ES2229356T3 - Lectinas de tipo c. - Google Patents
Lectinas de tipo c.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A MIEMBROS DE LA FAMILIA DE LAS LECTINAS DE TIPO C ENDOCITICAS Y A PROCEDIMIENTOS Y MEDIOS PARA PRODUCIRLOS. LOS POLIPEPTIDOS NATIVOS DE LA INVENCION SE CARACTERIZAN PORQUE CONTIENEN UNA SECUENCIA SEÑAL, UN DOMINIO RICO EN CISTEINA, UN DOMINIO DE FIBRONECTINA DE TIPO II, 8 DOMINIOS DE LECTINA DE TIPO C, UN DOMINIO TRANSMEMBRANAR Y UN DOMINIO CITOPLASMATICO. SE INCLUYEN ASIMISMO SECUENCIAS QUE CODIFICAN PARA DICHOS POLIPEPTIDOS, VECTORES QUE CONTIENEN DICHAS SECUENCIAS, CELULAS HUESPED RECOMBINANTES TRANSFORMADAS CON DICHOS VECTORES Y PROCEDIMIENTOS PARA PRODUCCION RECOMBINANTE DE LECTINAS DE TIPO C.
Description
Lectinas de tipo C.
La presente invención está relacionada con nuevas
lectinas de tipo C. Más particularmente, la invención se refiere a
nuevos miembros de la familia de lectinas endocíticas de tipo C y a
derivados funcionales de tales nuevos polipéptidos.
Se ha encontrado que el reconocimiento de
carbohidratos por lectinas desempeña un importante papel en varios
aspectos de la fisiología eucariótica. Existen varias familias
diferentes de lectinas animales y vegetales, pero son las lectinas
dependientes de calcio, o de tipo C, las que han recabado
recientemente mayor atención. Por ejemplo, se ha encontrado que el
reconocimiento de residuos de carbohidratos en células endoteliales
o en leucocitos por la familia de selectinas de lectinas
dependientes de calcio es de gran importancia para el tráfico de
leucocitos hacia lugares inflamatorios. Lasky, L., Ann. Rev.
Biochem., 64, 113-139 (1995). El análisis
biofísico de estas interacciones adhesivas ha sugerido que la unión
lectina-carbohidrato evolucionó en este caso para
permitir la adhesión entre los leucocitos y el endotelio bajo las
condiciones de elevado cizallamiento de la vasculatura. Alon y col.,
Nature (1995) en prensa. Por tanto, las rápidas
velocidades de reconocimiento de carbohidratos por tales lectinas
permite una rápida adquisición del ligando, una necesidad bajo el
elevado cizallamiento del flujo vascular. El uso fisiológico de las
lectinas de tipo C en este caso está apoyado también por las
afinidades relativamente bajas de estas interacciones, un requisito
para el fenómeno de rodamiento de los leucocitos que se ha
observado que ocurre en los lugares de inflamación aguda. Las
estructuras de los cristales de la proteína de unión a manosa (Weis
y col., Science, 254, 1608-1615
[1991]; Weis y col., Nature, 360,
127-134 [1992]) y de la selectina E (Graves y col.,
Nature, 367(6463), 532-538 [1994]),
junto con varios análisis de mutagénesis (Erbe y col., J. Cell.
Biol., 119(1), 215-227 [1992];
Drickamer, Nature, 360, 183-186
[1992]); Iobst y col., J. Biol. Chem., 169(22),
15505-15511 [1994]; Kogan y col., J. Biol.
Chem., 270(23), 14047-14055 [1995]), es
consistente con la suposición de que las lectinas de tipo C están
implicadas, en general, en el reconocimiento rápido de
carbohidratos agrupados. Juntos, estos datos sugieren que las
lectinas de tipo C llevan a cabo varios fenómenos fisiológicos
críticos a través del rápido reconocimiento de carbohidratos con
una afinidad relativamente baja.
Aunque se conocen varias familias diferentes de
lectinas de tipo C, un grupo particularmente inusual es el
representado por los receptores de manosa de los macrófagos (Taylor
y col., J. Biol. Chem., 265(21),
12156-62 [1990]; Harris y col., Blood,
80(9), 2363-73 [1992]), de fosfolipasa A2
(Ishizaki y col., J. Biol. Chem., 269(8),
5897-904 [1994]; Lambeau y col., J. Biol.
Chem., 269(3), 1575-8 [1994]; Higashino y
col., Eur. J. Biochem., 225(1),
375-82 [1994]) y DEC 205 (Jiang y col.,
Nature, 375(6527), 151-5 [1995]).
Aunque la mayoría de los miembros del grupo de lectinas de tipo C
contiene solamente un único dominio de unión a carbohidratos, estos
tres receptores contienen 8 (los receptores de manosa de los
macrófagos y de fosfolipasa A2) o 10 (el receptor DEC 205) dominios
lectina, y es probable que estos dominios cooperen unos con otros
para incrementar la avidez por el ligando (Taylor y col., J.
Biol. Chem., 267(3), 1719-20 [1992];
Taylor y col., J. Biol. Chem., 268(1),
399-404 [1993]). Estas tres moléculas parecen ser
todas proteínas transmembranales de tipo 1, y parece que todas
median diferentes fenómenos endocíticos. Por consiguiente, esta
familia será referida de aquí en adelante como la familia de
lectinas endocíticas de tipo C (Harris y col., supra; Jiang
y col., supra; Zvaritch y col., J. Biol. Chem.,
271(1), 250-7 [1996]). El mecanismo
endocítico es particularmente importante en el caso del receptor de
manosa de los macrófagos, expresado predominantemente en macrófagos
y en el endotelio hepático (Harris y col., supra) y en el
receptor DEC 205 (Jiang y col., supra), expresado
específicamente en células dendríticas y en células epiteliales del
timo. Por tanto, ambos receptores parecen mediar la endocitosis de
partículas grandes (esto es, patógenos tales como levaduras) (el
receptor de manosa de los macrófagos) o de complejos moleculares
altamente glicosilados (el receptor DEC 205). En ambos casos, la
endocitosis de complejos glicosilados por estos receptores está
implicada en el transporte de partículas o de glicoproteínas hacia
la ruta endosómica en la que son degradadas y, en el caso del
receptor DEC 205, presentadas eficazmente a células del sistema
inmune por las células dendríticas o por las células epiteliales
del timo (Jiang y col., supra). Parece probable, por tanto,
que ambos receptores estén implicados en la presentación de
estructuras altamente glicosiladas a las células inmunes para
permitir respuestas eficaces frente a organismos patógenos.
Curiosamente, el receptor de la fosfolipasa A2 es probable que esté
también implicado en la captación endocítica de proteínas
extracelulares, aunque en este caso parece ser una proteína
endógena, esto es una o más fosfolipasas (Ishizaki y col.,
supra; Lambeau y col., supra; Higashino y col.,
supra; Zvaritch y col., supra). La función biológica
exacta de este receptor, distinta de la de un mediador de alta
afinidad de la unión de fosfolipasa, es desconocida, y su patrón de
expresión en los tejidos parece ser mucho más extenso que el de los
otros dos receptores de esta familia (Higashino y col.,
supra). Además, no está claro que la unión de fosfolipasa a
este receptor esté mediada por interacciones
proteína-carbohidrato, aunque este receptor es
claramente capaz de unirse a proteínas glicosiladas (Lambeau y
col., supra). En resumen, los tres miembros conocidos de
esta familia de lectinas de tipo C parecen estar todos implicados
en la unión y en la captación de partículas grandes o de complejos
moleculares en la ruta endocítica de la célula, y en el caso de los
receptores de manosa de los macrófagos y DEC 205, estas
interacciones parecen ser a través de un reconocimiento
proteína-carbohidrato.
La presente invención está basada en la
identificación, la producción recombinante y la caracterización de
un nuevo miembro de la familia de lectinas endocíticas de tipo C.
Más específicamente, la invención tiene que ver con un nuevo
polipéptido que comprende una región que muestra una distante
homología (\sim 23%) con una región del dominio lectina de la
selectina E. Al analizar el motivo de la secuencia homóloga, hemos
encontrado sorprendentemente que, a pesar del bajo grado de
homología, los residuos que eran idénticos a residuos del dominio
lectina de la selectina E estaban incluidos en el subgrupo de
aminoácidos que están conservados en la gran mayoría de las
lectinas de tipo C. Sobre la base de esta observación y de
hallazgos posteriores que serán descritos en la presente
posteriormente, la nueva proteína ha sido identificada como un nuevo
miembro de la familia de lectinas endocíticas de tipo C. La nueva
proteína contiene dominios que están distantemente relacionados,
pero que son similares en la estructura global, a los encontrados
en los demás miembros de esta familia de lectinas. Además, parece
que se expresa específicamente en ciertas regiones altamente
endotelializadas del embrión y del adulto así como en condrocitos
del embrión que están creciendo activamente y diferenciándose.
Estos datos sugieren que esta lectina representa un nuevo miembro
de la familia de lectinas endocíticas que puede estar implicado en
la endocitosis de complejos glicosilados por el endotelio así como
por los condrocitos durante la formación del cartílago.
En un aspecto, la presente invención tiene que
ver con nuevas lectinas de tipo C de mamífero aisladas
estrechamente relacionadas con el receptor de manosa de los
macrófagos, con el receptor de fosfolipasa A2 y con el receptor DEC
205, miembros todos de la familia de lectinas de tipo C que
contienen múltiples dominios lectina que median la endocitosis, y
con derivados funcionales de las nuevas lectinas de tipo C. Los
polipéptidos nativos dentro del ámbito de la presente invención se
caracterizan por contener una secuencia señal, un dominio rico en
cisteína, un dominio fibronectina de tipo II, 8 dominios lectina de
tipo C, un dominio transmembranal y un corto dominio citoplásmico.
La presente invención incluye específicamente las formas solubles
de las nuevas moléculas de receptores, que están desprovistas de un
dominio transmembranal activo y opcionalmente de todo o parte del
dominio citoplásmico.
La invención tiene que ver con una lectina de
tipo C aislada seleccionada del grupo que consta de:
(a) un polipéptido que comprende los residuos 37
a 1393 de la secuencia de aminoácidos de la Figura 2 (SEC ID Nº: 2)
o de la Figura 9 (SEC ID Nº: 4);
(b) un polipéptido que tiene al menos un 60% de
identidad de secuencias con la secuencia de aminoácidos de la
Figura 1 (SEC ID Nº: 2) o de la Figura 9 (SEC ID Nº: 4);
(c) un polipéptido que tiene al menos un 80% de
identidad de secuencias con los tres primeros dominios lectina o
con el dominio fibronectina de tipo II de la secuencia de
aminoácidos de la Figura 1 (SEC ID Nº: 2) o de la Figura 9 (SEC ID
Nº: 4);
(d) un polipéptido que tiene al menos un 80% de
identidad de secuencias con la secuencia de aminoácidos de la
Figura 1 (SEC ID Nº: 2) o de la Figura 9 (SEC ID Nº: 4); y
(e) el polipéptido de (a)-(d) que está
desprovisto de un dominio transmembranal activo y/o de un dominio
citoplásmico, que no está acompañado por glicosilación nativa, o
que tiene una glicosilación variante.
La invención tiene que ver además con una
molécula de ácido nucleico que codifica una nueva lectina de tipo C
de la presente invención, con vectores que contienen tal ácido
nucleico y con células huésped transformadas con los vectores. El
ácido nucleico codifica preferiblemente al menos el dominio
fibronectina de tipo II y los tres primeros dominios lectina de una
lectina de tipo C nativa o variante de la presente invención. La
invención incluye además un ácido nucleico que hibrida bajo
condiciones rigurosas con el complemento de un ácido nucleico que
codifica una lectina de tipo C nativa de la presente invención y
que codifica una proteína que conserva las propiedades cualitativas
de unión a carbohidratos de la lectina de tipo C nativa de la
presente.
En otro aspecto, la invención tiene que ver con
un proceso para producir una lectina de tipo C según se definió en
la presente anteriormente, que comprende la transformación de una
célula huésped con un ácido nucleico que codifique la lectina de
tipo C deseada, el cultivo de la célula huésped transformada y la
recuperación de la lectina de tipo C producida a partir del cultivo
de la célula huésped.
En un aspecto adicional más, la invención tiene
que ver con una inmunoadhesina que comprende una secuencia de una
nueva lectina de tipo C según se describió aquí anteriormente
fusionada a una secuencia de inmunoglobulina. La secuencia de la
lectina de tipo C es preferiblemente una forma en la que se ha
eliminado el dominio transmembranal de un polipéptido nativo o
variante fusionada a una secuencia del dominio constante de una
inmunoglobulina, y comprende al menos el dominio fibronectina de
tipo II y un dominio de reconocimiento de carbohidratos (lectina)
de una lectina de tipo C nativa de la presente invención. En otra
realización preferida, la secuencia de la lectina de tipo C presente
en la inmunoadhesina muestra al menos un 80% aproximadamente de
homología de secuencias con el dominio fibronectina de tipo II y/o
con al menos uno de los tres primeros dominios de reconocimiento de
carbohidratos de una lectina de tipo C nativa de la presente
invención. La secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina
es preferiblemente la de una molécula de IgG-1,
IgG-2 o IgG-3.
La invención tiene que ver además con
composiciones farmacéuticas que contienen una lectina de tipo C
como la definida en la presente anteriormente mezclada con un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
Figura 1. Homología de secuencias entre el
dominio lectina de la selectina E y una EST. Se muestra la
secuencia homóloga (T11885) (SEC ID Nº: 9) derivada de una búsqueda
de la base de datos de marcas de secuencias expresadas (EST) con el
dominio lectina de la selectina E (SEC ID Nº: 8). La región de
homología se encontró en los aminoácidos 10-67 del
dominio lectina de la selectina E.
Figura 2. Secuencia de ADN y de la proteína
derivada del ADNc que codifica la secuencia murina homóloga de la
selectina E. Se ilustra la secuencia de ADN completa (SEC ID
Nº: 1) y la secuencia de la proteína derivada (SEC ID Nº: 2) de los
clones de ADNc murinos y de los productos de RACE derivados
utilizando como sonda la secuencia de ADN T11885. La región
homóloga a la EST original se extiende desde el aminoácido 995 al
1.061.
Figura 3. Homologías de proteínas entre la
nueva lectina de tipo C (SEC ID Nº: 2), el receptor de manosa de
los macrófagos (SEC ID Nº: 5), el receptor de fosfolipasa A2 (SEC
ID Nº: 7) y el receptor DEC 205 (SEC ID Nº: 6). Se ilustran los
residuos conservados en los tres miembros de la familia de lectinas
de tipo C endocíticas (recuadrados). Se muestran sobrerayados la
secuencias señal, el dominio rico en cisteína, el dominio
fibronectina de tipo II, el dominio lectina de tipo C, el dominio
transmembranal y el dominio citoplásmico. Los dominios lectina de
tipo C noveno y décimo del receptor DEC 205 fueron eliminados para
permitir una alineación más clara.
Figura 4. Homología de dominios y porcentaje
relativo de conservación entre la nueva lectina, el receptor de
manosa de los macrófagos, el receptor de fosfolipasa A2 y el
receptor DEC 205. Se ilustran los diferentes dominios y el
porcentaje de conservación entre estos dominios de la nueva lectina
de tipo C y los de los otros tres miembros de la familia de
lectinas endocíticas de tipo C. Los dominios son según sigue: Rico
en Cys: rico en cisteína, Fn II: fibronectina de tipo 2, CRD:
dominio de reconocimiento de carbohidratos (lectina de tipo C), TM:
transmembranal, CITO: citoplásmico.
Figura 5. Transferencia genómica sondada con
el ADNc del nuevo receptor y la estructura genómica del gen que
codifica el nuevo receptor. A. Una "transferencia zoo"
conteniendo ADNs genómicos aislados de varios organismos y
digeridos con EcoRI fue sondada con el fragmento EST original
aislado por PCR de la biblioteca cardíaca. B. La parte superior de
la figura ilustra la estructura de los dominios de la nueva lectina
de tipo C y los sitios aproximados determinados por transferencia
de manchas y análisis de PCR para cada intrón (cabezas de flecha).
Abajo se muestra el locus genómico con cada exón definido como un
pequeño recuadro.
Figura 6. Análisis de transferencia Northern
de tejidos y líneas celulares humanos y murinos para determinar la
expresión del transcrito que codifica la nueva lectina de tipo
C. A. Una transferencia Northern comercial conteniendo ARN
murino fetal completo (panel de la izquierda) o ARN derivado de
tejidos murinos adultos fue sondada con el fragmento derivado de
la EST original aislado de la biblioteca de ADNc cardíaco murino.
B. Una transferencia Northern comercial conteniendo ARN aislado de
varios tejidos humanos adultos o fetales fue sondada con la EST
original derivada de la biblioteca de ADNc de corazón humano. C.
Una transferencia comercial conteniendo ARN aislado de las líneas
celulares tumorales humanas: a. HL-60 de leucemia
promielocítica, b. células HeLa S3, c. K-562 de
leucemia mielógena crónica, d. MOLT-4 de leucemia
linfoblástica, e. Raji de linfoma de Burkitt, f. SW480 de
adenocarcinoma colorrectal, g. A549 de carcinoma de pulmón y h.
G361 de melanoma, fue sondada con la EST original derivada de la
biblioteca de ADNc de corazón humano.
Figura 7. Caracterización de la región 5 prima
del transcrito de hígado fetal humano ayustado
alternativamente. La secuencia ilustra que el transcrito humano
de longitud completa (MRX) y el ayustado alternativamente
(FL) eran idénticos desde la región 3 prima hasta el
nucleótido 61 del clon de hígado fetal ayustado alternativamente.
La parte superior de la figura ilustra el análisis de PCR
utilizando dos cebadores 5 prima específicos para el transcrito de
longitud completa (cebador 1) (SEC ID Nº: 12) o para el transcrito
ayustado alternativamente (cebador 2) (SEC ID Nº: 13). El cebador
de PCR 3 prima está mostrado al final de la secuencia y es idéntico
en ambos casos (SEC ID Nº: 14). Se muestra una sonda
oligonucleotídica interna utilizada para la hibridación como el
cebador central y es idéntica también para ambas secuencias (SEC ID
Nº: 15). En los paneles superiores, 1 ó 2 se refieren a los
cebadores 5 prima utilizados en la reacción de PCR para cada
tejido. Los paneles ilustran que el fragmento de PCR más pequeño
(2) corresponde al transcrito ayustado alternativamente, y se
encuentra solamente en el hígado fetal y no en el pulmón ni en el
corazón.
Figura 8. Análisis de hibridación in
situ de tejidos neonatales y embrionarios con la nueva lectina
de tipo C. A. Pulmón hibridado con la sonda antisentido, B.
Pulmón hibridado con la sonda sentido, C. Glomérulo renal hibridado
con la sonda antisentido, D. Plexo coroideo hibridado con la sonda
antisentido, E. Esternón en desarrollo hibridado con la sonda
antisentido, F. Esternón en desarrollo hibridado con la sonda
sentido, G. Diente en desarrollo hibridado con la sonda antisentido,
H. Cartílago de la laringe en desarrollo hibridado con la sonda
antisentido.
Figura 9. La secuencia proteica de la nueva
lectina de tipo C humana (SEC ID Nº: 4).
Las frases "nueva lectina de tipo C" y
"nueva lectina endocítica de tipo C" son utilizadas
indistintamente y se refieren a nuevos miembros nativos de la
familia de las lectinas endocíticas de tipo C que se expresan
específicamente en ciertas regiones muy endotelializadas del
embrión y del adulto, y en condrocitos del embrión que crecen y se
diferencian activamente, y a derivados funcionales de tales
polipéptidos nativos.
