ES2201049T3

ES2201049T3 - Un ligando de selectina.

Info

Publication number: ES2201049T3
Application number: ES92912173T
Authority: ES
Inventors: Laurence A. Lasky; Yasuyuki Imai; Steven D. Rosen; Mark S. Singer
Original assignee: Genentech Inc; University of California
Current assignee: Genentech Inc; University of California
Priority date: 1991-05-06
Filing date: 1992-05-06
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2012-05-06
Also published as: CA2108029A1; AU1993792A; JP2003144181A; DE69233136T2; IE921450A1; DK0584229T3; JP3691467B2; EP0584229B1; DE69233136D1; ATE245696T1; AU660995B2; US5484891A; EP0584229A1; WO1992019735A1; JP3859697B2; JPH07507679A

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A LIGANDOS DE GLIGOPROTEINA DE SELECTINAS. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A METODOS Y MEDIO PARA PREPARAR Y A ACIDOS NUCLEICOS QUE COFICIAN ESTOS LIGANDOS. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A UN METODO PARA TRATAR UN SINTOMA O CONDICION ASOCIADA CON ENLACE EXCESIVA DE LEUCOCITOS CIRCULANDO A CELULAS ENDOTELIALES ADMINISTRANDO A UN PACIENTE NECESITADO DE TAL TRATAMIENTO UN LIGANDO DE GLIGOPROTEINA DE UNA SELECTINA.

Description

Un ligando de selectina.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a ligandos de selectina endoteliales. La invención se refiere además a métodos y medios para prepararlos y a ácidos nucleicos que codifican estos ligandos.

Descripción de antecedentes y técnica relacionada

Los linfocitos son mediadores de la infamación del tejido normal así como del daño en el tejido patológico tal como ocurre en la artritis reumatoide y otras enfermedades autoinmunes. Para explotar completamente el repertorio antigénico del sistema inmune, los vertebrados han desarrollado un mecanismo para distribuir linfocitos con diversas especificidades antigénicas a regiones espacialmente distintas del organismo [Butcher, E. C., Curr. Top. Micro. Immunol. 128, 85 (1986); Gallatin et al., Cell 44, 673 (1986); Woodruff et al., Immunol. Today 10, 23 (1989); Yednock et al., Adv. Immunol. 44, 313 (1989)].

Este mecanismo implica la recirculación continua de los linfocitos entre la sangre, donde las células tienen el mayor grado de movilidad, y los órganos linfoides, donde los linfocitos encuentran antígeno secuestrado y procesado.

Se ha reconocido durante algún tiempo que el tráfico de linfocitos desde la sangre a los órganos linfoides secundarios, tales como los nódulos linfáticos (LN) y las placas de Peyer asociadas al intestino(PP), se inicia por una interacción adhesiva con las células endoteliales especializadas del endotelio venoso alto (HEV) [Berg et al., Immunol. Rev. 108, 5 (1989); Duijvestijn y Hamann, Immunol. Today 10. 23 (1989); Woodruff et al., Annu. Rev. Immunol. 5, 201 (1987); Yednock y Rosen, Adv. Immunol. 44, 313 (1989); Stoolman, Cell 56, 907 (1989)]. Una evidencia considerable indica que la migración selectiva a los órganos linfoides o "alojamiento" de los linfocitos se dicta en gran parte por la unión específica de los órganos de los linfocitos al HEV [Butcher (1986), Supra]. Operacionalmente, las moléculas asociadas a los linfocitos inherentes a la interacción selectiva de los órganos con el HEV se denominan "receptores de alojamiento" mientras que las moléculas endoteliales cognadas se conocen como "ligandos del HEV" [Gallatin et al. (1986), Supra; Rosen, Curr. Opin. Cell. Biol. 1, 913 (1989)]. Se postula que los ligandos del HEV endoteliales son distintivos para los diversos órganos linfoides y como tales se proponen como responsables de regular las poblaciones de linfocitos para penetrar en cada clase de órgano linfoide [Butcher, Am. J. Pathol. 136, 3 (1990)]. Es interesante desde un punto de vista científico y clínico una caracterización de los mecanismos moleculares detallados inherentes al tráfico de linfocitos, ya que procesos adhesivos similares pueden estar implicados en las formas normal y patogénica de la inflamación leucocítica [Watson et al., Nature 349, 164-167 (1991)].

De los receptores de alojamiento, el estudiado más a fondo es un receptor denominado inicialmente receptor de alojamiento en el nódulo linfático periférico (pnHR). Este receptor se definió primero en el sistema murino por el anticuerpo monoclonal MEL-14 (mAb), un anticuerpo que se encontró que reconocía un antígeno de la superficie del leucocito de aproximadamente 90 kD (designado como gp90^{MEL}) [Gallatin et al., Nature 303, 30 (1983)]. Se encontró que este anticuerpo bloquea la adhesión del linfocito al HEV de nódulos linfáticos mesentéricos y periféricos en el análisis de adherencia in vitro de Stamper-Woodruff y previene la migración in vivo a nódulos linfáticos. Se mostró definitivamente una función de alojamiento para gp90^{MEL} por el hallazgo de que las formas recombinantes solubles y solubilizadas en detergente del receptor pueden bloquear selectivamente los sitios adhesivos para los linfocitos en LN pero no aquellos en PP del HEV [Geoffroy y Rosen, J. Cell. Biol 109, 2463 (1989)].

La clonación molecular de cDNAs que codifican los receptores gp90^{MEL} humanos y murinos reveló una proteína transmembrana con un dominio lectina de tipo-calcio (tipo-C) en su región extracelular aminoterminal, seguido por un motivo EGF, dos motivos reguladores del complemento relacionados con los encontrados en proteínas con actividad de unión a complemento, un dominio transmembrana, y una cola citosólica corta. [Lasky et al., Cell 56. 1045 (1989); Siegelman et al., Science (Wash., D.C.) 243, 1165 (1989); Siegelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5562 (1989); Tedder et al., J. Exp. Med. 170 (1) 123 (1989); Tedder et al., J. Immunol. 144, 532 (1989), Bowen et al., J. Cell Biol. 109, 421 (1989); Camerini et al., Nature 342(6245), 78 (1989); solicitud en tramitación con la presente No. Ser. 315.015 presentada 23 Febrero 1989; documento WO 91/08298 publicado 13 Jun. 1991].

Otros investigadores identificaron otra molécula asociada con la adhesión de neutrófilos. Se propuso que esta molécula, denominada la molécula de adhesión endotelial de leucocitos ELAM-1, es una molécula de adhesión inducible cuyo papel puede ser mediar en la unión de los neutrófilos a las células del endotelio venoso adyacente a los sitios de la inflamación [Bevilacqua et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 9238 (1989); Hession et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(5), 1673 (1990)].

Las investigaciones de las proteínas contenidas en los gránulos alfa de las plaquetas condujeron al descubrimiento de una molécula de adhesión adicional diversamente denominada proteína de membrana granular 140 (GMP-140), proteína de membrana externa de granulo dependiente de activación plaquetaria (PADGEM) o CD62 [McEver et al., J. Biol. Chem. 259, 9799 (1984); Bonfanti et al., Blood 73, 1109 (1989); Hattori et al., J. Biol. Chem. 264(14), 7768 (1989)].La secuencia de cDNA que codifica este receptor se determinó por Johnston et al., Cell 56, 1033 (1989).

La comparación de sus secuencias de aminoácidos reveló que estas tres moléculas de adhesión están relacionadas de una forma altamente llamativa y convincente. Su estructura en mosaico común consiste en un motivo lectina calcio dependiente o de unión a hidratos de carbono, un motivo parecido al factor de crecimiento epidérmico (EGF), y varios motivos reguladores del complemento (CR). La conjunción ordenada de estos motivos ha dado lugar al nombre LEC-CAM (Lectin Egf Complement regulatory-Cell Adhesion Molecule) para esta nueva familia de moléculas de adhesión de células endoteliales a leucocitos [Stoolman, Cell 56:907 (1989)]. Alternativamente, a esta familia se le ha aplicado el nombre de "selectina" [Bevilacqua et al., Science 243:1160 (1989); Geng et al., Nature 343:757 (1990)].

Los tres miembros de la familia LEC-CAM o selectina de moléculas de adhesión celular son: L-selectina (también conocida como receptor de alojamiento de nódulo linfático periférico (pnHR), LEC-CAM-1, LAM-1, gp90MEL, gp100MEL, gp110MEL, antígeno Leu-8, antígeno TQ-1, antígeno DREG), E-selectina (LEC-CAM-2, LECAM-2, ELAM-1) y P-selectina (LEC-CAM-2, LECAM-3, GMP-140, PADGEM). Estos receptores serán extensamente denominados como "selectinas". Las estructuras de los miembros de la familia selectina y de los genes que codifican se ilustran en las Figuras 1 y 2, respectivamente. El hallazgo de que los azucares monoméricos simples, tales como la manosa-6-fosfato (M6P) y la fructosa-1-fosfato (F1P), pueden bloquear las interacciones de los linfocitos murinos y humanos con el HEV de los nódulos linfáticos periféricos (pln) [Stoolman et al., J. Cell Biol. 96, 722 (1983); Stoolman et al., J. Cell Biol. 99, 1535 (1984); Stoolman et al., Blood 70, 1842 (1987)] sugirió que el ligando endotelial reconocido por la L-selectina está basado en hidrato de carbono. En una serie de experimentos, Rosen y sus colegas demostraron que la unión dependiente del receptor de alojamiento de linfocitos al HEV pln era suprimida por tratamiento o in vitro o in vivo con sialidasas de amplio espectro [Rosen et al., Science (Wash., D.C.) 228, 1005 (1985); Rosen et al., J. Immunol. 142, 1895 (1989)]. Porque esta enzima separa selectivamente restos de ácido siálico de los oligosacáridos, estos resultados implicaron fuertemente que el ácido siálico era un elemento crítico para el reconocimiento.

La naturaleza de la molécula(s) reconocida por L-selectina se sondeó posteriormente con una única quimera recombinante, consistente en un dominio extracelular de L-selectina unido a la bisagra, regiones CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana [ver documento WO 91/08298 publicado el 13 Jun. 1991 para la quimera, y Watson et al., J. Cell Biol. 110, 2221 (1990) para su uso como sonda para ligandos adhesivos del endotelio venoso alto de nódulos linfáticos]. Estudios iniciales con esta supuesta quimera receptor-inmunoglobulina demostró que podía adherir al (un) ligando(s) del HEV específico de los nódulos linfáticos mesentéricos y periféricos en experimentos de bloqueo celular e inmunohistoquímicos [Watson et al. (1990), Supra]. El reconocimiento inmunohistoquímico de este ligando del HEV se suprimió por tratamiento de secciones de nódulos linfáticos con sialidasa, lo que sugiere que un componente del hidrato de carbono reconocido por L-selectina era similar al ácido siálico y además acentuó la importancia del dominio lectina en la adhesión mediada por L-selectina [Rosen et al., Science (Wash. D.C.) 228, 1005-1007 (1985); Rosen et al. (1989), Supra, y True et al., J. Cell Biol. 11, 2757-2764 (1990)]. Estos resultados demostraron la especificidad de la quimera L-selectina-inmunoglobulina para el ligando del HEV pln y establecieron que el ligando expresa restos de hidratos de carbono que son esenciales para la adhesión celular mediada por el receptor de alojamiento.

Una serie reciente de publicaciones confirmó que el ligando de E-selectina también tiene un carácter de hidrato de carbono. Varios laboratorios, adoptando una amplia gama de aproximaciones, han concluido que un ligando de E-selectina es un hidrato de carbono conocido como sialil Lewis^{x} (sLex) o una estructura estrechamente relacionada conocida como CD65 o VIM-2 [NeuAca2-3Galbl-4(Fucal-3)GlcNAcbl]. Lowe et al.[Cell 63, 475 (1990)], transfectaron células no mieloides con una a1,3/4 fucosiltransferasa y generaron actividad de ligando para E-selectina, que se correlacionó con la expresión del determinante Slex. Goeltz et al. [Cell 63(6), 1349 (1990)] identificaron y clonaron una a1,3 fucosiltransferasa que parecía estar involucrada en la síntesis del actual ligando ELAM-1 en células mieloides. Utilizando aproximaciones más directas, Phillips et al. [Science 250(4984), 1130 (1990)] and Walz et al. [Science 250(4984), 1132 (1990)] pudieron mostrar inhibición de la adhesión dependiente de E-selectina a Slex o con glicoconjugados o con anticuerpos que contiene Slex. En estos estudios se demostró la participación crítica de los restos de ácido siálico y fucosa en la actividad de ligando. Finalmente, Tiemeyer et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991)] purificaron varios glicolípidos derivados de mieloide que tenían actividad de ligando para células transfectadas de E-selectina en un análisis en fase sólida. El análisis espectroscópico de masas del glicolípido, purificado, de unión a E-selectina, reveló que la estructura mínima necesaria para la actividad era una lactosamina sililada con una segunda unidad de N-acetillactosamina interna que contiene una fucosa a1,3-unida en la N-acetilglucosamina (CD65). Al igual que era verdad para el determinante Slex, el ácido siálico y la fucosa fueron esenciales para la actividad de unión del ligando putativo.

También se han hecho progresos en la identificación de los ligandos para P-selectina. Larsen et al. [Cell 63, 467 (1990)] han implicado al determinante Lex [Galbl-4(al-3Fuc)GlcNAc] como elemento importante del ligando de P-selectina en las células mieloides. Sin embargo, también se requiere el ácido siálico para la actividad de ligando completa, probablemente en una unión a2,3 [Corral et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 172. 1349 (1990); Moore et al., J. Cell Biol. 112, 491 (1991)]. Hay una posibilidad de que el ligandos para P-selectina sea el mismo o muy similar a ése para E-selectina, especialmente puesto que ambas selectinas se unen a un espectro muy similar de tipos celulares [Polley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6224 (1991)].

La notable homología en las estructuras de selectina así como las ya demostradas semejanzas en los ligandos sugieren que los ligandos tendrán diversas estructuras con todo sutilmente relacionadas.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para la purificación de un ligando de selectina.

Otro objeto de la invención es proporcionar selectina purificada, especialmente ligandos de L-selectina.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar secuencias de ácido nucleico que codifiquen ligandos de glicoproteína de selectina.

Es otro objeto determinar las secuencias de aminoácidos de los ligandos de selectina, e identificar los sitios (unidos a O y N) de glicosilación en estos ligandos.

Un objeto aún adicional es permitir la preparación de la secuencia de aminoácidos y/o variantes de glicosilación de los ligandos de selectina, de otra manera no encontrados en la naturaleza.

Aún en un aspecto adicional, la invención proporciona un método de diseño de inhibidores de selectina, imitando a los determinantes basados en hidratos de carbono de los ligandos de selectina.

Compendio de la invención

Nuestro análisis inicial del ligando asociado al HEV se aprovechó de un aspecto único del metabolismo del HEV. El trabajo inicial de Andrews et al. [J. Cell Sci. 57, 277 (1982)] había demostrado que el HEV in situ era distintivo en que incorporó altas cantidades de sulfato inorgánico en macromoléculas. Por lo tanto, nosotros hemos analizado la capacidad de la quimera L-selectina-IgG para precipitar material marcado con sulfato inorgánico de nódulos linfáticos marcados con ^{35}S-sulfato en cultivo de un órgano. Un componente prominente de 50 kD y una molécula más débil de 90kD (Sgp^{50} y Spg^{90}) se precipitaron de nódulos linfáticos pero no estaban presentes en ningún otro órgano probado. La precipitación de estos componentes con la quimera L-selectina-IgG demostró ser dependiente de calcio, sensible al mAb MEL-14 y a los hidratos de carbono específicos. Esta reacción se pudo suprimir por tratamiento de las proteínas marcadas con sulfato con sialidasa o por inclusión del polímero hidrato de carbono fucoidina en la reacción. Finalmente, un anticuerpo monoclonal, denominado MECA-79, que reacciona selectivamente con el llamado "direccionamiento vascular" del HEV de pln y bloquea la adhesividad por linfocitos [Streeter et al., J. Cell Biol. 107, 1853 (1988)] , precipitó ambos componentes. Un análisis bioquímico preliminar reveló que los ligandos de L-selectina
\sim50 kD y \sim90 kD eran glicoproteínas sensibles a la tripsina, que contienen predominantemente cadenas O-ligadas. [Imai et al., J. Cell Biol. 113, 1213 (1991).] El hallazgo de cadenas O-ligadas es de interés en vista de la evidencia de que las regiones O-ligadas hacen a las glicoproteínas superficiales celulares ser estructuras altamente extendidas y rígidas [Jentoft et al., Trends in Biochem Sci. 15, 291 (1990)] y así estar idealmente colocadas para realizar funciones de reconocimiento. En las cadenas O-ligadas de estas moléculas se encontraron fucosa, sulfato y ácido siálico, y se cree que la fucosa, como el ácido siálico, se requiere para una actividad de ligando completa.

Para caracterizar adicionalmente la naturaleza del ligando endotelial reconocido por L-selectina, hemos tomado la nueva aproximación de afinidad purificando la glicoproteína del HEV de \sim50 kD con la quimera L-selectina-IgG. La glicoproteína purificada se ha sometido a una secuenciación N-terminal de aminoácidos, y esta información de secuencia se ha utilizado para clonar un cDNA que codifica el componente proteico de este ligando de L-selectina. Los detalles del trabajo experimental junto con los resultados y su interpretación se proporcionan en los ejemplos.

La actual invención se refiere a una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia del nucleótido que codifica un ligando de selectina según la reivindicación 1.

Tal molécula de ácido nucleico comprende preferentemente una secuencia de nucleótido capaz de hibridarse a la cadena complementaria de una secuencia de nucleótido que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4.

