯ−結合性炭水化物側鎖によるものであ
る〔Cysterら, The Embo J. 10:893 (1991), Fukuda,
M., Glycobiology 1:347 (1991), Gendlerら, Am. Rev.
Respir. Dis. 144:S42(1991), Gumら, The J. of Bio
l. Chem. 266:22733 (1991), Porchetら, Am. Rev. Res
p. Dis. 144:S15 (1991)〕。本明細書中で開示されるＬ
−セレクチンリガンドにおいて見られる高いセリンおよ
びトレオニン含量は、タンパク質の高度なグリコシル化
（分子量で〜７０％）と一緒になって、リガンド上の炭
水化物の大部分が実際にＯ−結合性であることを示唆
し、〜５０kDの硫酸化ＰＬＮリガンドのＮ−グリカナー
ゼ耐性を示している以前の実験が確認された。Ｏ−結合
性炭水化物がＬ−セレクチンのレクチンドメインにより
媒介される接着性相互作用に直接関係するようであると
いう事実は、本明細書中で開示されるタンパク質の背骨
の役割が炭水化物の提供のための骨格としてのものであ
るらしいことを示唆する。ゆえに、このタンパク質は組
織−特異的な方法でＬ−セレクチンのレクチンドメイン
に炭水化物を提供するために機能する新規な型の細胞接
着分子を表す。このように、この「骨格」の局所での発
現がリンパ球群の局所交通の結果を与えるのであろう。

【０１９３】セレクチンヘの炭水化物提供のための骨格
としてのムチン様糖タンパク質の使用は、ムチン構造に
ついて現在知られていることとの関連の上で見たときに
意味を持つ。ムチン等の高度なＯ−結合性糖タンパク質
の構造の以前の研究により、これらの分子が高度に拡張
された、いくらか棒状の分子である傾向があることが明
らかになっている。例えば、白血球表面のムチン・ロイ
コシアリン（シアロホリン、ＣＤ４３）（Cysterら, 19
91, 上記;Fukuda 1991, 上記）は固い棒状構造を形成す
ることが示されており、他のムチンの物理化学的分析に
より同様の棒状構造が特に高度なＯ−グリコシル化領域
において示されている〔Harding, S. E., Advances in
Carbohydrate Chemistry and Biochemistry 47:345 Aca
demic Press, Inc. (1989), Jentoft, N., TIBS 15:291
(1990)〕。さらに、他の非−ムチンタンパク質、例え
ば崩壊促進因子（ＤＡＦ）および低密度リポタンパク質
（ＬＤＬ）レセプターは、グリコカリックスを介してレ
セプターを広げるように機能し得る棒状のドメインを形
成するらしい高度なＯ−結合性ドメインを細胞表面の近
くに有する（Jentoft 1991, 上記）。この棒状構造はま
さに、セレクチンのレクチンドメインに炭水化物を提供
することを役割とする分子について予想されるであろう
構造である。図６に図示したモデルに示すように、Ｌ−
セレクチンリガンドはＨＥＶの管腔中に拡張する「瓶洗
いブラシ」として考えることができる。これにより、リ
ンパ球表面に局在化しているＬ−セレクチンのレクチン
ドメインに多数のＯ−結合性炭水化物リガンド（ブラシ
の荒毛）が適切に提供され、このようにして内皮細胞へ
の接着を媒介する。リガンド上の２つのドメインヘのこ
れらの炭水化物の見かけ上の密集は、リンパ球−ＨＥＶ
接着性相互作用の結合親和力を高めるために多価の様式
でそれらが提供され得ることを示唆している。即ち、Ｌ
−セレクチンリガンドのムチン様の性質は、拡張された
棒状のプラットホームを介して多価の炭水化物リガンド
をＬ−セレクチンのレクチンドメインに提供するように
機能し得るであろう。的確に言えば、これは免疫系にお
ける細胞接着の新しい機構を規定するものであろう。