Los términos "lectina endocítica de tipo C
nativa (nueva)" y "lectina de tipo C nativa (nueva)", en
este contexto, se refieren a nuevos receptores lectinas endocíticas
de tipo C que existen de forma natural y comprenden un dominio rico
en cisteína, un dominio fibronectina de tipo II, múltiples dominios
lectina de tipo C, un dominio transmembranal y un dominio
citoplásmico, con o sin una secuencia señal nativa, y a formas
solubles que existen de forma natural de tales receptores lectina
de tipo C, con o sin la metionina de inicio, ya sean purificados de
la fuente nativa, sintetizados, producidos mediante la tecnología
del ADN recombinante o mediante cualquier combinación de éstos y/o
otros métodos. Las lectinas de tipo C nativas de la presente
invención incluyen específicamente la lectina de tipo C murina,
cuya secuencia de aminoácidos está mostrada en la Figura 2 (SEC ID
Nº: 2), y la lectina de tipo C humana que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en la Figura 9 (SEC ID Nº: 4), y homólogos
adicionales de estos receptores nativos de mamífero. Las nuevas
lectinas de tipo C nativas murinas y humanas de la presente
invención tienen 1480 aminoácidos de longitud aproximadamente y
comprenden una secuencia señal (aminoácidos 1-36),
un dominio rico en cisteína (desde el aminoácido en posición 37
aproximadamente hasta el aminoácidos en posición 174
aproximadamente), un dominio fibronectina de tipo II (desde el
aminoácido en posición 175 aproximadamente hasta el aminoácido en
posición 229 aproximadamente), ocho dominios (lectina) de
reconocimiento de carbohidratos (CRDs) (CRD1: aa
234-360 aproximadamente; CRD2: aa
381-507 aproximadamente; CRD3: aa
520-645 aproximadamente; CRD4: aa
667-809 aproximadamente; CRD5: aa
824-951 aproximadamente; CRD6: aa
970-1108 aproximadamente; CRD7: aa
1110-1243 aproximadamente; CRD8: aa
1259-1393 aproximadamente); un dominio
transmembranal (desde el aminoácido en posición 1410
aproximadamente hasta el aminoácido en posición 1434
aproximadamente) y un dominio citoplásmico que se extiende hasta el
extremo C de la molécula. Los límites de estos dominios están
indicados en la Figura 3 para la secuencia de la nueva lectina de
tipo C murina.
Los términos "forma soluble", "receptor
soluble", "lectina de tipo C soluble", "lectina
endocítica de tipo C soluble" y las variantes gramaticales de los
mismos, se refieren a variantes de las lectinas de tipo C nativas o
variantes de la presente invención que están desprovistas de un
dominio transmembranal funcional. En los receptores solubles el
dominio transmembranal puede ser eliminado, truncado o inactivado
de otro modo de tal manera que no sean capaces de anclarse a la
membrana celular. Si se desea, tales formas solubles de la lectinas
de tipo C de la presente invención podrían tener adicionalmente sus
dominios citoplásmicos eliminados total o parcialmente o inactivados
de otro modo.
Un "derivado funcional" de un polipéptido es
un compuesto que tiene una actividad biológica cualitativa en común
con el polipéptido nativo. Así, un derivado funcional de una nueva
lectina de tipo C nativa de la presente invención es un compuesto
que tiene una actividad biológica cualitativa en común con tal
lectina nativa. Los "derivados funcionales" incluyen, pero no
se limitan a, fragmentos de polipéptidos nativos de cualquier
especie animal (incluyendo humanos), derivados de polipéptidos
nativos (humanos y no humanos) y sus fragmentos, y análogos
peptídicos y no peptídicos de polipéptidos nativos, con la
condición de que tengan una actividad biológica en común con el
polipéptido nativo respectivo. Los "fragmentos" comprenden
regiones dentro de la secuencia de un polipéptido nativo maduro. El
término "derivado" es utilizado para definir variantes de la
secuencia de aminoácidos y de glicosilación y modificaciones
covalentes de un polipéptido nativo. "Análogos no peptídicos"
son compuestos orgánicos que presentan sustancialmente la misma
superficie que análogos peptídicos de los polipéptidos nativos. De
este modo, los análogos no peptídicos de las nuevas lectinas de
tipo C nativas de la presente invención son compuestos orgánicos
que presentan sustancialmente la misma superficie que los análogos
peptídicos de las lectinas de tipo C nativas. Tales compuestos
interaccionan con otras moléculas de manera similar a los análogos
peptídicos y remedan una actividad biológica de una lectina de tipo
C nativa de la presente invención. Preferiblemente, las variantes
de la secuencia de aminoácidos de la presente invención conservan
al menos un dominio de una lectina de tipo C nativa, o tienen al
menos un 60% de identidad de la secuencia de aminoácidos
aproximadamente, más preferiblemente al menos un 70% de identidad de
la secuencia de aminoácidos aproximadamente, incluso más
preferiblemente al menos un 80% de identidad de la secuencia de
aminoácidos aproximadamente, muy preferiblemente al menos un 90% de
identidad de la secuencia de aminoácidos aproximadamente, con un
dominio de una lectina de tipo C nativa de la presente invención.
Las variantes de la secuencia de aminoácidos muestran
preferiblemente el grado más elevado de homología de la secuencia
de aminoácidos con el dominio fibronectina de tipo II o con
el(los) dominio(s) similar(es) a lectina,
preferiblemente con los tres primeros dominios similares a lectina
(de unión a carbohidratos) de las lectinas de tipo C nativas de la
presente invención. Estos son los dominios que muestran el
porcentaje más elevado de conservación de aminoácidos entre las
nuevas lectinas de tipo C de la presente invención y otros miembros
de la familia de lectinas endocíticas de tipo C (Figura 4).
Los términos "modificación covalente" y
"derivados covalentes" son utilizados indistintamente e
incluyen, pero no se limitan a, modificaciones de un polipéptido
nativo o de un fragmento del mismo con un agente derivatizante
proteináceo o no proteináceo orgánico, fusiones con secuencias
polipeptídicas heterólogas y modificaciones
post-traduccionales. Las modificaciones covalentes
son introducidas tradicionalmente haciendo reaccionar residuos de
aminoácidos diana con un agente derivatizante orgánico que es capaz
de reaccionar con residuos laterales o terminales seleccionados, o
utilizando los mecanismos de las modificaciones
post-traduccionales que funcionan en células huésped
recombinantes seleccionadas. Ciertas modificaciones
post-traduccionales son el resultado de la acción
de las células huésped recombinantes sobre el polipéptido
expresado. Los residuos de glutaminilo y asparraginilo son
frecuentemente desamidados post-traduccionalmente
para dar los residuos glutamilo y aspartilo correspondientes.
Alternativamente, estos residuos son desamidados bajo condiciones
ácidas suaves. Otras modificaciones
post-traduccionales incluyen la hidroxilación de
prolina y lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de los
residuos de serilo, tirosina o treonilo, la metilación de los grupos
\alpha-amino de las cadenas laterales de lisina,
arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and
Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco,
pp. 79-86 (1983)]. Los derivados/modificaciones
covalentes incluyen específicamente proteínas de fusión que
comprenden secuencias de la lectina de tipo C nativa de la presente
invención y de sus variantes de la secuencia de aminoácidos, tales
como inmunoadhesinas, y fusiones N-terminales con
secuencias señal heterólogas.
El término "actividad biológica", en el
contexto de la presente invención, se define como la posesión de al
menos una función adhesiva, reguladora o efectora cualitativamente
en común con un polipéptido nativo. Los derivados funcionales
preferidos dentro del ámbito de la presente invención están
unificados por la conservación de las propiedades de reconocimiento
de carbohidratos cualitativas de una lectina endocítica de tipo C
nativa de la presente invención.
"Identidad" u "homología", con respecto
a un polipéptido nativo y a su derivado funcional, se define en la
presente como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la
secuencia candidata que son idénticos a los residuos de un
polipéptido nativo correspondiente después de alinear las secuencias
e introducir huecos, si es necesario, para alcanzar el máximo
porcentaje de homología, y no considerando ninguna sustitución
conservadora como parte de la identidad de las secuencias. No se
interpretarán las extensiones e inserciones N- o
C-terminales como reductoras de la identidad o la
homología. Son bien conocidos en la técnica métodos y programas de
ordenador para la alineación.
El término "agonista" se utiliza para
referirse a análogos peptídicos y no peptídicos de las lectinas de
tipo C nativas de la presente invención y a anticuerpos que se unen
específicamente a tales lectinas de tipo C nativas, siempre que
conserven al menos una actividad biológica de una lectina de tipo C
nativa. Preferiblemente, los agonistas de la presente invención
conservan las propiedades cualitativas de reconocimiento de
carbohidratos de los polipéptidos lectina de tipo C nativa.
El término "antagonista" es utilizado para
referirse a una molécula que inhibe una actividad biológica de una
lectina de tipo C nativa de la presente invención. Preferiblemente,
los antagonistas de la presente inhiben la unión a carbohidratos de
una lectina de tipo C nativa de la presente invención. Los
antagonistas preferidos bloquean esencialmente de manera completa la
unión de una lectina de tipo C nativa a una estructura
carbohidratada a la cual se uniría en caso contrario.
Comúnmente, los términos "aminoácido" y
"aminoácidos" se refieren a todos los
L-\alpha-aminoácidos que existen
en la naturaleza. En algunas realizaciones, sin embargo, pueden
estar presentes D-aminoácidos en los polipéptidos o
péptidos de la presente invención con el fin de facilitar la
restricción conformacional. Por ejemplo, para facilitar la
formación de enlaces disulfuro y la estabilidad, puede
proporcionarse un D-aminoácido cisteína en uno o en
ambos extremos de un derivado funcional peptídico o de un
antagonista peptídico de las lectinas de tipo C nativas de la
presente invención. Los aminoácidos son identificados por las
denominaciones de una letra o de tres
letras:
letras:
| Asp | D | ácido aspártico | Ile | I | isoleucina |
| Thr | T | treonina | Leu | L | leucina |
| Ser | S | serina | Tyr | Y | tirosina |
| Glu | E | ácido glutámico | Phe | F | fenilalanina |
| Pro | P | prolina | His | H | histidina |
| Gly | G | glicina | Lys | K | lisina |
| Ala | A | alanina | Arg | R | arginina |
| Cys | C | cisteína | Trp | W | triptófano |
| Val | V | valina | Gln | Q | glutamina |
| Met | M | metionina | Asn | N | asparragina |
El término "variante de la secuencia de
aminoácidos" se refiere a moléculas con algunas diferencias en
sus secuencias de aminoácidos en comparación con una secuencia de
aminoácidos nativa.
Las variantes por sustitución son aquéllas que
tienen al menos un residuo de aminoácido de la secuencia nativa
eliminado y un aminoácido diferente insertado en su lugar en la
misma posición.
Las variantes por inserción son aquéllas con uno
o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un
aminoácido en una posición particular de una secuencia nativa.
Inmediatamente adyacente a un aminoácido significa conectado al
grupo funcional \alpha-carboxi o
\alpha-amino del aminoácido.
Las variantes por deleción son aquéllas con uno o
más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa
eliminados.
Los "anticuerpos (Abs)" y las
"inmunoglobulinas (Igs)" son glicoproteínas que tienen las
mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos
presentan especificidad de unión a un antígeno específico, las
inmunoglobulinas incluyen anticuerpos y otras moléculas similares a
anticuerpos que carecen de especificidad antigénica. Los
polipéptidos de este último tipo son producidos, por ejemplo, en
bajos niveles por el sistema linfático y en niveles incrementados
por los mielomas.
Los anticuerpos y las inmunoglobulinas nativos
son normalmente glicoproteínas heterotetraméricas de 150.000
daltons aproximadamente compuestas por dos cadenas ligeras (L)
idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera
está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente,
aunque el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas
pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena
pesada y ligera tiene también puentes disulfuro intracatenarios
separados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un
dominio variable (V_{H}) seguido por varios dominios constantes.
Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V_{L})
y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de
la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de
la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está
alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que
residuos de aminoácidos particulares forman una interfase entre los
dominios variables de las cadenas ligera y pesada (Clothia y col.,
J. Mol. Biol., 186, 651-663 [1985];
Novotny y Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,
4592-4596 [1985]).
Las cadenas ligeras de los anticuerpos
(inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden ser
asignadas a uno de dos tipos claramente distintos, denominados
kappa y lambda (\lambda), sobre la base de las secuencias de
aminoácidos de sus dominios constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del
dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas
pueden ser asignadas a diferentes clases. Hay cinco clases
principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias
de éstas pueden ser divididas adicionalmente en subclases
(isotipos), por ejemplo IgG-1,
IgG-2, IgG-3 e
IgG-4; IgA-1 e
IgA-2. Los dominios constantes de la cadena pesada
que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas son
denominados \alpha, delta, épsilon, \gamma y \mu,
respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las
configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de
inmunoglobulinas son bien conocidas.
El término "anticuerpo" es utilizado en el
sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales
individuales (incluyendo anticuerpos agonistas y antagonistas),
composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica, así
como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab, F(ab')_{2}
y Fv), siempre que presenten la actividad biológica deseada.
El término "anticuerpo monoclonal", según se
utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido a
partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos,
esto es, los anticuerpos individuales que comprende la población
son idénticos excepto por las posibles mutaciones que ocurren de
forma natural que pueden estar presentes en cantidades mínimas. El
calificativo "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo
como obtenido de una población sustancialmente homogénea de
anticuerpos, y no debe ser interpretado como que se requiera la
producción del anticuerpo mediante algún método particular. Por
ejemplo, los anticuerpos monoclonales para ser utilizados de acuerdo
con la presente invención pueden ser producidos mediante el método
de hibridomas descrito por vez primera por Kohler y Milstein,
Nature, 256, 495 (1975), o pueden ser producidos
mediante métodos de ADN recombinante [ver, por ejemplo, la Patente
de EE.UU. Nº 4.816.567 (Cabilly y col.)].
Los anticuerpos monoclonales de la presente
incluyen específicamente anticuerpos (inmunoglobulinas)
"quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o
ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes de
anticuerpos derivados de una especie particular o pertenece a una
clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de
la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las
secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de otra
especie o pertenece a otra clase o subclase de anticuerpos, así como
fragmentos de tales anticuerpos, siempre que presenten la actividad
biológica deseada (Patente de EE.UU. Nº 4.816.567 (Cabilly y col.;
Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81,
6851-6855 [1984]).
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no
humanos (por ejemplo murinos) son inmunoglobulinas quiméricas,
cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de la mismas (tales como
Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de
anticuerpos que se unen al antígeno) que contienen una secuencia
mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Para la mayoría,
los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas
(anticuerpo receptor) en las que residuos de una región
determinante de la complementariedad (CDR) del receptor son
sustituidos por residuos procedentes de una CDR de una especie no
humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata o conejo que tenga
la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos,
residuos del armazón Fv de la inmunoglobulina humana son
sustituidos por residuos no humanos correspondientes. Además, el
anticuerpo humanizado puede contener residuos que no se encuentran
ni en las secuencias del anticuerpo receptor ni en las secuencias
de la CDR o del armazón importadas. Estas modificaciones se
realizan para refinar y optimizar adicionalmente el funcionamiento
del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado contendrá
sustancialmente al menos uno, y típicamente dos, de todos los
dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las
regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y
todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una
secuencia consenso de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo
humanizado contendrá también óptimamente al menos una porción de
una región constante de una inmunoglobulina (Fc), típicamente la de
una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales ver: Jones y
col., Nature, 321, 522-525 [1986];
Reichmann y col., Nature, 332,
323-329 [1988];
EP-B-239 400 publicada el 30 de
Septiembre de 1987; Presta, Curr. Op. Struct. Biol.,
2, 593-596 [1992] y
EP-B-451 216 publicada el 24 de
Enero de 1996).
En el contexto de la presente invención las
expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo
celular" son utilizadas indistintamente, y tales denominaciones
incluyen todas la progenie. Se comprende también que toda la
progenie puede no ser exactamente idéntica en el contenido de ADN,
debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la
progenie mutante que tiene la misma función o la misma propiedad
biológica por la que se seleccionó la célula transformada
originalmente.
Los términos "vector de expresión
replicable", "vector de expresión" y "vector" se
refieren a un fragmento de ADN, normalmente de doble hebra, que
puede tener insertado en el mismo un fragmento de ADN foráneo. El
ADN foráneo se define como ADN heterólogo, que es un ADN que no se
encuentra de manera natural en la célula huésped. El vector es
utilizado para transportar el ADN foráneo o heterólogo a una célula
huésped adecuada. Una vez en la célula huésped, el vector puede
replicarse independientemente del ADN cromosómico del huésped, y
pueden generarse varias copias del vector y de su ADN insertado
(foráneo). Además, el vector contiene los elementos necesarios que
permiten la traducción del ADN foráneo a un polipéptido. Muchas
moléculas del polipéptido codificado por el ADN foráneo pueden ser
de este modo rápidamente sintetizadas.
El término "secuencias control" se refiere a
secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia
codificadora unida operativamente en un organismo huésped
particular. Las secuencias control que son adecuadas para
procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una
secuencia operadora, un sitio de unión de ribosomas y,
posiblemente, otras secuencias todavía poco conocidas. Se sabe que
las células eucarióticas utilizan promotores, señales de
poliadenilación e intensificadores.
Un ácido nucleico está "unido
operativamente" cuando está colocado en una relación funcional
con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un ADN para una
presecuencia o un líder secretor está unido operativamente al ADN de
un polipéptido si es expresado como una preproteína que participa
en la secreción del polipéptido; un promotor o un intensificador
está unido operativamente a una secuencia codificadora si afecta a
la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosomas
está unido operativamente a una secuencia codificadora si está
situado de tal forma que facilita la traducción. Generalmente,
"unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que
está unidas son contiguas y, en el caso de un líder secretor,
contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los intensificadores
no tienen que estar contiguos. La unión se realiza mediante
ligadura en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no
existen, se utilizan entonces adaptadores o conectores
oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica
convencional.
Los "oligonucleótidos" son
polidesoxinucleótidos de hebra sencilla o de doble hebra, de
longitud corta, que son sintetizados químicamente mediante métodos
conocidos [tal como mediante la química de fosfotriésteres, fosfitos
o fosforamiditas, utilizando técnicas de fase sólida tales como las
descritas en EP 266.032, publicada el 4 de Mayo de 1988, o a través
de productos intermedios desoxinucleósido
H-fosfanatos según está descrito por Froehler y
col., Nucl. Acids Res., 14, 5399 (1986)].
Posteriormente son purificados en geles de poliacrilamida.
La hibridación se realiza preferiblemente bajo
"condiciones rigurosas", lo cual significa (1) el empleo de
una baja fuerza iónica y una temperatura elevada para el lavado,
por ejemplo, cloruro de sodio 0,015/citrato de sodio 0,0015
M/dodecil sulfato de sodio 0,1% a 50ºC, o (2) el empleo durante la
hibridación de un agente desnaturalizante, tal como formamida, por
ejemplo, formamida 50% (vol/vol) con seroalbúmina bovina
0,1%/Ficoll 0,1%/polivinilpirrolidona 0,1%/tampón fosfato de sodio
50 nM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM
a 42ºC. Otro ejemplo es la utilización de formamida 50%, SSC 5X
(NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH
6/8), pirofosfato de sodio 0,1%, solución de Denhardt 5X, ADN de
esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS 0,1% y dextrán
sulfato 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en SSC 0,2X y SDS 0,1%. Otro
ejemplo más es la hibridación utilizando un tampón de dextrán
sulfato 10%, SSC 2X (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida
50% a 55ºC, seguido por un lavado muy riguroso consistente en SSC
0,1X conteniendo EDTA a 55ºC.
Las "inmunoadhesinas" o "quimeras lectina
de tipo C-inmunoglobulina" son moléculas
quiméricas similares a anticuerpos que combinan el(los)
dominio(s) funcional(es) de una proteína de unión
(normalmente un receptor, una molécula de adhesión celular o un
ligando) con la secuencia de una inmunoglobulina. El ejemplo más
común de este tipo de proteína de fusión combina las regiones
bisagra y Fc de una inmunoglobulina (Ig) con dominios de un receptor
de la superficie celular que reconoce un ligando específico. Este
tipo de molécula es denominado "inmunoadhesina" ya que combina
las funciones "inmune" y de "adhesión"; otros nombres
frecuentemente utilizados son "quimera de Ig", "proteína de
fusión de Ig" o "proteína de fusión de Fc" o
"receptor-globulina".