En otra realización, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótido que codifica una proteína ligando de selectina que tiene una secuencia de aminoácidos con una homología mayor que aproximadamente 40% con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4.

En una realización adicional, la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en:

(a): un clon cDNA que tiene una secuencia de nucleótido derivada de la región codificadora de un gen de ligando nativo de selectina;

(b): una secuencia de DNA capaz de hibridar bajo condiciones poco rigurosas a un clon de (a); y

(c): una variante genética de cualquiera de las secuencias de DNA de (a) y (b) que codifica una glicoproteína que posee una propiedad biológica de un ligando que se da de forma natural de una molécula de selectina.

La molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender además una secuencia del nucleótido que codifica un dominio constante de inmunoglobulina.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótido de la reivindicación 1, operativamente unido a las secuencias de control reconocidas por una célula anfitriona transformada con el vehículo.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una célula anfitriona transformada con el vehículo de expresión anteriormente descrito, y a los métodos para cultivar tales células anfitrionas transformadas para expresar un ligando de selectina.

Aún en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un polipéptido del ligando de L-selectina aislado según la reivindicación 16. Tal polipéptido puede comprender la región extracelular de una glicoproteína superficial de célula endotelial. In otra realización, el polipéptido es Sgp50 o Sgp90.

El polipéptido de la presente invención comprende preferentemente una secuencia de aminoácidos que tiene una estructura estérica que permite la presentación de un resto unido a L-selectina a su receptor.

En una realización específica, el polipéptido precedente comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico capaz de hibridarse bajo condiciones poco rigurosas a la cadena complementaria de una secuencia de nucleótido que codifica la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4.

En una realización específica adicional, el polipéptido anteriormente descrito es un ligando nativo de selectina substancialmente libre de otras proteínas de la misma especie animal en la que se encuentra naturalmente.

Aún en un aspecto adicional, la investigación se refiere a un polipéptido según lo definido anteriormente en la presente memoria, que comprende además una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina.

En un aspecto diferente, la invención se refiere a un composición que comprende una cantidad de un polipéptido del ligando de L-selectina según lo definido más arriba en la presente memoria, eficaz en el bloqueo de la unión de un receptor de selectina correspondiente a su ligando nativo, en mezcla con un excipiente no tóxico, farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso del polipéptido del ligando de L-selectina en el tratamiento de un síntoma o enfermedad asociado a la unión excesiva de leucocitos circulantes a células endoteliales.

Aún en otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo inmunoreactivo con la parte proteica del polipéptido del ligando de L-selectina. Los anticuerpos preferidos fijan el ligando de selectina respectivo pero substancialmente no reaccionará de forma cruzada con otros ligandos conocidos, y evitará que los ligandos de selectina se unan a sus receptores. Los anticuerpos de ligando de anti-selectina se pueden inmovilizar, y en esta forma son, por ejemplo, útiles para la detección o purificación del ligando de selectina de la presente invención.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para determinar la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido del ligando de L-selectina, que comprende

a): hibridar un ácido nucleico que codifica la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4 a una muestra de ensayo de ácido nucleico; y

b): detectar cualquier hibridación para determinar la presencia de la secuencia de nucleótidos en la muestra.

Aún en un aspecto adicional, la invención proporciona un método para la purificación del polipéptido del ligando de L-selectina que comprende absorber el ligando a una quimera que comprende la correspondiente L-selectina y una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina.

La invención además se refiere a un método para presentar un resto de unión a L-selectina a una correspondiente L-selectina por la unión de tal resto al polipéptido del ligando de L-selectina.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra las estructuras de los miembros de la familia de selectina (LEC-CAM) según lo determinado por la clonación de cDNA. Se ilustran las estructuras para L-selectina, E-selectina y P-selectina. La lectina, factor de crecimiento epidérmico (EGF), y múltiples repeticiones de consenso cortas (SCRs) se muestran con las estructuras hipotéticas de enlace disulfuro según lo primeramente propuesto para GMP-140 por Johnston et al., Cell 56, 1033 (1989). También se muestra una secuencia N-terminal (posteriormente escindida en la proteína madura) así como un anclaje transmembranal hidrofóbico (TM) y una cola citoplasmática. Otras dos formas de P-selectina también se ilustran, una con un dominio scr-7 con deleción y otra con un anclaje de membrana con deleción.

La Figura. 2 muestra la estructura de los genes que codifican a miembros de la familia de selectina. Se ilustran las estructuras genómicas que codifican la L-selectina humana y murina, la E-selectina humana y la P-selectina humana. Los rectángulos oscuros muestran los exones que codifican varios motivos estructurales, incluyendo el codón de comienzo para el gen murino (ATG), la secuencia de señal (SS), la lectina (LEC), el factor de crecimiento epidérmico (E), las repeticiones de consenso cortas (SCR), el anclaje transmembranal (TM) y los dominios citoplásmicos (CD) y las regiones interpuestas que codifican los intrones que separan estos dominios de codificación de proteína. En el ser humano, los tres genes de selectina están dentro de 200 kilobases del uno al otro en el brazo largo del cromosoma 1 cerca de un locus que codifica una familia de las proteínas que todas contienen números variables del exón corto de SCR. La L-selectina murina también se codifica en el cromosoma murino 1 en una región sintónica a ésa encontrada en el cromosoma humano 1 homólogo.

Figura 3A. Ilustra la purificación y la secuencia de aminoácidos N-terminal del ligando de L-selectina de
\sim50 kD. La purificación del ligando desde un medio acondicionado se monitorizó por seguimiento del ligando marcado con ^{35}S añadido. Calle A, Medio acondicionado de partida. Calle B, Capa acuosa después de particionar en cloroformo:metanol. Calle C, Material unido LEC-IgG, el área entre corchetes se cortó para la secuenciación de proteínas en fase gaseosa. Las Calles A-C son membrana de ProBlott teñida con Azul de Coomassie R-250. La Calle D es la autorradiografía de la Calle C.

Figura 3B. Secuencia N-terminal de aminoácidos.

Figura 3C. Se analizaron los 21 aminoácidos con C-terminal mediante el programa de la rueda. Este programa muestra una vista hacia abajo del barril de una región helicoidal e ilustra los restos de aminoácidos que rodean la hélice. Los aminoácidos apolares se muestran en círculos abiertos y los aminoácidos polares se muestran en círculos sombreados.

Figura 3D. Ilustra un gráfico de hidropatía derivado de la secuencia de aminoácidos predicha en A. Las bolas oscuras corresponden a restos de serina o treonina, mientras que la bola abierta al ASN del único sitio potencial de glicosilación ligado al N. La estructura predicha del dominio del ligando de \sim50 kD se muestra arriba, con la secuencia de señal (SS), las regiones ligadas al O I y II y la región helicoidal anfipática C-terminal.

La Figura 4 muestra el nucleótido y la secuencia de aminoácidos codificada de la proteína del núcleo de un ligando endotelial para L-selectina. El rectángulo no sombreado ilustra un sitio de iniciación de traducción de Kozak rodeando el primer codón de metionina. La secuencia de aminoácidos subrayada con línea de puntos que comienza en el residuo 20 se corresponde con la secuencia de aminoácidos determinada por secuenciación N-terminal del ligando purificado de L-selectina (Figura 3B) con la excepción de una TRH en posición 34 (una MET en la secuencia N-terminal). Los residuos de serina y treonina en la secuencia de aminoácidos predicha se muestran en rectángulos sombreados.

Las Figuras 5A y 5B muestran la inmunoprecipitación del ligando de \sim50 kD purificado de L-selectina por anticuerpos de peptidos. Los códigos de las leyendas de las Figuras 5A y 5B son:

P1	=	CAM01 Preinmune - perlas
P_{s}1	=	CAM01 Preinmune - sobrenadantes dejado después de inmunoprecipitación.
I1	=	CAM01 Inmune - perlas
I_{ \underline{s} }1	=	CAM01 Inmune - sobrenadantes dejado después de inmunoprecipitación.
P_{s}2	=	CAM02 Preinmune - sobrenadantes dejado después de inmunoprecipitación.
I_{ \underline{s} }2	=	CAM02 Inmune - sobrenadantes dejado después de inmunoprecipitación.
I2	=	CAM02 Inmune - perlas
PEP	=	péptido libre

Figura 6. Análisis de transferencia Northern de la expresión del mRNA que codifica el ligando de L-selectina de \sim50 kD. A. El RNA total(a) o poli A+ (b,c) se aisló de nódulos linfáticos periféricos normales (a,b) o inflamados (c), se corrió en geles de formaldehído y se analizó mediante el análisis de transferencia Northern con el cDNA que se muestra en la Figura 4. B. El RNA poli A+ se aisló de nódulo linfático periférico a) braquial, b) axilar, c) cervical, d) popliteal, y e) total y se hibridó en transferencias Northern con el ligando de cDNA según se describe en A., C. Y D. El RNA poli A+ se aisló de a)nódulos linfáticos periféricos, b) hígado, c) placa de Peyer, d) timo, e) músculo esquelético, f) nódulos linfáticos mesentéricos, g) testículos, h) pulmón, i) corazón, j) bazo, k) cerebro, y l) riñón y se hibridó en transferencias Northern con C. el cDNA que corresponde al ligando de L-selectina o D. un cDNA de beta actina de pollo.

Figura 7. Análisis de la hibridación In Situ de la expresión del mRNA que codifica el ligando de L-selectina de
\sim50 kD. Las secciones de nódulo linfático periférico se hibridaron o con una sonda de hibridación antisentido (A) o con una sonda de hibridación sentido (B) correspondiente al cDNA del ligando de L-selectina, se lavaron, se expusieron a emulsión durante 6 semanas y se desarrollaron. La morfología del HEV se muestra con una línea de puntos rodeando la venula.

Figura 8. Un modelo de la estructura del ligando de L-selectina de \sim50 kD. Se ilustra un posible modelo para la estructura del ligando de L-selectina de \sim50 kD en la superficie luminal del HEV de nódulos linfáticos periféricos. Las regiones extendidas con forma de escobilla corresponden a las regiones ligadas al O I y II en un estado altamente O-glicosilado. Las regiones menos extendidas corresponden al N terminal y central de los dominios pobres en serina/treonina. En este modelo, la unión a la membrana se logra por oligomerización de las regiones helicoidales anfipáticas C-terminales e inserción de estas regiones en la membrana de modo que las regiones polares interactúan unas con otras para formar un oligómero y las caras apolares de las hélices interactúan con la bicapa lipídica. Según lo descrito en el texto, otros varios modelos son también igualmente probables.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

La terminología "ligando de selectina" y sus variantes gramaticales, se utilizan para referirse a un polipéptido que tiene una propiedad biológica cualitativa en común con un ligando que se da de forma natural de una molécula de selectina.

"Propiedad biológica" en este contexto significa un efector in vivo o función antigénica o actividad que se realiza directa o indirectamente por un ligando que se da de forma natural de una molécula de selectina, o por cualquiera de sus subsecuencias. Las funciones efectoras incluyen la unión a receptores, cualquier actividad enzimática o actividad moduladora enzimática, cualquier actividad de unión a portadores, cualquier actividad hormonal, cualquier actividad que promueva o inhiba la adhesión de células a la matriz extracelular o a moléculas de la superficie celular, o cualquier papel estructural. Las funciones antigénicas significan esencialmente la posesión de un sitio epítopo o antigénico que es capaz de reaccionar de forma cruzada con anticuerpos levantados contra un ligando que se da de forma natural de una molécula de selectina.

Los ligandos de selectina "biológicamente activos" comparten una función efectora de un ligando que se da de forma natural de una molécula de selectina, que pueden, pero no necesitan, poseer además una función antigénica.

El ligando de selectina como se define para los propósitos de la presente invención, comprende preferentemente una secuencia que tiene la capacidad cualitativa de unirse a una selectina, y que tiene una estructura tipo mucina altamente ligada a O, con forma de varilla, que permiten la presentación de sus hidratos de carbono al dominio lectina de una selectina.

En una realización preferida adicional, el ligando de selectina comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse (bajo condiciones poco rigurosas) a la cadena complementaria de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 4.

La secuencia de aminoácidos del núcleo proteico del ligando de selectina es preferentemente mayor de aproximadamente 40% homóloga, más preferentemente mayor de aproximadamente 60% homóloga, aún más preferentemente mayor de aproximadamente 70% homóloga, incluso más preferentemente mayor de aproximadamente 80% homóloga, lo más preferentemente por lo menos aproximadamente 90% homóloga con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 4.

"Homóloga" se define como el porcentaje de residuos en la secuencia de aminoácidos candidata que son idénticos a los residuos en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 4 después de alinear las secuencias e introducir los huecos, si es necesario, para alcanzar el máximo porcentaje de homología.

La terminología "ligando de selectina" incluye específicamente variantes de aminoácidos y de glicosilación de ligandos nativos de selectina, así como sus derivados, tales como los obtenidos por modificaciones covalentes, a condición de que retengan cualitativamente una propiedad biológica poseída por un ligando que se da de forma natural de una molécula de selectina, y preferentemente la capacidad cualitativa de unirse a sus receptores.

El término incluye específicamente glicoproteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tienen una propiedad biológica en común con un ligando que se da de forma natural de una molécula de selectina fusionada a una proteína plasmática estable.

"Proteínas plasmáticas estables" son proteínas que típicamente tienen aproximadamente 30 a aproximadamente 2000 residuos, que exhiben en su entorno natural un periodo extendido de semivida en la circulación, i.e. una semivida mayor de aproximadamente 20 horas. Ejemplos de proteínas plasmáticas estables adecuadas son las inmunoglobulinas, albúmina, lipoproteínas, apolipoproteinas y transferrina. La secuencia de aminoácidos que tiene una propiedad biológica cualitativa en común con un ligando que se da de forma natural se fusiona generalmente de manera C-terminal a una secuencia de proteína plasmática estable, por ejemplo la secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina.

El término "inmunoglobulina" se refiere generalmente a polipéptidos que comprenden una cadena ligera o pesada ambas generalmente con enlaces disulfuro en la configuración "Y" nativo, aunque otros enlaces entre ellos, incluyendo tetrámeros y sus agregados, está dentro del alcance de la presente memoria.

Se conocen inmunoglobulinas (Ig) y ciertas de sus variantes y muchas se han preparado en cultivo celular recombinante. Por ejemplo, ver patente de EE.UU. 4.745.055; EP 256.654; Faulkner et al., Nature 298:286 (1982); EP 120.694; EP 125.023; Morrison, J. Immun. 123:793 (1979); Kohler et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980); Raso et al., Cancer Res. 41:2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2:239 (1984); Morrison, Science 229:1202 (1985); Morrison et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984); EP 255.694; EP 266.663; y WO 88/03559. Se conocen también cadenas de inmunoglobulina reordenadas. Ver por ejemplo la patente de EE.UU. 4.444.878; WO 88/03565; y EP 68.763 y las referencias allí citadas. Las quimeras de proteína de unión a ligando-proteína plasmática estable, y específicamente quimeras de L-selectina-inmunoglobulina se describen, por ejemplo, en el documento WO 91/08298 publicado el 13 de Junio de 1991. El resto de inmunoglobulina en la quimera de la presente invención se puede obtener a partir de los subtipos IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, o IgG_{4}, IgA, IgE, IgD o IgM, pero preferentemente IgG_{1} o IgG_{3}.

La selectina, tal como la unión de L-selectina se puede, por ejemplo, analizar determinando la unión de ligandos radiomarcados (por ejemplo marcado con ^{35}S) para inmovilizar la quimera receptor-inmunoglobulina, en presencia o ausencia de inhibidores solubles, esencialmente como se describe por Imai et al., J. Cell Biol. 113, 1213 (1991). Alternativa o adicionalmente, la adherencia a células que expresan el receptor respectivo se puede utilizar para analizar la unión a ligando. Por ejemplo, se conocen células EL-4 (ATCC TIB39) para expresar altos niveles de L-selectina en sus superficies, y se pueden, por tanto, utilizar en los análisis de adhesión celular para ligandos de L-selectina. Las células adherentes se pueden cuantificar por la actividad lactato deshidrogenasa [Bradley et al., J. Cell. Biol. 105, 991 (1987)].

Las terminologías "molécula de ácido nucleico que codifica", "secuencia de DNA que codifica", y "DNA que codifica" se refiere al orden o secuencia de desoxirribonucleótido a lo largo de una hebra de ácido desoxirribonucléico. El orden de estos desoxirribonucleótidos determina el orden de los aminoácidos a lo largo de la cadena de polipéptido. La secuencia de DNA codifica así la secuencia de aminoácidos.

El término "aislado" cuando se utiliza en relación con un ácido nucleico o una proteína se refiere a un ácido nucleico o proteína que se identifica y se separa a partir de al menos un ácido nucleico o proteína de contención con el que está normalmente asociado en su fuente natural. El ácido nucleico o proteína aislado está así presente en una forma o disposición que es diferente de la que se encuentra en la naturaleza. Sin embargo, el ácido nucleico aislado que codifica un ligando de selectina incluye tal ácido nucleico en células que normalmente expresan ligandos de selectina donde el ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales, o está, de otra manera, flanqueado por una secuencia de DNA diferente de la encontrada en la naturaleza.

"Condiciones poco rigurosas" son incubación durante toda la noche a 37ºC en una solución que comprende: 20% de formamida, 5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM citrato de trisodio), 50 mM fosfato de sodio (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, y 20 \mug/ml de DNA desnaturalizado, de esperma de salmón cizallado, seguido por el lavado de los filtros en 1x SSC a aproximadamente 50ºC.

