UA91004C2 - Спосіб запобігання або зниження опосередкованої т-клітинами імунної реакції - Google Patents

Abstract

Винахід належить до способу запобігання або зниження опосередкованої Т-клітинами імунної реакції в організмі суб'єкта шляхом введення суб'єктові димерної сполуки, яка зв'язується з Р-селектин лігандом 1 глікопротеїну (PSGL-1) на поверхні Т-клітини або NK-клітини, де димерна сполука включає домен зв'язування Р-селектину або Е-селектину, що зв'язується з PSGL-1, злитий з гетерологічною послідовністю, яка відповідає Fc області IgG1 людини. Винахід також належить до комплекта, який включає зазначену димерну сполуку та інструкцію застосування димерної сполуки для лікування стану, який асоціюється з надлишковою або небажаною опосередкованою Т-клітинами імунною реакцією, або надлишковою або небажаною Т-клітинною проліферацією, де стан включає запалення, автоімунність, відторгнення трансплантатів, алергічний стан та Т-клітинний рак.

Description

модуляторів функції РОСІЇ -1 для запобігання або зниження опосередкованої Т-клітинами імунної реакції, а також способів відбору модуляторів функції РО -1.

В одному аспекті винахід стосується способу запобігання або зниження опосередкованої Т-клітинами імунної реакції в організмі суб'єкта. Спосіб включає такі етапи: відбір суб'єкта, у якого діагностовано або який є підданим ризикові виникнення стану, який характеризується надмірною або небажаною опосередкованою Т- клітинами імунною реакцією; і введення суб'єктові сполуки, яка зв'язується з РОСІЇ -1 на поверхні Т-клітини, причому зв'язування сполуки з РБСІ-1 на поверхні Т-клітини викликає шлях трансдукції сигналу, який в результаті призводить до смерті Т-клітини, таким чином, запобігаючи або знижуючи опосередковану Т- клітинами імунну реакцію в організмі суб'єкта.

Сполука, яку застосовують згідно з цим способом, може включати антитіло або фрагмент його зв'язування з антигеном, що специфічно зв'язується з РОЇ -1. В одному прикладі сполука є моноклональним антитілом, яке специфічно зв'язується з РОСИ -1. В одному варіанті втілення спосіб включає додатковий етап введення агента, який зв'язується з моноклональним антитілом і викликає зшивання певної кількості антигенів РОС -1 на поверхні Т-клітини.

У деяких варіантах втілення спосіб включає викликання зшивання певної кількості антигенів РОС -1 на поверхні Т-клітини, причому зшивання викликає шлях трансдукції сигналу, який в результаті призводить до смерті Т-клітини.

У деяких варіантах втілення спосіб включає такі етапи: (ії) відбір суб'єкта, у якого діагностовано або який є підданим ризикові виникнення стану, який характеризується надмірною або небажаною опосередкованою Т- клітинами імунною реакцією; і (її) введення суб'єктові мультимерної сполуки, яка зв'язується з принаймні двома білками РБ(Ї- 1 на поверхні Т-клітини, причому мультимерна сполука містить два поліпептидні ланцюги, кожен з поліпептидних ланцюгів включає (а) домен зв'язування, який зв'язується з РБОІ-1. і (Б) гетерологічну амінокислотну послідовність, у якій поліпептидні ланцюги є зв'язаними через гетерологічну амінокислотну послідовність для утворення мультимерної сполуки, і зв'язування мультимерної сполуки з принаймні двома білками РБИЇІ -1 на поверхні Т-клітини викликає шлях трансдукції сигналу, який у результаті призводить до смерті Т-клітини, таким чином, запобігаючи або знижуючи опосередковану Т-клітинами імунну реакцію в організмі суб'єкта.

Мультимерна сполука може бути гомомультимерною сполукою або гетеромультимерною сполукою. Домен зв'язування необов'язково може містити позаклітинний домен Р-Селектину або його РБОІ -1-зв'язувальний фрагмент, позаклітинний домен Е-Селектину або його РБОЇ -1-зв'язувальний фрагмент, позаклітинний домен

Ї-Селектину або його РОСІЇ -1-зв'язувальний фрагмент, антитіло проти РБОИЇ -1 або його РОСІЇ -1-зв'язувальний фрагмент, РБаЇ -1-зв'язувальний поліпептид, вибраний з бібліотек фагів, або комбінацію з будь-яких із них.

У деяких варіантах втілення мультимерна сполука не включає антитіло проти РОСІЇ -1 або фрагмент антитіла, який зв'язується з РООІ -1.

Гетерологічна амінокислотна послідовність необов'язково може містити ділянку зв'язування з рецептором поверхні клітин, наприклад, постійну ділянку важкого ланцюга імуноглобуліну. У деяких варіантах втілення поліпептидні ланцюги є ковалентно зв'язаними, наприклад, дисульфідно зв'язаними, через гетерологічну амінокислотну послідовність для утворення мультимерної сполуки.

У деяких варіантах втілення спосіб може включати додатковий етап введення суб'єктові агента, який зв'язується з мультимерною сполукою через гетерологічну амінокислотну послідовність і викликає зшивання певної кількості антигенів РОС -1 на поверхні Т-клітини.