\newpage
Las lectinas endocíticas de tipo C nativas de la
presente invención pueden ser aisladas a partir de bibliotecas de
ADNc o genómicas. Por ejemplo, puede construirse una biblioteca de
ADNc adecuada obteniendo ARNm poliadenilado de células que se sabe
que expresan la lectina de tipo C deseada, y utilizando el ARNm
como molde para sintetizar ADNc de doble hebra. Las fuentes
adecuadas del ARNm son las regiones altamente endotelializadas de
tejidos de mamífero embrionarios y adultos, y condrocitos en
diferenciación del embrión. El ARNm que codifica las lectinas de
tipo C nativas de la presente invención se expresa, por ejemplo, en
tejido pulmonar, renal y hepático fetal humano; en tejido cardíaco,
pulmonar, renal, cerebral y muscular murino adulto; tejido cardíaco,
prostático, testicular, ovárico, intestinal, cerebral, placentario,
pulmonar, renal, pancreático, esplénico, tímico y colónico humano
adulto. El gen que codifica las nuevas lectinas de tipo C de la
presente invención puede ser también obtenido a partir de una
biblioteca genómica, tal como una biblioteca de cósmidos genómicos
humanos, o una biblioteca genómica de células embrionarias derivadas
de ratón (ES).
Las bibliotecas, de ADNc o genómicas, son
posteriormente sometidas a selección con sondas diseñadas para
identificar el gen de interés o la proteína por él codificada. Para
las bibliotecas de expresión de ADNc, las sondas adecuadas incluyen
anticuerpos monoclonales y policlonales que reconocen y se unen
específicamente a un receptor lectina de tipo C. Para las
bibliotecas de ADNc, las sondas adecuadas incluyen sondas
oligonucleotídicas cuidadosamente seleccionadas (normalmente de 20
a 80 bases de longitud aproximadamente) que codifican porciones
conocidas o sospechosas de un polipéptido lectina de tipo C de la
misma especie o de especies diferentes, y/o ADNcs complementarios u
homólogos o fragmentos de los mismos que codifican el mismo gen o un
gen similar. Las sondas apropiadas para el proceso de selección de
bibliotecas de ADN genómico incluyen, sin limitación,
oligonucleótidos, ADNcs, o fragmentos de los mismos que codifiquen
el mismo gen o un gen similar y/o ADNs genómicos homólogos o
fragmentos de los mismos. El proceso de selección de la biblioteca
de ADNc o de la biblioteca genómica con la sonda seleccionada puede
ser llevado a cabo utilizando procedimientos estándar como los
descritos en los Capítulos 10-12 de Sambrook y
col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
Si el ADN que codifica un enzima de la presente
invención es aislado utilizando secuencias oligonucleotídicas
cuidadosamente seleccionadas para someter a selección bibliotecas
de ADNc de varios tejidos, las secuencias oligonucleotídicas
seleccionadas como sondas deben ser suficientes en longitud y
suficientemente no ambiguas para que se minimicen los falsos
positivos. La(s) secuencia(s) de nucleótidos
real(es) es(son) diseñada(s) normalmente sobre
la base de regiones que tienen la mínima redundancia de codones.
Los oligonucleótidos pueden ser degenerados en una o más
posiciones. La utilización de oligonucleótidos degenerados es de
particular importancia cuando se somete a selección una biblioteca
de una especie en la que no se conoce el tratamiento preferencial
de codones.
El oligonucleótido debe estar marcado de tal
manera que pueda ser detectado después de la hibridación al ADN de
la biblioteca que está siendo sometida a selección. El método de
marcaje preferido es la utilización de ATP (por ejemplo,
\gamma^{32}P) y polinucleótido quinasa para radiomarcar el extremo
5' del oligonucleótido. Sin embargo, pueden utilizarse otros
métodos para marcar el oligonucleótido incluyendo, pero sin
limitarse a, biotinilación o marcaje enzimático.
Los ADNcs que codifican las nuevas lectinas de
tipo C pueden ser también identificados y aislados mediante otras
técnicas conocidas de la tecnología de ADN recombinante, tal como
mediante clonaje de expresión directa o mediante la utilización de
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) según está descrito en
la Patente de EE.UU. Nº 4.683.195, publicada el 28 de Julio de 1987,
en la sección 14 de Sambrook y col., supra, o en el Capítulo
15 de Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col.
eds., Greene Publishing Associates and
Wiley-Interscience 1991. La utilización de la
técnica de PCR para amplificar una biblioteca de ADNc cardíaco
humano y cardíaco de ratón está descrita en los ejemplos.
Una vez que el ADNc que codifica una nueva
lectina endocítica de tipo C nativa de una especie ha sido aislado,
pueden obtenerse también ADNcs de otras especies mediante
hibridación cruzada de especies. De acuerdo con este planteamiento,
bibliotecas de ADNc o genómicas humanas o de otros mamíferos son
sondadas con secuencias oligonucleotídicas marcadas seleccionadas a
partir de secuencias de lectinas de tipo C conocidas (tales como
secuencias murinas o humanas) de acuerdo con criterios conocidos,
entre los cuales está el que la secuencia debe ser suficiente en
longitud y suficientemente no ambigua para que se minimicen los
falsos positivos. Típicamente, un oligonucleótido marcado con
^{32}P que tenga de 30 a 50 bases aproximadamente es suficiente,
particularmente si el oligonucleótido contiene uno o más codones
para metionina o triptófano. El ácido nucleico aislado será ADN que
es identificado y separado del ácido nucleico contaminante que
codifica otros polipéptidos de la fuente del ácido nucleico. La
hibridación se realiza preferiblemente bajo "condiciones
rigurosas", según se definieron aquí anteriormente.
Una vez que se conoce la secuencia, puede
obtenerse también el gen que codifica una lectina de tipo C
particular mediante síntesis química, siguiendo uno de los métodos
descritos en Engels y Uhlmann, Agnew. Chem. Int. Ed. Engl.,
28, 716 (1989). Estos métodos incluyen los métodos de los
triésteres, fosfitos, fosforamiditas y
H-fosfonatos, PCR y otros métodos con autocebadores,
y síntesis de oligonucleótidos en soportes sólidos.
Una vez que está disponible el ácido nucleico que
codifica una nueva lectina de tipo C, es ligado generalmente en un
vector de expresión replicable para clonaje posterior
(amplificación del ADN) o para expresión.
Los vectores de expresión y clonaje son bien
conocidos en la técnica y contienen una secuencia de ácido nucleico
que permite al vector replicarse en una o más células huésped
seleccionadas. La selección del vector apropiado dependerá de (1)
si va a ser utilizado para amplificación de ADN o para expresión de
ADN, (2) del tamaño del ADN que va a ser insertado en el vector y
(3) de la célula huésped que va a ser transformada con el vector.
Cada vector contiene varios componentes dependiendo de su función
(amplificación de ADN o expresión de ADN) y de la célula huésped
para la que es compatible. Los componentes del vector incluyen
generalmente, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una
secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes
marcadores, un elemento intensificador, un promotor y una secuencia
de terminación de la transcripción. La construcción de vectores
adecuados que contienen uno o más de los componentes anteriormente
enumerados, la secuencia codificadora y las secuencias control
deseadas, utiliza técnicas estándar de ligadura. Plásmidos o
fragmentos de ADN aislados son cortados, adaptados y vueltos a ligar
en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos. Para el
análisis de confirmación de las secuencias correctas en los
plásmidos construidos, las mezclas de ligadura son utilizadas
comúnmente para transformar células de E. coli, por ejemplo
E. coli K12 cepa 294 (ATCC 31.446) y los transformantes con
éxito son seleccionados mediante resistencia a ampicilina o
tetraciclina cuando es apropiado. Los plásmidos procedentes de los
transformantes son preparados, analizados mediante digestión con
endonucleasas de restricción y/o secuenciados por el método de
Messing y col., Nucleic Acids Res., 9, 309 (1981) o
por el método de Maxam y col., Methods in Enzymology,
65, 499 (1980).
Los polipéptidos de la presente invención pueden
ser expresados en una variedad de células huésped procarióticas y
eucarióticas. Los procariotas adecuados incluyen organismos gram
negativos o gram positivos, por ejemplo E. coli o bacilos.
Un huésped de clonaje preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446)
aunque son adecuados otros procariotas gram negativos o gram
positivos tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC
31.537), E. coli W3110 (ATCC 27.325), especies de
Pseudomonas o Serratia marcesans.
Además de los procariotas, microbios eucarióticos
tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes adecuados
para los vectores de la presente. Saccharomyces cerevisiae,
o levadura común de panadero, es el más comúnmente utilizado entre
los microorganismos huésped eucarióticos inferiores. Sin embargo,
están comúnmente disponibles otros géneros, especies y cepas varios
y son útiles en la presente, tales como S. pombe [Beach y
Nurse, Nature, 290, 140 (1981)], Kluyveromyces lactis
[Louvencourt y col., J. Bacteriol., 737 (1983],
yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070),
Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa
[Case y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,
5259-5263 (1979)] y huéspedes Aspergillus
tales como A. nidulans [Ballance y col., Biochem. Biophys.
Res. Commun., 112, 284-289 (1983);
Tilburn y col., Gene, 26, 205-221
(1983); Yelton y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
81, 1470-1474 (1984)] y A. niger
[Kelly y Hynes, EMBO J., 4, 475-479
(1985)].
Las células huésped adecuadas pueden derivar
también de organismos multicelulares. Tales células huésped son
capaces de realizar las actividades de procesamiento de complejos y
glicosilación. En principio, cualquier cultivo de células
eucarióticas superiores es factible, ya sea un cultivo de
vertebrados o invertebrados, aunque se prefieren las células de
mamíferos tales como humanos. Ejemplos de células de invertebrados
incluyen células vegetales y de insectos. Se han identificado
numerosas cepas y variantes de baculovirus y células huésped de
insectos permisivos correspondientes procedentes de huéspedes tales
como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti
(mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila
melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Ver, por
ejemplo, Luckow y col., Bio/Technology, 6,
47-55 (1988); Miller y col., en Genetic
Engineering, Setlow, J.K. y col., eds., Vol. 8 (Plenum
Publishing, 1986), pp. 277-279 y Maeda y col.,
Nature, 315, 592-594 (1985). Una
variedad de tales cepas víricas está disponible públicamente, por
ejemplo la variante L-1 de Autographa
californica NPV, y tales virus pueden ser utilizados como el
virus de la presente de acuerdo con la presente invención,
particularmente para la transfección de células de Spodoptera
frugiperda.
Pueden utilizarse como huéspedes cultivos de
células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y
tabaco. Típicamente, las células vegetales son transfectadas
mediante incubación con ciertas cepas de la bacteria
Agrobacterium tumefaciens, que ha sido manipulada previamente
para que contenga el ADN de la lectina de tipo C. Durante la
incubación del cultivo de células vegetales con A.
tumefaciens, el ADN que codifica una lectina de tipo C es
transferido a la célula vegetal huésped de tal manera que la misma
resulta transfectada y expresará, bajo las condiciones apropiadas,
el ADN de la lectina de tipo C. Además, están disponibles
secuencias señal y reguladoras compatibles con células vegetales,
tales como el promotor de la nopalina sintasa y secuencias señal de
poliadenilación. Depicker y col., J. Mol. Appl. Gen.,
1, 561 (1982). Además, segmentos de ADN aislados de la región
corriente arriba del gen 780 del ADN-T son capaces
de activar o incrementar los niveles de transcripción de genes
expresables en plantas en el tejido vegetal que contiene el ADN
recombinante. Ver EP 321.196, publicada el 21 de Junio de 1989.
Sin embargo, el interés ha sido mayor en células
de vertebrados, y la propagación de las células de vertebrados en
cultivo (cultivo de tejidos) es bien conocida per se. Ver
Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, editores
(1973). Ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero útiles son
la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40
(COS-7, ATCC CRL 1651); la línea celular de riñón
embrionario humano [293 o células 293 subclonadas para crecimiento
en un cultivo en suspensión, Graham y col., J. Gen. Virol.,
36, 59 (1977)]; células de riñón de cría de hámster (BHK,
ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR [CHO, Urlaub
y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216
(1980)]; células de Sertolli de ratón [TM4, Mather, Biol.
Reprod., 23, 243-251 (1980)]; células de
riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón del mono verde
africano (VERO-76, ATCC CRL-1587);
células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de
riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de la rata
búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138,
ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor
mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL 51); células TR1 [Mather y
col., Annals N. Y. Acad. Sci., 383, 44068 (1982)];
células MRC 5; células FS4 y una línea celular de hepatoma humano
(Hep G2). Las células huésped preferidas son las células 293 de
riñón embrionario humano y las células de ovario de hámster
chino.
Son particularmente útiles en la práctica de esta
invención vectores de expresión que proporcionan la expresión
transitoria en células de mamífero del ADN que codifica una nueva
lectina de tipo C de la presente. En general, la expresión
transitoria implica la utilización de un vector de expresión que es
capaz de replicarse eficazmente en una célula huésped, de tal manera
que la célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión
y, a su vez, sintetiza niveles elevados de un polipéptido deseado
codificado por el vector de expresión. Los sistemas transitorios,
que comprenden un vector de expresión y una célula huésped
adecuados, permiten la identificación positiva conveniente de los
polipéptidos codificados por clones de ADNs, así como la selección
rápida de tales polipéptidos por las propiedades biológicas o
fisiológicas deseadas. De este modo, los sistemas de expresión
transitoria son particularmente útiles en la invención para
identificar análogos y variantes de una lectina de tipo C nativa de
la presente.
Otros métodos, vectores y células huéspedes
adecuados para la adaptación a la síntesis de las lectinas de tipo
C en un cultivo de células de vertebrados recombinantes están
descritos en Getting y col., Nature, 293,
620-625 (1981); Mantel y col., Nature,
281, 40-46 (1979); Levinson y col., EP
117.060 y EP 117.058. Plásmidos particularmente útiles para la
expresión en cultivo de células de mamífero de los polipéptidos
lectinas de tipo C son pRK5 (EP 307.247) o pSV16B (Publicación de
PCT Nº WO 91/08291).
Otros vectores de clonaje y expresión adecuados
para la expresión de las lectinas de tipo C de la presente
invención en una variedad de células huésped están descritos en,
por ejemplo, EP 457.758 publicada el 27 de Noviembre de 1991. Una
gran variedad de vectores de expresión está actualmente disponible
comercialmente. Un vector de expresión de levaduras comercial
ejemplar es pPIC.9 (Invitrogen), mientras que un vector de
expresión disponible comercialmente adecuado para la transformación
de células de E. coli es PET15b (Novagen).
Las células procarióticas utilizadas para
producir las lectinas de tipo C de esta invención son cultivadas en
un medio adecuado según está descrito de manera general en Sambrook
y col., supra.
Las células de mamífero pueden ser cultivadas en
una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales
como F10 de Ham (Sigma), Medio Mínimo Esencial (MEM, Sigma),
RPMI-1640 (Sigma) y Medio de Eagle Modificado de
Dulbecco (DMEM, Sigma) son adecuados para el cultivo de las células
huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y
Wallace, Meth. Enzymol., 58, 44 (1979); Barnes y
Sato, Anal. Biochem., 102, 255 (1980), US 4.767.704;
4.657.866; 4.927.762 ó 4.560.655; WO 90/03430; WO 87/00195 o Patente
de EE.UU. Re. 30.985 puede ser utilizado como medio de cultivo para
las células huésped. Cualquiera de estos medios puede ser
suplementado según sea necesario con hormonas y/u otros factores de
crecimiento (tales como insulina, transferrina o el factor de
crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio,
calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES),
nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales
como el fármaco Gentamicina™), elementos traza (definidos como
compuestos inorgánicos presentes normalmente a concentraciones
finales en el rango micromolar) y glucosa o una fuente de energía
equivalente. Puede incluirse también cualquier otro suplemento
necesario a las concentraciones apropiadas que serán conocidas por
las personas expertas en la técnica. Las condiciones de cultivo,
tales como la temperatura, el pH y similares, son aquéllas
previamente utilizadas idóneamente con la célula huésped
seleccionada para el clonaje o la expresión, según sea el caso, y
serán obvias para el técnico común.
Las células huésped referidas en esta descripción
incluyen células en un cultivo celular in vitro así como
células que están en un animal o planta huésped.
Se considera además que las lectinas de tipo C de
esta invención pueden ser producidas mediante recombinación
homóloga, o con métodos de producción recombinantes que utilizan
elementos control introducidos en las células que ya contienen el
ADN que codifica la lectina de tipo C particular.
La amplificación y/o la expresión del gen pueden
ser medidas en una muestra directamente, por ejemplo, mediante
transferencia Southern convencional, transferencia Northern para
cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 77, 5201-5205 (1980)],
transferencia de manchas (análisis de ADN) o hibridación in
situ, utilizando una sonda marcada apropiadamente, sobre la
base de las secuencias proporcionadas en la presente. Pueden
emplearse diferentes marcas, muy comúnmente radioisótopos,
particularmente ^{32}P. Sin embargo, pueden emplearse también
otras técnicas tales como la utilización de nucleótidos modificados
con biotina para su introducción en un polinucleótido. La biotina
sirve posteriormente como un lugar para la unión de avidina o de
anticuerpos, que pueden estar marcados con una amplia variedad de
marcas, tales como radionúclidos, marcas fluorescentes, enzimas o
similares. Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que
puedan reconocer dúplices específicos, incluyendo dúplices de ADN,
dúplices de ARN y dúplices híbridos ADN-ARN o
dúplices ADN-proteína. Los anticuerpos, a su vez,
pueden estar marcados y el ensayo puede ser llevado a cabo cuando
el dúplice está unido a la superficie, de manera que después de la
formación del dúplice en la superficie puede detectarse la
presencia de anticuerpo unido al dúplice.
La expresión génica, alternativamente, puede ser
medida mediante métodos inmunológicos tales como la tinción
inmunohistoquímica de secciones tisulares y el ensayo del cultivo
celular o de fluidos corporales para cuantificar directamente la
expresión del producto génico. Una técnica de tinción
particularmente sensible adecuada para ser utilizada en la presente
invención está descrita por Hse y col., Am. J. Clin. Pharm.,
75, 734-738 (1980).
Los anticuerpos útiles para la tinción
inmunohistoquímica y/o para el ensayo de fluidos de muestra pueden
ser monoclonales o policlonales y pueden ser preparados en
cualquier animal. Convenientemente, los anticuerpos pueden ser
preparados contra un polipéptido lectina de tipo C nativa o contra
un péptido sintético basado en la secuencia de ADN aquí
proporcionada según se describe adicionalmente en la presente más
adelante.
Las variantes de la secuencia de aminoácidos de
las lectinas de tipo C nativas son preparadas mediante métodos
conocidos en la técnica introduciendo cambios de nucleótidos
apropiados en el ADN de una lectina de tipo C nativa, o mediante la
síntesis in vitro del polipéptido deseado. Existen dos
variables principales en la construcción de variantes de la
secuencia de aminoácidos: la posición del sitio de mutación y la
naturaleza de la mutación. Con la excepción de los alelos que se
presentan de manera natural, los cuales no requieren la manipulación
de la secuencia de ADN que codifica la lectina de tipo C nativa,
las variantes de la secuencia de aminoácidos de las lectinas de
tipo C son construidas preferiblemente mutando el ADN, con el fin
de conseguir una variante de un alelo o de una secuencia de
aminoácidos que no existe en la naturaleza.
Un grupo de mutaciones será creado en el dominio
fibronectina de tipo II o en uno o más de los dominios lectina de
tipo C (preferiblemente en los dominios 1-3
similares a lectina) de una nueva lectina de tipo C nativa de la
presente invención. Se cree que estos dominios son funcionalmente
importantes, por tanto, se espera que alteraciones tales como
sustituciones, inserciones y/o deleciones no conservadoras en estas
regiones tengan como resultado cambios genuinos de las propiedades
de las moléculas receptoras nativas. Se cree también que el residuo
de tirosina en posición 1451 de las nuevas lectinas de tipo C
murinas y humanas y los aminoácidos circundantes tienen una
significación funcional, ya que esta tirosina está conservada en
las lectinas de tipo C y se ha encontrado previamente que es
importante para la endocitosis del receptor de fosfolipasa A2. Por
consiguiente, se cree también que alteraciones de aminoácidos en
esta región tendrán como resultado variantes con propiedades
significativamente diferentes de las de los polipéptidos nativos
correspondientes. Sustituciones no conservadoras dentro de estos
dominios funcionalmente importantes pueden tener como resultado
variantes que pierden la capacidad de reconocimiento y unión a
carbohidratos de sus equivalentes nativos, o variantes que tienen
propiedades de reconocimiento de carbohidratos incrementadas o una
selectividad aumentada en comparación con las proteínas nativas
correspondientes.