El ácido nucleico está "operativamente unido" cuando se sitúa en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, El DNA para una presencuencia o líder secretor está operativamente unido a un DNA que codifica un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante si se coloca de forma que facilite la traducción. Generalmente, "operativamente unido" significa que las secuencias de DNA que se unen están contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguo y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos. El enlace se consigue por el ligamiento a los sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, entonces se utilizan adaptadores o conectores oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Las terminologías "vehículo de expresión replicable" y "vehículo de expresión" se refieren a un fragmento de DNA, generalmente bicatenario, que puede tener insertado un fragmento de DNA foráneo. El DNA foráneo se define como DNA heterólogo, que es un DNA no encontrado de forma natural en la célula anfitriona. El vehículo se utiliza para transportar el DNA foráneo o heterólogo al interior de una célula anfitriona. Una vez en la célula anfitriona, el vehículo puede replicarse independientemente del DNA cromosómico anfitrión, y se pueden generar varias copias del vehículo y su DNA (foráneo) insertado. Además, el vehículo contiene los elementos necesarios permiten la traducción del DNA foráneo a un polipéptido. Así se pueden sintetizar rápidamente muchas moléculas del polipéptido codificado por el DNA foráneo.

En el contexto de la presente invención las expresiones "célula", "línea de células", y "cultivo de células" se utilizan indistintamente, y todas estas designaciones incluyen la progenie. También se entiende que, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas, toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en el contenido de DNA. Se incluyen las progenies mutantes que tengan la misma función o propiedad biológica que la buscada sistemáticamente en la célula transformada originalmente.

Las terminologías "célula anfitriona transformada" y "transformada" se refieren a la introducción de DNA en el interior de una célula. La célula se denomina "célula anfitriona", y puede ser una célula procariótica o eucariótica. Las células anfitrionas procarióticas típicas incluyen varias cepas de E. Coli. Las células anfitrionas eucarióticas típicas son de mamífero, por ejemplo células de ovario de hámster chino o células 293 de riñón embrionario humano. El DNA introducido está generalmente en forma de un vector que contiene un fragmento de DNA insertado.

La secuencia de DNA introducido puede ser de la misma especie que la célula anfitriona o de una especie diferente de la célula anfitriona, o puede ser una secuencia de DNA híbrida, que contiene un poco de DNA foráneo y un poco de DNA homólogo.

El "ligamiento" se refiere a un proceso de formación de enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico. Para ligar los fragmentos de DNA juntos, sus extremos deben ser compatibles. En algunos casos, los extremos serán directamente compatibles después de la digestión con endonucleasa. Sin embargo, puede ser necesario convertir primero los extremos escalonados, comúnmente producidos después de la digestión con endonucleasa, en extremos romos para hacerlos compatibles para el ligamiento. Para los extremos romos, el DNA se trata en un tampón adecuado durante al menos 15 minutos a 15ºC con aproximadamente 10 unidades del fragmento Klenow de DNA-polimerasa I o DNA-polimerasa T4 en presencia de los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato. Después el DNA se purifica por extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol. Los fragmentos de DNA que se están ligando juntos se ponen en solución en cantidades aproximadamente equimolares. La solución contendrá también ATP, tampón de ligasa, y una ligasa tal como la DNA-ligasa T4 en aproximadamente 10 unidades por 0,5 \mug de DNA. Si el DNA se va a ligar a un vector, el vector primero se lineariza por digestión con la(s) endonucleasa(s) de restricción apropiada(s). Después el fragmento linearizado se trata con fosfatasa alcalina bacteriana, o con fosfatasa intestinal de ternera para prevenir el auto-ligamiento durante la etapa de ligamiento.

Los términos "aminoácido" y "aminoácidos" se refieren a todos los L-á-aminoácidos. Esta definición se entiende que incluye norleucina, ornitina, y homocisteína. Los aminoácidos están identificados por las designaciones o de una letra o de tres letras

Asp	D	ácido aspártico	Ile	I	isoleucina
Thr	T	treonina	Leu	L	leucina
Ser	S	serina	Tyr	Y	tirosina
Glu	E	ácido glutámico	Phe	F	fenilalanina
Pro	P	prolina	His	H	histidina
Gly	G	glicina	Lys	L	lisina
Ala	A	alanina	Arg	R	arginina
Cys	C	cisteína	Trp	W	triptófano
Val	V	valina	Gln	Q	glutamina
Met	M	metionina	Asn	N	asparagina

Estos aminoácidos se pueden clasificar según la composición química y las propiedades de sus cadenas laterales. Están ampliamente clasificados en dos grupos, cargados y no cargados. Cada uno de estos grupos se divide en subgrupos para clasificar los aminoácidos mas exactamente:

I. Aminoácidos Cargados

: Residuos Ácidos: ácido aspártico, ácido glutámico

: Residuos Básicos: lisina, arginina, histidina

II. Aminoácidos No Cargados

: Residuos Hidrofílicos: serina, treonina, asparagina, glutamina

: Residuos Alifáticos: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina

: Residuos No Polares: cisteína, metionina, prolina

: Residuos Aromáticos: fenilalanina, tirosina, triptófano

Las terminologías "alteración", "alteración de la secuencia de aminoácidos", "variante" y "variante de la secuencia de aminoácidos" se refieren a moléculas con algunas diferencias en sus secuencias de aminoácidos con respecto a la secuencia nativa de una selectina, por ejemplo un ligando de L-selectina. Normalmente, las variantes poseerán al menos un 70% de homología con un ligando nativo de selectina, y preferentemente, serán al menos aproximadamente 80%, más preferentemente al menos aproximadamente 90% homólogas con un ligando nativo de selectina. Las variantes de la secuencia de aminoácidos que caen dentro de esta invención poseen sustituciones, deleciones, y/o inserciones, con seguridad, dentro de la secuencia de aminoácidos de un ligando nativo de selectina.

Las variantes de sustitución son las que en una secuencia nativa tienen al menos un residuo de aminoácido eliminado y un aminoácido diferente insertado en su lugar en la misma posición. Las sustituciones pueden ser sencillas, en donde sólo se ha sustituido un aminoácido en la molécula, o pueden ser múltiples, en donde dos o más aminoácidos se han sustituido en la misma molécula.

Se pueden obtener cambios substanciales en las propiedades del ligando sustituyendo un aminoácido con una cadena lateral que es significativamente diferente en carga y/o estructura de el del aminoácido nativo. Sería de esperar que este tipo de sustitución afectara la estructura del esqueleto del polipéptido y/o la carga o hidrofobicidad de la molécula en el área de la sustitución.

Serían de esperar cambios moderados en las propiedades del ligando sustituyendo un aminoácido con una cadena lateral que sea similar en carga y/o estructura a la de la molécula nativa. No sería de esperar que este tipo de sustitución, designada como una sustitución conservadora, altere substancialmente o la estructura del esqueleto del polipéptido o la carga o hidrofobicidad de la molécula en el área de la sustitución.

Las variantes de inserción son ésas con uno o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoácido en una posición particular en una secuencia del ligando nativo de selectina. Inmediatamente adyacente a un aminoácido significa conectado o al grupo funcional á-carboxílico o al á-amino del aminoácido. La inserción puede ser de uno o más aminoácidos. Normalmente, la inserción consistirá en uno o dos aminoácidos conservadores. Los aminoácidos similares en carga y/o estructura a los aminoácidos adyacentes al sitio de inserción se definen como conservadores. Alternativamente, esta invención incluye la inserción de un aminoácido con una carga y/o estructura que es substancialmente diferente de la de los aminoácidos adyacentes al sitio de inserción.

Las variantes de deleción son ésas con uno o más aminoácidos suprimidos en la secuencia de aminoácidos del ligando nativo de selectina. Normalmente, las variantes de deleción tendrán uno o dos aminoácidos suprimidos en una región particular de la molécula.

Un papel esencial del núcleo proteico de los presentes ligandos de selectina es presentar la estructura de hidrato de carbono específica reconocida por un receptor de selectina al receptor respectivo.

Por consiguiente, cualquier alteración en las dos regiones ricas en serina o treonina altamente O-glicosiladas (aminoácidos 42-63 y aminoácidos 93-122 en Figura 4) de la secuencia de aminoácidos del ligando de L-selectina se espera que tenga un efecto más significativo en la interacción linfocito-endotelio venoso alto que los cambios en otras regiones de la proteína. Como se mostrará más abajo en la presente memoria, las regiones altamente O-glicosiladas son esenciales para proporcionar una estructura rígida, inflexible de "escobillón" que permite para el gran número de ligandos de hidratos de carbono ligados a O, unidos a los residuos de serina y treonina presentarse apropiadamente a los dominios lectina de L-selectina localizados en la superficie del leucocito, de tal modo que medien en la interacción adhesiva dependiente de hidratos de carbono. Se espera que las alteraciones en estas regiones den lugar a moléculas cuyas actividades de unión a los receptores serán significativamente diferentes de las del correspondiente ligando nativo.

Los ligandos de glicoproteína de la presente invención comprenden fucosa, ácido siálico y un componente aniónico, preferentemente ésteres de sulfato como componentes de hidratos de carbono ligados a O, y se cree que se requieren la fucosa, como el ácido siálico, y el sulfato para la actividad de ligando completa.

Ejemplos de componentes específicos de hidratos de carbono de los ligandos de glicoproteína de la invención se pueden expresar como sigue:

NeuNAc\alpha2-3Gal\betal-4(Fuc\alphal-3)GlcNAc

NeuNAcA2-3Gal\alphal-4GlcNAcBl-3GalBl-4(FucAl-4(FucAl-3)GlcNAc.

El "análisis de transferencia Northern" es un método utilizado para identificar secuencias de RNA que hibridan a una sonda conocida tal como unos oligonucleótidos, fragmento de DNA, cDNA o sus fragmentos, o fragmentos de RNA. La sonda se marca con un radioisótopo tal como el ^{32}P, o por biotinación, o con una enzima. El RNA a ser analizado generalmente se separa electroforéticamente en un gel de agarosa o de poliacrilamida, se transfiere a nitrocelulosa, nailon, o otra membrana adecuada, y se hibrida con la sonda, utilizando métodos estándar bien conocidos en la técnica tales como los descritos en las secciones 7.32-7.52 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Los "oligonucleótidos" son polidesoxinucleótidos mono- o bicatenarios, de longitud corta, que se sintetizan químicamente por métodos conocidos [tales como la química del fosforotriéster, fosfito, o fosforamidito, utilizando técnicas en fase sólida tales como las descritas en el documento EP 266.032, publicado el 4 de Mayo de 1988, o vía intermedios de desoxinucleósidos H-fosfanato según lo descrito por Froehler et al., Nucl. Acids Res. 14, 5399 (1986)]. Después se purifican en geles de poliacrilamida.

La técnica de "la reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR", como se usa en la presente memoria, se refiere, generalmente, a un procedimiento en el que se amplifican cantidades mínimas de un fragmento específico de ácido nucleico, RNA y/o DNA, como se describe en la patente de EE.UU. No. 4.683.195, editado el 28 de Julio de 1987 y en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience 1991, Volumen 2, Capítulo 15.

"Transformación" significa introducir DNA en un organismo de modo que el DNA sea replicable, o como elemento extracromosómico o por integración cromosómica

La "transfección" se refiere a la captura de un vector de expresión por una célula anfitriona tanto si algunas secuencias codificantes son de hecho expresadas como si no.

Los términos "tratamiento", "tratando" y sus variantes gramaticales, se utilizan en el sentido más amplio e incluyen la prevención y el mejoramiento de ciertos síntomas o condiciones indeseados.

La "microsecuenciación en fase gaseosa" se logró basando se en los procedimientos siguientes. La proteína purificada o se secuenció directamente mediante degradación de Edman automatizada con un secuenciador en fase gaseosa de Applied Biosystems modelo 470A equipado con analizador 120A de PTH-aminoácidos o se secuenció después de la digestión con varios productos químicos o enzimas. Los PTH-aminoácidos se integraron utilizando un sistema de datos ChromPerfect (Justice Innovations, Palo Alto, CA). La interpretación de la secuencia se realizó en un ordenador VAZ 11/785 de Digital Equipment Corporation según lo descrito por Henzel et al., J. Chromatography 404, 41 (1987). En algunos casos, alícuotas de las fracciones de HPLC se somete a electroforesis en geles de poliacrilamida SDS 5-20%, se electrotransfiere a una membrana de PVDF (ProBlott, ABI, Foster City, Ca.) y se tiñe con Azul Brillante de Coomassie [Matsudaira, P. J., Biol. Chem. 262, 10035 (1987)]. La proteína específica se eliminó de la mancha para la secuenciación N-terminal. Para determinar las secuencias internas de la proteína, las fracciones de HPLC se secaron a vacío (SpeedVac), se resuspendieron en los tampones apropiados, y se digirieron con bromuro de cianógeno, la enzima específica para lisina Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, Va.) o Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.). Después de la digestión, los péptidos resultantes se secuenciaron como una mezcla o se resolvieron por HPLC en una columna C4 desarrollada con un gradiente de propanol en TFA al 0,1% antes de la secuenciación según lo descrito más arriba.

La terminología "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones que ocurran naturalmente que se pueden presentar en cantidades de menor importancia. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como no siendo una mezcla de anticuerpos discretos.

Los anticuerpos monoclonales incluidos en el alcance de la presente invención incluyen anticuerpos híbridos y recombinantes producidos empalmando un dominio variable (incluyendo hipervariable) de un anticuerpo de ligando anti-selectina con un dominio constante (por ejemplo anticuerpos "humanizados"), solo uno de los cuales está dirigido contra el ligando de selectina, o una cadena ligera con una cadena pesada, o una cadena de una especie con una cadena de otra especie, o fusiones con proteínas heterogéneas, sin importar las especies de origen o la designación de clases o subclases de inmunoglobulinas, así como los fragmentos de anticuerpos(por ejemplo, Fab, F(ab')_{2}, y Fv). Cabilly, et al., Patente de EE.UU. No. 4,816,567; Mage & Lamoyi, en Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.79-97 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).

Así, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que es obtenido a partir de una población substancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe ser interpretado como que se requiere la producción del anticuerpo por cualquier método particular.

II. Métodos generales A. Obtención de DNA que codifica un ligando de selectina

El DNA que codifica un ligando de selectina se puede obtener a partir de cualquier biblioteca de cDNA preparada a partir de tejidos que se cree que poseen mRNA para el ligando de selectina y lo expresan a un nivel detectable. Un gen de ligando de L-selectina se puede obtener así de una biblioteca de cDNA preparada a partir de nódulos linfáticos (mesentéricos y periféricos). Genes que codifican los otros ligandos de selectina se pueden preparar a partir de otras bibliotecas de cDNA de una manera análoga.

Las bibliotecas son examinadas sistemáticamente con sondas designadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por él. Para bibliotecas de expresión de cDNA, las sondas adecuadas incluyen generalmente anticuerpos mono- y policlonales que reconocen y se enlazan a las proteínas deseadas; los oligonucleótidos de aproximadamente 20-80 bases de longitud que codifican porciones conocidas o sospechadas de cDNA de ligando de selectina de la misma especie o de diferentes especies; y/o cDNAs complementarios u homólogos o sus fragmentos que codifican el mismo gen o similar.

Una manera alternativa para aislar el gen que codifica un ligando de selectina, por ejemplo un ligando de
L-selectina, es utilizar la metodología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) según lo descrito en la sección 14 de Sambrook et al., Supra o en el Capítulo 15 de Current Protocols in Molecular Biology, Supra.

Otra alternativa es sintetizar químicamente el gen que codifica el ligando de selectina deseado utilizando uno de los métodos descritos en Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. 28, 716 (1989). Estos métodos incluyen los métodos del triéster, fosfito, fosforamidito, y H-fosfonato, PCR y otros métodos con autocebadores, y síntesis de oligonucleótidos sobre soportes sólidos. Estos métodos se pueden utilizar si se conoce la secuencia completa de ácidos nucleicos del gen, o si está disponible la secuencia del ácido nucleico complementario a la hebra codificante, o, alternativamente, si se conoce la secuencia de aminoácidos elegida como objetivo, uno puede inferir las secuencias potenciales de ácidos nucleicos, utilizando los residuos codificantes conocidos o preferidos para cada residuo de aminoácido.

Un método preferido para practicar esta invención es utilizar secuencias cuidadosamente seleccionadas de oligonucleótidos para cribar las bibliotecas de cDNA de tejidos diversos, preferentemente endotelio venoso alto de nódulos linfáticos de mamíferos (ligando de L-selectina), o células mieloides (ligandos de E-selectina y P-selectina). Entre los mamíferos preferidos están los seres humanos y miembros de los siguientes ordenes: bovino, ovino, equino, murino, y rodentia.

Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben ser de suficiente longitud y suficientemente inequívocas como para minimizar los falsos positivos. La(s) secuencia(s) real(es) de nucleótidos esta(n) basada(s) generalmente en regiones o en secuencias de nucleótidos conservadoras o altamente homólogas de un ligando de selectina, por ejemplo un ligando de L-selectina.

El DNA mostrado en la Figura 4 se puede utilizar para aislar DNA que codifica otros ligandos de selectina o para aislar DNA que codifica el ligando de L-selectina de otra especie animal vía hibridación empleando los métodos discutidos más abajo. Los animales preferidos son los mamíferos, particularmente humanos, bovinos, ovinos, equinos, felinos, caninos y rodentia, y más específicamente humanos, bovinos, ratas y conejos.