【０１９４】本明細書中で開示された発現分析により、
Ｌ−セレクチンにより媒介される局所のリンパ球交通の
調節がリガンドmＲＮＡの組織特異的発現によるもので
あろうと示唆される。本発明者らは、Ｌ−セレクチンを
介するリンパ球−ＨＥＶ相互作用を媒介しているとして
以前に記載された組織のみがリガンドに対する高レベル
のmＲＮＡを発現することを見いだしたが、バイアー斑
における非常に低レベルのmＲＮＡは多少予期しなかっ
たことであった〔Gallatin, Cell 44:673 (1986), Butc
her, Am. J. Pathol. 136:3 (1990), Imaiら, J. Cell
Biol. 113, 1213(1991), Streeterら, J. Cell Biol.10
7, 1853 1988b, Woodruffら, Annu. Rev. Immunol. 5,
201 (1987)〕。これらの結果は、局所の交通は少なくと
も一部分において本明細書中に開示した該リガンドmＲ
ＮＡの転写活性化により制御されているという可能性と
一致し、外因性因子はリガンド遺伝子の転写を制御する
ことによりＬ−セレクチン−介在性接着を調節し得るこ
とを示している。もちろん該リガンドのタンパク質の背
骨はＬ−セレクチン接着を媒介するには不十分であり、
この背骨上に見られる炭水化物リガンドの作成に関与す
るグリコシル−トランスフェラーゼを制御している遺伝
子も転写調節されているかもしれない。この後者の可能
性は、非−ＨＥＶ細胞において本明細書中に開示したｃ
ＤＮＡの発現により産生されるリガンド糖タンパク質の
活性を調べることにより現在試験可能である。別レベル
の調節が、適当なＬ−セレクチン−特異的炭水化物側鎖
を〜５０kDリガンドが受容する一方で他のＯ−結合性糖
タンパク質が受容しない機構に関係しているのかもしれ
ない。本明細書中に開示されるＬ−セレクチンリガンド
が慢性または急性の炎症部位において異所的に発現さ
れ、リンパ球または好中球の交通を媒介し得るという可
能性は研究すべきものとして残されている〔Watsonら,
Nature 349:164 (1991)〕。バイアー斑において検出さ
れる非常に低いレベルのリガンドmＲＮＡの発現はこの
ような調節可能な異所性の発現を示すものである可能性
がある。

【０１９５】本明細書中に開示される〜５０kDのリガン
ドがタンパク質一炭水化物相互作用を介してＬ−セレク
チンに容易に接着することは明らかであるが、このリガ
ンドが内皮細胞表面と結合する機構は明らかにすべきも
のとして残されている。本発明において見いだされた急
速な放散は器官培養物の人工産物であり得たが、該リガ
ンドの活性な放散型がウシ（J．Gilbert−未公開観察結
果）またはネズミ（S.Watson−未公開観察結果）血清か
ら精製し得ることを示している他のデータはこのリガン
ドがインビボで放散され得ることを示している。他の多
くの細胞表面接着分子、例えばＬ−およびＰ−セレクチ
ン〔Johnstonら, Cell 56, 1033 (1989)〕およびＩＣＡ
Ｍ １〔Rothleinら, J. 1mmunol. 147:3788 (1991)〕
は放散されることが見いだされており、多くの場合にお
いてこの放散は生理学的に重要であるらしい。本明細書
中に報告したリガンドの急速な放散は、ＨＥＶの管腔表
面との比較的ゆるい結合を示す。このような結合の１つ
は上記の両親媒性ヘリックスによる媒介が可能であり、
図８に示すモデルで説明することができた。このヘリッ
クス領域は膜に架橋して同時に膜の接着およびリガンド
のオリゴマー型の形成を媒介することができた。該リガ
ンドがオリゴマー化し得ることはゲル濾過実験の間に見
いだされた（Y．ImaiおよびS．Rosen−未公開観察結
果）。他の多くのタンパク質は両親媒性ヘリックスを膜
結合および孔形成のために利用することが見いだされて
おり〔Haffarら, J. Cell Biol. 107:1677 (1988), Eis
enberら, J. Mol. Biol. 179:125 (1984), Finer-Moore
およびStroud, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:155 (1
984)〕、ゆえにこのドメインはＬ−セレクチンリガンド
の場合に同様の様式で機能し得る可能性がある。別の仮
説は、両親媒性ヘリックスが内皮細胞表面とより堅固に
結合されている別のタンパク質と弱い相互作用をし得る
というものである。また、該リガンドは現在不明の様式
でグリコカリックス中に組み込まれてる可能性がある。
最後の可能性は、Ｌ−セレクチンレクチンドメインに結
合するいくつかのＨＥＶリガンドが存在し、そのうちの
いくつかは、例えばImaiら〔(1991), 上記〕により開示
されている〜９０kD硫酸化リガンドまたはStreeterら
〔J. Cell Biol. 107, 1853 (1988b)〕により開示され
ているＰＬＮアドレシン等の様に内皮細胞表面と堅固に
結合されており、そして他のものは本明細書中に開示さ
れる〜５０kDリガンドの様に放散されるというものであ
る。