Alternativamente, o además de, pueden producirse
alteraciones de aminoácidos en lugares que difieran en las nuevas
lectinas de tipo C de diferentes especies, o en regiones altamente
conservadas, dependiendo del objetivo a conseguir. Los sitios en
tales posiciones serán modificados típicamente en serie, por ejemplo
(1) sustituyendo primeramente con elecciones conservadoras y luego
con selecciones más radicales dependiendo de los resultados
conseguidos, (2) eliminando el residuo o los residuos diana o (3)
insertando residuos de la misma clase o de una clase diferente
adyacentes al sitio localizado, o combinaciones de las opciones
1-3. Una técnica útil es denominada "barrido de
alanina" (Cunningham y Wells, Science, 244,
1081-1085 [1989]).
En otro grupo todavía más de las lectinas de tipo
C variantes de la presente invención, pueden eliminarse o
inactivarse uno o más de los dominios funcionalmente menos
significativos. Por ejemplo, la eliminación o la inactivación del
dominio transmembranal produce variantes solubles de las proteínas
nativas. Alternativamente, o además de, puede eliminarse, truncarse
o alterarse de otro modo el dominio citoplásmico.
Los aminoácidos que existen en la naturaleza son
divididos en grupos sobre la base de las propiedades comunes de la
cadena lateral:
(1) hidrofóbicos: nerleucina, met, ala, val, leu,
ile;
(2) hidrofóbicos neutros: cys, ser, thr;
(3) ácidos: asp, glu;
(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;
(5) residuos que afectan a la orientación de la
cadena: gly, pro; y
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones conservadoras implican el
cambio de un miembro de un grupo por otro miembro del mismo grupo,
mientras que las sustituciones no conservadoras supondrán el cambio
de un miembro de una de estas clases por otro de otra clase. Los
cambios sustanciales de la función o de la identidad inmunológica se
realizan seleccionando sustituciones que sean menos conservadoras,
esto es que difieran más significativamente en su efecto sobre el
mantenimiento (a) de la estructura del esqueleto polipeptídico en
el área de sustitución, por ejemplo como una conformación de lámina
o helicoidal, (b) de la carga o la hidrofobicidad de la molécula en
el sitio diana o (c) del volumen de la cadena lateral. Las
sustituciones que se espera en general que produzcan los mayores
cambios en las propiedades de las nuevas lectinas de tipo C nativas
de la presente invención serán aquéllas en las cuales (a) un
residuo hidrofílico, por ejemplo serilo o treonilo, es sustituido
por un residuo hidrofóbico, por ejemplo leucilo, isoleucilo,
fenilalanilo, valilo o alanilo (o viceversa); (b) una cisteína o
una prolina es sustituida por cualquier otro residuo (o viceversa);
(c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por
ejemplo lisilo, arginilo o histidilo es sustituido por un residuo
electronegativo, por ejemplo glutamilo o aspartilo (o viceversa); o
(d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo
fenilalanila, es sustituido por uno que no tenga cadena lateral,
por ejemplo glicina
(o viceversa).
(o viceversa).
Las variantes por sustitución de las nuevas
lectinas de tipo C de la presente invención incluyen también
variantes en las que uno o más de los dominios anteriormente
identificados dentro de la estructura de la nueva lectina de tipo C
son sustituidos por dominios de otras proteínas funcionalmente
homólogos (teniendo al menos un 40%-50% de homología
aproximadamente) mediante métodos de rutina. Por ejemplo, el
dominio rico en cisteína, el dominio fibronectina de tipo II o uno
o más de los tres primeros dominios de reconocimiento de
carbohidratos (CDR) de una nueva lectina de tipo C de la presente
invención pueden ser sustituidos por un dominio correspondiente de
un receptor de manosa de macrófagos, de un receptor de fosfolipasa
A2 o de un receptor DEC 205.
Las deleciones de secuencias de aminoácidos
varían generalmente de 1 a 30 residuos aproximadamente, más
preferiblemente de 1 a 10 residuos aproximadamente y, típicamente,
son contiguas. Típicamente, se eliminan los dominios transmembranal
y citoplásmico, o solamente el dominio citoplásmico. Sin embargo,
es adecuada una deleción desde el extremo C hasta cualquier otro
extremo N adecuado de la región transmembranal que conserve la
actividad biológica o la reactividad inmunológica cruzada de una
lectina de tipo C nativa.
Una clase preferida de variantes por sustitución
y/o deleción de la presente invención son aquéllas que implican una
región transmembranal de una nueva molécula de lectina de tipo C.
Las regiones transmembranales son dominios muy hidrofóbicos o
lipofílicos que tienen el tamaño adecuado para cruzar la bicapa
lipídica de la membrana celular. Se cree que anclan la lectina a la
membrana celular y permiten la formación de complejos homo o
heteropoliméricos. La inactivación del dominio transmembranal,
típicamente por deleción o sustitución de residuos de hidroxilación
del dominio transmembranal, facilitará la recuperación y la
formulación reduciendo su afinidad por los lípidos celulares o de
la membrana y mejorando su solubilidad acuosa. Si se eliminan los
dominios transmembranal y citoplásmico se evita la introducción de
epítopos potencialmente inmunogénicos, ya sea por la exposición de
polipéptidos de otro modo intracelulares que podrían ser
reconocidos por el organismo como extraños o por la inserción de
polipéptidos heterólogos que son potencialmente inmunogénicos. La
inactivación de la función de unión a la membrana se lleva a cabo
por la deleción de residuos suficientes para producir un perfil de
hidropatía sustancialmente hidrofílico en este lugar o por la
sustitución con residuos heterólogos que consigan el mismo
resultado.
Una ventaja principal de las variantes de las
lectinas de tipo C de la presente invención con el dominio
transmembranal inactivado es que pueden ser secretadas al medio de
cultivo de los huéspedes recombinantes. Estas variantes son solubles
en fluidos corporales tales como la sangre y no tienen una afinidad
apreciable por los lípidos de la membrana celular, simplificando de
este modo considerablemente su recuperación a partir del cultivo de
células recombinantes. Como una propuesta general, tales variantes
solubles no tendrán un dominio transmembranal funcional y
preferiblemente no tendrán un dominio citoplásmico funcional. Por
ejemplo, el dominio transmembranal puede ser sustituido por
cualquier secuencia de aminoácidos, por ejemplo una secuencia
aleatoria o predeterminada de 5 a 50 residuos aproximadamente de
serina, treonina, lisina, arginina, glutamina, ácido aspártico y
residuos hidrofílicos similares, que en conjunto presenten un
perfil de hidropatía hidrofílico. Igual que las variantes solubles
por deleción (truncadas), estas variantes son secretadas al medio de
cultivo de los huéspedes recombinantes.
Las inserciones de aminoácidos incluyen fusiones
amino y/o carboxilo terminales que varían en longitud desde un
residuo hasta polipéptidos conteniendo cien o más residuos, así
como inserciones intrasecuencia de un sólo residuo o de múltiples
residuos de aminoácidos. Las inserciones intrasecuencia (esto es,
inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos de la nueva
lectina de tipo C) pueden variar generalmente de 1 a 10 residuos
aproximadamente, más preferiblemente de 1 a 5 residuos, muy
preferiblemente de 1 a 3 residuos. Ejemplos de inserciones
terminales incluyen las lectinas de tipo C con un residuo de
metionilo N-terminal, un artefacto de su expresión
directa en un cultivo de células recombinantes bacterianas, y la
fusión de una secuencia señal N-terminal heteróloga
al extremo N de la molécula de lectina de tipo C para facilitar la
secreción de la lectina de tipo C madura por las células huésped
recombinantes. Tales secuencias señal serán obtenidas generalmente
de, y por tanto serán homólogas a, la especie de célula huésped
deseada. Las secuencias adecuadas incluyen STII o Ipp para E.
coli, factor alfa para levaduras y señales víricas tales como
gD de herpes para células de mamífero.
Otras variantes por inserción de las moléculas de
lectina de tipo C nativas incluyen la fusión del extremo N o del
extremo C de la molécula de lectina de tipo C a polipéptidos
inmunogénicos, por ejemplo polipéptidos bacterianos tales como la
beta-lactamasa o un enzima codificado por el locus
trp de E. coli, o una proteína de levaduras, y fusiones
C-terminales con proteínas que tengan una semivida
larga tales como regiones de inmunoglobulinas (preferiblemente
regiones constantes de inmunoglobulinas), albúmina o ferritina,
según está descrito en WO 89/02922 publicada el 6 de Abril de
1989.
Variantes por inserción adicionales son derivados
inmunológicamente activos de las nuevas lectinas de tipo C, que
comprenden la lectina y un polipéptido conteniendo un epítopo de un
polipéptido foráneo inmunológicamente competente, esto es un
polipéptido que sea capaz de producir una respuesta inmune en el
animal al cual se va a administrar la fusión, o que sea capaz de
unirse a un anticuerpo producido contra un polipéptido foráneo.
Ejemplos típicos de tales polipéptidos inmunológicamente
competentes son alergenos, epítopos autoinmunes u otros inmunógenos
o antígenos potentes reconocidos por anticuerpos preexistentes en
el receptor de la fusión, incluyendo polipéptidos bacterianos tales
como trpLE, \beta-galactosidasa, polipéptidos
víricos tales como la proteína gD de herpes y similares.
Las fusiones inmunogénicas son producidas
mediante entrecruzamiento in vitro o mediante un cultivo de
células recombinantes transformadas con ADN que codifica un
polipéptido inmunogénico. Es preferible que la fusión inmunogénica
sea una en la cual la secuencia inmunogénica esté unida a, o
insertada en, la nueva molécula de lectina de tipo C o en un
fragmento de la misma mediante enlace(s)
peptídico(s). Estos productos constan, por tanto, de una
cadena polipeptídica lineal conteniendo el epítopo lectina de tipo
C y al menos un epítopo foráneo a la lectina de tipo C. Se
comprenderá que está dentro del ámbito de la invención introducir
los epítopos en cualquier lugar dentro de una molécula de lectina
de tipo C de la presente invención o de un fragmento de la misma.
Estas inserciones inmunogénicas son particularmente útiles cuando se
formulan en un vehículo farmacológicamente aceptable y se
administran a un sujeto con el fin de producir anticuerpos contra
la molécula de lectina de tipo C, anticuerpos que a su vez son
útiles como agentes de diagnóstico, en la tipificación de tejidos,
o en la purificación de las nuevas lectinas de tipo C mediante
técnicas de inmunoafinidad conocidas per se.
Alternativamente, en la purificación de las lectinas de tipo C de
la presente invención, se utilizan parejas de unión para el
polipéptido foráneo fusionado, por ejemplo anticuerpos, receptores
o ligandos, con el fin de adsorber la fusión a partir de mezclas
impuras, después de lo cual la fusión es eluida y, si se desea, la
nueva lectina de tipo C es recuperada de la fusión mediante, por
ejemplo, corte
enzimático.
enzimático.
Como es a menudo difícil predecir por adelantado
las características de una lectina de tipo C variante, se
comprenderá que puede ser necesario algún procedimiento de
selección con el fin de seleccionar la variante óptima.
Después de identificar la(s)
mutación(es) deseada(s), el gen que codifica una
variante de lectina de tipo C puede ser obtenido mediante, por
ejemplo, síntesis química según se describió en la presente
anteriormente. Más preferiblemente, se prepara ADN que codifique
una secuencia de aminoácidos de la lectina de tipo C variante
mediante mutagénesis dirigida a un sitio del ADN que codifica una
variante anteriormente preparada o una versión no variante de la
lectina de tipo C. La mutagénesis dirigida a un sitio (específica
de un sitio) permite la producción de variantes de lectinas de tipo
C mediante la utilización de secuencias oligonucleotídicas
específicas que codifican la secuencia de ADN de la mutación
deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes,
con el fin de proporcionar una secuencia cebadora de tamaño y
complejidad de secuencia suficientes para formar un dúplice estable
en ambos lados de la unión de la deleción que está siendo
recorrida. Típicamente, se prefiere un cebador de 20 a 25
nucleótidos de longitud aproximadamente, con 5 a 10 residuos
aproximadamente en ambos lados de la unión de la secuencia que está
siendo alterada. En general, las técnicas de mutagénesis
específicas de un sitio son bien conocidas en el oficio, según está
ejemplificado por publicaciones tales como Edelman y col.,
DNA, 2, 183 (1983). Como se apreciará, la técnica de
mutagénesis específica de un sitio emplea típicamente un vector fago
que existe en forma de hebra sencilla y en forma de doble hebra.
Los vectores típicos útiles para la mutagénesis dirigida a un sitio
incluyen vectores tales como el fago M13, por ejemplo, según está
descrito por Messing y col., Third Cleveland Symposium on
Macromolecules and Recombinant DNA, A. Walton, ed., Elsevier,
Amsterdam (1981). Éste y otros fagos vectores están disponibles
comercialmente y su utilización es bien conocida por las personas
expertas en la técnica. Un procedimiento versátil y eficaz para la
construcción de mutaciones específicas de un sitio dirigidas por
oligodesoxirribonucleótidos en fragmentos de ADN utilizando
vectores derivados de M13 fue publicado por Zoller, M.J. y Smith,
M., Nucleic Acids Res., 10, 6487-6500
[1982]). También pueden emplearse vectores plasmídicos que
contienen un origen de replicación de un fago de hebra sencilla
para obtener ADN de hebra sencilla (Veira y col., Meth.
Enzymol., 153, 3 [1987]). Alternativamente, se
introducen sustituciones de nucleótidos sintetizando el fragmento
de ADN apropiado in vitro y amplificando el mismo por
procedimientos de PCR conocidos en la
técnica.
técnica.
La técnica de PCR puede ser utilizada también
para crear variantes de la secuencia de aminoácidos de una nueva
lectina de tipo C. En un ejemplo específico de mutagénesis por PCR,
el ADN plasmídico molde (1 \mug) es linealizado por digestión con
una endonucleasa de restricción que tenga un único sitio de
reconocimiento en el ADN plasmídico fuera de la región que va a ser
amplificada. De este material, 100 ng son añadidos a una mezcla de
PCR conteniendo tampón de PCR, que contiene los cuatro
desoxinucleótidos trifosfato y que está incluida en los kits
GeneAmp® (obtenidos de Perkin-Elmer Cetus, Norwalk,
CT y Emeryville, CA) y 25 pmoles de cada cebador oligonucleotídico
en un volumen final de 50 \mul. La mezcla de reacción es cubierta
con 35 \mul de aceite mineral. La reacción es desnaturalizada
durante 5 minutos a 100ºC, colocada brevemente sobre hielo y
posteriormente se añade por debajo de la capa de aceite mineral 1
\mul de ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq)
(5 unidades/l) (adquirida a Perkin-Elmer Cetus,
Norwalk, CT y Emeryville, CA). La mezcla de reacción es insertada
posteriormente en un Ciclador Térmico de ADN (adquirido a
Perkin-Elmer Cetus) programado según sigue:
- 2 minutos a 55ºC,
- 30 segundos a 72ºC, posteriormente 19 ciclos de las características siguientes:
- 30 segundos a 94ºC,
- 30 segundos a 55ºC, y
- 30 segundos a 72ºC.
Al final del programa, el vial de reacción es
extraído del ciclador térmico y la fase acuosa es transferida a un
nuevo vial, extraída con fenol/cloroformo (50:50 volumen) y
precipitada con etanol, y el ADN es recuperado mediante
procedimientos estándar. Este material es sometido posteriormente a
tratamientos apropiados para su inserción en un vector.
Otro método para preparar variantes, mutagénesis
por casete, está basado en la técnica descrita por Wells y col.
[Gene, 34, 315 (1985)].
Adicionalmente, el llamado método de presentación
en fagémidos puede ser útil para producir variantes de la secuencia
de aminoácidos de las lectinas de tipo C nativas o variantes o de
sus fragmentos. Este método implica (a) la construcción de un
vector de expresión replicable que contiene un primer gen que
codifica un receptor que va a ser mutado, un segundo gen que
codifica al menos una porción de una proteína de revestimiento de
un fago natural o de tipo salvaje, donde el primer y el segundo gen
son heterólogos, y un elemento regulador de la transcripción unido
operativamente al primer y al segundo gen, formando de este modo
una fusión de genes que codifica una proteína de fusión; (b) la
mutación del vector en una o más posiciones seleccionadas dentro
del primer gen, formando de este modo una familia de plásmidos
relacionados; (c) la transformación de células huésped adecuadas
con los plásmidos; (d) la infección de las células huésped
transformadas con un fago cooperador que tiene un gen que codifica
la proteína de revestimiento del fago; (e) el cultivo de las
células huésped infectadas transformadas bajo condiciones adecuadas
para la formación de partículas de fagémido recombinantes que
contienen al menos una porción del plásmido y que son capaces de
transformar el huésped, estando las condiciones ajustadas de tal
manera que no más de una mínima cantidad de partículas de fagémido
presentan más de una copia de la proteína de fusión en la superficie
de la partícula; (f) la puesta en contacto de las partículas del
fagémido con un antígeno adecuado de tal manera que al menos una
porción de las partículas de fagémido se unan al antígeno; y (g) la
separación de las partículas de fagémido que se unen de aquéllas
que no lo hacen. Las etapas (d) a (g) pueden ser repetidas una o
más veces. Preferiblemente, en este método el plásmido está bajo un
estrecho control del elemento regulador de la transcripción, y las
condiciones de cultivo son ajustadas de tal manera que la cantidad o
el número de partículas de fagémido que presentan más de una copia
de la proteína de fusión en la superficie de la partícula es menor
del 1% aproximadamente. También, preferiblemente, la cantidad de
partículas de fagémido que presentan más de una copia de la
proteína de fusión es menor del 10% de la cantidad de partículas de
fagémido que presentan una única copia de la proteína de fusión.
Más preferiblemente, la cantidad es menor del 20%. Típicamente en
este método, el vector de expresión contendrá además una secuencia
señal de secreción fusionada al ADN que codifica cada subunidad del
polipéptido y el elemento regulador de la transcripción será un
sistema de promotores. Los sistemas de promotores preferidos son
seleccionados de los promotores de lac Z, \lambda_{PL},
tac, polimerasa de T7, triptófano y fosfatasa alcalina y
combinaciones de los mismos. Además, el método empleará normalmente
un fago cooperador seleccionado de M13K07, M13R408,
M13-VCS y Phi X 174. El fago cooperador preferido
es M13K07 y la proteína de revestimiento preferida es la proteína
de revestimiento del gen III del Fago M13. El huésped preferido es
E. coli y cepas de E. coli deficientes en
proteasas.
Detalles adicionales de las técnicas precedentes
y técnicas de mutagénesis similares se encuentran en libros de
texto generales tales como, por ejemplo, Sambrook y col.,
supra y Current Protocols in Molecular Biology,
Ausubel y col., eds., supra.
Las variantes por glicosilación están incluidas
dentro del ámbito de la presente invención. Éstas incluyen
variantes que carecen completamente de glicosilación (no
glicosiladas), variantes que tienen al menos un sitio glicosilado
menos que la forma nativa (desglicosiladas), así como variantes en
las que la glicosilación ha sido cambiada. Están incluidas
variantes de secuencias de aminoácidos desglicosiladas y no
glicosiladas, lectinas de tipo C nativas desglicosiladas y no
glicosiladas y otras variantes de glicosilación. Por ejemplo, puede
emplearse mutagénesis por sustitución o deleción para eliminar los
sitios de glicosilación unidos a N o a O en la lectina de tipo C
nativa o variante de la presente invención; por ejemplo el residuo
de asparragina puede ser eliminado o sustituido por otro residuo
básico tal como lisina o histidina. Alternativamente, los residuos
flanqueantes que constituyen el sitio de glicosilación pueden ser
sustituidos o eliminados, aunque los residuos de asparragina
permanezcan inalterados, con el fin de prevenir la glicosilación por
la eliminación del sitio de reconocimiento de glicosilación.