B. Construcción de variantes de la secuencia de aminoácidos

Las variantes de la secuencia de aminoácidos de los ligandos de selectina de esta invención se construyen preferentemente por mutación de la secuencia de DNA que codifica el núcleo proteico de una selectina natural, por ejemplo un ligando de L-selectina. Generalmente, sitios o regiones particulares del DNA se elegirán como objetivo para la mutagénesis, y por tanto la metodología general empleada para lograr esto se denomina mutagénesis dirigida al sitio. Las mutaciones se hacen utilizando enzimas modificadoras de DNA tales como las endonucleasas de restricción (que segmenta el DNA en localizaciones determinadas), nucleasas (que degradan el DNA) y/o polimerasas (que sintetizan el DNA).

1. Inserciones y deleciones simples

La digestión con endonucleasa de restricción de DNA seguido por ligamiento se puede utilizar para generar deleciones, como se describe en la sección 15.3 de Sambrook et al., Supra. Para utilizar este método, es preferible que el DNA foráneo se inserte en un plásmido vector. Debe estar disponible un mapa de restricción del DNA foráneo (insertado) y del DNA vector, o se debe conocer la secuencia del DNA foráneo y del DNA vector. El DNA foráneo debe tener sitios de restricción exclusivos que no estén presentes en el vector. Así, las deleciones se hacen en el DNA foráneo digiriéndolo entre estos sitios de restricción únicos, utilizando las endonucleasas de restricción apropiadas bajo las condiciones sugeridas por el fabricante de las enzimas. Si las enzimas utilizadas crean extremos romos o extremos compatibles, los extremos se pueden ligar directamente utilizando una ligasa tal como la DNA ligasa de bacteriófago T4 e incubando la mezcla a 16ºC durante 1-4 horas en presencia de ATP y tampón de ligasa según lo descrito en la sección 1.68 de Sambrook et al., Supra. Si los extremos no son compatibles, primero se deben hacer romos utilizando el fragmento de Klenow de DNA polimerasa I o de DNA polimerasa de bacteriófago T4, ambas de las cuales requieren los cuatro desoxirribonucleótido trifosfatos para rellenar los extremos, del DNA digerido, de hebra simple que sobresalen. Alternativamente, los extremos se pueden arromar utilizando una nucleasa tal como la nucleasa S1 o la nucleasa de judía mung, las que funcionan cortando las hebras, de DNA, simples que sobresalen. Después el DNA se religa utilizando una ligasa. La molécula resultante es una variante de deleción.

Una estrategia similar se puede utilizar para construir variantes de inserción, como se describe en la sección 15.3 de Sambrook et al., Supra. Después de la digestión del DNA foráneo en el(los) sitio(s) de restricción exclusivo(s), se liga un oligonucleótido en el sitio donde el DNA foráneo ha sido cortado. El oligonucleótido se diseña para codificar los aminoácidos deseados para ser insertados y adicionalmente tiene los extremos 5' y 3' que son compatibles con los extremos del DNA foráneo que se ha digerido, tal que es posible el ligamiento directo.

2. Mutagénesis mediada por oligonucleótido

La mutagénesis dirigida por oligonucleótidos es el método preferido para preparar las variantes de sustitución de esta invención. También se puede utilizar para preparar convenientemente variantes de deleción e inserción de esta invención. Este método es bien conocido en la técnica según lo descrito por Adelman et al. (DNA. 2:183 [1983]).

Generalmente, se utilizan oligonucleótidos de al menos 25 nucleótidos de longitud para insertar, eliminar o sustituir dos o más nucleótidos en la molécula t-PA. Un oligonucleótido óptimo tendrá 12 a 15 nucleótidos perfectamente emparejados a cada lado de los nucleótidos que codifican la mutación. Esto asegura que el oligonucleótido hibridará correctamente a la molécula molde de DNA monocatenario. Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica tal como el descrito por Crea et al. (Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 75:5765 [1978]).

La molécula molde de DNA es la forma monocatenaria del vector con su inserción de cDNA t-PA natural. El molde monocatenario sólo se puede generar o por esos vectores que se derivan de vectores de bacteriófago M13 (los vectores comercialmente disponibles M13mp18 y m13mp19 son adecuados), o por esos vectores que contienen un origen de replicación monocatenario de fago según lo descrito por Veira et al. (Meth. Enzymol., 153:3 [1987]). Así, el cDNA
t-PA que se va a mutar se debe insertar en uno de estos vectores para general el molde monocatenario. La producción del molde monocatenario se describe en las secciones 4.21-4.41 de Sambrook et al., Supra.

Para mutagenizar la secuencia del ligando de selectina nativo, el oligonucleótido se alinea a la molécula molde de DNA monocatenaria bajo condiciones de hibridación adecuadas. Después se añade una enzima polimerizante de DNA, generalmente el fragmento de Klenow de DNA polimerasa I de E. Coli. Esta enzima utiliza el oligonucleótido como un cebador para completar la síntesis de la hebra de DNA que soporta la mutación. Así, se forma una molécula heterodúplex tal que una hebra de DNA codifica el ligando nativo de selectina insertado en el vector, y la segunda hebra de DNA codifica la forma mutada del ligando de selectina insertado en el mismo vector. Después esta molécula heterodúplex se transforma dentro de una célula anfitriona adecuada, generalmente una procariota tal como E. Coli. JM101. Después de cultivar las células, se extienden en placas de agarosa y se examinan sistemáticamente utilizando el oligonucleótido cebador radiomarcado con 32-P para identificar las colonias que contienen el ligando de selectina mutado es su núcleo proteico. Se seleccionan estas colonias, y se secuencia el DNA para confirmar la presencia de mutaciones en el núcleo proteico de la molécula.

Se pueden generar mutantes con más de un aminoácido sustituido de varias maneras. Si los aminoácidos se localizan juntos en la cadena polipeptídica, se pueden mutar simultáneamente utilizando un oligonucleótido que codifica todas las sustituciones de aminoácido deseadas. Si, sin embargo, los aminoácidos se localizan a alguna distancia unos de otros (separados por más de diez aminoácidos, por ejemplo) es más difícil generar un único oligonucleótido que codifique todos los cambios deseados. En su lugar, se pueden emplear uno de dos métodos alternativos. En el primer método, se genera un oligonucleótido separado para cada aminoácido a ser sustituido. Después los oligonucleótidos se alinean simultáneamente al DNA molde monocatenario, y la segunda hebra de DNA que se sintetiza a partir del molde codificará todas las sustituciones de aminoácidos deseadas. El método alternativo implica dos o más rondas de mutagénesis para producir el mutante deseado. La primera ronda es como se describe para los mutantes simples: el DNA que codifica el núcleo proteico de un ligando nativo de selectina se utiliza para el molde, un oligonucleótido que codifica la primera sustitución(es) de aminoácido deseada(s) se alinea a este molde, y entonces se genera la molécula de DNA heterodúplex. La segunda ronda de mutagénesis utiliza como molde el DNA producido en la primera ronda de mutagénesis. Así, este molde ya contiene una o más mutaciones. Después el oligonucleótido que codifica la sustitución(es) de aminoácido deseada(s) se alinea a este molde, y la hebra resultante de DNA ahora codifica las mutaciones de la primera y de la segunda rondas de mutagénsis. Este DNA resultante se puede utilizar como un molde en una tercera ronda de mutagénesis, y así sucesivamente.

3. Mutagénesis PCR

La mutagénesis PCR también es adecuada para hacer variantes de aminoácidos de los ligandos de selectina de la presente invención. Mientras que la siguiente discusión se refiere al DNA, se entiende que la técnica también encuentra aplicación con el RNA. La técnica PCR generalmente se refiere al siguiente procedimiento. Cuando cantidades pequeñas de DNA molde se utilizan como material de partida en una PCR, se pueden utilizar cebadores que difieren ligeramente en la secuencia de la correspondiente región en un DNA molde para generar cantidades relativamente grandes de un fragmento de DNA específico que difiere de la secuencia molde sólo en las posiciones donde los cebadores difieren del molde. Para la introducción de una mutación de un DNA plasmídico, se designa uno de los cebadores para solapar la posición de la mutación y para contener la mutación; la secuencia del otro cebador debe ser idéntica a un tramo de secuencia de la hebra opuesta del plásmido, pero esta secuencia se puede localizar en cualquier parte a lo largo del DNA plasmídico. Se prefiere, sin embargo, que la secuencia del segundo cebador se localice en los 200 nucleótidos a partir de el del primero, tal que en el extremo se pueda secuenciar fácilmente la región de DNA amplificada entera enlazada por los cebadores. La amplificación PCR utilizando un par de cebadores como la que se acaba de describir da lugar a una población de fragmentos de DNA que difiere en la posición de la mutación especificada por el cebador, y posiblemente en otras posiciones, como molde la copia es algo propensa a error.

Si la proporción de molde a material producido es extremadamente baja, la vasta mayoría de fragmentos de DNA producidos incorporan la mutación(es) deseada(s). Este material producido se utiliza para reemplazar la región correspondiente en el plásmido que sirvió como modelo PCR utilizando tecnología de DNA estándar. Las mutaciones en posiciones separadas se pueden introducir simultáneamente o utilizando un segundo cebador mutante o realizando una segunda PCR con cebadores mutantes diferentes y ligando simultáneamente los dos fragmentos resultantes de PCR al fragmento vector en un ligamiento en tres (o más) partes.

C. Inserción de DNA en un vector replicable

El cDNA o DNA genómico que codifica los ligandos de selectina (nativos o variantes) de la presente invención se inserta en un vector replicable para ulterior clonación o expresión. Están disponibles muchos vectores, y la selección de los vectores apropiados dependerá de 1) si se va a utilizar para amplificación de DNA (clonación) o para expresión, 2) el tamaño del DNA que se va a insertar en el vector, y 3) la célula anfitriona que se va a transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes dependiendo de su función y de la célula anfitriona con la que es compatible. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción. Los vectores específicos se discutirán más abajo en la presente memoria en conjunción con las células anfitrionas con las que son compatibles.

Se preparan vectores adecuados utilizando procedimientos de DNA recombinante estándares. Plásmidos aislados y fragmentos de DNA son divididos, confeccionados, y ligados juntos en un orden específico para generar los vectores deseados.

El DNA se divide utilizando la enzima o enzimas de restricción apropiadas en un tampón adecuado. En general, se utilizan aproximadamente 0,2-1 \mug de plásmido o fragmentos de DNA con aproximadamente 1-2 unidades de la enzima de restricción apropiada en aproximadamente 20 \mul de solución tampón. (Los fabricantes de las enzimas de restricción especifican los tampones, concentraciones de DNA, y tiempos de incubación y temperaturas apropiados) Generalmente, son adecuados tiempos de incubación de aproximadamente una o dos horas a 37ºC, aunque algunas enzimas requieren temperaturas mayores. Después de la incubación, las enzimas y otros contaminantes se separan por extracción de la solución de digestión con una mezcla de fenol y cloroformo, y el DNA se recupera de la fracción acuosa por precipitación en etanol.

Para ligar juntos los fragmentos de DNA y formar un vector funcional, los extremos de los fragmentos de DNA deben ser compatibles unos con otros. En algunos casos los extremos serán directamente compatibles después de la digestión con endonucleasa. Sin embargo, puede ser necesario primero convertir los extremos cohesivos, comúnmente producidos por la digestión con endonucleasa, en extremos romos para hacerlos compatibles para el ligamiento. Para arromar los extremos, el DNA se trata en un tampón adecuado durante al menos 15 minutos a 15ºC con 10 unidades del fragmento de Klenow de DNA polimerasa I (Klenow) en presencia de los cuatro nucleótidos trifosfatos. Después se purifican por extracción con fenol-cloroformo y precipitación en etanol.

Los fragmentos de DNA divididos se pueden separar por tamaños y seleccionar utilizando electroforesis en gel del DNA. El DNA se puede someter a electroforesis a través de una matriz o de agarosa o de poliacrilamida. La selección de la matriz dependerá del tamaño de los fragmentos de DNA que se van a separar. Después de la electroforesis, el DNA se extrae de la matriz por electroelución, o, si se ha utilizado agarosa de bajo punto de fusión como matriz, fundiendo la agarosa y extrayendo de ella el DNA, como se describe en las secciones 6.30-6.33 de Sambrook et al., Supra.

Los fragmentos de DNA que se van a ligar juntos (previamente digeridos con las enzimas de restricción apropiadas tal que los extremos de cada fragmento que se va a ligar sea compatible) se presentan en solución en cantidades aproximadamente equimoleculares. La solución también contendrá ATP, tampón de ligasa y una ligasa tal como la DNA ligasa T4 en aproximadamente 10 unidades por 0,5 \mug de DNA. Si el fragmento de DNA se va a ligar a un vector, el vector primero se lineariza cortando con la(s) endonucleasa(s) de restricción apropiada(s) y después se fosfatasa o con fosfatasa alcalina bacteriana o con fosfatasa alcalina de intestino de ternera. Esto previene el auto-ligamiento del vector durante la etapa de ligamiento.

Después del ligamiento, el vector con el gen foráneo ahora insertado se transforma en una célula anfitriona adecuada. Las células trasformadas se seleccionan por crecimiento en un antibiótico, comúnmente tetraciclina (tet) o ampicilina (amp), a los cuales se vuelven resistentes debido a la presencia de genes resistentes a tet y/o amp en el vector. Si la mezcla de ligamiento se ha transformado en una célula anfitriona eucariota, las células transformadas se pueden seleccionar mediante el sistema DHFR/MTX descrito arriba. Las células transformadas se desarrollan en cultivo y después se aísla el DNA plásmido (plásmido se refiere al vector ligado al gen foráneo de interés).Entonces, este DNA plásmido se analiza mediante el mapa de restricción y/o secuenciación de DNA. La secuenciación de DNA se realiza generalmente o por el método de Messing et al., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981) o por el método de Maxam et al., Methods of Enzymology, 65:499 (1980).

D. Selección y transformación de células anfitrionas

El componente hidrato de carbono de los ligandos de glicoproteína de la presente invención es esencial para el reconocimiento del receptor y la unión al receptor. Por consiguiente, para los ligandos de la presente memoria se prefieren las células anfitrionas eucariotas que expresan proteínas en una forma glicosilada. Sin embargo, también es factible la expresión en procariotas que no glicosilan proteínas, tales como E. Coli. La proteína no glicosilada se puede posteriormente glicosilar, por ejemplo por métodos químicos y/o enzimáticos detallados más abajo en la presente memoria.

1. Organismos multicelulares eucarióticos

Para la práctica de esta invención se prefieren los organismos multicelulares como anfitriones. Mientras que los cultivos celulares de invertebrados y los de vertebrados, ambos, son aceptables, los cultivos celulares de vertebrados, particularmente cultivos de mamíferos, son preferibles. Ejemplos de líneas celulares adecuadas incluyen línea CVI de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea 293S de riñón embrionario humano (Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59 [1977]); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino (Urlab and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci USA. 77:4216 [1980]); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243 [1980]); células de riñón de mono (CVI-76, ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); células de tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL 51); células de hepatoma de rata (HTC, MI.54, Baumann et al., J. Cell Biol., 85:1 [1980]); y células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44 [1982]). Los vectores de expresión de estas células normalmente incluyen (si es necesario) secuencias de DNA para un origen de replicación, un promotor localizado en frente del gen que se va a expresar, un sitio de unión a ribosoma, un sitio de empalme de RNA, un sitio de poliadenilación, y un sitio de terminación de transcripción.

Los promotores utilizados en vectores de expresión de mamíferos son a menudo de origen viral. Estos promotores virales se derivan comúnmente de virus polioma, Adenovirus2, y lo más frecuentemente de Virus de Simio 40 (SV40). El virus SV40 contiene dos promotores que se denominan promotores temprano y tardío. Estos promotores son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente a partir del virus como un fragmento de DNA que también contiene el origen viral de replicación (Fiers et al., Nature, 273:113 [1978]). También pueden utilizarse fragmentos de DNA de SV40 más cortos o más largos, a condición de que contengan la secuencia 250-bp aproximadamente extendiéndose desde el sitio HindIII hacia el sitio BglI localizado en el origen viral de replicación.

Alternativamente, los promotores que se asocian naturalmente con el gen foráneo (promotores homólogos) se pueden utilizar siempre que sean compatibles con la línea de células anfitrionas seleccionadas para la transformación.

Un origen de replicación se puede obtener a partir de una fuente exógena, tal como SV40 u otro virus (por ejemplo, Polioma, Adeno, VSV, BPV) e insertar en el vector de clonación. Alternativamente, el origen de replicación puede ser proporcionado por el mecanismo de replicación cromosómico de la célula anfitriona. Si el vector que contiene el gen foráneo se integra en el cromosoma de la célula anfitriona, lo último es a menudo suficiente.

Se pueden producir cantidades satisfactorias de ligando de selectina mediante cultivos de células transformadas. Sin embargo, el uso de una secuencia codificante de DNA secundaria puede mejorar los niveles de producción. La secuencia codificante secundaria típicamente comprende la enzima dihidrofolatoreductasa (DHFR). La forma natural de DHFR se inhibe normalmente por la sustancia química metotrexato (MTX). El nivel de expresión de DHFR en una célula variará dependiendo de la cantidad de MTX añadida a las células anfitrionas cultivadas. Una característica adicional de la DHFR que la hace particularmente útil como una secuencia secundaria es que se puede utilizar como un marcador de selección para identificar células transformadas.

Están disponibles dos formas de DHFR para su uso como secuencias secundarias, DHFR natural y DHFR MTX-resistente. El tipo de DHFR utilizado en una célula anfitriona particular depende de si la célula anfitriona es deficitaria de DHFR (tal que o produce niveles muy bajos de DHFR endógena, o no produce DHFR funcional). Las líneas de células DHFR-deficientes por ejemplo la línea de células CHO descrita por Urlaub y Chasin (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216 [1980]) se transforman con secuencias codificantes de DHFR de tipo natural. Después de la transformación, estas líneas de células DHFR-deficientes expresan DHFR funcional y son capaces de desarrollarse en un medio de cultivo que carezca de nutrientes hipoxantina, glicina y timidina. Las células no transformadas no sobrevivirán en este medio.