【０１９６】本明細書中に開示したムチン様内皮性リガ
ンドとモノクローナル抗体ＭＥＣＡ７９により定義され
る既に報告されているタンパク質の群〔pln“アドレシ
ンス”Streeterら, Nature (Lond.) 331:41, J. Cell B
iol. 107, 1853 (1988), Bergら, Immunol. Rev. 108:5
(1991)〕の間の関係は明らかにすべきものとして残さ
れている。Imaiら〔(1991), 上記〕は本明細書中に開示
したリガンドがＭＥＣＡ７９抗体（未知の炭水化物決定
基に結合する抗体）により認識されることを既に示した
が、Streeterら〔(1988b), 上記〕およびBergら〔(199
1), 上記〕は多くの他の糖タンパク質もこの炭水化物様
エピトープを発現するらしいことを示している。したが
って、Ｌ−セレクチンのレクチンドメインに炭水化物を
提供する他の内皮性糖タンパク質が存在する可能性があ
る。ゆえに本明細書中に報告したムチン様リガンドに特
異的なモノクローナル抗体の開発は、Ｌ−セレクチン−
介在性の交通のための接着性リガンドとして本糖タンパ
ク質と他のものの相対的な寄与の評価を可能にするであ
ろうから、非常に重要であろう。

【０１９７】〜５０kDのＬ−セレクチンリガンドは免疫
系における細胞接着に関与する分子の４番目の型であ
る：１）白血球インテグリン、２）そのリガンド、免疫
グロブリン（Ig）スーパーファミリー構成員、３）セレ
クチン、および４）〜５０kDＬ−セレクチンリガンド。
該インテグリン、Igスーパーファミリー構成員、および
セレクチンの全ては種々の関連の分子を含んでいるファ
ミリーからなることが見いだされている。本明細書中に
開示したリガンドの特徴のゆえに、本発明者らはこの出
願中に用いた扱いにくい名称をより記述的な用語である
ＧＬＹＣＡＭ１〔ＧＬＹcosylation dependant Cell Ad
hesion Molecule（グリコシル化依存性細胞接着分
子）〕と置き換えることを提案する。

【０１９８】上記に特に好ましい態様について示してい
るが、本発明はそのように限定されないことは理解され
るであろう。当業者は、開示された態様に対して本発明
の全体の概念から逸脱ことなく種々の修飾を行うことが
できるであろう。このような全ての修飾は本発明の範囲
内にあることが意図されている。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ｃＤＮＡクローニングにより決定され
たセレクチン（ＬＥＣ−ＣＡＭ）ファミリー構成員の構
造を示す。示したのはＬ−セレクチン、Ｅ−セレクチン
およびＰ−セレクチンの構造である。レクチン、上皮増
殖因子（ＥＧＦ）、および多重性短共通反復（multiple
short consensus repeats）（SＣＲs）を、Johnstonら
〔Cell 56, 1033 (1989)〕により最初にＧＭＰ−１４０
について提示された仮定的なジスルフィド結合と共に示
す。また、Ｎ末端配列（後に成熟タンパク質において切
断される）を疎水性トランスメンブラン・スパニング・
アンカー（ＴＭ）および細胞質尾部と共に示す。またＰ
−セレクチンの他の２つの形態を示すが、一方はscr−
７ドメインを欠失し、もう一方はメンブラン・スパニン
グ・アンカーを欠失している。