Adicionalmente, pueden producirse lectinas de
tipo C no glicosiladas que tengan los sitios de glicosilación de
una molécula nativa en un cultivo de células procarióticas
recombinantes, ya que los procariotas son incapaces de introducir
glicosilación en los polipéptidos.
Pueden producirse variantes de glicosilación
seleccionando células huésped apropiadas o mediante métodos in
vitro. Las células de levaduras e insectos, por ejemplo,
introducen una glicosilación que varía significativamente de la de
los sistemas de mamífero. De manera similar, células de mamífero
originarias de una especie diferente (por ejemplo, hámster, murina,
porcina, bovina u ovina), o de un tejido diferente (por ejemplo,
pulmón, hígado, linfoide, mesenquimático o epidérmico) de los de la
fuente de la lectina de tipo C son sometidas a selección
rutinariamente por su capacidad para introducir una glicosilación
variante caracterizada por ejemplo por niveles elevados de manosa o
proporciones variables de manosa, fucosa, ácido siálico y otros
azúcares encontrados típicamente en las glicoproteínas de mamífero.
El procesamiento in vitro de la lectina de tipo C se lleva a
cabo típicamente mediante hidrólisis enzimática, por ejemplo
digestión con neuraminidasa.
Las modificaciones covalentes de las nuevas
lectinas de tipo C de la presente invención están incluidas en el
ámbito de la misma. Tales modificaciones son introducidas
tradicionalmente haciendo reaccionar residuos de aminoácidos diana
de las lectinas de tipo C con un agente orgánico derivatizante que
sea capaz de reaccionar con residuos laterales o terminales
seleccionados, o aprovechando los mecanismos de las modificaciones
post-traduccionales que funcionan en las células
huésped recombinantes seleccionadas. Los derivados covalentes
resultantes son útiles en programas dirigidos a la identificación de
residuos importantes para la actividad biológica, para
inmunoensayos de la lectina de tipo C o para la preparación de
anticuerpos anti-lectina de tipo C para la
purificación del recombinante mediante inmunoafinidad. Por ejemplo,
la inactivación completa de la actividad biológica de la proteína
después de reacción con ninhidrina sugeriría que al menos un
residuo de arginilo o lisilo es crítico para su actividad, después
de lo cual los residuos individuales que fueron modificados bajo
las condiciones seleccionadas son identificados mediante el
aislamiento de un fragmento peptídico que contiene el residuo de
aminoácido modificado. Tales modificaciones están dentro de la
experiencia habitual en la técnica y son realizadas sin una
experimentación excesiva.
La derivatización con agentes bifuncionales es
útil para preparar agregados intramoleculares de las lectinas de
tipo C con polipéptidos así como para el entrecruzamiento del
polipéptido lectina de tipo C con una matriz o superficie soporte
insoluble en agua para utilización en ensayos o en purificación por
afinidad. Además, un estudio de los entrecruzamientos
intercatenarios proporcionará información directa sobre la
estructura conformacional. Los agentes de entrecruzamiento
utilizados comúnmente incluyen
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida,
imidoésteres homobifuncionales y maleimidas bifuncionales. Agentes
derivatizantes tales como
metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato
proporcionan productos intermedios fotoactivables que son capaces
de formar entrecruzamientos en presencia de luz. Alternativamente,
se emplean para la inmovilización y el entrecruzamiento de
proteínas matrices reactivas insolubles en agua tales como
carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sistemas de
sustratos reactivos descritos en las Patentes de EE.UU. N^{os}
3.959.642; 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537;
4.055.635 y 4.330.440.
Ciertas modificaciones
post-traduccionales son el resultado de la acción de
las células huésped recombinantes sobre el polipéptido expresado.
Los residuos de glutaminilo y asparraginilo son frecuentemente
desamidados post-traduccionalmente para dar los
residuos glutamilo y aspartilo correspondientes. Alternativamente,
estos residuos son desamidados bajo condiciones suavemente ácidas.
Todas las formas de estos residuos entran dentro del ámbito de esta
invención.
Otras modificaciones
post-traduccionales incluyen la hidroxilación de
prolina y lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de los
residuos de serilo, treonilo o tirosilo, la metilación de los
grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de
lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure
and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San
Francisco, pp 79-86 (1983)].
Derivados adicionales de las lectinas de tipo C
de la presente son las denominadas "inmunoadhesinas", que son
moléculas quiméricas similares a anticuerpos que combinan
el(los) dominio(s) funcional(es) de una
proteína de unión (normalmente un receptor, una molécula de
adhesión celular o un ligando) con la secuencia de una
inmunoglobulina. El ejemplo más común de este tipo de proteína de
fusión combina las regiones bisagra y Fc de una inmunoglobulina (Ig)
con dominios de un receptor de la superficie celular que reconoce
un ligando específico. Este tipo de molécula es denomina
"inmunoadhesina" porque combina las funciones "inmune" y
de "adhesión"; otros nombres frecuentemente utilizados son
"quimera de Ig", "proteína de fusión de Ig" o "proteína
de fusión de Fc", o
"receptor-globulina".
Hasta la fecha, se han descrito en la técnica más
de cincuenta inmunoadhesinas. Las inmunoadhesinas descritas en la
literatura incluyen, por ejemplo, fusiones del receptor de células
T (Gascoigne y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,
2936-2940 [1987]); de CD4 (Capon y col.,
Nature, 337, 525-531 [1989];
Traunecker y col., Nature, 339, 68-70
[1989]; Zettmeissl y col., DNA Cell Biol. USA, 9,
347-353 [1990]; Byrn y col., Nature,
344, 667-670 [1990]); de selectina L
(receptor de alojamiento) (Watson y col., J. Cell. Biol.,
110, 2221-2229 [1990]; Watson y col.,
Nature, 349, 164-167 [1991]), de
selectina E (Mulligan y col., J. Immunol., 151,
6410-17 [1993]; Jacob y col., Biochemistry,
34, 1210-1217 [1995]); de selectina P
(Mulligan y col., supra; Hollenbaugh y col., Biochemistry,
34, 5678-84 [1995]); de ICAM-1
(Stauton y col., J. Exp. Med., 176,
1471-1476 [1992]; Martin y col., J. Virol.,
67, 3561-68 [1993]; Roep y col.,
Lancet, 343, 1590-93 [1994]); de
ICAM-2 (Damle y col., J. Immunol.,
148, 665-71 [1992]); de
ICAM-3 (Holness y col., J. Biol. Chem.,
270, 877-84 [1995]); de LFA-3
(Kanner y col., J. Immunol., 148,
2-23-29 [1992]); de glicoproteína L1
(Doherty y col., Neuron, 14, 57-66
[1995]); de TNF-R1 (Ashkenazi y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 88, 10535-539 [1991];
Lesslauer y col., Eur. J. Immunol., 21,
2883-86 [1991]; Peppel y col., J. Exp. Med.,
174, 1483-1489 [1991]); de
TNF-R2 (Zack y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 90, 2335-39 [1993]; Wooley y col.,
J. Immunol., 151, 6602-07 [1993]); de
CD44 (Aruffo y col., Cell, 61,
1303-1313 [1990]); de CD28 y B7 (Linsley y col.,
J. Exp. Med., 173 721-730 [1991]); de
CTLA-4 (Lisley y col., J. Exp. Med.,
174, 561-569 [1991]); de CD22 (Stamenkovic y
col., Cell, 66, 1133-1144 [1991]); de
receptores NP (Bennett y col., J. Biol. Chem., 266,
23060-23067 [1991]); del receptor á de IgE (Ridgway
y Gorman, J. Cell. Biol., 115, resumen 1448 [1991]);
del receptor de HGF (Mark, M.R. y col., J. Biol. Chem.,
[1992] enviado); de las cadenas \alpha y \beta de
IFN-\gammaR (Marsters y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 92, 5401-05 [1995]); de
trk-A, -B y -C (Shelton y col., J. Neurosci.,
15, 477-91 [1995]); de IL-2
(Landolfi, J. Immunol., 146, 915-19
[1991]); de IL-10 (Zheng y col., J. Immunol.,
154, 5590-5600 [1995]).
El diseño más sencillo y más claro de una
inmunoadhesina combina la(s) región(es) de unión de
la proteína "adhesina" con las regiones bisagra y Fc de la
cadena pesada de una inmunoglobulina. Normalmente, cuando se
preparan las quimeras lectina-inmunoglobulina de la
presente invención, el ácido nucleico que codifica el polipéptido
lectina de tipo C deseado será fusionado
C-terminalmente al ácido nucleico que codifica el
extremo N de la secuencia del dominio constante de la
inmunoglobulina, sin embargo son también posibles fusiones
N-terminales. Típicamente, en tales fusiones el
polipéptido quimérico codificado conservará al menos funcionalmente
activos los dominios bisagra, CH2 y CH3 de la región constante de
la cadena pesada de la inmunoglobulina. Se realizan también
fusiones en el extremo C de la porción Fc de un dominio constante, o
inmediatamente N-terminales al CH1 de la cadena
pesada o de la región correspondiente de la cadena ligera. El sitio
exacto en el que se realice la fusión no es crítico; sitios
particulares son bien conocidos y pueden ser seleccionados con el
fin de optimizar la actividad biológica, las características de
secreción o unión de las quimeras
lectina-inmunoglobulina.
En una realización preferida, la secuencia de un
polipéptido lectina madura nativa, o de una forma soluble de la
misma (dominio transmembranal inactivado), es fusionada al extremo
N de la porción C-terminal de un anticuerpo (en
particular el dominio Fc), que contiene las funciones efectoras de
una inmunoglobulina, por ejemplo IgG-1. Es posible
fusionar la región constante completa de la cadena pesada a la
secuencia de la lectina. Sin embargo, más preferiblemente, se
utiliza en la fusión una secuencia que comienza en la región
bisagra justo corriente arriba del sitio de corte de papaína (que
define la Fc de IgG químicamente; residuo 216, tomando como primer
residuo de la región constante de la cadena pesada el 114 [Kobet y
col., supra], o sitios análogos de otras inmunoglobulinas).
En una realización particularmente preferida, la secuencia de la
lectina de tipo C (de longitud completa o soluble) es fusionada a
la región bisagra y a los dominios CH2 y CH3 o CH1, bisagra, CH2 y
CH3 de la cadena pesada de
IgG-1, IgG-2 o IgG-3. El sitio exacto en el que se realiza la fusión no es crítico y el sitio óptimo puede ser determinado mediante experimentación de rutina.
IgG-1, IgG-2 o IgG-3. El sitio exacto en el que se realiza la fusión no es crítico y el sitio óptimo puede ser determinado mediante experimentación de rutina.
En algunas realizaciones, las quimeras
lectina-inmunoglobulina son ensambladas como
multímeros y, particularmente, como homodímeros u homotetrámeros (WO
91/08298). Generalmente, estas inmunoglobulinas ensambladas tendrán
estructuras unitarias conocidas. Una unidad estructural básica de
cuatro cadenas es la forma en la cual existen IgG, IgD e IgE. Una
cuarta unidad se repite en las inmunoglobulinas de mayor peso
molecular; IgM existe generalmente como un pentámero de cuatro
unidades básicas mantenidas juntas mediante enlaces disulfuro. La
globulina IgA, y ocasionalmente la globulina IgG, pueden existir
también en forma multimérica en el suero. En el caso del multímero,
cada cuarta unidad puede ser la misma o diferente.
Varios ejemplos de quimeras
lectina-inmunoglobulina ensambladas dentro del
ámbito de la presente están resumidas esquemáticamente a
continuación:
(a)
AC_{L}-AC_{L};
(b) AC_{H}-[AC_{H},
AC_{L}-AC_{H},
AC_{L}-V_{H}C_{H} o
V_{L}C_{L}-AC_{H}];
(c)
AC_{L}-AC_{H}-[AC_{L}-AC_{H},
AC_{L}-V_{H}C_{H},
V_{L}C_{L}-AC_{H} o
V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H}];
(d)
AC_{L}-V_{H}C_{H}-[AC_{H} o
AC_{L}-V_{H}C_{H} o
V_{L}C_{L}-AC_{H}];
(e)
V_{L}C_{L}-AC_{H}-[AC_{L}-V_{H}C_{H}
o V_{L}C_{L}- AC_{H}];
y
(f)
[A-Y]_{n}-[V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H}]_{2},
donde
- cada A representa secuencias de aminoácidos de los nuevos polipéptidos lectina de tipo C idénticas o diferentes;
- V_{L} es un dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
- V_{H} es un dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
- C_{L} es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
- C_{H} es un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina;
- n es un número entero mayor de 1;
- Y indica el residuo de un agente de entrecruzamiento covalente.
Por cuestiones de brevedad, las estructuras
precedentes muestran solamente características clave; no indican
los dominios de unión (J) ni otros dominios de las
inmunoglobulinas, tampoco se muestran enlaces disulfuro. Sin
embargo, cuando se requieran tales dominios para la actividad de
unión, serán construidos como están presentes en las posiciones
ordinarias que ocupan en las moléculas de inmunoglobulina.
Alternativamente, las secuencias de aminoácidos
de la lectina de tipo C pueden ser insertadas entre secuencias de
la cadena pesada y de la cadena ligera de la inmunoglobulina de tal
manera que se obtiene una inmunoglobulina que contiene una cadena
pesada quimérica. En esta realización, las secuencias polipeptídicas
de la lectina de tipo C son fusionadas al extremo 3' de una cadena
pesada de inmunoglobulina en cada brazo de la inmunoglobulina,
entre la bisagra y el dominio CH2 o bien entre los dominios CH2 y
CH3. Construcciones similares han sido descritas por Hoogenboom,
H.R. y col., Mol. Immunol., 28,
1027-1037 (1991).
Aunque no se requiere en las inmunoadhesinas de
la presente invención la presencia de una cadena ligera de
inmunoglobulina, podría estar presente una cadena ligera de
inmunoglobulina asociada covalentemente a un polipéptido de fusión
lectina de tipo C-cadena pesada de inmunoglobulina,
o bien fusionada directamente al polipéptido lectina de tipo C. En
el primer caso, el ADN que codifica una cadena ligera de
inmunoglobulina es coexpresado típicamente con el ADN que codifica
la proteína de fusión lectina de tipo C-cadena
pesada de inmunoglobulina. Después de la secreción, la cadena
pesada híbrida y la cadena ligera estarán asociadas covalentemente
para proporcionar una estructura similar a la de las
inmunoglobulinas que comprende dos pares cadena
pesada-cadena ligera de inmunoglobulina unidos por
disulfuro. Métodos adecuados para la preparación de tales
estructuras están descritos en, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº
4.816-567 publicada el 28 de Marzo de 1989.
En una realización preferida, las secuencias de
inmunoglobulina utilizadas en la construcción de las
inmunoadhesinas de la presente invención proceden de un dominio
constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina IgG. Para las
inmunoadhesinas humanas, se prefiere la utilización de secuencias de
las inmunoglobulinas IgG-1 e IgG-3
humanas. Una ventaja importante de la utilización de
IgG-1, es que las inmunoadhesinas de
IgG-1 pueden ser purificadas eficazmente sobre
proteína A inmovilizada. En contraste, la purificación de
IgG-3 requiere proteína G, un medio
significativamente menos versátil. Sin embargo, deben considerarse
otras propiedades estructurales y funcionales de las
inmunoglobulinas cuando se elige la pareja de fusión de la Ig para
la construcción de una inmunoadhesina particular. Por ejemplo, la
bisagra de IgG-3 es más larga y más flexible, por
lo que puede acomodar dominios de "adhesina" más grandes que
puede que no se plieguen o que no funcionen correctamente cuando se
fusionan a IgG-1. Aunque las inmunoadhesinas de IgG
son típicamente mono o bivalentes, otros subtipos de Ig como IgA e
IgM pueden dar lugar a estructuras diméricas o pentaméricas,
respectivamente, de la unidad homodimérica de Ig básica. Las
inmunoadhesinas multiméricas son ventajosas en cuanto a que pueden
unirse a sus respectivas dianas con mayor avidez que sus
equivalentes basadas en IgG. Ejemplos descritos de tales
estructuras son CD4-IgM (Traunecker y col.,
supra); ICAM-IgM (Martin y col., J.
Virol., 67, 3561-68 [1993]) y
CD2-IgM (Arulanandam y col., J. Exp. Med.,
177, 1439-50 [1993]).
Para las inmunoadhesinas lectina de tipo
C-Ig, que son diseñadas para aplicación in
vivo, son también importantes las propiedades farmacocinéticas y
las funciones efectoras especificadas por la región Fc. Aunque
IgG-1, IgG-2 e
IgG-4 tienen todas semividas in vivo de 21 días, sus potencias relativas para activar el sistema del complemento son diferentes. IgG-4 no activa el complemento e IgG-2 es significativamente más débil en cuanto a la activación del complemento que IgG-1. Además, a diferencia de IgG-1, IgG-2 no se une a los receptores Fc de las células mononucleares ni de los neutrófilos. Aunque IgG-3 es óptima para la activación del complemento, su semivida in vivo es aproximadamente un tercio de la de los demás isotipos de IgG. Otra consideración importante para las inmunoadhesinas diseñadas para ser utilizadas como productos terapéuticos humanos es el número de variantes alotípicas del isotipo particular. En general, se prefieren los isotipos de IgG con menos alotipos serológicamente definidos. Por ejemplo, IgG-1 tiene solamente cuatro sitios alotípicos serológicamente definidos, dos de los cuales (G1m y 2) están situados en la región Fc; y uno de estos sitios, G1m1, no es inmunogénico. En contraste, hay 12 alotipos serológicamente definidos en IgG-3, todos los cuales están en la región Fc; solamente tres de estos sitios (G3m5, 11 y 21) tienen un alotipo que no es inmunogénico. Por tanto, la inmunogenicidad potencial de una inmunoadhesina \gamma3 es mayor que la de una inmunoadhesina \gamma1.
IgG-4 tienen todas semividas in vivo de 21 días, sus potencias relativas para activar el sistema del complemento son diferentes. IgG-4 no activa el complemento e IgG-2 es significativamente más débil en cuanto a la activación del complemento que IgG-1. Además, a diferencia de IgG-1, IgG-2 no se une a los receptores Fc de las células mononucleares ni de los neutrófilos. Aunque IgG-3 es óptima para la activación del complemento, su semivida in vivo es aproximadamente un tercio de la de los demás isotipos de IgG. Otra consideración importante para las inmunoadhesinas diseñadas para ser utilizadas como productos terapéuticos humanos es el número de variantes alotípicas del isotipo particular. En general, se prefieren los isotipos de IgG con menos alotipos serológicamente definidos. Por ejemplo, IgG-1 tiene solamente cuatro sitios alotípicos serológicamente definidos, dos de los cuales (G1m y 2) están situados en la región Fc; y uno de estos sitios, G1m1, no es inmunogénico. En contraste, hay 12 alotipos serológicamente definidos en IgG-3, todos los cuales están en la región Fc; solamente tres de estos sitios (G3m5, 11 y 21) tienen un alotipo que no es inmunogénico. Por tanto, la inmunogenicidad potencial de una inmunoadhesina \gamma3 es mayor que la de una inmunoadhesina \gamma1.