La forma MTX-resistente de DHFR se puede utilizar como un medio de selección de las células anfitrionas transformadas en esas células anfitrionas que endogéneamente producen cantidades normales de DHFR funcional que es sensible a MTX. La línea de células CHO-K1 (ATCC number CL 61) posee estas características, y por tanto es una línea de células útil para este propósito. La adición de MTX al medio de cultivo celular permitirá desarrollarse sólo a las células transformadas con el DNA que codifica la DHFR MTX-resistente. Las células no transformadas serán incapaces de sobrevivir en este medio.

Las células anfitrionas de mamíferos utilizadas para producir las variantes de esta invención se pueden cultivar en una variedad de medios. Medios comercialmente disponibles tales como Ham F10 (Sigma), Medio Esencial Mínimo ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Medio de Eagle Modificado de Dulbecco ([DMEM], Sigma) son adecuados para el cultivo de células anfitrionas. Cualquiera de estos medios se puede suplementar según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como Gentamicina), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos generalmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o fuente de energía equivalente. También se puede incluir otros suplementos necesarios cualquiera en concentraciones apropiadas que serían conocidos por los expertos en la técnica.

2. Microbios eucarióticos

Además de los eucariotas multicelulares, los microbios eucarióticos tales como hongos y levaduras filamentosas son adecuados para practicar esta invención. Saccharomyes cerevisiae, o la levadura común del pan, es el más comúnmente utilizado entre los microorganismos anfitrión eucarióticos más bajos. Sin embargo, varios géneros, especies, y cepas están comúnmente disponibles y son útiles en la presente memoria, por ejemplo Schizosaccharomyces pombe [Beach and Nurse, Nature, 290:140 (1981); documento EP 139.383 publicado el 2 de Mayo de 1985]; anfitriones Kluyveromyces (Patente de EE.UU. No. 4.943.529; Fleer et al., Supra) tales como, por ejemplo, K. lactis [MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)], K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178); K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Supra), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia [EP 402.226]; Pichia pastoris [EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988)]; Candida; Trichoderma reesia [EP 244.234]; Neurospora crassa [Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259 (1979)]; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis [EP 394.538 publicado el 31 Oct. 1990]; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium [WO 91/00357 publicado el 10 Enero. 1991], y anfitriones Aspergillus tales como A. nidulans [Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284 (1983); Tilburn et al, Gene. 26:205 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:1470 (1984)] y A. niger [Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475 (1985)].

Las secuencias promotoras adecuadas en vectores de levadura incluyen el promotor para 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 [1980]) o otras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 [1968]; Holland et al., Biochemistry, 17:4900 [1978]), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucose-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa. En la construcción de plásmidos de expresión adecuados, las secuencias de terminación asociadas con estos genes se ligan también en el vector de expresión 3' de la secuencia deseada para ser expresada, para proporcionar poliadenilación del mRNA y terminación. Otros promotores que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de desarrollo son la región promotora para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo de nitrógeno, y la anteriormente mencionada gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Es adecuado cualquier vector plásmido que contenga un promotor compatible con las levaduras, secuencias de origen de replicación y de terminación.

3. Células procarióticas

Las procariotas son particularmente útiles para la producción rápida de grandes cantidades de DNA, para la producción de DNA monocatenarios modelos utilizados para la mutagénesis sitio-dirigida, para examinar sistemática y simultáneamente muchos mutantes, y para la secuenciación del DNA de los mutantes generados. Células anfitrionas procarióticas adecuadas incluyen la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC número 31.446), la cepa W3110 de E. Coli. (ATCC número 27.325), E. coli X1776 (ATCC number 31.537), y E. Coli. B; sin embargo, se pueden utilizar muchas otras cepas de E. Coli., tales como HB101, JM101, NM522, NM538, NM539, y otras muchas especies y géneros de procariotas.

También se pueden utilizar procariotas como anfitriones para la expresión de secuencias de DNA. Las cepas de E. Coli. listadas más arriba, bacilos tales como Bacillus subtilis, otras enterobacteriaceas tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcesans, y diversas especies de Pseudomonas se pueden, todas, utilizar como anfitriones.

Los plásmidos vectores que contiene replicón y secuencias de control que se derivan de una especie compatible con la célula anfitriona se utiliza con estos anfitriones. El vector generalmente tiene un sitio de replicación, genes marcadores que proporcionan una selección fenotípica en células transformadas, uno o más promotores, y una región de polienlace que contiene varios sitios de restricción par a la inserción de DNA foráneo. Los plásmidos utilizados para la transformación de E. Coli. incluyen pBR322, pUC18, pUC19, pUCI18, pUCI19, y Bluescript M13, todos los cuales se describen en las secciones 1.12-1.20 de Sambrook et al., Supra. Sin embargo, también están disponibles muchos otros vectores adecuados. Estos vectores contienen genes que codifican la resistencia a ampicilina y/o tetraciclina lo que permite a las células transformadas con estos vectores desarrollarse en presencia de estos antibióticos.

Los promotores más comúnmente utilizados en vectores procarióticos incluyen la \beta-lactamasa (penicilinasa) y sistemas promotores de lactosa (Chang et al. Nature, 375:615 [1978]; Itakura et al., Science, 198:1056 [1977]; Goeddel et al., Nature, 281:544 [1979]) y un sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res., 8:4057 [1980]; EPO Appl. Publ. No. 36.776), y los sistemas de fosfatasa alcalina. Mientras que estos son los más comúnmente utilizados, otros promotores microbianos se han utilizado, y se han publicado detalles referentes a sus secuencias de nucleótidos, permitiendo a un experto ligarlos funcionalmente en plásmidos vectores (ver Siebenlist et al., Cell, 20:269 [1980]).

4. Sistemas de secreción

Muchas proteínas eucarióticas normalmente segregadas por la célula, contienen una secuencia señal endógena como parte de la secuencia de aminoácidos. Esta secuencia elige como objetivo la proteína a exportar de la célula vía el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi. La secuencia señal se localiza típicamente en el terminal amino de la proteína, y se extiende en longitud desde aproximadamente 13 a aproximadamente 36 aminoácidos. Aunque la secuencia real varía entre proteínas, todas las secuencias señal eucarióticas conocidas contienen al menos un residuo cargado positivamente y un tramo altamente hidrofóbico de 10-15 aminoácidos (generalmente rico en los aminoácidos leucina, isoleucina, alanina, valina y fenilalanina) cerca del centro de la secuencia señal. La secuencia señal está normalmente ausente de la forma segregada de la proteína, pues es dividida por una señal-peptidasa localizada en el retículo endoplasmático durante la translocación de la proteína al interior del retículo endoplasmático. La proteina con su secuencia señal todavía unida es a menudo denominada como "pre-proteína" o la forma inmadura de la proteína.

Sin embargo, no todas las proteínas segregadas contienen una secuencia señal amino terminal que se divide. Algunas proteínas, tales como ovalbúmina, contienen una secuencia señal que se localiza en una región interna de la proteína. Esta secuencia normalmente no se divide durante la translocación.

\newpage

Las proteínas encontradas normalmente en el citoplasma se pueden elegir como objetivo para la secreción mediante la unión a la secuencia señal de la proteína. Esto se logra fácilmente ligando al DNA que codifica una secuencia señal el extremo 5' del DNA que codifica la proteína y después expresando esta proteína de fusión en una célula anfitriona apropiada. El DNA que codifica la secuencia señal se puede obtener como un fragmento de restricción a partir de cualquier gen que codifica una proteína con una secuencia de señal. Así, en la presente memoria se pueden obtener secuencias señal procarióticas, de levaduras, y eucarióticas, dependiendo del tipo de célula anfitriona utilizada para practicar la invención. El DNA que codifica la porción del gen de la secuencia señal se elimina utilizando endonucleasas de restricción apropiadas y después se liga al DNA que codifica la proteína que se va a segregar.

La selección de una secuencia señal funcional requiere que la secuencia señal sea reconocida por la señal-peptidasa de la célula anfitriona tal que ocurrirá la división de esta secuencia señal y la secreción de la proteína. Se conocen el DNA y la secuencia de aminoácidos que codifica la porción de la secuencia señal de varios genes eucarióticos que incluyen, por ejemplo, la hormona de crecimiento humana, proinsulina, y proalbúmina (ver Stryer, Biochemistry, W. H. Freeman and Company, New York [1988], p. 769) y se pueden utilizar como secuencias señal en células anfitrionas eucarióticas. Secuencias señal de levaduras, como pro ejemplo la fosfatasa ácida (Arima et al., Nuc. Acids Res., 11:1657 [1983]), factor alfa, fosfatasa alcalina e invertasa se pueden utilizar para la secreción directa a partir de las células anfitrionas de levadura. Secuencias señal procarióticas de genes que codifican, por ejemplo, LamB o OmpF (Wong et al., Gene 68:193 [1988]), MalE, PhoA, o beta-lactamasa, así como otros genes, se pueden utilizar para elegir como objetivo proteínas de células procarióticas en un medio de cultivo.

Una técnica alternativa para proporcionar una proteína de interés con una secuencia señal tal que se pueda segregar es sintetizar químicamente el DNA que codifica la secuencia señal. En este método, ambas hebras de un oligonucleótido que codifica la secuencia señal seleccionada se sintetizan químicamente y después se alinean uno a otro para formar un dúplex. Después el oligonucleótido bicatenario se liga al extremo 5' del DNA que codifica la proteína.

La construcción que contiene el DNA que codifica la proteína con la secuencia señal ligada a ella, después se puede ligar a un vector de expresión adecuado. Este vector de expresión se transforma dentro de una célula anfitriona apropiada y la proteína de interés se expresa y se segrega.

E. Métodos de transformación

Cultivos de células anfitrionas de mamíferos y otras células anfitrionas que no tienen barreras de membrana celular rígidas generalmente se transforman utilizando el método del fosfato de calcio como se describe originalmente por Graham y Van der Eb (Virology. 52:546 [1978]) y modificado como se describe en las secciones 16.32-16.37 de Sambrook et al. Supra. Sin embargo, también se pueden utilizar otros métodos para introducir DNA dentro de células tales como Polybrene (Kawai y Nishizawa, Mol. Cell. Biol. 4:1172 [1984]), fusion de protoplasto (Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:2163 [1980]), electroporación (Neumann et al., EMBO J., 1:841 [1982]), y microinyección directa en el núcleo (Capecchi, Cell, 22:479 [1980]).

Las células anfitrionas de levaduras se transforman generalmente utilizando el método del polietilenglicol, según lo descrito por Hinnen (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75:1929 [1978]).

F. Cultivo de células anfitrionas

Las células anfitrionas de mamíferos utilizadas para producir los ligandos de selectina de la presente invención se pueden cultivar en una variedad de medios. Medios comercialmente disponibles, tales como Ham F10 (Sigma), Medio Esencial Mínimo ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma), o Medio de Eagle Modificado de Dulbecco ([DMEM], Sigma) son adecuados para el cultivo de tales células anfitrionas. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y Wallace, Meth. Enz. 58, 44 (1979); Barnes y Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980); Patentes de EE.UU Nos. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; o 4.560.655; WO 90/03430; WO 87/00195; Patente de EE.UU. Re. 30.985; o solicitudes en tramitación con la presente No. 07/592.107 o 07/592.141, ambas presentadas el 3 Oct. 1990, se pueden utilizar como medio de cultivo para las células anfitrionas. Cualquiera de estos medios se puede suplementar según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como Gentamicina^{TM}), elementos traza (compuestos inorgánicos generalmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o fuente de energía equivalente. También se puede incluir otros suplementos necesarios cualquiera en concentraciones apropiadas que serían conocidos por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las utilizadas previamente para la célula anfitriona seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto.

G. Variantes de glicosilación

La glicosilación de polipéptidos es típicamente o N-unido o O-ligado. N-unido se refiere al enlace del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripéptidas, asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son secuencias de reconocimiento para uniones enzimáticas del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. La glicosilación O-ligada se refiere al enlace de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque la 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina también pueden estar involucradas en la glicosilación O-ligada.

Los ligandos de selectina de la presente invención se caracterizan por el predominio de sitios de glicosilación
O-ligados. Estos se pueden modificar, por ejemplo, por la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia de aminoácidos del ligando. Por facilidad, los cambios generalmente se hacen al nivel de DNA, esencialmente utilizando las técnicas discutidas más arriba en la presente memoria con respecto a las variantes de secuencias de aminoácidos.

El acoplamiento químico o enzimático de glicósidos a los ligandos de la presente invención también se puede utilizar para modificar o aumentar el número o perfil de los sustituyentes hidrato de carbono. Estos procedimientos son ventajosos porque no requieren la producción del polipéptido que es capaz de glicosilación O-ligada (o N-unida). Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el azúcar(es) se puede(n) enlazar a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxílicos libres, (c) grupos hidroxílicos libres tales como los de cisteina, (d) grupos sulfidrilos libres tales como los de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina, o triptófano o (f) el grupo amido de la glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO 87/05330 (publicado el 11 Sep. 1987), y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

Los restos de hidratos de carbono presentes en un ligando de selectina también se pueden eliminar química o enzimáticamente. La desglicosilación química requiere la exposición a ácido trifluorometanosulfónico o un compuesto equivalente. Este tratamiento supone la división de la mayoría o de todos los azúcares, excepto el azúcar de enlace, mientras que deja el polipéptido intacto. La desglicosilación química está descrita por Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987) y por Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981). Los restos de hidratos de carbono se pueden eliminar mediante una variedad de endo- y exoglicosidasas según lo descrito por Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987). La glicosilación se suprime por tunicamicina según lo descrito por Duskin et al., J. Biol. Chem. 257, 3105 (1982). La tunicamicina bloquea la formación de enlaces proteína-N-glicosidasa.

Las variantes de glicosilación de los ligandos de selectina de la presente memoria también se pueden producir seleccionando las células anfitrionas adecuadas. Las levaduras, por ejemplo, introducen glicosilación que varía significativamente de la de los sistemas de mamíferos. Similarmente, las células de mamífero que tienen diferentes especies (por ejemplo hámster, murina, insecto, porcino, bovino, ovino) o tejidos (por ejemplo pulmonar, hepático, linfoide, mesenquimatoso o epidérmico) de origen que la fuente de ligando de selectina, rutinariamente se examinan sistemáticamente buscando la capacidad para introducir variantes de glicosilación como las caracterizadas por ejemplo, por los niveles elevados de manosa o proporciones variables de manosa, fucosa, ácido siálico, y otros azúcares esenciales para la unión a selectina.

H. Modificaciones covalentes

Las modificaciones covalentes de una molécula ligando de selectina que se da de forma natural o una secuencia que tenga una propiedad biológica en común con tal molécula, están incluidas en el alcance de la presente memoria. Tales modificaciones se introducen tradicionalmente por reacción de los residuos de aminoácidos seleccionados como objetivo de la proteína de ligando de selectina con un agente orgánico derivatizante que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales o residuos terminales seleccionados, o por los mecanismos de canalización de modificaciones postraduccionales que funcionan en las células anfitrionas recombinantes seleccionadas. Los derivados covalentes resultantes son útiles en programas dirigidos a identificar residuos importantes para la actividad biológica, para inmunoensayos de ligandos de selectina, o para la preparación de anticuerpos de ligandos de anti-selectina para purificación por inmunoafinidad de la glicoproteína recombinante. Por ejemplo, la inactivación completa de la actividad biológica de la proteína después de la reacción con ninhidrina sugeriría que al menos un residuo de arginina o lisina es crítico para su actividad, después los residuos individuales que se modificaron bajo las condiciones seleccionadas se identifican por aislamiento de un fragmento de péptido que contiene el residuo de aminoácido modificado. Tales modificaciones están dentro de la experiencia ordinaria en la técnica y se realizan sin experimentación excesiva.

La derivatización con agentes bifuncionales se utiliza para preparar agregados intramoleculares de la glicoproteína de ligando de selectina con polipéptidos, al igual que para el entrecruzamiento de la glicoproteína de ligando de selectina con una matriz o superficie soporte insoluble en agua para el uso en análisis o purificación por afinidad. Además, un estudio de entrecruzamiento intercadenas proporcionará información directa sobre la estructura conformacional. Los agentes de entrecruzamiento comúnmente utilizados incluyen 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, imidoésteres homobifuncionales, y maleimidas bifuncionales. Agentes derivatizantes tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propionimidato rinden intermedios fotoactivables que son capaces de formar entrecruzamientos en presencia de luz. Alternativamente, matrices reactivas insolubles en agua tales como hidratos de carbono activados con bromuro de cianógeno y los sistemas de sustratos reactivos descritos en las patentes de EE.UU. Nos. 3.959.642; 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; 4.055.635; y 4.330.440 se emplean para la inmovilización y entrecruzamiento de proteínas.

Ciertas modificaciones postraduccionales son el resultado de la acción de células anfitrionas recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo frecuentemente se desamidan postraduccionalmente a los correspondientes residuos glutamilo y aspartilo. Alternativamente, estos residuos se desamidan bajo condiciones suavemente ácidas. Cualquier forma de estos residuos caen dentro del alcance de esta invención.

Otras modificaciones postraduccionales incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de los grupos hidroxílicos de los residuos serilo o treonilo, metilación de los grupos á-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)].