【図２】図２はセレクチンファミリーの構成員をコード
している遺伝子の構造を示す。ヒトおよびネズミのＬ−
セレクチン、ヒトＥ−セレクチンおよびヒトＰ−セレク
チンをコードしているゲノム構造を示す。黒い箱は様々
な構造のモチーフをコードするエキソン、例えばネズミ
遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）、シグナル配列（Ｓ
Ｓ）、レクチン（ＬＥＣ）、上皮増殖因子（Ｅ）、短共
通反復（ＳＣＲ）、トランスメンブラン・アンカー（Ｔ
Ｍ）および細胞質ドメイン（ＣＤ）、およびこれらのタ
ンパク質コード化ドメインを隔てるイントロンをコード
する介在領域を示す。ヒトにおいては、３つ全てのセレ
クチン遺伝子は互いに染色体１の長アーム上の一群のタ
ンパク質（その全てが異なる数の短いＳＣＲエキソンを
含む）をコードしている遺伝子座の近くの２００キロ塩
基以内にある。またネズミＬ−セレクチンはネズミ染色
体１上であって、ヒト染色体１相同体において見い出さ
れる領域と同調の領域中にコードされている。

【図３Ａ】図３Ａは〜５０kD Ｌ−セレクチンリガンド
の精製およびＮ末端アミノ酸配列を示す。培養培地から
のリガンドの精製は後に添加した³⁵Ｓ−ラベル化リガン
ドによりモニターした。レーンＡ：開始培養培地。レー
ンＢ：クロロホルム：メタノール分配後の水層。レーン
Ｃ：ＬＥＣ−ＩｇＧ結合物質であり、括弧で囲んだ範囲
を気相タンパク質配列決定のために切り出した。レーン
Ａ−ＣはクマシーＲ−２５０で染色したProBlott膜であ
る。レーンＤはレーンＣのオートラジオグラフである。

【図３Ｂ】図３Ｂ：末端アミノ酸配列。

【図３Ｃ】図３Ｃ：Ｃ末端の２１のアミノ酸を回転（wh
eel）プログラムにより分析した。このプログラムはヘ
リックス領域の円筒部を見下ろしたものを表示し、ヘリ
ックスの周りのアミノ酸残基を示す。非極性のアミノ酸
は白抜きの囲みで示し、極性のアミノ酸は陰をつけた囲
みで示す。

【図３Ｄ】図３Ｄ：Ａにおける推定アミノ酸配列から得
たハイドロパシー・プロットを示す。黒丸はセリンまた
はトレオニン残基に対応し、白抜きの丸は可能性のある
１個のＮ−結合性グリコシル化部位のＡＳＮである。〜
５０kDリガンドの推定されたドメイン構造をシグナル配
列（ＳＳ）、Ｏ−結合性領域ＩおよびIIならびにＣ末端
両親媒性ヘリックス領域と共に上に示す。

【図４Ａ】図４はＬ−セレクチンに対する内皮性リガン
ドのコアタンパク質のヌクレオチドおよびコードされた
アミノ酸配列を示す。陰を付けていない囲みは最初のメ
チオニンコドンの周りのKozak翻訳開始部位を示す。残
基２０を起点とする点線を下に付けたアミノ酸配列は、
位置３４のＴＨＲ（Ｎ末端配列ではＭＥＴ）を除き、Ｌ
−セレクチン精製リガンドのＮ末端配列決定により決定
されたアミノ酸配列（図３Ｂ）に対応する。推定された
アミノ酸配列中のセリンおよびトレオニン残基は陰をつ
けた囲み中に示す。

【図４Ｂ】図４はＬ−セレクチンに対する内皮性リガン
ドのコアタンパク質のヌクレオチドおよびコードされた
アミノ酸配列を示す。陰を付けていない囲みは最初のメ
チオニンコドンの周りのKozak翻訳開始部位を示す。残
基２０を起点とする点線を下に付けたアミノ酸配列は、
位置３４のＴＨＲ（Ｎ末端配列ではＭＥＴ）を除き、Ｌ
−セレクチン精製リガンドのＮ末端配列決定により決定
されたアミノ酸配列（図３Ｂ）に対応する。推定された
アミノ酸配列中のセリンおよびトレオニン残基は陰をつ
けた囲み中に示す。