Las inmunoadhesinas lectina de tipo
C-Ig son construidas muy convenientemente
fusionando la secuencia de ADNc que codifica la porción lectina de
tipo C en marco con una secuencia de ADNc de Ig. Sin embargo, puede
utilizarse también la fusión a fragmentos de Ig genómicos (ver, por
ejemplo, Gascoigne y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
84, 2936-2940 [1987]; Aruffo y col.,
Cell, 61, 1303-1313 [1990]; Stamenkovic y
col., Cell, 66, 1133-1144 [1991]). Este último tipo
de fusión requiere para la expresión la presencia de secuencias
reguladoras de Ig. Los ADNcs que codifican regiones constantes de
la cadena pesada de IgG pueden ser aislados sobre la base de la
secuencia publicada procedente de bibliotecas de ADNc derivadas de
linfocitos esplénicos o de sangre periférica, mediante técnicas de
hibridación o mediante la técnica de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
Otros derivados de las nuevas lectinas de tipo C
de la presente invención, que poseen una semivida más larga que las
moléculas nativas, comprenden la lectina o una quimera
lectina-inmunoglobulina unidas covalente a un
polímero no proteináceo. El polímero no proteináceo es normalmente
un polímero sintético hidrofílico, esto es, un polímero que por lo
demás no se encuentra en la naturaleza. Sin embargo, son útiles
polímeros que existen en la naturaleza y que son producidos
mediante métodos recombinantes o in vitro, igual que lo son
los polímeros que son aislados de fuentes nativas. Los polímeros de
polivinilo hidrofílicos entran dentro del ámbito de esta invención,
por ejemplo polivinilalcohol y polivinilpirrolidona. Son
particularmente útiles los éteres de polialquileno tales como
polietilén glicol (PEG); polielquilenos tales como polioxietileno,
polioxipropileno y copolímeros en bloque de polioxietileno y
polioxipropileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbómeros;
polisacáridos ramificados o no ramificados que comprenden los
monómeros sacarídicos D-manosa, D- y
L-galactosa, fucosa, fructosa,
D-xilosa, L-arabinosa, ácido
D-glucurónico, ácido siálico, ácido
D-galacturónico, ácido D-manurónico
(por ejemplo ácido polimanurónico o ácido algínico),
D-glucosamina, D-galactosamina,
D-glucosa y ácido neuramínico incluyendo
homopolisacáridos y heteroplisacáridos tales como lactosa,
amilopectina, almidón, hidroxietil almidón, amilosa, dextrán
sulfato, dextrano, dextrinas, glucógeno o la subunidad
polisacarídica de mucopolisacáridos ácidos, por ejemplo ácido
hialurónico; polímeros de alcoholes azucarados tales como
polisorbitol y polimanitol; heparina o heparón. El polímero antes
del entrecruzamiento no necesita ser, pero preferiblemente es,
soluble en agua, pero el conjugado final debe ser soluble en agua.
Además, el polímero no debe ser muy inmunogénico en la forma
conjugada, ni debe poseer una viscosidad que sea incompatible con
la infusión o inyección intravenosa si está destinado a ser
administrado por tales vías.
Preferiblemente, el polímero contiene solamente
un único grupo que sea reactivo. Esto ayuda a evitar el
entrecruzamiento de moléculas de proteína. Sin embargo, está dentro
del ámbito de la presente el optimizar las condiciones de reacción
para reducir el entrecruzamiento, o para purificar los productos de
la reacción mediante filtración en gel o tamices cromatográficos
para recuperar derivados sustancialmente homogéneos.
El peso molecular del polímero puede variar
deseablemente de 100 a 500.000 aproximadamente, y es
preferiblemente de 1.000 a 20.000 aproximadamente. El peso
molecular elegido dependerá de la naturaleza del polímero y del
grado de sustitución. En general, cuanto mayor sea la
hidrofilicidad del polímero y mayor sea el grado de sustitución,
menor será el peso molecular que puede ser empleado. Los pesos
moleculares óptimos serán determinados mediante experimentación
rutinaria.
El polímero es unido generalmente covalentemente
a la nueva lectina de tipo C o a las quimeras
lectina-inmunoglobulina a través de un agente de
entrecruzamiento multifuncional que reacciona con el polímero y con
uno o más residuos de aminoácido o de azúcar de la lectina de tipo
C o de la quimera lectina- inmunoglobulina que va a ser unida. Sin
embargo, está dentro del ámbito de la invención entrecruzar
directamente el polímero haciendo reaccionar un polímero
derivatizado con el híbrido, o viceversa.
El sitio de entrecruzamiento covalente en la
lectina de tipo C o en la lectina- Ig incluye el grupo amino
N-terminal y los grupos amino épsilon encontrados en
los residuos de lisina, así como otros grupos amino, imino,
carboxilo, sulfhidrilo, hidroxilo u otros grupos hidrofílicos. El
polímero puede ser unido covalentemente al híbrido directamente sin
la utilización de un agente de entrecruzamiento multifuncional
(normalmente bifuncional). La unión covalente a grupos amino se
lleva a cabo mediante una química conocida basada en cloruro
cianúrico, carbonil diimidazol, grupos reactivos con aldehído (PEG
alcóxido más dietil acetal de bromoacetaldehído; PEG más DMSO y
anhídrido acético, o cloruro de PEG más el fenóxido del
4-hidroxibenzaldehído, succinimidil ésteres activos,
PEG activado con ditiocarbonato, cloroformato de
2,4,5-triclorofenilo o PEG activado con
cloroformato de P-nitrofenilo). Los grupos carboxilo
son derivatizados mediante acoplamiento de
PEG-amina utilizando carbodiimida.
Los polímeros son conjugados a los grupos
oligosacarídicos mediante oxidación utilizando productos químicos,
por ejemplo metaperyodato, o enzimas, por ejemplo glucosa o
galactosa oxidasa (cualquiera de los cuales produce el derivado
aldehído del carbohidrato), seguido por la reacción con polímeros
derivatizados con hidrazida o amino, de la misma manera que la
descrita por Heitzmann y col., P.N.A.S., 71,
3537-41 (1974) o Bayer y col., Methods in
Enzymology, 62, 310 (1979), para el marcaje de
oligosacáridos con biotina o avidina. Además, otros métodos
químicos o enzimáticos que han sido utilizados hasta ahora para unir
oligosacáridos son particularmente ventajosos ya que, en general,
hay menos sustituciones que sitios de aminoácidos para
derivatización, y los productos oligosacarídicos serán por tanto
más homogéneos. Los sustituyentes oligosacarídicos son también
modificados opcionalmente mediante digestión enzimática para
eliminar azúcares, por ejemplo mediante digestión con
neuraminidasa, antes de la derivatización del polímero.
El polímero llevará un grupo que sea reactivo
directamente con la cadena lateral de un aminoácido, o con el
extremo N o C del polipéptido unido, o que sea reactivo con el
agente de entrecruzamiento multifuncional. En general, se conocen
polímeros portadores de tales grupos reactivos para la preparación
de proteínas inmovilizadas. Con el fin de utilizar tal química
aquí, debe emplearse un polímero soluble en agua derivatizado por
otra parte de la misma manera que los polímeros insolubles
empleados hasta ahora para la inmovilización de proteínas. La
activación con bromuro de cianógeno es un procedimiento
particularmente útil para ser empleado en el entrecruzamiento de
polisacáridos.
"Soluble en agua", en referencia al polímero
de partida, significa que el polímero o su producto intermedio
reactivo utilizado para la conjugación es suficientemente soluble
en agua para participar en una reacción de derivatización.
"Soluble en agua", en referencia al
conjugado del polímero, significa que el conjugado es soluble en
fluidos fisiológicos tales como la sangre.
El grado de sustitución con tal polímero variará
dependiendo del número de sitios reactivos en la proteína, de si se
utiliza toda la proteína o un fragmento de la misma, de si la
proteína es una fusión con una proteína heteróloga (por ejemplo una
quimera lectina de tipo C-inmunoglobulina), del peso
molecular, de la hidrofilicidad y de otras características del
polímero, y de los sitios de derivatización de una proteína
particular elegidos. En general, el conjugado contiene de 1 a 10
moléculas de polímero aproximadamente, aunque cualquier secuencia
heteróloga puede ser sustituida por un número esencialmente
ilimitado de moléculas de polímero, siempre que la actividad deseada
no sea afectada de manera adversa significativamente. El grado
óptimo de entrecruzamiento es determinado fácilmente por una matriz
experimental en la que se varían el tiempo, la temperatura y otras
condiciones de la reacción con el fin de cambiar el grado de
sustitución, después de lo cual se determina la capacidad de los
conjugados para funcionar de la manera deseada.
El polímero, por ejemplo PEG, es entrecruzado
mediante una amplia variedad de métodos conocidos per se
para la modificación covalente de proteínas con polímeros no
proteináceos tales como PEG. Algunos de estos métodos, sin embargo,
no son preferidos para los fines de la presente. La química del
cloruro cianurónico da lugar a muchas reacciones colaterales,
incluyendo el entrecruzamiento de proteínas. Además, puede ser
particularmente probable que dé lugar a la inactivación de
proteínas que contengan grupos sulfhidrilo. La química del carbonil
diimidazol (Beauchamp y col., Anal. Biochem., 131,
25-33 [1983]) requiere un pH alto (>8,5), que
puede inactivar las proteínas. Además, como el producto intermedio
"PEG activado" puede reaccionar con el agua, se requiere un
exceso molar muy grande de "PEG activado" sobre la proteína.
Las elevadas concentraciones de PEG requeridas para la química del
carbonil diimidazol dan lugar también a problemas en la
purificación, ya que la cromatografía de filtración en gel y la
cromatografía de interacción hidrofílica son ambas afectadas de
manera adversa. Además, las elevadas concentraciones de "PEG
activado" pueden precipitar la proteína, un problema que ha sido
observado previamente per se (Davis, Patente de EE.UU. Nº
4.179.337). Por otra parte, la química de los aldehídos (Royer,
Patente de EE.UU. Nº 4.002.531) es más eficaz, ya que requiere
solamente un exceso molar de PEG de 40 veces y una incubación de
1-2 horas. Sin embargo, el dióxido de manganeso
sugerido por Royer para la preparación del aldehído de PEG es
problemático "debido a la pronunciada tendencia del PEG a formar
complejos con agentes oxidantes basados en metales" (Harris y
col., J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 22,
341-52 [1984]). El empleo de una oxidación de
Moffatt, utilizando DMSO y anhídrido acético, obvia este problema.
Además, el borohidruro de sodio sugerido por Royer debe ser
utilizado a un pH elevado y tiene una tendencia significativa a
reducir los enlaces disulfuro. En contraste, se prefiere el
cianoborohidruro de sodio, que es eficaz a pH neutro y tiene muy
poca tendencia a reducir los enlaces disulfuro.
Los conjugados de semivida larga de esta
invención son separados de los materiales de partida no
reaccionados mediante filtración en gel. Especies heterólogas de
los conjugados son purificadas unas de otras de la misma manera. El
polímero puede ser también insoluble en agua, como un gel
hidrofílico.
Las nuevas lectinas de tipo C pueden estar
incluidas en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante
técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, en
sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo,
liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones,
nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Tales técnicas
están descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª
Edición, Osol, A., Ed. (1980).
Los anticuerpos policlonales hacia una lectina de
tipo C de la presente invención son producidos generalmente en
animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o
intraperitoneales (ip) de la lectina de tipo C y un adyuvante.
Puede ser útil conjugar la lectina o un fragmento que contenga la
secuencia de aminoácidos diana a una proteína que sea inmunogénica
en la especie que va a ser inmunizada, por ejemplo hemocianina de
la lapa ojo de cerradura, seroalbúmina, tiroglobulina bovina o
inhibidor de tripsina de soja, utilizando un agente bifuncional o
derivatizante, por ejemplo maleimidobenzoil sulfosuccinimida éster
(conjugación a través de los residuos de cisteína),
N-hidroxisuccinimida (a través de los residuos de
lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl_{2} o
R^{1}N=C=NR, donde R y R^{1} son grupos alquilo diferentes.
Los animales son inmunizados contra los
conjugados inmunogénicos o derivados combinando 1 mg o 1 \mug de
conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes
de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución
intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes más tarde los animales
son reforzados con 1/5 ó 1/10 de la cantidad original del conjugado
en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en
múltiples sitios. De 7 a 14 días más tarde se extrae sangre a los
animales y se analiza el suero para determinar el título de
anticuerpos anti-lectina de tipo C. Los animales son
reforzados hasta que el título alcanza una meseta. Preferiblemente,
el animal es reforzado con el conjugado de la misma lectina de tipo
C, pero conjugada a una proteína diferencia y/o a través de un
reactivo de entrecruzamiento diferente. Los conjugados pueden ser
también producidos en un cultivo de células recombinantes como
fusiones de proteínas. Además, se utilizan agentes agregantes tales
como hidróxido de aluminio para intensificar la respuesta
inmune.
Los anticuerpos monoclonales son obtenidos a
partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos,
esto es, los anticuerpos individuales que componen la población son
idénticos excepto por las posibles mutaciones que tienen lugar de
forma natural y que pueden estar presentes en cantidades mínimas.
Por tanto, el calificativo "monoclonal" indica el carácter del
anticuerpo, que no es una mezcla de anticuerpos discretos. Por
ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-lectina
de tipo C de la invención pueden ser producidos utilizando el
método de los hibridomas descrito por vez primera por Kohler y
Milstein, Nature, 256, 495 (1975) o pueden ser
producidos mediante métodos de ADN recombinante [Cabilly y col.,
Patente de EE.UU. Nº 4.816.567].
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales
es aislado y secuenciado fácilmente utilizando procedimientos
convencionales (por ejemplo, utilizando sondas oligonucleotídicas
que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las
cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de
hibridoma sirven como fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado,
el ADN puede ser colocado en vectores de expresión, que son
posteriormente transfectados a células huésped tales como células
COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de
mieloma que no producen de lo contrario proteína inmunoglobulina,
con el fin de obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en
las células huésped recombinantes. El ADN puede ser modificado
también, por ejemplo, sustituyendo los dominios constantes de las
cadenas pesada y ligera humanas por la secuencia codificadora en
lugar de las secuencias murinas homólogas, Morrison y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851 (1984), o
uniendo covalentemente a la secuencia codificadora de la
inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificadora de un
polipéptido que no sea una inmunoglobulina. De esa manera, se
preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen
la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal hacia la
lectina de tipo C de la presente.
Típicamente, los dominios constantes de un
anticuerpo son sustituidos por tales polipéptidos que no son
inmunoglobulinas, o los dominios variables de un sitio de
combinación del antígeno de un anticuerpo de la invención son
sustituidos por los mismos para crear un anticuerpo quimérico
bivalente que contiene un sitio de combinación con el antígeno que
tiene especificidad por una lectina de tipo C y otro sitio de
combinación con el antígeno que tiene especificidad por un antígeno
diferente.
Los anticuerpos quiméricos o híbridos pueden ser
también preparados in vitro utilizando métodos conocidos en
la química de la síntesis de proteínas, incluyendo aquéllos que
implican agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, pueden
construirse inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio de
disulfuros o mediante la formación de un enlace tioéter. Ejemplos de
reactivos adecuados para este fin incluyen iminotiolato y
metil-4-mercaptobutirimidato.
Para aplicaciones de diagnóstico, los anticuerpos
serán marcados típicamente con un resto detectable. El resto
detectable puede ser cualquiera que sea capaz de producir,
directamente o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el
resto detectable puede ser un radioisótopo tal como ^{3}H,
^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I, un compuesto fluorescente
o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína,
rodamina o luciferina; biotina; marcas isotópicas radioactivas
tales como, por ejemplo, ^{125}I, ^{32}P, ^{14}C o ^{3}H, o
un enzima tal como fosfatasa alcalina,
beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano
picante.
Puede emplearse cualquier método conocido en la
técnica para conjugar separadamente el anticuerpo al resto
detectable, incluyendo aquellos métodos descritos por Hunter y
col., Nature, 144, 945 (1962); David y col.,
Biochemistry, 13, 1014 (1974); Pain y col., J.
Immunol. Meth., 40, 219 (1981); y Nygren, J.
Histochem. and Cytochem., 30, 407 (1982).
Los anticuerpos pueden ser empleados en cualquier
método de ensayo conocido, tal como en ensayos de unión
competitiva, en ensayos de sándwich directos e indirectos y en
ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A
Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press,
Inc., 1987).
Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos
son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo
humanizado tiene introducido en el mismo uno o más residuos de
aminoácido procedentes de una fuente que no es humana. Estos
residuos de aminoácidos no humanos son referidos a menudo como
residuos "importados", los cuales son tomados típicamente de
un dominio variable "importado". La humanización puede ser
llevada a cabo esencialmente siguiendo el método de Winter y
colaboradores [Jones y col., Nature, 321,
522-525 (1986); Riechmann y col., Nature,
332, 323-327 (1988); Verhoeyen y col.,
Sciences, 239, 1534-1536 (1988)],
sustituyendo las secuencias correspondientes de un anticuerpo
humano por secuencias de las CDRs o CDR de roedores. Por
consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos
quiméricos (Cabilly, supra), en los que sustancialmente
menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por
la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la
práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos
humanos en los que algunos residuos de la CDR y posiblemente
algunos residuos de la FR están sustituidos por residuos
procedentes de sitios análogos de anticuerpos de roedores.
Es importante que los anticuerpos sean
humanizados conservando la elevada afinidad por el antígeno y otras
propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, de
acuerdo con un método preferido, los anticuerpos humanizados son
preparados mediante un proceso de análisis de las secuencias
parentales y varios productos humanizados conceptuales utilizando
modelos tridimensionales de las secuencias parentales y
humanizadas. Los modelos de inmunoglobulinas tridimensionales están
normalmente disponibles y son familiares para las personas expertas
en la técnica. Están disponibles programas de ordenador que
ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales
probables de secuencias de inmunoglobulinas candidatas
seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el
análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de
la secuencia de inmunoglobulina candidata, esto es, el análisis de
los residuos que afectan a la capacidad de la inmunoglobulina
candidata para unirse a su antígeno. De esta forma, pueden
seleccionarse y combinarse residuos de la FR a partir de la
secuencia consenso y de la secuencia importada, de tal manera que
se consiga la característica del anticuerpo deseada, tal como una
afinidad incrementada por el(los) antígeno(s) diana.
En general, los residuos de la CDR están implicados directamente y
muy sustancialmente en la influencia sobre la unión al antígeno.
Para detalles adicionales ver la Publicación de PCT WO 94/04679
publicada el 3 de Marzo de 1994, la cual es una continuación en
parte de la Publicación de PCT WO 92/22653 publicada el 23 de
Diciembre de 1992.
Alternativamente, es ahora posible producir
animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces,
después de su inmunización, de producir un completo repertorio de
anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas
endógenas. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homozigota
del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo
(J_{H}) en ratones quiméricos y en ratones mutantes de la línea
germinal, tiene como resultado la inhibición completa de la
producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la serie
de genes de inmunoglobulinas de la línea germinal humana en tales
ratones mutantes de la línea germinal tendrá como resultado la
producción de anticuerpos humanos después del desafío con el
antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 90, 2551-255 (1993);
Jakobovits y col., Nature, 362,
255-258 (1993).
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos
monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen
especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. En
el presente caso, una de las especificidades de unión es por una
lectina de tipo C de la presente invención y la otra es por
cualquier otro antígeno, por ejemplo por cualquier otro miembro de
la familia de lectinas endocíticas de tipo C, o por una selectina
tal como selectina E, L o P. Tales construcciones pueden ser
referidas también como inmunoadhesinas biespecíficas. Se conocen en
la técnica métodos para producir anticuerpos biespecíficos (e
inmunoadhesinas biespecíficas).
Tradicionalmente, la producción recombinante de
anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares
cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en
los que las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes
(Millstein y Cuello, Nature, 305,
537-539 (1983)). Debido a la mezcla aleatoria de
las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas
(cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de
anticuerpo diferentes, de las cuales solamente una tiene la
estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula
correcta, que se realiza normalmente mediante etapas de
cromatografía de afinidad, es bastante tediosa y los rendimientos
de producto son bajos. Procedimientos similares están descritos en
la solicitud de PCT Nº de publicación WO 93/08829 (publicada el 13
de Mayo de 1993) y en Traunecker y col., EMBO, 10,
3655-3659 (1991).