Otros derivados comprenden los nuevos péptidos de esta invención enlazados covalentemente a polímeros no proteinaceos. El polímero no proteinaceo normalmente es un polímero sintético hidrofílico, es decir un polímero no encontrado, de lo contrario, en la naturaleza. Sin embargo, los polímeros que existen en la naturaleza y se producen por métodos recombinantes o in vitro son útiles, como lo son los polímeros que se aíslan de la naturaleza. Los polímeros polivinílicos hidrofílicos caen dentro del alcance de esta invención, por ejemplo el polivinilalcohol y la polivinilpirrolidona. Particularmente útiles son los polivinilalquilen-éteres tales como polietilenglicol, polipropilenglicol.

Los ligandos de selectina se pueden unir a diversos polímeros no proteinaceos, tales como polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera dispuesta en las patentes de EE.UU. Nos. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

Los ligandos de selectina se pueden encerrar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, en sistemas coloidales de liberación de fármacos (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Tales técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, Osol, A., Ed. (1980).

I. Quimeras ligando de selectina - proteína plasmática estable

Una secuencia de ligando de selectina se puede unir a una secuencia de proteína plasmática estable como se define anteriormente en la presente memoria. La secuencia de proteína plasmática estable puede ser, por ejemplo, una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. Las moléculas resultantes se denominan comúnmente como quimeras ligando de selectina-inmunoglobulina.

En una realización preferida, el C-terminal de una secuencia que contiene el sitio(s) de unión para una selectina, se fusiona al N-terminal de la porción C-terminal de un anticuerpo (en particular el dominio Fc), que contiene las funciones efectoras de una inmunoglobulina, por ejemplo inmunoglobulina G_{1}. Es posible fusionar la región constante de cadena pesada entera a la secuencia que contiene el sitio(s) de unión a selectina. Sin embargo, más preferentemente, en la fusión se utiliza una secuencia que comienza en la región bisagra justo cadena arriba del sitio de división de papaina (que define químicamente Fc de IgG; residuo 216, cogiendo el primer residuo de la región constante de cadena pesada que es el 114 [Kobet et al., Supra], o sitios análogos de otras inmunoglobulinas). En una realización particularmente preferida, la secuencia de aminoácidos que contiene el sitio(s) de unión a selectina se fusiona a la región bisagra y los dominios CH2 y CH3 o CH1, bisagra, CH2 y CH3 de una cadena pesada de IgG1, IgG2 o IgG3. El sitio exacto en donde se hace la fusión no es crítico, y el sitio óptimo se puede determinar mediante experimentación rutinaria.

J. Purificación de los ligandos de selectina

El ligando de selectina se puede recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes por métodos reconocidos, que incluyen precipitación en etanol o con sulfato de amonio, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en hidroxiapatita, cromatografía de inmunoafinidad y cromatografía con lectina. Otros métodos de purificación conocidos dentro del alcance de esta invención usan cromatografía de HPLC de fase reversa utilizando anticuerpos de ligandos anti-selectina, son útiles para la purificación de los ligandos de la presente invención

Un esquema de purificación particularmente ventajoso, especialmente desarrollado para la purificación de ligandos de L-selectina, será descrito en el Ejemplo 1. Este método se aprovecha de una quimera receptor de selectina-inmunoglobulina única (denominada como L-selectina-IgG), producida por métodos recombinantes, que es capaz de precipitar el ligando correspondiente (marcado con sulfato).

K. Composiciones terapéuticas

Los ligando de selectina de la presente invención se pueden utilizar para bloquear la unión del correspondiente receptor de selectina a su ligando nativo. Por ejemplo, el ligando de L-selectina bloquea eficazmente la unión de un receptor L-selectina en un leucocito circulante a su ligando nativo en una célula endotelial. Esta propiedad es útil para tratar un síntoma o enfermedad asociada a la unión excesiva de leucocitos circulantes a las células endoteliales, tales como la inflamación asociada con artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis múltiple, etc.

Los ligandos de selectina de la presente invención se pueden formular de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, por los que el ligando se combina en una mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. Portadores adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences. 16th ed., 1980, Mack Publishing Co., editado por Oslo et al. Estas composiciones contendrán típicamente una cantidad eficaz del ligando, por ejemplo, en el orden de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 mg/ml, junto con una cantidad adecuada del portador para preparar composiciones farmacéuticamente aceptables adecuadas para la administración eficaz al paciente. Los ligando se pueden administrar parenteralmente o por otros métodos que aseguren su liberación en el torrente sanguíneo en una forma eficaz.

Composiciones particularmente muy adecuadas para la administración clínica de los ligandos utilizados para practicar esta invención incluyen soluciones acuosas estériles o polvos estériles hidratables tal como proteína liofilizada. Típicamente, también se utiliza en la formulación una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable para hacer la formulación isotónica.

Las dosificaciones y concentraciones del fármaco deseadas de las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden variar dependiendo del uso particular previsto.

K. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones que ocurren naturalmente que pueden estar presentes en cantidades de menor importancia. Así, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo de que no es una mezcla de anticuerpos discretos.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden hacer utilizando el método del hibridoma descrito primeramente por Kohler & Milstein, Nature 256:495 (1975), o se pueden hacer por métodos de DNA recombinante [Cabilly, et al., patente de EE.UU. No. 4.816.567].

En el método del hibridoma, un ratón u otro animal anfitrión apropiado, tal como el hámster, se inmuniza con la proteína de ligando de selectina por rutas subcutánea, intraperitoneal, o intramuscular para provocar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Después los linfocitos se fusionan con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como el polietilenglicol, para formar una célula hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)].

Las células hibridoma así preparadas se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más substancias que inhiben el desarrollo o supervivencia de las no fusionadas, las células de mieloma parentales. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), substancias que previenen el desarrollo de células deficientes de HGPRT.

Las células de mieloma preferidas son las que se fusionan eficientemente, apoyan la expresión estable de alto nivel de anticuerpo por las células seleccionadas que producen anticuerpos, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas, las líneas de células de mieloma preferidas son las líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y las células SP-2 disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA. También se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos líneas de células de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano [Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].

En el medio de cultivo en el cual las células hibridoma están creciendo se analiza la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra TNFR1. Preferentemente, la especificidad de la unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un análisis de la unión in vitro, tales como radioinmunoanálisis (RIA) o ensayo con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas (ELISA).

La afinidad del anticuerpo monoclonal para unirse a al correspondiente ligando se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980).

Después de que se identifique que las células hibridoma producen los anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilución limitante y desarrollar por métodos estándares. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-104 (Academic Press, 1986). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, el Medio de Eagle Modificado de Dulbecco o el medio RPMI-1640. Además, las células hibridoma se pueden desarrollar in vivo como tumores de ascitis en un animal.

Los anticuerpos monoclonales segregados por los subclones se separan convenientemente del medio de cultivo, líquido ascítico, o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharosa, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.

El DNA que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención se aísla y se secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células hibridoma de la invención sirven como una fuente preferida de tal DNA. Una vez aislado, el DNA se puede poner dentro de vectores de expresión, que después se transfectan dentro de células anfitrionas tales como las células COS de simios, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de otra forma no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células anfitrionas recombinantes. El DNA también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de las cadenas ligera y pesada humanos en lugar de las secuencias homólogas murinas, Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851 (1984), o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina todo o parte de la secuencia codificante para un péptido de no-inmunoglobulina. De esta manera, se preparan los anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que presentan la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal de ligando anti-selectina de la presente memoria.

Típicamente tales péptidos de no-inmunoglobulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación con el antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación con el antígeno que tiene especificidad por un ligando de selectina y otro sitio de combinación con el antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.

Los anticuerpos quiméricos o híbridos también se pueden preparar in vitro utilizando métodos conocidos en química de síntesis de proteínas, que incluyen los que involucran agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y 4-mercaptobutirimidato de metilo.

Para aplicaciones de diagnóstico, los anticuerpos de la invención se marcarán típicamente con un resto detectable. El resto detectable puede ser cualquiera que sea capaz de producir, o directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser un radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tales como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, o luciferina; los marcadores isotópicos radiactivos, tales como, por ejemplo, ^{125}I, ^{32}P, ^{14}C, o ^{3}H, o una enzima, tal como la fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o peroxidasa de rábano picante.

Se puede emplear cualquier método conocido en la técnica para conjugar separadamente el anticuerpo del resto detectable, incluyendo los métodos descritos por Hunter, et al., Nature 144:945 (1962); David, et al., Biochemistry 13:1014 (1974); Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982).

Los anticuerpos de la presente invención se pueden emplear en cualquier método de análisis conocido, tales como ensayos de unión competitiva, ensayos sándwich directos o indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques. pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Los ensayos de unión competitiva dependen de la capacidad de un estándar marcado (que puede ser un ligando de selectina o una porción inmunológicamente reactiva suya) para competir con el analito de la muestra de ensayo (ligando de selectina) por la unión con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de ligando de selectina en la muestra de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que llega a estar enlazada a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que llega a estar enlazada, los anticuerpos generalmente se insolubilizan antes o después de la competición, así se pueden separar convenientemente el estándar y el analito que están enlazados a los anticuerpos del estándar y el analito que permanecen sin enlazar.

Los ensayos sándwich implican el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porción inmunógena diferente, o epítopo, de la proteína que se va a detectar. In un ensayo sándwich, el analito de la muestra de ensayo se enlaza por un primer anticuerpo que está inmovilizado sobre un soporte sólido, y más tarde un segundo anticuerpo se une al analito, formando así un complejo de tres partes insoluble. David & Greene, patente de EE.UU. No. 4.376.110. El segundo anticuerpo se puede marcar con un resto detectable (ensayos sándwich directos) o se puede medir utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que se marca con un resto detectable (ensayos sándwich indirectos). Por ejemplo, un tipo de ensayo sándwich es un ensayo ELISA, en el cuyo caso el resto detectable en un enzima.

La invención será ilustrada adicionalmente por los ejemplos no limitantes siguientes.

III. Ejemplos Ejemplo 1 Identificación de glicoproteínas superficiales en células endoteliales reconocidas por L-selectina.

Este ejemplo muestra que la L-selectina recombinante se une selectivamente a macromoléculas marcadas con ^{35}SO_{4} de nódulos linfáticos. En particular, se han identificado dos glicoproteínas sulfatadas, fucosilada y sialilada.

A. Marcaje metabólico de órganos con ^{35}S-sulfato

Los nódulos linfáticos mesentéricos o periféricos (cervicales, braquiales, axilares) se recogieron de ratones ICR hembras de 8-16 semanas de edad. Los nódulos linfáticos se cortaron en rebanadas de 1 mm de grueso con una cuchilla de afeitar y las rebanadas (típicamente, 0,2 g de peso húmedo) se suspendieron en 1 ml de RPMI-1640 que contenía 25 mM de HEPES, 100 U/ml de Penicilina G, 100 \mug/ml de estreptomicina, y 200 \muCi se sulfato de sodio [^{35}S] libre de portador (ICN Biochemicals Inc., Costa Mesa, Ca.) según el procedimiento de Ager, J. Cell Sci., 87:133 (1987). Después de la incubación a 37ºC durante 4 horas, las rebanadas se lavaron extensivamente en solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato (PBS), y después se homogeneizaron en 1 ml de tampón de lisis (2% de Triton X-100 en PBS que contenía 1 mM de PMSF, 1% v/v de aprotinina, 10 \mug/ml de pepstatina, 0,02% de NaN_{3}) con un homogeneizador Potter-Elvehjem sobre hielo. La lisis se continuó durante 1 hora en un balancín a 4ºC. El lisado se centrífugo a 10.000 x g durante 1 hora a 4ºC. Se añadió EDTA al sobrenadante a una concentración final de 2mM y el sobrenadante se preaclaró por balanceo con Proteína A Affi-Gel(250 \mul de perlas empaquetadas, BioRad Laboratories, Richmond, Ca.) durante toda la noche a 4ºC.

B. Identificación de los componentes adsorbidos en perlas de L-selectina-IgG

Se incubó Proteína A Affi-Gel (10 \mul de perlas empaquetadas) con 30 \mug o de L-selectina-IgG (WO 91/08298 publicado el 13 Jun. 1991), de CD4-IgG (preparado según Capon et al., Nature 337:525 (1989)) o de IgG_{1} humana (Calbiochem, La Jolla, Ca.) en 1 ml de PBS balanceándose toda la noche a 4ºC. Las perlas (designadas como perlas L-selectina-IgG, perlas CD4-IgG y perlas huIgG) se lavaron 3 veces en PBS y una vez con tampón de lisis. Las perlas CD4-IgG y huIgG se utilizaron como controles.

El lisado preclarificado descrito en la Sección A, más arriba, se centrífugo a 10.000 x g durante 10 segundos, se añadió CaCl_{2} al sobrenadante a una concentración final de 5 mM, y el sobrenadante se mezcló inmediatamente o con perlas L-selectina-IgG, con perlas CD4-IgG o con perlas huIgG (típicamente 200 \mul de lisado preclarificado por 10 \mul de perlas empaquetadas), y se incubó durante 4 horas a 4ºC en un balancín. Las perlas se lavaron 6 veces con tampón de lisis, se transfirió a un tubo nuevo, y se lavó una vez más con tampón de lisis.

Los materiales enlazados a las perlas L-selectina-IgG se solubilizaron por ebullición en SDS en presencia de
2-mercaptoetanol, se sometieron a electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida (9 ó 10%) y se sometieron a fluorografía con ENTENSIFY o EN^{3}HANCE (NEM). Por fluorografía, el componente de 50 kD tendió a ser más difuso con ENTENSIFY que con EN^{3}HANCE. En el experimento de reprecipitación, la muestra solubilizada en SDS se sometió a electroforesis sobre un gel de SDS 7,5% con patrones preteñidos (BioRad, alto rango) como marcadores. La región alrededor de 50 kD sobre el gel se eliminó utilizando ovoalbúmina preteñida (49,5 kD) como marcador de posición, y la proteína se electroeluyó (BioRad modelo 422) en tampón de desarrollo de Laemmli a 60 mA durante toda la noche. El eluato se concentró y el tampón se intercambió por 10 mM CAHPS en PBS en una unidad Centricon 30 (Amicon, Danvers, MA), seguido de incubación con perlas L-selectina-IgG, CD4-IgG o perlas huIgG según se describe más arriba. Para el análisis del lisado crudo, se precipitaron 200 \mul del lisado preclarificado con acetona fría (80% v/v) y después se sometió a electroforesis como más arriba.

Las perlas L-selectina-IgG precipitaron un componente difuso de 50 kD (el intervalo de peso molecular aparente es 50 kD - 58 kD) a partir de nódulos linfáticos mesentéricos (MLN) o nódulos linfáticos periféricos (PN) marcados con [^{35}S]-sulfato. También se observó una banda de 90 kD (83 kD - 102 kD), de relativamente menor importancia en términos de incorporación de sulfato) en la mayoría de los análisis. En las precipitaciones de control, las perlas
CD4-IgG y huIgG no reconocieron en los lisados el componente principal de 50 kD o el componente de 90 kD. Cuando los lisados crudos se analizaron directamente, el componente de 50 kD representó el constituyente principal entre otras varias bandas. La distribución de tejidos del componente de 50 kD se examinó además aplicando un protocolo idéntico al del marcaje con [^{35}S]-sulfato y precipitación con IgG de LHR en varios órganos. De entre los tejidos linfoides, sólo los nódulos linfáticos periféricos y los nódulos linfáticos mesentéricos mostraron las bandas de 50 kD y 90 kD, mientras que las placas de Peyer, el bazo, y el timo fueron negativos para ambos. Los órganos no-linfoides tales como riñón, hígado, cerebro o cerebelo también fueron totalmente negativos.

Las perlas L-selectina-IgG precipitaron el componente de 50 kD cuando el calcio estuvo presente, pero no en su ausencia. La especificidad de la interacción se examinó además con el uso del mAb MEL-14. La preincubación de perlas L-selectina-IgG con este anticuerpo bloqueó totalmente la unión de la banda de 50 kD a las perlas, mientras que un anticuerpo de control clase-compatible (anti-CD45) no tuvo ningún efecto. La fucoidina bloqueó totalmente la precipitación del componente de 50 kD por perlas L-selectina-IgG, mientras que los polisacáridos de control (sulfato B de condroitina, sulfato A de condroitina, sulfato de queratano) fueron totalmente inactivos. Además, la presencia dePPME redujo significativamente la intensidad de la banda de 50 kD, aunque se requirió una concentración relativamente alta. Un manano de levadura de control (mnn 2) no tuvo ningún efecto a la misma concentración. La precipitación de la banda minoritaria de 90 kD por perlas L-selectina-IgG fue también dependiente de calcio, inhibible por mAb
MEL-14, y bloqueada por fucoidina y PPME.

Finalmente, se encontró que el tratamiento con sialidasa de las glicoproteínas inhibía la unión a L-selectina-IgG. Así, el ácido siálico en las glicoproteínas es aparentemente esencial para la unión. Este resultado está de acuerdo con las caracterizaciones previas de las interacciones entre las selectinas y sus ligandos.

Ejemplo 2 Purificación del ligando de L-selectina de 50 kD por clonación y determinación de la secuencia.

El trabajo descrito en el Ejemplo 1 demostró que la quimera L-selectina-IgG se podía utilizar para caracterizar bioquímicamente el ligando endotelial sulfatado de \sim50 kD producido por los nódulos linfáticos periféricos y mesentéricos. El trabajo adicional ha demostrado que este ligando es fácilmente vertido en el medio cuando los nódulos linfáticos periféricos (PLN) están colocados en un cultivo de órganos (S. Watson - observaciones no publicadas). Así, la etapa inicial en la purificación del ligando de L-selectina para la determinación de la secuencia fue producir grandes cantidades de medio acondicionado por PLN murinos. Una segunda observación que permitió una dramática purificación fue que el ligando de L-selectina sulfatado de \sim50 kD era soluble después del tratamiento con cloroformo-metanol del medio acondicionado. Esta etapa dio lugar a una purificación >350 veces mayor del ligando sulfatado. La siguiente etapa de purificación consistió en una columna de afinidad de aglutinina de germen de trigo, que se aprovechó del contenido aparentemente alto del hidrato de carbono en este ligando. La etapa final de purificación utilizó una columna de afinidad de quimera L-selectina-IgG para purificar el ligando. Esta etapa final aseguró que el material contenido en la región de \sim50 kD correspondería a una glicoproteína que podría unirse con afinidad relativamente alta a la L-selectina.