【図５Ａ】図５Ａは、Ｌ−セレクチン精製した〜５０kD
リガンドのペプチド抗体による免疫沈降を示す。図５Ａ
および５Ｂの説明のための記号は以下の通りである： Ｐ１＝免疫前ＣＡＭ０１−ビーズ Ｐｓ１＝免疫前ＣＡＭ０１−免疫沈降後に残った上清 Ｉ１＝免疫ＣＡＭ０１−ビーズ Ｉｓ１＝免疫ＣＡＭ０１−免疫沈降後に残った上清 Ｐｓ２＝免疫前ＣＡＭ０２−免疫沈降後に残った上清 Ｉｓ２＝免疫ＣＡＭ０２−免疫沈降後に残った上清 Ｉ２＝免疫ＣＡＭ０２−ビーズ ＰＥＰ＝遊離のペプチド

【図５Ｂ】図５Ｂは、Ｌ−セレクチン精製した〜５０kD
リガンドのペプチド抗体による免疫沈降を示す。

【図６Ａ】図６：〜５０kD Ｌ−セレクチンリガンドを
コードしているmＲＮＡの発現のノーザンブロット分
析。Ａ：全体（ａ）またはポリＡ＋（ｂ、ｃ）ＲＮＡを
正常（ａ、ｂ）または炎症を起こした（ｃ）末梢リンパ
節から単離し、ホルムアルデヒドゲル上で泳動し、図４
に示したｃＤＮＡを用いたノーザンブロット分析により
分析した。

【図６Ｂ】図６：〜５０kD Ｌ−セレクチンリガンドを
コードしているmＲＮＡの発現のノーザンブロット分
析。Ｂ：ポリＡ＋ＲＮＡをａ）上腕、ｂ）腋窩、ｃ）く
び、ｄ）膝窩およびｅ）全末梢リンパ節から単離し、
Ａ、ＣおよびＤにおいて記述するようにノーザンブロッ
トにおいてリガンドｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。
ポリＡ＋ＲＮＡをａ）末梢リンパ節、ｂ）肝臓、ｃ）バ
イヤー斑、ｄ）胸腺、ｅ）骨格筋、ｆ）腸間膜リンパ
節、ｇ）精巣、ｈ）肺、ｉ）心臓、ｊ）脾臓、ｋ）脳お
よびｌ）腎臓から単離し、ノーザンブロット上で（Ｃ）
Ｌ−セレクチンリガンドに対応するｃＤＮＡまたは
（Ｄ）ニワトリβアクチンｃＤＮＡとハイブリダイズさ
せた。

【図６Ｃ】図６：〜５０kD Ｌ−セレクチンリガンドを
コードしているmＲＮＡの発現のノーザンブロット分
析。ポリＡ＋ＲＮＡをａ）末梢リンパ節、ｂ）肝臓、
ｃ）バイヤー斑、ｄ）胸腺、ｅ）骨格筋、ｆ）腸間膜リ
ンパ節、ｇ）精巣、ｈ）肺、ｉ）心臓、ｊ）脾臓、ｋ）
脳およびｌ）腎臓から単離し、ノーザンブロット上で
（Ｃ）Ｌ−セレクチンリガンドに対応するｃＤＮＡとハ
イブリダイズさせた。

【図６Ｄ】図６：〜５０kD Ｌ−セレクチンリガンドを
コードしているmＲＮＡの発現のノーザンブロット分
析。ポリＡ＋ＲＮＡをａ）末梢リンパ節、ｂ）肝臓、
ｃ）バイヤー斑、ｄ）胸腺、ｅ）骨格筋、ｆ）腸間膜リ
ンパ節、ｇ）精巣、ｈ）肺、ｉ）心臓、ｊ）脾臓、ｋ）
脳およびｌ）腎臓から単離し、ノーザンブロット上で
（Ｄ）ニワトリβアクチンｃＤＮＡとハイブリダイズさ
せた。