De acuerdo con un planteamiento diferente y más
preferido, los dominios variables del anticuerpo con las
especificidades de unión deseadas (sitios de combinación
anticuerpo-antígeno) son fusionados a secuencias del
dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión es
preferiblemente con un dominio constante de la cadena pesada de la
inmunoglobulina, comprendiendo al menos parte de la bisagra, y una
segunda y una tercera región constante de una cadena pesada de la
inmunoglobulina (CH2 y CH3). Se prefiere tener la primera región
constante de la cadena pesada (CH1) conteniendo el sitio necesario
para la unión de la cadena ligera, presente en al menos una de las
fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de la cadena pesada
de la inmunoglobulina y, si se desea, de la cadena ligera de la
inmunoglobulina, son insertados en vectores de expresión separados
y son cotransfectados en un organismo huésped adecuado. Esto
proporciona una gran flexibilidad para ajustar las proporciones
mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en realizaciones
cuando proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas
utilizadas en la construcción proporcionan los rendimientos
óptimos. Es posible, sin embargo, insertar las secuencias que
codifican dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de
expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas
polipeptídicas en proporciones iguales tiene como resultado
rendimientos elevados, o cuando las proporciones no tienen una
significación particular. En una realización preferida de este
planteamiento, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por
una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera
especificidad de unión en un brazo, y un par cadena
pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrido (que
proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo.
Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación
del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas
de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena
ligera de inmunoglobulina en solamente la mitad de la molécula
biespecífica proporciona una forma fácil de separación. Esta
aproximación está descrita en la solicitud de PCT WO 94/04690
publicada el 3 de Marzo de 1994.
Para detalles adicionales de la generación de
anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh y col.,
Methods in Enzymology, 121, 210 (1986).
Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos
por dos anticuerpos unidos covalentemente. Tales anticuerpos han
sido propuestos, por ejemplo, para dirigir células del sistema
inmune hacia células no deseadas (Patente de EE.UU. N^{os}
4.676.980), y para el tratamiento de la infección por VIH
(solicitudes de PCT N^{os} de publicación WO 91/00360 y WO
92/200373; EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden ser
producidos utilizando cualquier método de entrecruzamiento
conveniente. Los agentes de entrecruzamiento adecuados son bien
conocidos en la técnica y están descritos en la Patente de EE.UU. Nº
4.676.980, junto con varias técnicas de entrecruzamiento.
Los análogos peptídicos de las lectinas de tipo C
de la presente invención son modelados sobre la base de la
estructura tridimensional de los polipéptidos nativos. Los péptidos
pueden ser sintetizados mediante técnicas bien conocidas tales como
las técnicas sintéticas en fase sólida descritas inicialmente en
Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 15,
2149-2154 (1963). Otras técnicas de síntesis
peptídica están descritas en, por ejemplo, Bodanszky y col.,
Peptide Synthesis, John Wiley and Sons, 2º Ed., 1976, así
como en otros libros de referencia fácilmente disponibles para las
personas expertas en la técnica. Un resumen de técnicas de síntesis
peptídica puede ser encontrado en Stuart y Young, Solid Phase
Peptide Synthelia, Pierce Chemical Company, Rockford, IL (1984).
Los péptidos pueden ser también preparados mediante la tecnología
de ADN recombinante, utilizando una secuencia de ADN que codifique
el péptido deseado.
Además de los análogos peptídicos, la presente
invención contempla también compuestos no peptídicos (por ejemplo
orgánicos) que presenten sustancialmente la misma superficie que
los análogos peptídicos de la presente invención y que, por tanto,
interaccionen con otras moléculas de manera similar.
Las variantes de la secuencia de aminoácidos de
las lectinas de tipo C nativas de la presente invención pueden ser
empleadas terapéuticamente para competir con la unión normal de las
proteínas nativas a sus ligandos. Las variantes de la secuencia de
aminoácidos de las lectinas de tipo C son, por tanto, útiles como
inhibidores competitivos de la actividad biológica de las lectinas
de tipo C nativas.
Las lectinas de tipo C nativas y sus variantes de
la secuencia de aminoácidos son útiles en la identificación y
purificación de sus ligandos nativos. La purificación se realiza
preferiblemente por inmunoadhesinas que comprenden una secuencia de
aminoácidos de una lectina de tipo C que conserva la capacidad
cualitativa de una lectina de tipo C nativa de la presente invención
para reconocer su ligando carbohidrato nativo.
Las lectinas de tipo C nativas de la presente
invención son además útiles como marcadores moleculares de los
tejidos en los que se expresan.
Además, las lectinas de tipo de C de la presente
invención proporcionan motivos de secuencia valiosos que pueden ser
insertados o sustituidos en otros miembros nativos de las lectinas
endocíticas de tipo C, tales como el receptor de manosa, el
receptor DEC 205 o el receptor de la fosfolipasa A2 nativos. La
alteración de estas proteínas nativas por la sustitución o
inserción de secuencias procedentes de las nuevas lectinas de tipo
C de la presente invención puede producir moléculas variantes con
propiedades biológicas alteradas, tales como la afinidad de unión
al ligando o la especificidad por el ligando. Por ejemplo, uno o más
dominios lectina de otro miembro de la familia de lectinas
endocíticas de tipo C pueden ser sustituidos totalmente o
parcialmente por secuencias del dominio lectina derivadas de las
lectinas de tipo C de la presente invención. De manera similar,
secuencias del dominio fibronectina de tipo II procedentes de las
lectinas de tipo C de la presente pueden ser sustituidas o
insertadas en las secuencias de aminoácidos de otras lectinas de
tipo C.
El ácido nucleico que codifica las lectinas de
tipo C de la presente invención es también útil para proporcionar
sondas de hibridación para la búsqueda de bibliotecas de ADNc y
genómicas con el fin de encontrar la secuencia codificadora de
otras lectinas de tipo C.
Detalles adicionales de la invención serán obvios
a partir del ejemplo no limitante siguiente.
De acuerdo con la secuencia EST, se sintetizaron
dos 33-meros (5' CCG GAA TTC CGG TTT GTT GCC ACT
GGG AGC AGG 3' (SEC ID Nº: 10) y 5' CCC AAG CTT GAA GTG GTC AGA GGC
ACA GTT CTC 3' (SEC ID Nº: 11)) para PCR (94ºC 1 minuto, 60ºC 1
minuto y 72ºC 1 minuto, durante 35 ciclos) utilizando 5 microlitros
de una biblioteca de ADNc de corazón humano (Clontech) como molde.
El producto de PCR de 260 bases fue clonado (kit de clonaje TA,
Invitrogen) y utilizado como sonda para someter a selección una
biblioteca de ADNc de corazón humano así como para sondar
transferencias Northern y Southern (Clontech). El mismo par de
cebadores fue utilizado también para amplificar una biblioteca de
ADNc de corazón de ratón con una temperatura de hibridación más
baja (55ºC) y se obtuvo un producto de ratón con el mismo tamaño
(260 pb). La selección de 500.000 placas aproximadamente de las
bibliotecas de ADNc fue realizada utilizando un procedimiento
estándar con una sonda de ADN marcada aleatoriamente. Los clones de
fagos positivos individuales fueron aislados después de dos rondas
más de reselección. El tamaño de los insertos fue identificado por
PCR utilizando dos cebadores procedentes del vector lambda gt10 y
se subclonaron los insertos. La secuenciación del ADN se realizó en
un secuenciador de ADN automatizado de Applied Biosystems. Para
clonar la región 5 prima de los transcritos, se realizó una 5' RACE
(Amplificación Rápida de los Extremos del ADNc) utilizando el
extremo más 5' de la secuencia conocida y se siguió el protocolo
para la 5' RACE proporcionado por el fabricante
(Marathon-Ready cDNAs, Clontech). Los productos de
la RACE fueron subclonados y secuenciados según se ha descrito.
Las sondas de ADN fueron preparadas mediante
purificación en gel de agarosa (Gel Extraction Kit, Qiagen) y
marcaje aleatorio (Pharmacia). La hibridación de las transferencias
se llevó a cabo según estaba descrito en las instrucciones del
fabricante utilizando transferencias suministradas comercialmente
(Clontech).
La secuenciación de los productos de la RACE
utilizando ADNc de hígado fetal humano
(Marathon-Ready, Clontech) como molde reveló una
nueva región 5 prima no encontrada en los clones derivados de
corazón originales. Para caracterizar adicionalmente este
transcrito, se realizó una PCR en corazón, pulmón e hígado fetal
utilizando un cebador corriente abajo común con dos cebadores
corriente arriba diferentes. Uno de los cebadores corriente arriba
procede de la secuencia de la lectina, que no está presente en el
clon de hígado fetal, y el otro procede de la secuencia única de
hígado fetal. Los productos de la PCR fueron analizados en gel de
agarosa e hibridados por un oligonucleótido común a ambos
transcritos.
Se utilizó una biblioteca genómica de células
embrionarias derivadas de 129 de ratón (ES) para la selección por
dos secuencias de ADNc de lectina. Una procede del extremo 5' de la
secuencia codificadora de la lectina y la otra procede del extremo
3' del ADNc. El proceso de selección de 500.000 placas produjo tres
tipos de clones genómicos de lectina; positivos para la sonda del
extremo 5', para la sonda del extremo 3' y para ambas. El ADN de
fago recombinante fue aislado de lisados de las placas (Wizard
Lambda Preps, Promega) y digerido con NotI. Los insertos de ADN
genómico fueron subclonados en un vector pBlueScript SK digerido
con NotI utilizando el Kit de Ligadura de ADN Rápido (Boehringer
Mannheim), después de la inactivación por calor del enzima de
restricción. Las posiciones aproximadas de los intrones y de los
exones fueron identificadas utilizando hibridación de
transferencias de manchas con sondas oligonucleotídicas específicas
y análisis por PCR de los clones de lambda utilizando sondas
específicas de los exones. El mapeo físico del gen de la lectina
fue realizado utilizando digestión con enzimas de restricción de los
clones genómicos seguido por hibridación de la transferencia
Southern con sondas oligonucleotídicas específicas de los
exones.
La hibridación in situ fue realizada
esencialmente según se describió previamente (Lasky y col.,
Cell, 69(6), 927-38 [1992]).
Brevemente, se generaron ribosondas antisentido y sentido para este
clon mediante la utilización de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) con el fin de derivar moldes para una
transcripción in vitro posterior. En la preparación para la
hibridación, las secciones fueron tratadas secuencialmente con
paraformaldehído al 4% (10 minutos) y proteinasa K (0,5 mg/ml, 15
minutos) y posteriormente prehibridadas con 50 ml de tampón de
hibridación a 42ºC durante 2 horas. El tampón de hibridación
constaba de dextrán sulfato 10%, SSC 2X (cloruro de sodio/citrato de
sodio) y formamida 50%. Las sondas fueron añadidas a una
concentración final de 106 cpm/portaobjetos y las secciones fueron
incubadas durante una noche a 55ºC. Los lavados
post-hibridación constaban de SSC 2X conteniendo
EDTA 1 mM, antes y después de un tratamiento de 30 minutos con
ribonucleasa (20 mg/ml). Se llevó a cabo un lavado de rigurosidad
elevada que constaba de SSC 0,1X conteniendo EDTA en un volumen
grande durante 2 horas a 55ºC. Las secciones fueron luego lavadas
en SSC 0,5X, deshidratadas en concentraciones crecientes de etanol y
posteriormente desecadas con vacío. Los portaobjetos fueron
cubiertos con la emulsión nuclear NTB2 (Eastman Kodak, Rochester,
NY) y expuestos durante un periodo de tiempo de hasta 5 semanas.
Una vez que los portaobjetos fueron revelados, fueron contrateñidos
con hematoxilina y eosina y evaluados mediante microscopía
epiluminiscente para detectar la hibridación positiva. Secciones
seriadas de los tejidos hibridados con las sondas sentido sirvieron
como controles negativos.
La base de datos de marcas de secuencias
expresadas (EST) es una gran colección de secuencias de ADNc
aleatorias procedente de una diversidad de bibliotecas. Nosotros
sondamos la base de datos EST in silico con el dominio
lectina de la selectina E. Como puede observarse en la Figura 1, se
identificó una secuencia (T11885) que mostraba una baja homología
(\sim23%) con una región del dominio lectina de la selectina E.
Aunque esta homología parecía ser bastante distante, encontramos
que los residuos que eran idénticos estaban incluidos en el
subgrupo de aminoácidos que se había mostrado previamente que se
conservaba en la inmensa mayoría de las lectinas de tipo C
(Drickhamer, J. Biol. Chem., 263,
9557-9560 [1988]). Además, la búsqueda de la base de
datos GenBank-EMBL con la nueva secuencia
relacionada con la selectina E derivada de EST tuvo como resultado
homologías solamente con las lectinas de tipo C (datos no
mostrados), consistente de nuevo con que la nueva secuencia sea un
miembro de esta gran familia de proteínas.
Como la nueva secuencia de EST derivaba
originalmente de una biblioteca de ADNc de corazón humano, se
utilizó una biblioteca similar para análisis por PCR utilizando
cebadores deducidos de la secuencia de EST. Éste tuvo como resultado
un fragmento de ADN que contenía la misma secuencia que la
encontrada para la entrada de la base de datos, y este fragmento
fue utilizado para sondar una biblioteca de corazón humano. Además,
se aisló también un fragmento murino utilizando técnicas similares,
y este fragmento fue utilizado para el aislamiento de un ADNc de
una biblioteca de corazón murino. La Figura 2 ilustra la secuencia
de longitud completa obtenida para el clon de ADNc murino. Como
puede verse en esta figura, este gran transcrito codificaba una
proteína de 1.479 residuos con un peso molecular de 167 kD
aproximadamente. La secuencia humana revelaba un 90%
aproximadamente de homología de secuencias de aminoácidos con la
proteína murina. El codón de inicio de la traducción ATG mostrado en
la secuencia murina está en el contexto de un sitio de inicio de la
traducción de Kozak, y hay dos codones de parada 5 prima respecto a
este ATG. Una búsqueda en el GenBank con la secuencia de la
proteína murina deducida reveló que esta nueva secuencia estaba muy
estrechamente relacionada con el receptor de manosa macrofágico
(32,5% de identidad) (Taylor y col., supra; Harris y col.,
supra), con el receptor de fosfolipasa A2 (34% de identidad)
(Higishino y col., supra; Ishizaki y col., supra;
Lambeau y col., supra) y con el receptor DEC 205 (33% de
identidad) (Jiang y col., supra), tres miembros de la
familia de lectinas de tipo C que contienen múltiples dominios
lectina que median todos la endocitosis (Figura 3). Estos niveles
de homología de secuencias son similares a los encontrados cuando
estos tres receptores similares a lectinas son comparados entre sí,
consistente con la hipótesis de que el nuevo ADNc aquí descrito es
un nuevo miembro de esta familia. Un análisis de homología
adicional por dominios reveló que las mayores homologías de
secuencias entre estas cuatro proteínas relacionadas se encontraban
en el dominio fibronectina de tipo II y en los dominios similares a
lectina 1-3, consistente con la posibilidad de que
estos dominios pudieran ser funcionalmente importantes (Figura 4).
Además, el análisis del dominio citoplásmico de la nueva lectina de
tipo C reveló también que contenía un residuo de tirosina conservado
(residuo número 1.451) en un contexto similar al motivo NSYY que se
había encontrado previamente que era importante para la endocitosis
del receptor de fosfolipasa A2 (Zvaritch y col., supra). En
resumen, el nuevo receptor aquí descrito está relacionado con las
tres lectinas previamente descritas que tienen una estructura
global que consta de una secuencia señal, un dominio rico en
cisteína, un dominio fibronectina de tipo II, 8 dominios lectina de
tipo C (10 de tales dominios en el receptor DEC 205), un dominio
transmembranal y un corto dominio citoplásmico (Figura 4).
Análisis de transferencia Southern con una
pequeña región de la nueva lectina de tipo C revelaron que la misma
estaba codificada por un gen de una única copia, altamente
conservado, en concordancia con el elevado grado de homología de
secuencias entre los ADNcs murinos y humanos (Figura 5). El gen que
codifica la forma murina de la nueva lectina de tipo C, con la
excepción de los exones de la secuencia señal y del dominio rico en
cisteína que no pudieron ser aislados de nuestra biblioteca, fue
caracterizado utilizando una combinación de transferencia Southern
y análisis por PCR de los clones de lambda utilizando sondas
específicas de los exones pronosticadas a partir de las estructuras
de los genes de los receptores de manosa macrofágicos humanos y
murinos (Kim y col., Genomic, 14(3),
721-727 [1992], Harris y col., Biochem. Biophys.
Res. Commun., 198(2), 682-92 [1994]).
Como puede observarse en la Figura 5, el gen estaba interrumpido
por un mínimo de 28 intrones y se extendía a través de al menos 39
kB del ADN. Esta estructura genómica es por tanto altamente
reminiscente de la encontrada para los receptores de manosa
macrofágicos humanos y murinos, ambos de los cuales estaban
interrumpidos por un número similar de intrones en lugares
similares. Estos datos son por tanto consistentes con la suposición
de que los miembros de esta familia de lectinas de tipo C derivaban
todos de un gen progenitor original que fue posteriormente duplicado
y mutado para dar lugar a estas cuatro proteínas diferentes con
funciones diferentes.
Se analizó una colección diversa de tejidos
murinos y humanos para determinar la expresión del transcrito que
codifica la nueva lectina de tipo C. Como puede observarse en la
Figura 6, se encontró que el transcrito se expresaba en la etapa
embrionaria murina más temprana examinada (día 7) y su expresión
continuaba a lo largo de todo el desarrollo embrionario. El análisis
de tejidos fetales humanos reveló que el transcrito se expresaba a
un nivel elevado en pulmón y riñón. Curiosamente, se encontró que
un transcrito truncado se expresaba predominantemente en el hígado
fetal, y este transcrito será descrito con mayor detalle más
adelante. El análisis de los tejidos murinos adultos reveló que se
detectaban niveles de expresión elevados en corazón, pulmón y
riñón, con niveles más bajos en el cerebro y en el músculo.
Curiosamente, el transcrito en el hígado adulto de humanos y
ratones parece estar ausente, apoyando adicionalmente la
especificidad del transcrito ayustado alternativamente por el
hígado fetal. El análisis de la expresión en tejidos humanos reveló
que había también niveles elevados de transcrito en el corazón así
como en la próstata, testículos, ovarios e intestino, con menores
niveles en cerebro, placenta, pulmón, riñón, páncreas, bazo, timo y
colon. El análisis de la expresión en varias células transformadas
(Figura 6) reveló que la nueva lectina se transcribía en al menos
dos líneas celulares hematopoyéticas diferentes, en contraste con
su aparente falta de expresión en leucocitos de sangre periférica
(PBL) humanos. Además, otras varias líneas celulares transformadas
derivadas de diferentes tumores fueron también positivas para la
expresión de esta lectina. En resumen, el análisis de la expresión
de la nueva lectina de tipo C sugiere que se expresa en una
diversidad de tejidos y a lo largo del desarrollo, aunque parece
estar ausente del hígado adulto y se encuentra como un transcrito
más pequeño en el hígado fetal. La expresión de un transcrito más
pequeño en el hígado fetal humano, junto con la compleja estructura
genómica anteriormente descrita, sugería que este ARN podría haber
sido producido mediante ayuste alternativo. El análisis de los
clones de RACE derivados del hígado fetal reveló que el transcrito
más pequeño parecía tener una secuencia 5 prima divergente. Con el
fin de caracterizar adicionalmente este transcrito, se sometió a
selección una biblioteca de hígado fetal humano, y los fagos
positivos resultantes fueron secuenciados. Se encontró un fago
positivo que parecía codificar un ADNc parcial que correspondía al
transcrito más pequeño. Por tanto, según puede observarse en la
Figura 7, la secuencia resultante es idéntica a la lectina de
longitud completa original hasta el nucleótido 61, donde se
encuentra una secuencia divergente que se dirige hacia el extremo
5' del transcrito contenido en este fago. Éste es el sitio de ayuste
idéntico al encontrado para el intrón número 18 en el
receptor de manosa (Kim y col., supra; Harris y col.,
supra), que interrumpe una región en el extremo carboxi del
quinto dominio lectina, consistente con el ayuste alternativo. Con
el fin de demostrar que este transcrito existe, así como para
investigar su especificidad tisular, se diseñaron cebadores
específicos a partir del transcrito original así como del
transcrito más pequeño ayustado alternativamente (Figura 7). Como
puede observarse en la Figura 7, el análisis de ARN de pulmón,
corazón e hígado fetal reveló que el transcrito pequeño, ayustado
alternativamente, era específico del hígado fetal, aunque parecía
que este tejido producía también el transcrito de longitud
completa. Además, el análisis de una transferencia Northern del
tejido con un oligonucleótido 30-mero específico
para la nueva región de este transcrito, reveló una señal solamente
en el hígado fetal que correspondía a este pequeño ARN (datos no
mostrados). Debido al tamaño del transcrito en las transferencias
Northern, se sugiere que este transcrito ayustado alternativamente
debería prolongarse solamente a lo largo de una distancia
relativamente corta 5' hacia el clon de lambda aquí aislado.