Los nódulos linfáticos mesentéricos o periféricos (cervicales, braquiales, y axilares) se recogieron de ratones ICR hembras de 8-16 semanas de edad. Se mataron los ratones y se quitaron sus nódulos linfáticos mesentéricos. Típicamente, se hizo un solo lote de medio acondicionado a partir de los nódulos mesentéricos de 30 ratones. Ocasionalmente, también se añadió un pequeño número (aproximadamente 5% del peso total de nódulos linfáticos) de nódulos linfáticos periféricos. Los nódulos se cortaron en rebanadas de 1 mm de grosor con una cuchilla de afeitar y las rebanadas se añadieron al medio de cultivo celular estándar RPMI-1640 suplementado con 25 mM de tampón HEPES,
1 U/ml de penicilina y 1 \mug/ml de estreptomicina en una botella de cultivo celular de 100 ml. La proporción de medio a nódulos fue de 6 ml/30 nódulos linfáticos mesentéricos.

La botella de cultivo se colocó en una incubadora a 37ºC. Después de 4 horas, el medio se vertió en un tubo cónico de 15 ml y se centrífugo a 500 x g durante 10 minutos para separar los detritos de tejido grandes. El sobrenadante se centrifugó otra vez en un tubo Corex de 15 ml a 20.000 x g durante 15 minutos. El sobrenadante resultante primero se vertió a través de un tamiz Nitex para separar las partículas grasas que no se granulan durante la centrifugación, y después se congeló instantáneamente con nitrógeno líquido y se almacenó a -20ºC.

Con el fin de monitorizar el esquema de purificación de la proteína, Sgp50 marcado con ^{35}SO_{4} se añadió al medio acondicionado preparado como se describe más arriba en la presente memoria. Este material se preparó marcando los nódulos linfáticos mesentéricos de 5 ratones en 1 ml del medio de cultivo descrito anteriormente con 0,5 mCi de Na^{35}SO_{4} (ICN). Después de 4 horas, el medio de cultivo celular acondicionado se separó y centrífugo en una microfuga durante 10 minutos. El sobrenadante se separó y preclarificó por adición a 100 \mul de perlas empaquetadas de proteína A-agarosa (Zymed Corp.), y balanceo durante toda la noche a 4ºC. El medio preclarificado se añadió a una columna de 3 ml de LEC-IgG-proteína A-agarosa covalentemente entrecruzada (LEC x proteína A-agarosa) preparada con 10 mg de L-selectina-IgG por 1 ml de proteína A-agarosa empaquetada (Zymed) siguiendo el procedimiento perfilado en las páginas 522-523 de Antibodies. A Laboratory Manual (1988) Harlow y Lane, Cold Spring Harbor Laboratory. Después de balancear durante 6 horas a toda la noche con L-selectina x proteína A-agarosa, la columna se lavó con 10 volúmenes de solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato (PBS) y se eluyó el material purificado
(50 kD de ligando de L-selectina, también conocido como GlyCAM) con 10 ml de EDTA 4 mM en PBS. Este material se concentró en un Centricon 30 (Amicon Corp.) a un volumen final de aproximadamente 100 \mul. Se obtuvieron aproximadamente 60.000 cpm de material.

Para producir proteína purificada para análisis de microsecuenciación, se descongelaron 4 lotes (aproximadamente 120 ratones) de medio acondicionado (24 ml). Se añadieron 50 \mul de Sgp50 marcado con ^{35}SO_{4} (32.000 cpm). Se añadieron nueve volúmenes de cloroformo:metanol (2:1) (216 ml) y se balancearon en tubos cónicos de 50 ml durante 30 minutos a temperatura ambiente y se centrifugaron a 500 x g durante 20 minutos. Se recogió la capa acuosa superior y la capa de "interfase" se recentrifugó para extraer tanta capa acuosa como fuera posible. Se repitió la extracción con cloroformo:metanol. Para ver una capa acuosa, se añadieron aproximadamente 20 ml de PBS. Se recogió la capa acuosa y el cloroformo: metanol residual se evaporó agitando en vitrina la capa acuosa durante 3 horas en un vaso de precipitados de 1 litro en un baño de agua caliente. Después el material, ahora llamado <C:M ("después del reparto cloroformo:metanol"), se dializó contra PBS durante 4 horas. En una preparación similar, se consiguió una purificación 1 385 veces mayor. El <C:M dializado, con 19.200 cpm, se balanceó toda la noche a 4ºC con 4 ml de gel de aglutinina de germen de trigo (WGA)-agarosa (Vector Laboratories). El gel se recogió en una columna, se lavó con 40 ml de PBS y se eluyó con N-acetilglucosamina 0,2 M en PBS. En un experimento similar, se consiguió una purificación adicional de 4,4 veces. Este material, que contiene aproximadamente 15.000 cpm que representa el equivalente a 60 ratones, se concentró en un Centricon 30, y se corrió sobre un gel de 10% SDS bajo los procedimientos estándar de Laemmli. En un experimento similar, una purificación final en LEC x proteína A-agarosa rindió una purificación total de 60.606 veces. Después la proteína se electrotransfirió en un minitransferidor de BioRad (250 mA, corriente constante durante 2 horas) sobre una membrana ProBlott (Applied Biosystems Incorp.). La membrana (calco) se tiñó y se destiñó con Coomassie R-250 siguiendo las recomendaciones del fabricante. El calco se secó al aire y se realizó una autorradiografía con película Kodak XAR.

Después el material purificado se sometió a microsecuenciación en fase gaseosa.

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Ejemplo 3 Determinación de la secuencia de la proteina

La secuencia del polipéptido se determinó por microsecuenciación en fase gaseosa del material purificado como se describe en el Ejemplo 2. La proteína eluida de la columna de afinidad de L-Selectina-IgG se corrió en un gel de 10% SDS, se electrotransfirió sobre una membrana Problott (Applied Biosystems Inc.), se tiñó con Coomassie R-250 y se destiñó. El calco se secó al aire y se expuso a una película Kodak XAR para detectar la posición del ligando marcado con sulfato. Esta región del gel fue cortada y sometida a microsecuenciación en fase gaseosa. La secuenciación se realizó esencialmente como se describe anteriormente en la presente memoria.

La secuenciación del polipéptido reveló un tramo inambiguo de 25 aminoácidos aproximadamente en el nivel de 5 pM (Figura 3B).

Ejemplo 4 Clonación de cDNA y análisis de secuencia del ligando de L-selectina de \sim50 kD

Se construyó una biblioteca de cDNA de nódulos linfáticos periféricos murinos utilizando un kit de biblioteca de cDNA InvitroGen y poli A + RNA aislado de nódulos linfáticos periféricos murinos. Se derivó una colección redundante de sondas de oligonucleótidos a partir de los residuos 9-17 de la secuencia N-terminal (QMKTQPMDA) utilizando codones degenerados seleccionados en base a la regla de uso de codón de mamífero. Los codones fueron CAG, ATG, AAG, AAA, ACA, ACT, ACC, CCA, CCT, CCC, GAT, o GAC. Solamente GC fue utilizado por el codón 5' Ala. El oligonucleótido 26-mer se marcó con ^{32}P mediante la polinucleótido quinasa y se hibridó para duplicar los filtros de nitrocelulosa derivados de 20 placas que contenían 1 millón de bacteriófagos gT10 en formamida 20%, 5X SSC (CaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio (pH 7,6) 50 mM, 5X solución de Denhardt, sulfato de dextrano 10% y 20 \mug por ml desnaturalizado, de DNA de esperma de salmón cizallado, a 42ºC durante toda la noche. Los filtros se lavaron en 1X SSC, SDS 0,1% a 42ºC dos veces durante 30 minutos y se autoradiografiaron a -70ºC durante toda la noche. Un solo fago positivo duplicado fue purificado en placa, y la inserción Eco R1 se subclonó en el vector pGEM. Se obtuvo la secuencia entera de nucleótidos de ambas hebras por secuenciación de la superhélice con el kit de Sequenasa. Para la hibridación in situ y el análisis de transferencia Northern, se sintetizó un fragmento de reacción en cadena de polimerasa que carecía de la cola poli A, después se subclonó en el vector pGEM (PROMEGA). La secuencia de nucleótidos del cDNA codificado se muestra en la Figura 4. El clon contenía un cDNA corto (aproximadamente 600 pb) con un solo marco abierto de lectura de 151 aminoácidos. Se encontró una "caja de Kozak" (CCACCATGA) alrededor de la primera metionina codificada [Kozak, M. Cell Biology 115:887 (1991)]. Esta metionina fue seguida por una secuencia altamente hidrofóbica de 19 aminoácidos de longitud, que parece funcionar como una secuencia señal para la translocación de la proteína en el camino secretor. Esta región está seguida por una secuencia que corresponde casi exactamente a ésa determinada por secuenciación N-terminal del material enlazado a L-selectina-IgG. La proteína de 132 aminoácidos procesada con la secuencia señal es extremadamente rica en serina y treonina, con aproximadamente el 29% de los aminoácidos codificados que corresponden a estos residuos.

Quizás más interesantemente, se encontró que estos residuos de serina y treonina se agrupan en dos regiones de la glicoproteína (Figura 3D). Se encontró que la región I (residuos 42-63) contenía 12 residuos de serina o treonina (\sim55%) mientras que se encontró que la región II (residuos 93-122) contenía 14 residuos de serina o treonina (\sim48%). Dentro de estas regiones, se encontró que los residuos de serina y treonina generalmente se arracimaban en grupos de dos, tres o cuatro. La proteina carecía de residuos de cisteina, y había un sitio potencial de glicosilación N-ligado (residuos 115-117). La carencia de residuos de cisteina fue consistente con los datos previos que demostraron que la movilidad del ligando marcado con sulfato sobre geles de SDS-poliacrilamida no se afectó por la ausencia de agentes reductores de disulfuro [S. Imai y S. Rosen observaciones sin publicar]. Además, el único sitio potencial N-ligado está de acuerdo con la falta previamente demostrada de cadenas laterales de hidratos de carbono sensibles a N-glicanasa en el ligando de \sim50 kD. Finalmente, se encontró que el peso molecular de la proteína procesada era de \sim14.154 kD. Puesto que el peso molecular del ligando de L-selectina aislado es \sim50 kD, este resultado sugiere que 70 kD de la masa de la glicoproteína es hidrato de carbono O-ligado [Carraway y Hull, BioAssays 10(4), 117-121 (1989)], un resultado que es consistente con la incapacidad de teñir la glicoproteína aislada con azul de Coomassie.

El examen del extremo C-terminal de la proteina codificada por este cDNA reveló un dominio suavemente hidrofóbico, pero ningún motivo de anclaje transmembrana obvio. Mientras que es posible que esta región se corresponde con una señal que dirige la adición de una cola de fosfatidil-inositol (PI), el tratamiento de secciones de nódulo linfático con fosfatidil-inositol fosfolipasa C (PIPLC) no parece separar el ligando del endotelio (M. Singer, S. Watson, R. Mebius - observaciones sin publicar). Mientras que este resultado no refuta la posibilidad de que el ligando de
\sim50 kD se asocia con la superficie celular utilizando una cola de PI, sugiere que otros posibles ligamientos a la superficie celular pueden ser utilizados por esta glicoproteína. El examen de los 21 aminoácidos C-terminales por un programa que busca hélices anfipáticas revela que el extremo C-terminal de esta glicoproteína codifica una hélice anfipática altamente significativa (Figura 3C), con una cara de esta región potencialmente helicoidal que contiene residuos apolares mientras que la otra cara contiene residuos polares [J. Mol. Biol. 81:155 (1984)].

Ejemplo 5 Producción de anticuerpos contra péptidos

Para probar en última instancia que el DNA aislado codifica una secuencia que corresponde al esqueleto de la proteína de un ligando de L-selectina, produjimos péptidos derivados de la secuencia de aminoácidos predicha a partir de la secuencia de nucleótidos del cDNA aislado del ligando, se produjeron en un sintetizador de péptidos de Appied Biosystems. Los péptidos del extremo N-terminal (CAM01:LPSKDELQMKTC), la región media de la proteína (CAM02:CKEPSIFREELISKD), y el extremo C-terminal de la proteína (CAM05:CIISGASRITKS) se acoplaron a la hemocianina de lapa fissurella a través de los residuos, añadidos, subrayados de cisteina y se inyectaron en conejos siguiendo un protocolo de inmunización estándar. Se recogieron los sueros preinmunes y los sueros de conejos revacunados (los sueros antipéptido policlonal de conejo ahora se designan CAM01, CAM02, CAM05), y en cada suero se probó su capacidad para inmunoprecipitar el ligando de L-selectina marcado con sulfato que se purificó por unión a la quimera L-selectina-IgG como se describe más arriba.

Para verificar que la proteína clonada es la misma que el materia marcado con ^{35}S que se purificó, a partir del medio acondicionado, con la quimera L-selectina-IgG, se realizó la inmunoprecipitación del material marcado con ^{35}S purificado con L-selectina-IgG. El siguiente procedimiento se utilizó para dos experimentos separados. Para la preparación de perlas de inmunoprecipitación, se balancearon juntos en un tubo de microfuga durante 3 horas a 4ºC, 25 \mul de perlas empaquetadas de proteína A-agarosa (Zymed Laboratories) + 25 \mul de suero de conejo + 350 \mul de PBS. Cada tubo se lava 3 veces con PBS para separar la inmunoglobulina no- enlazada y quedan solamente 25 \mul de perlas. Se añaden 60 \mul de PBS que contienen aproximadamente 6.000 cpm de material marcado con ^{35}S purificado con
L-selectina-IgG. Esto se incuba en hielo durante 3 horas, golpeando ligeramente el tubo cada 15 minutos. Después de 3 horas, se hace girar el tubo de microfuga para granular las perlas. Se sacan 45 \mul de sobrenadante y se mezclan con 15 \mul 4X de tampón de muestra de Laemmli y se hierven para análisis de SDS-PAGE. Las perlas granuladas se lavan 3 veces con PBS, se transfieren a un tubo nuevo, y el sobrenadante se decanta para dejar un volumen final de 45 \mul en el tubo. Se añaden 15 \mul 4X de tampón de muestra de Laemmli y los tubos se hierven para análisis de SDS- PAGE. Este desarrollo en gel SDS fue en condiciones reductoras. La cadena pesada de inmunoglobulina corre a 50 kD bajo condiciones reductoras y se comprime la banda marcada. En este experimento, ninguno de los sueros preinmunes interaccionan con la marca, mientras que, CAM01 y CAM05 tienen efectos parciales y CAM02 inmunoprecipita totalmente la banda. Este experimento se repitió con CAM02 con las siguientes diferencias. El gel se corrió bajo condiciones no reductoras de modo que la banda de 50 kD no se comprimiera. (Hemos establecido previamente que el material marcado con ^{35}S purificado con L-selectina-IgG no cambia la movilidad en un gel SDS bajo condiciones reductoras.) También, para un tubo, se preincubaron las perlas recubiertas con anticuerpos CAM02 con 1 mg/ml de péptido CAM02 durante 30 minutos en hielo para demostrar la especificidad de la interacción anticuerpo-antígeno. Finalmente, se probó un anticuerpo de péptido de control irrelevante contra el péptido C-terminal de L-selectina (llamado ROSY 1B), también preparado por Caltag utilizando protocolos similares. Ambos geles se sometieron a fluorografía con Enhance (New England Nuclear) y a autorradiografía con película Kodak Xar. CAM02 inmunoprecipita totalmente el material marcado con ^{35}S purificado con L-selectina-IgG, CAM02 preinmune y ROSY 1B no tienen ningún efecto. El péptido CAM02 libre bloquea la inmunoprecipitación específica. El resultado se muestra en las Figuras 5A y B.

Ejemplo 6 Expresión del ligando de L-selectina

La Figura 6 muestra un análisis de transferencia Northern del mRNA que codifica el ligando de L-selectina de \sim50 kD. Como se puede ver en la Figura 6ª, el mRNA se codifica en la fracción poli A + y corresponde a una banda discreta de \sim70 kD. La nitidez de la banda argumenta contra un nivel significativo de corte y empalme alternativo de RNA, y el reexamen sistemático de la biblioteca de cDNA de PLN murino con el clon aislado del ligando no ha revelado ningunas otras formas cortadas y empalmadas del mensaje. La inducción de una respuesta inflamatoria en la región drenada por un nódulo linfático muestra una disminución relativa en la cantidad de mRNA que codifica el ligando, presumiblemente debido a la gran contribución del mRNA poli A + de linfocitos de reciente migración. Este resultado sugiere que el ligando no parece estar dramáticamente inducido en el HEV de PLN durante la inflamación, aunque es difícil hacer conclusiones cuantitativas de este experimento. La inspección de la expresión de este mRNA en diferentes nódulos linfáticos regionales demuestra que se expresa en todos los PLN regionales que hemos examinado (Figura 6B).