【図７Ａ】図７：〜５０kD Ｌ−セレクチンリガンドを
コードしているmＲＮＡの発現のその場でのハイブリダ
イゼーション分析。末梢リンパ節切片をＬ−セレクチン
リガンドｃＤＮＡに対応しているアンチセンス（Ａ）ハ
イブリダイゼーションプローブとハイブリダイズさせ、
洗浄し、感光乳剤に６週間感光させて現像した。ＨＥＶ
の形態は細静脈の周りの点線で示す。

【図７Ｂ】図７：〜５０kD Ｌ−セレクチンリガンドを
コードしているmＲＮＡの発現のその場でのハイブリダ
イゼーション分析。末梢リンパ節切片をＬ−セレクチン
リガンドｃＤＮＡに対応しているセンス（Ｂ）ハイブリ
ダイゼーションプローブとハイブリダイズさせ、洗浄
し、感光乳剤に６週間感光させて現像した。ＨＥＶの形
態は細静脈の周りの点線で示す。

【図８】図８：〜５０kD セレクチンリガンド構造のモ
デル。末梢リンパ節ＨＥＶの管腔表面上の〜５０kD Ｌ
−セレクチンリガンドの構造についての１つの可能なモ
デルを示す。拡張されたブラシ様の領域は、高度にＯ−
グリコシル化された状態におけるＯ−結合性領域Ｉおよ
びIIに対応する。拡張が少ない領域はＮ末端および中央
のセリン／トレオニンに乏しいドメインに対応する。こ
のモデルにおいて膜接着は、極性領域が互いに相互作用
してオリゴマーを形成し、ヘリックスの非極性面が脂質
二重層と相互作用するような、Ｃ末端の両親媒性ヘリッ
クス領域のオリゴマー化およびこれらの領域の膜への挿
入により行われる。本明細書中に開示するように、他の
多数のモデルもまた等しく存在し得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 17/06 Ａ６１Ｐ 17/06 19/02 19/02 25/28 25/28 29/00 29/00 １０１ １０１ 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (71)出願人 500210903 ザ、リージェンツ、オブ、ザ、ユニバーシ ティ、オブ、カリフォルニア ＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＡＬＩＦ ＯＲＮＩＡ アメリカ合衆国、カリフォルニア 94607、 オークランド、フランクリン・ストリート 1111、トゥエルフス・フロア (72)発明者 ラスキー，ローレンス・エイ アメリカ合衆国カリフォルニア94965、ソ ーサリト、スター・ルート・ボックス460 番 (72)発明者 イマイ，ヤスユキ アメリカ合衆国カリフォルニア94122、サ ン・フランシスコ、ロックスレー・アベニ ュー172番、ナンバー・スリー (72)発明者 ローゼン，スティーブン・ディー アメリカ合衆国カリフォルニア94100、サ ン・フランシスコ、クレイトン・ストリー ト828番 (72)発明者 シンガー，マーク・エス アメリカ合衆国カリフォルニア94703、バ ークレイ、グラント・ストリート1915番 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA04 CA12 HA14 4B063 QA01 QQ79 QR32 QR55 QR62 QS25 QS34 4C084 AA17 NA14 ZA151 ZA891 ZA961 ZB022 ZB111 ZB151 ZB212 ZC412 4H045 AA10 BA10 CA40 DA75 EA50 FA74

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 セレクチンリガンドのタンパク質部分に
   対して免疫反応性の抗体。
2. 【請求項２】 該リガンドがＬ−セレクチンリガンドで
   ある、請求項１に記載の抗体。
3. 【請求項３】 下記： ａ）セレクチンリガンドをコードしている核酸又はその
   ような核酸の相補体を核酸の試験サンプルにハイブリダ
   イズさせるか、又は ｂ）セレクチンリガンドをコードしている核酸に基づく
   プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、そし
   て、 ｃ）セレクチンリガンドの存在を測定することからなる
   セレクチンリガンドの存在を測定するための方法。