Con el fin de examinar los tipos de células que
expresaban el transcrito que codifica la nueva lectina de tipo C,
se llevaron a cabo análisis de hibridación in situ
utilizando tejidos neonatales y adultos murinos. Como puede
observarse en la Figura 8, este transcrito se encontró en dos tipos
de tejidos muy divergentes. Por ejemplo, el análisis de
transferencia Northern de tejidos adultos murinos así como de
tejidos fetales humanos (Figura 7) sugería un elevado nivel de
expresión del transcrito en el pulmón, y la Figura 8 ilustra que se
encontró que este ARN se expresaba claramente en el pulmón. Aunque
es difícil decir con la resolución de los experimentos in
situ la localización celular exacta del transcrito, debido a la
naturaleza muy vascularizada del pulmón, es posible que sea
expresado por el endotelio pulmonar. El transcrito fue encontrado
también en otros varios lugares altamente endotelializados
incluyendo, por ejemplo, el plexo coroideo y los glomérulos renales
(Figura 8), pero no se expresaba universalmente a niveles
detectables en todo el endotelio. Además, el examen por PCR de
líneas celulares endoteliales derivadas del saco vitelino murino
demostró también la expresión de la lectina (datos no mostrados).
La figura ilustra también que se encontró que el transcrito era
altamente expresado por condrocitos en los lugares de depósito de
cartílago activo. Como puede observarse en esta figura, la región
colagenosa de la laringe producía un nivel elevado de este
transcrito igual que otras regiones formadoras de hueso en el
neonato, incluyendo los huesos del esternón en desarrollo así como
los dientes en desarrollo. Estos datos sugieren que, en contraste
con la expresión restringida de los miembros de esta familia
previamente descritos, la nueva lectina de tipo C aquí descrita
parece que se expresa en una diversidad de regiones altamente
endotelializadas y en los lugares de formación de hueso en el
embrión así como en el adulto.
El reconocimiento de carbohidratos por diferentes
lectinas dependientes de calcio, o de tipo C, ha sido reconocido
recientemente como un aspecto fundamental de varios fenómenos
fisiológicos. Éstos incluyen, por ejemplo, la adhesión de varias
células leucocíticas al endotelio bajo las condiciones del flujo
vascular (Lasky y col., Ann. Rev. Biochem., 64,
113-139 [1995]), la unión y la deglución de
organismos patógenos por los macrófagos (Harris y col.,
supra), el reconocimiento de células transformadas por las
células destructoras naturales (NK) (Bezouska y col.,
Nature, 372(6502), 150-7 [1994]) y
la eliminación de la circulación de glicoproteínas desialiladas. La
importancia de estos tipos de interacciones ha sido resaltada
significativamente por mutaciones que se producen de forma natural
así como por mutaciones inducidas. Por ejemplo, mutaciones en
humanos que ocurren de forma natural en la proteína de unión a
manosa circulante tienen como resultado la sensibilidad a varias
infecciones patógenas en los individuos afectados (Lipscombe y col.,
Immunology, 85(4), 660-7 [1995]), y
la producción de animales con mutaciones en varios genes de
selectinas da lugar a grandes defectos en el tráfico de leucocitos
(Mayadas y col., Cell, 74(3), 541-554
[1993]; Arbones y col., Immunity, 1,
247-260 [1994]). Aunque no se han descrito todavía
mutaciones que ocurran naturalmente ni mutaciones inducidas en la
familia de lectinas endocíticas de tipo C, varios datos in
vitro apoyan el argumento de que estas lectinas son también
importantes para un rango de funciones potencialmente críticas.
Nosotros describimos aquí un nuevo miembro de la familia de
lectinas endocíticas que contiene muchas de las características
estructurales de los miembros previamente descritos, pero que
revela varias diferencias en los lugares de expresión con
implicaciones funcionales potencialmente importantes. La comparación
de la estructura global del nuevo receptor aquí descrito sugiere
que el mismo es claramente un miembro de la familia de lectinas
endocíticas de tipo C. Esto se basa en la clara conservación de
cada uno de los motivos de la proteína encontrados en esta familia
en comparación con los encontrados en la nueva lectina. Por tanto,
el nuevo receptor contiene regiones que son homólogas a los motivos
del dominio rico en cisteína, del dominio fibronectina de tipo II y
de los múltiples dominios lectina encontrados en los otros tres
miembros de esta familia de lectinas, además de una secuencia señal
y un dominio transmembranal que orientarían al receptor como una
proteína transmembranal de tipo 1. Curiosamente, el dominio
citoplásmido es también homólogo a los otros miembros de esta
familia, y esta homología incluye una tirosina conservada dentro de
un contexto similar al motivo NSYY que es crítico para la
endocitosis (Zvaritch y col., supra). Por tanto, aunque los
niveles de conservación entre estos miembros de la familia parecen
ser bastante bajos (\sim30-35%), las estructuras
globales de sus dominios proteicos pronosticados, además de las
estructuras de los exones de al menos los genes para los receptores
de manosa macrofágicos humanos y murinos (Kim y col., supra;
Harris y col., supra), así como el nuevo receptor aquí
descrito, sugieren que son claramente una familia de receptores
relacionados. De este modo, es muy probable que este nuevo receptor
esté implicado en la captación de ligandos para una respuesta
endocítica como se ha encontrado para las demás proteínas de esta
familia.
Con respecto al reconocimiento del ligando por el
nuevo receptor, el trabajo previo ha implicado a los dominios
lectina de tipo C como críticos para la actividad de unión de los
demás miembros de esta familia. Por ejemplo, varios análisis de
deleción del receptor de manosa macrofágico (ver los dos artículos
de Taylor y col., supra) y del receptor de fosfolipasa A2
(Ishizaki y col., supra) han revelado que los motivos de
lectina de tipo C están implicados en la unión de glicoproteínas
que contienen una elevada cantidad de manosa (el receptor de manosa
macrofágico) o de fosfolipasa A2 (el receptor de fosfolipasa A2).
Curiosamente, en el caso de este último receptor, la unión de
fosfolipasa no es dependiente de carbohidratos, aunque este
receptor se unirá también con una afinidad significativa a
neoglicoproteínas altamente glicosiladas tales como
manosa-BSA (Lambeau y col., supra). La
necesidad de múltiples motivos de reconocimiento de carbohidratos
está subrayada por el hallazgo de que la afinidad del receptor de
manosa macrofágico por las proteínas glicosiladas está incrementada
cuando se expresa más de un motivo en el contexto de un receptor
truncado (ver los dos artículos de Taylor y col., supra).
Como el receptor DEC 205 parece también unirse a antígenos
glicosilados con el fin de incrementar la presentación del antígeno
por las células dendríticas y el epitelio del timo (Jiang y col.,
supra), parece muy probable que utilice también una
multiplicidad de motivos de lectina para la unión a ligandos con
alta afinidad. Finalmente, el análisis comparativo de las
secuencias de los motivos de lectina de tipo C del nuevo receptor
con las de los encontrados en la estructura cocristalina de la
proteína de unión a manosa y de la manosa (los dos artículos de
Weis y col., supra; Drickhamer y col., supra) (K.
Drickhamer-comunicación personal) demuestra que
muchos de los aminoácidos implicados en la ligadura del calcio y
en el reconocimiento de manosa o de galactosa se encuentran en los
dos primeros motivos de lectina de la nueva proteína, lo cual es
consistente con un papel de estos motivos en el reconocimiento de
carbohidratos. Curiosamente, esto contrasta con el receptor de
manosa macrofágico, en el que el cuarto dominio de tipo lectina
parece ser el que es más crítico para el reconocimiento de
carbohidratos (los dos artículos de Taylor y col., supra).
En resumen, estos datos apoyan por tanto la idea de que la lectina
relacionada aquí descrita está implicada también en el
reconocimiento de ligando(s) altamente glicosilado(s)
con el fin de mediar una captación endocítica.
Aunque los datos aquí descritos sugieren que los
mecanismos de reconocimiento del ligando por la nueva lectina de
tipo C endocítica podrían estar relacionados con los previamente
descritos para los demás miembros de la familia, el análisis de los
patrones de expresión de esta nueva proteína sugiere que la misma
desempeña potencialmente una(s) nueva(s)
tarea(s). Los patrones de expresión de dos de los miembros
de la familia de lectinas endocíticas, el receptor de manosa
macrofágico y el receptor DEC 205, revelan una transcripción de
estas proteínas muy restringida en los macrófagos y en las células
endoteliales hepáticas (el receptor de manosa macrofágico) o en las
células dendríticas y en el epitelio del timo (el receptor DEC
205), y estos patrones se correlacionan con las funciones conocidas
de estos receptores en la función del sistema inmune. Para el
receptor de la fosfolipasa A2 se observa un patrón de expresión más
amplio. Este receptor endocítico se expresa en varios tejidos del
embrión y del adulto, incluyendo corazón, pulmón, riñón, músculo
esquelético e hígado en el ratón adulto y riñón en el embrión
humano. Este patrón es en cierto modo reminiscente del nuevo
receptor aquí descrito, especialmente la expresión en el corazón,
pulmón y riñón del adulto. Sin embargo, existen varias diferencias
entre estos dos receptores, incluyendo la expresión del nuevo
receptor en el pulmón embrionario como un transcrito grande y en el
hígado fetal como un transcrito pequeño, ayustado alternativamente.
Además, el nuevo receptor no se expresa en absoluto en el hígado
adulto, en contraste con el receptor de la fosfolipasa A2. Estas
diferencias en el patrón de expresión son consistentes con
diferencias en la función entre estos dos receptores similares a
lectina más extensamente expresados.
Los tipos celulares que expresan la nueva lectina
endocítica dan también algunas pistas respecto a su posible
función. La transcripción relativamente extendida en los tejidos
adultos es consistente con la expresión endotelial, y el análisis
de hibridación in situ apoya también esta idea. Por tanto,
aunque la resolución de estos experimentos fue insuficiente para
identificar exactamente los tipos celulares que expresaban la nueva
lectina, la misma se encontró a menudo en áreas muy vascularizadas,
incluyendo el pulmón, el glomérulo renal, el plexo coroideo y la
médula ósea, por nombrar unos cuantos. Estos datos sugieren por
tanto que la nueva lectina podría funcionar como una proteína de
unión a carbohidratos vasculares. En contraste, otros miembros de
esta familia, incluyendo el receptor de manosa macrofágico y el
receptor DEC 205, parecen funcionar como mediadores del sistema
inmune, y se expresan en un pequeño subgrupo de células del sistema
inmune del adulto. Sin embargo, como el embrión está en un entorno
estéril, es poco probable que la lectina actualmente descrita esté
implicada en este tipo de función, predominantemente porque se
expresa a lo largo de todo el desarrollo embrionario, comenzando
tan pronto como el día 7 del desarrollo del ratón. Una posible
función que esta lectina podría llevar a cabo en la vasculatura
podría ser el transporte de proteínas altamente glicosiladas a
través del vaso sanguíneo. Esto podría tener lugar desde el lado de
la luz del vaso hacia el espacio extravascular o en la otra
dirección, dependiendo de la disposición de la lectina. Si la
lectina estuviera de cara al lado de la luz, podría funcionar por
tanto como transportadora de proteínas muy glicosiladas desde el
flujo vascular hacia el espacio extravascular. Consistente con su
expresión en el endotelio es su identificación en varias líneas
celulares endoteliales derivadas del embrión. Este tipo de posible
función es, por tanto, similar a la hipotetizada para el receptor
de manosa macrofágico expresado en las células endoteliales del
hígado. En este caso, este receptor parece mediar la eliminación de
proteínas desialiladas de la corriente sanguínea. La investigación
de esta hipótesis espera la producción de anticuerpos dirigidos
contra esta nueva lectina, los cuales permitirán un análisis con
mayor resolución de la localización celular real de esta proteína
en el embrión y en el adulto. El elevado nivel de expresión de la
nueva lectina en condrocitos sugiere también interesantes
posibilidades. En contraste con las células endoteliales, estas
células no están expuestas directamente a la corriente sanguínea,
por lo que es poco probable que la lectina se una a ligandos
idénticos en el caso de estas células que se depositan en la matriz.
La expresión de la lectina fue detectada en regiones de
mineralización, tales como las regiones del esternón y de los
dientes, así como en los sitios de depósito de cartílago, tal como
la laringe. Estos datos sugieren que la lectina podría estar
implicada en la síntesis del cartílago o de otros tipos de matriz
extracelular producidos por los condrocitos. Si se encuentra en
efecto que la nueva lectina aquí descrita está implicada en la
endocitosis, esa posible función en los condrocitos podría ser la
captación de proteínas precursoras muy glicosiladas que son
degradadas y utilizadas para la producción de la matriz
extracelular. Una posibilidad opuesta podría ser que los condrocitos
utilizaran esta lectina para remodelar la matriz extracelular
mediante la endocitosis de proteínas muy glicosiladas.
Finalmente, la identificación del transcrito
ayustado alternativamente que es específico del hígado fetal humano
es un resultado muy interesante con implicaciones potenciales en la
hematopoyesis, aunque la falta de un codón de inicio en el presente
clon no nos permite predecir que este transcrito codifique una
proteína. El análisis por PCR de este transcrito demostró claramente
que estaba completamente ausente del corazón y del pulmón, y el
análisis de transferencia Northern reveló una falta de señal para
este transcrito o para el transcrito de longitud completa en el
hígado adulto. Como el hígado fetal es un lugar llamativamente
importante de hematopoyesis en el embrión, este resultado sugiere
que este transcrito puede estar implicado de alguna forma en la
hematopoyesis fetal. La posible localización endotelial del
transcrito sugiere también una posible implicación en la producción
de células sanguíneas, ya que el trabajo previo ha sugerido que las
células endoteliales parecen estar implicadas en la expansión de
las células progenitoras en el embrión. Curiosamente, el transcrito
ayustado carece de los dos primeros dominios lectina que, por
homología de secuencias con la proteína de unión a manosa, podrían
estar implicados en el reconocimiento de carbohidratos. Por tanto,
es probable que, si este transcrito codifica un producto proteico,
esta forma de la lectina podría utilizar otras regiones de la
porción extracelular de la proteína para nuevas interacciones
receptor-ligando.
En resumen, los datos aquí descritos proporcionan
pruebas de un nuevo miembro de la familia de lectinas endocíticas
de tipo C. Esta glicoproteína parece ser expresada en una amplia
variedad de tejidos en el embrión y en el adulto, y es transcrita
por los condrocitos y, posiblemente, por las células
endoteliales.
Todos los documentos citados a lo largo de la
especificación, así como las referencias citadas en la misma, se
incorporan de este modo expresamente por referencia. Aunque la
presente invención está ilustrada con referencia a realizaciones
específicas, la invención no está limitada por ellas. Se
comprenderá que son posibles modificaciones y variaciones
adicionales sin alejarse del concepto global de la invención. Tales
modificaciones están destinadas todas ellas a ser incluidas dentro
del ámbito de la presente invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Genentech, Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: LECTINA DE TIPO C
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 15
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Genentech, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 460 Point San Bruno Blvd
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: South San Francisco
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
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- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 94080
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- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disco magnético flexible de 1,44 Mb, 3,5 pulgadas
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- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
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- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
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- (D)
- PROGRAMA: WinPatin (Genentech)
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- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
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- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
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- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE:
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- (A)
- NOMBRE: Dreger, Ginger R.
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- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33.055
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- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: P1019PCT
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- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
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- (A)
- TELÉFONO: 415/225-3216
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- (B)
- TELEFAX: 415/952-9881
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- (C)
- TÉLEX: 910/371-7168
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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
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- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
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- (A)
- LONGITUD: 4588 pares de bases
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- (B)
- TIPO: Ácido Nucleico
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- (C)
- TIPO DE HEBRA: Sencilla
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- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
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- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
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- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
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- (A)
- LONGITUD: 1479 aminoácidos
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- (B)
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- (D)
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- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
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- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4771 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: Sencilla
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- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
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- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
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- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1479 aminoácidos
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- (B)
- TIPO: Aminoácido
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- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
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- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1455 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1449 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1487 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 67 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 67 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGGAATTCC GGTTTGTTGC CACTGGGAGC AGG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCAAGCTTG AAGTGGTCAG AGGCACAGTT CTC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACGGGCCTG GCTGCGTTCC AGGAGGCCG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGGCCCAGC TGGGGGCCGG TGCTGGAGT
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGTGGAGCA GGAGCCTTTG ATGTATGCCA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTCAGGTCC AGGGCCAGGA ACCCCAGAGC
\hfill30
Claims (18)
1. Una lectina de tipo C aislada seleccionada del
grupo que consta de:
(a) un polipéptido que comprende los residuos
desde el 37 hasta el 1393 de la secuencia de aminoácidos de la SEC
ID Nº: 2 o de la SEC ID Nº: 4;
(b) un polipéptido que tiene al menos un 60% de
identidad de secuencias con la secuencia de aminoácidos de la SEC
ID Nº: 2 o de la SEC ID Nº: 4; y
(c) un polipéptido que tiene al menos un 80% de
identidad de secuencias con los tres primeros dominios lectina o
con el dominio fibronectina de tipo II de la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 o de la SEC ID Nº: 4.
2. La lectina de tipo C de la reivindicación 1,
que tiene al menos un 80% de identidad de secuencias con la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 o de la SEC ID Nº:
4.
3. La lectina de tipo C de la reivindicación 1
que está desprovista de un dominio transmembranal activo y/o de un
dominio citoplásmico.
4. La lectina de tipo C de la reivindicación 1
que no está acompañada por glicosilación nativa.
5. La lectina de tipo C de la reivindicación 1
que tiene una glicosilación variable.
6. Una molécula de ácido nucleico que codifica la
lectina de tipo C de la reivindicación 1.
7. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 6, que codifica al menos el dominio fibronectina de
tipo II y los tres primeros dominios lectina de una lectina de tipo
C que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 o de la
SEC ID Nº: 4.
8. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 6, que codifica una lectina de tipo C desprovista de
un dominio transmembranal activo y/o de un dominio
citoplásmico.
9. Un vector que contiene la molécula de ácido
nucleico de la reivindicación 6 unida operativamente a secuencias
control reconocidas por una célula huésped transformada con el
vector.
10. Una célula huésped transformada con el vector
de la reivindicación 9.
11. La célula huésped de la reivindicación 10,
que es una célula de mamífero.
12. La célula huésped de la reivindicación 11,
que es una célula de ovario de hámster chino.
13. Un proceso para producir la lectina de tipo C
de la reivindicación 1, que comprende la transformación de una
célula huésped con un ácido nucleico que codifica dicha lectina de
tipo C, el cultivo de la célula transformada y la recuperación de
dicha lectina de tipo C del cultivo celular.
14. El proceso de la reivindicación 13, en el que
dicha lectina de tipo C es secretada al medio de cultivo y
recuperada del medio de cultivo.
15. Una inmunoadhesina que comprende una
secuencia de aminoácidos de una lectina de tipo C de acuerdo con la
reivindicación 1 fusionada a una secuencia de inmunoglobulina.
16. La inmunoadhesina de la reivindicación 15,
que comprende al menos el dominio fibronectina de tipo II y un
dominio de reconocimiento de carbohidratos de un polipéptido que
tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 o de la SEC ID
Nº: 4.
17. La inmunoadhesina de la reivindicación 15, en
la que dicha secuencia de inmunoglobulina es una secuencia de un
dominio constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina,
preferiblemente de una IgG-1, IgG-2
o IgG-3.
18. Una composición farmacéutica que contiene una
lectina de tipo C de acuerdo con la reivindicación 1.
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