El análisis de la expresión del mRNA que codifica el ligando de L-selectina en varios tejidos diferentes linfoides y no-linfoides revela que esta secuencia se expresa de una manera altamente específica de los tejidos. La Figura 6C muestra el mRNA correspondiente al ligando se expresa fuertemente en nódulos linfáticos mesentéricos y periféricos. Esto está de acuerdo con el trabajo previo que demostró que el ligando marcado con sulfato se encontró que se expresaba sólo en estos dos órganos. El mensaje también se expresa en niveles significativos en el pulmón y en niveles muy bajos en las placas de Peyer. El mRNA no se detecta en varios órganos no-linfoides ni se encuentra en otros dos órganos linfoides: bazo y timo. Este último resultado sugiere fuertemente que el ligando se puede expresar significativamente en sólo un subconjunto de la vasculatura: por ejemplo el HEV encontrado en tejidos linfoides periféricos.Para probar que el mRNA del ligando se expresa en el HEV, se realizó la hibridación in situ. En los tejidos se analizó la expresión del ligando por hibridación in situ utilizando métodos previamente descritos (Wilcox et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2839 (1989)).Se cosecharon, de ratones, nódulos linfáticos periféricos y secciones de intestino delgado que tienen una placa de Peyer, se fijaron en paraformaldehído seguido de inmersión en sacarosa. Los tejidos se embebieron en compuesto OCT (Miles Scientific), se congelaron en isopentano y se seccionaron en secciones de 8 micrones. Las secciones se montaron desheladas en láminas recubiertas con Vectabond (Vector Laboratories). Se generaron sondas de RNA marcadas con ^{35}S en orientaciones sentido y antisentido utilizando métodos previamente descritos (Melton eta al. 1984). Para la hibridación, las secciones se trataron secuencialmente con paraformaldehído 4% (10 min.), proteinasa K (1 microgramo/ml, 10 min.) seguido por prehibridación con 100 microlitros de tampón de hibridación (formamida 50%, NaCl 0,03 M, Tris-HCl 20 mM, EDTA 5mM, 1X solución de Denhardt, sulfato de dextrano 5%, ditiotreitol 10 mM) a 42ºC durante 2 horas. Las sondas se añadieron a una concentración final de 8 x 10^{6} cpm/ml y después se incubaron toda la noche a 55ºC. Las láminas se lavaron con 2X SSC que contenía beta-mercaptoetanol (BME) 10 mM, EDTA 1 mM seguido por un tratamiento de 30 minutos (20 microgramos/ml durante 30 minutos). Se hizo un lavado altamente riguroso que consistió en 0,1X SSC que contenía EDTA y BME, a 55ºC durante 2 horas. Las láminas se lavaron en 0,5X SSC, se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol y se secaron a vacío. Las láminas se sumergieron en emulsión nuclear NTB2 (Kodak) y expuestas por hasta 5 semanas. Las láminas se desarrollaron, se contratiñeron con hematoxilina y eosina. Los controles negativos consistieron en la hibridación de secciones seriales con sondas sentido. Como se puede ver en la Figura 7, la cadena no codificante (antisentido) codificada por el clon de cDNA del ligando aislado híbrida claramente al HEV del tejido linfoide periférico, mientras que la cadena codificante (sentido) no muestra ninguna hibridación significativa. Este resultado demuestra claramente que el mRNA correspondiente al cDNA del ligando es sintetizado por las células del HEV, consistente con los datos inmunohistoquímicos previos demostrando la localización del ligando de L-selectina en esta región del PLN y mesentérico.

Los datos descritos aquí son consistentes con la hipótesis de que un ligando endotelial para L-selectina es una única glicoproteína de tipo mucina. Las mucinas, por definición, son proteínas ricas en serina/treonina cuyo peso molecular se debe predominantemente a cadenas laterales de hidratos de carbono ligadas a O (Cyster et al., The Embo J. 10:893 (1991), Fukuda, M., Glycobiology 1:347 (1991), Gendler et al., Am. Rev. Respir. Dis. 144:S42 (1991), Gum et al., The J. of Biol. Chem. 266:22733 (1991), Porchet et al., Am. Rev. Resp. Dis. 144:S15 (1991)). El alto contenido en serina y treonina encontrado en el ligando de L-selectina descrito en la presente memoria, junto con el alto grado de glicosilación de la proteina (\sim70% en peso molecular), sugiere que la mayor parte de los hidratos de carbono en el ligando están, de hecho, ligados a O y confirma los experimentos previos que demuestran resistencia a la N-glicanasa del ligando sulfatado de PLN de \sim50 kD. El hecho de que los hidratos de carbono ligados a O parecen estar directamente implicados en las interacciones adhesivas mediadas por el dominio lectina de L-selectina sugiere que el papel del esqueleto de proteína descrito aquí parece ser como un andamiaje para la presentación de hidratos de carbono. Esta proteína, por lo tanto, representa un nuevo tipo de molécula de adhesión celular que funciona presentando los hidratos de carbono en una manera específica de los tejidos al dominio lectina de L- selectina. De esta forma, la expresión regional de este "andamiaje" puede dar lugar al tráfico regional de poblaciones de linfocitos.

El uso de una glicoproteína similar a mucina como un andamiaje para la presentación de hidratos de carbono a una selectina tiene sentido cuando se ve en el contexto de lo que se conoce actualmente a cerca de la estructura de mucina. Las investigaciones previas en la estructura de glicoproteínas altamente ligadas a O tales como las mucinas ha revelado que estas moléculas tienden a estar altamente extendidas, casi moléculas como varillas. Por ejemplo, se ha demostrado que la leucosialina mucina de la superficie del leucocito (sialoforina, CD43) (Cyster et al. 1991, Supra. Fukuda 1991, Supra), forma una estructura rígida como varilla, y los análisis fisico-químicos de otras mucinas han demostrado conformaciones similares de tipo varilla, particularmente en las regiones altamente O-glicosiladas (Harding, S.E., Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry 47:345 Academic Press, Inc. (1989), Jentoft, N., TIBS 15:291 (1990)). Además, otras proteínas no-mucinicas, tales como el factor de aceleración del decaimiento (DAF) y el receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL), contienen dominios altamente ligados a O cerca de la superficie celular que parecen formar dominios de tipo varilla que pueden funcionar extendiendo los receptores a través del glucocáliz (Jentoft 1990, Supra). Esta estructura tipo varilla es exactamente lo que se esperaría de una molécula cuyo papel es presentar los hidratos de carbono al dominio lectina de una selectina. Como se muestra en el modelo ilustrado en la Figura 6, el ligando de L-selectina se puede considerar como un "escobillón" que se extiende dentro del lumen del HEV. Esto permitiría a un gran número de ligandos de hidratos de carbono ligados a O (las cerdas de la escobilla) estar apropiadamente presentes en el dominio lectina de L-selectina localizado en la superficie del linfocito, mediando, así, la adhesión al endotelio. El aparente agrupamiento de estos hidratos de carbono en 2 dominios sobre el ligando sugiere que se pueden presentar de una manera polivalente para potenciar la avidez de unión de la interacción adhesiva linfocito-HEV. La naturaleza tipo mucina del ligando de L-selectina podría funcionar, así, presentando ligandos de hidratos de carbono polivalentes al dominio lectina de L-selectina vía una plataforma extendida de tipo varilla. Si es exacto, esto definiría un nuevo mecanismo de adhesión celular en el sistema inmune.

El análisis de expresión descrito aquí sugiere que la regulación del tráfico regional de linfocitos mediada por
L-selectina se puede deber a la expresión específica del tejido del mRNA del ligando. Encontramos que sólo los tejidos que se describieron previamente como mediadores de las interacciones linfocito-HEV vía L-selectina expresaron altos niveles del mRNA para el ligando, aunque el nivel extremadamente bajo de mRNA en la placa de Peyer fue algo inesperado, Gallatin, Cell 44:673 (1986), Butcher, Am. J. Pathol. 136:3 (1990), Imai et al., J. Cell Biol. 113, 1213 (1991), Streeter et al., J. Cell Biol. 107, 1853 1988b, Woodruff et al., Annu. Rev. Immunol. 5, 201 (1987). Estos resultados son consistentes con la posibilidad de que el tráfico regional está, al menos en parte, controlado por la activación de la transcripción del mRNA del ligando descrito aquí, y sugiere que factores exógenos pueden regular la adhesión mediada por L-selectina controlando la transcripción del gen del ligando. Por supuesto, el esqueleto de la proteína del ligando es insuficiente para mediar la adhesión de L-selectina, y es posible que los genes que controlan la glicosil-transferasa implicados en la fabricación del ligando(s) de hidrato de carbono encontrado en este esqueleto también se puede regular mediante la transcripción. Esta última posibilidad es ahora testable investigando la actividad de la glicoproteína del ligando producida por la expresión del cDNA descrito aquí en células no-HEV. Otro nivel de regulación puede implicar los mecanismos por los cuales el ligando de \sim50 kD reciben las cadenas laterales de hidratos de carbono específicos de la L-selectina mientras que otras glicoproteínas ligadas a O no lo hacen. Queda por investigarse la posibilidad de que el ligando de L-selectina descrito aquí se pueda expresar ectópicamente en sitios inflamatorios crónicos o agudos para mediar el tráfico de linfocitos o neutrófilos (Watson et al., Nature 349:164 (1991)). Es posible que el nivel extremadamente bajo de expresión de mRNA del ligando detectado en la placa de Peyer sea una indicación de tal expresión ectópica regulable.

Mientras que está claro que el ligando de \sim50 kD descrito aquí se adhiere a L-selectina vía interacciones proteína-hidrato de carbono, queda por definirse el mecanismo por el cual este ligando se asocia con la superficie de la célula endotelial. El rápido desprendimiento encontrado aquí podría ser un artefacto del cultivo de órgano, pero otros datos que demuestran que se puede purificar una forma activa desprendida del ligando a partir de suero bovino (J. Gilbert - observaciones sin publicar) o murino (S. Watson - observaciones sin publicar) sugieren que este ligando se puede desprender in vivo. Se ha encontrado que varias moléculas de adhesión de la superficie celular, que incluyen L- y
P-selectinas, Johnston et al., Cell 56,1033 (1989)) e ICAM 1 (Rothlein et al., J. Immunol. 147:3788 (1991)), se desprenden, y parece que en muchos casos el desprendimiento es de importancia fisiológica. El rápido desprendimiento del ligando notificado aquí sugiere una asociación relativamente floja con la superficie luminal del HEV. Una asociación tal podría estar mediada por la hélice anfipática descrita más arriba e ilustrada en el modelo mostrado en la Figura 8. Esta región helicoidal podría atravesar la membrana y mediar simultáneamente en la unión a la membrana y la formación de formas oligoméricas del ligando. Durante los experimentos de filtración del gel se ha encontrado que el ligando es capaz de oligomerización (Y. Imai y S. Rosen - observaciones sin publicar). Se ha encontrado que varias proteínas utilizan hélices anfipáticas para la asociación con la membrana y la formación de poro (Haffar et al., J. Cell Biol. 107:1677 [1988], Eisenberg et al., J. Mol. Biol. 179:125 [1984], Finer-Moore y Stroud, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:155 [1984]), y es por lo tanto posible que este dominio pueda funcionar de una manera similar en el caso del ligando de L-selectina. Una hipótesis alternativa es que la hélice anfipática podría interactuar débilmente con otra proteína que se asocia más firmemente a la superficie celular endotelial. También es posible que el ligando se incorpore en el glucocáliz de una manera actualmente mal definida. Una posibilidad final es que haya varios ligandos del HEV que se unan al dominio lectina de L-selectina, alguno de los cuales se asocia firmemente con la superficie celular endotelial, tal como el ligando sulfatado de \sim90 kD descrito por Imai et al (1991), Supra o el direccionamiento de PLN descrito por Streeter et al., J. Cell Biol. 107, 1853 (1988b), y otros, como el ligando de \sim50 kD descrito aquí, que se desprenden.

Queda por definirse la relación entre el ligando endotelial de tipo mucina descrito aquí y el grupo de proteínas previamente notificado definido por el anticuerpo monoclonal MECA 79 (el "direccionamiento" de pln Streeter et al., Nature (Lond.) 331:41, J. Cell Biol. 107, 1853 [1988], Berg et al., Immunol. Rev. 108:5 [1991]). Imai et al. (1991), Supra demostraron previamente que el ligando descrito aquí es reconocido por el anticuerpo MECA 79 (un anticuerpo que se une a un determinante de hidrato de carbono desconocido), pero Streeter et al. (1988b), Supra y Berg et al. (1991), Supra han demostrado que varias glicoproteínas adicionales también parecen expresar este epítopo de tipo hidrato de carbono. Es, por lo tanto, posible que existan otras glicoproteínas endoteliales que presenten hidrato de carbono al dominio lectina de L-selectina. El desarrollo de reactivos de anticuerpos monoclonales específicos para el ligando de tipo mucina descrito aquí será , por tanto, de gran importancia, ya que permitirán una evaluación de la contribución relativa de esta glicoproteína versus otras como ligandos adhesivos para el tráfico mediado por
L-selectina.

El ligando de L-selectina de \sim50 kD es el cuarto tipo de molécula que está implicada en la adhesión celular en el sistema inmunológico: 1) Las integrinas leucocíticas, 2) sus ligandos, los miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig), 3) las selectinas y 4) el ligando de L-selectina de \sim50 kD. Se ha encontrado que las integrinas, los miembros de la superfamilia Ig, y las selectinas, todas comprenden familias que contienen una diversidad de moléculas relacionadas. Debido a las características del ligando descrito aquí, proponemos remplazar la incómoda nomenclatura utilizada a lo largo de esta solicitud con el término más descriptivo, GLYCAM 1 (GLYcosylation dependant Cell Adhesion Molecule) (Molécula de adhesión celular dependiente de la glicosilación).

Claims

1. Una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una estructura estérica que permite la presentación de un resto de unión a selectina que tiene la capacidad de unirse a una L-selectina, y en la que la secuencia de nucleótidos es capaz de hibridarse en condiciones poco rigurosas a la cadena complementaria de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la Figura 4.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína del ligando de selectina que tiene una secuencia de aminoácidos con una homología mayor que aproximadamente 40% con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada, que es un clon de cDNA que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 42 a 63, o 93 a 122 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4.

4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ligando de L-selectina.

5. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4, que comprende la región codificante de la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 4.

6. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, fusionada a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio constante de inmunoglobulina.

7. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6, en la que la inmunoglobulina es IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD or IgM.

8. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5, que comprende adicionalmente un promotor operativamente unido a la región codificante de la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 4.

9. Un vehículo de expresión que comprende y es capaz, en una célula anfitriona recombinante, de expresar una secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1, operativamente unida a secuencias de control reconocidas por una célula anfitriona transformada con el vehículo.

10. Una célula anfitriona transformada con el vehículo de expresión de la reivindicación 9.

11. La célula anfitriona de la reivindicación 10, que es una célula eucariótica.

12. La célula anfitriona de la reivindicación 11, que es una célula de mamífero.

13. La célula anfitriona de la reivindicación 12, que es de la línea celular de riñón embrionario humano 293S.

14. Un método para el cultivo de las células anfitrionas de la reivindicación 10, en un medio de cultivo adecuado para expresar un ligando de L-selectina.

15. El método de la reivindicación 14, que comprende adicionalmente la recuperación de dicho ligando de
L-selectina del cultivo.

16. Un polipéptido del ligando de L-selectina aislado, que comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 4.

17. El polipéptido del ligando de L-selectina de la reivindicación 16, que es una glicoproteína.

18. La glicoproteína de la reivindicación 17, que tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kD.

19. Un polipéptido del ligando de L-selectina aislado, de un origen animal distinto del ratón, o variante de dicho polipéptido, que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico capaz de hibridarse bajo condiciones poco rigurosas a la cadena complementaria de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteina que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4.

20. El polipéptido de la reivindicación 19, en el que las condiciones poco rigurosas son incubación a 37ºC durante toda la noche en una solución que comprende: 20% de formamida, 5X SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio
15 mM), fosfato de sodio (pH 7,6) 50 mM, 5X solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, y 20 \mug/ml de DNA desnaturalizado, de esperma de salmón cizallado.

21. El polipéptido de la reivindicación 19, que es un ligando de L-selectina nativo substancialmente libre de otras proteínas de la misma especie animal en la que se da de forma natural.

22. El polipéptido de la reivindicación 19, que comprende adicionalmente una secuencia del dominio constante de inmunoglobulina.

23. Una composición que comprende una cantidad de un polipéptido del ligando de L-selectina de la reivindicación 19, eficaz bloqueando la unión de un correspondiente receptor L-selectina a su ligando nativo en una célula endotelial, en asociación con un excipiente, no tóxico, farmacéuticamente aceptable.

24. El uso de un polipéptido del ligando de L-selectina según la reivindicación 19, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un síntoma o enfermedad asociado a la excesiva unión de leucocitos circulantes a células endoteliales.

25. El uso de la reivindicación 24, en el que dicho polipéptido se administra en una cantidad eficaz para bloquear la unión de L-selectina en un leucocito circulante a un ligando endotelial de L-selectina.

26. El uso de la reivindicación 25, que comprende adicionalmente la administración de un fármaco antiinflamatorio o antineoplásico.

27. Un anticuerpo inmunorreactivo con la parte proteínica de un polipéptido del ligando de L-selectina según la reivindicación 19.

28. Un método para determinar la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido del ligando de L-selectina según la reivindicación 19, que comprende

29. Un método para la purificación de un polipéptido del ligando de L-selectina según la reivindicación 19, que comprende el uso de una quimera que comprende la correspondiente L-selectina y una secuencia de la cadena pesada de inmunoglobulina.

30. Un método para presentar un resto de unión a selectina a una L-selectina correspondiente, que comprende unir dicho resto al polipéptido del ligando de L-selectina de la reivindicación 19.