У деяких варіантах втілення описаний авторами спосіб включає етап відбору суб'єкта, у якого діагностовано аутоїмунну хворобу. В іншому прикладі спосіб включає етап відбору суб'єкта, у якого діагностовано запальну хворобу. В іншому прикладі спосіб включає етап відбору суб'єкта, який отримав або який має отримати ксеногенний трансплантат. В іншому прикладі спосіб включає етап відбору суб'єкта, у якого діагностовано алергічну хворобу. В іншому прикладі спосіб включає етап відбору суб'єкта, у якого діагностовано Т-клітинний рак.

У деяких варіантах втілення Т-клітина є активованою Т-клітиною. В одному прикладі Т-клітина є СО4-- Т- клітиною. В іншому прикладі Т-клітина є СОв'- Т-клітиною.

У деяких варіантах втілення спосіб включає етап виявлення кількості Т-клітин у першому біологічному зразку, взятому в суб'єкта до введення сполуки (наприклад, мультимерної сполуки), і порівняння результатів з кількістю Т-клітин у другому біологічному зразку, взятому в суб'єкта після введення сполуки (наприклад, мультимерної сполуки).

У деяких варіантах втілення спосіб включає етап виявлення біологічної активності Т-клітин у першому біологічному зразку, взятому в суб'єкта до введення сполуки (наприклад, мультимерної сполуки), і порівняння результатів з біологічною активністю Т-клітин у другому біологічному зразку, взятому в суб'єкта після введення сполуки (наприклад, мультимерної сполуки).

У деяких варіантах втілення введення в результаті забезпечує виснаження принаймні 1095 активованих Т- клітин в організмі суб'єкта У деяких варіантах втілення введення в результаті забезпечує виснаження принаймні 1095, 20905, 3090, 4095, 50905 або більшої кількості активованих Т-клітин в організмі суб'єкта.

У деяких варіантах втілення антитіло або фрагмент його зв'язування з антигеном або мультимерна сполука викликає смерть принаймні 1095 активованих Т-клітин в організмі суб'єкта після піддавання дії антитіла або фрагмента його зв'язування з антигеном або мультимерної сполуки. У деяких варіантах втілення введення викликає смерть принаймні 1095, 2095, 3095, 4095, 5095 або більшої кількості активованих Т-клітин в організмі суб'єкта. Смерть клітин може бути виміряна у будь-який час, наприклад, через один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім або більше днів після піддавання дії антитіла або фрагмента його зв'язування з антигеном або мультимерної сполуки.

В іншому аспекті винахід стосується способу викликання смерті Т-клітини або природної клітини-кілера (МК). Спосіб включає етапи: забезпечення Т-клітини або МК-клітини, яка експресує РБОІЇ-1 на поверхні клітини; і контакту Т-клітини або МК-клітини зі сполукою, яка зв'язується з РОС -1 на поверхні Т-клітини або

МК-клітини, причому зв'язування сполуки з РОСЇ-1 на поверхні Т-клітини або МК-клітини викликає шлях трансдукції сигналу, який в результаті призводить до смерті Т-клітини або МК-клітини.

Сполука, яку застосовують згідно з цим способом, може включати антитіло або фрагмент його зв'язування з антигеном, що специфічно зв'язується з РОСІ-1. В одному прикладі сполука є моноклональним антитілом, яке специфічно зв'язується з РБОЇ-1. В одному варіанті втілення спосіб включає етап контакту моноклонального антитіла з агентом, який зв'язується з моноклональним антитілом і викликає зшивання певної кількості антигенів РОС -1 на поверхні Т-клітини або МК-клітини.

В одному варіанті втілення спосіб включає такі етапи: (ї) забезпечення Т-клітини аби МК-клітини, яка експресує РБОЇІ-1 на поверхні клітини; і (ії) контакту Т-клітини або МК-клітини з мультимерною сполукою, яка зв'язується з принаймні двома білками РБОИЇ-1 на поверхні Т-клітини або МК-клітини, причому мультимерна сполука містить два поліпептидні ланцюги, кожен з поліпептидних ланцюгів включає (а) домен зв'язування, який зв'язується з РОБИ -1, та (Б) гетерогогічну амінокислотну послідовність, у якій поліпептидні ланцюги є зв'язаними через гетерологічну амінокислотну послідовність для утворення мультимерної сполуки, причому зв'язування мультимерної сполуки з принаймні двома білками РБОІ-1 на поверхні Т-клітини або МК-клітини викликає шлях трансдукції сигналу, який в результаті призводить до смерті Т-клітини або МК-клітини.

Мультимерна сполука може бути гомомультимерною сполукою або гетеромультимерною сполукою. Домен зв'язування необов'язково може містити позаклітинний домен Р-Селектину або його РБОІ -1-зв'язувальний фрагмент, позаклітинний домен Е-Селектину або його РБОЇ -1-зв'язувальний фрагмент, позаклітинний домен

Ї-Селектину або його РОСІЇ -1-зв'язувальний фрагмент, антитіло проти РОЇ -1 або його РОСІЇ -1-зв'язувальний фрагмент, пептид, вибраний з бібліотеки фагів, або комбінацію з будь-яких із них.

Гетерологічна амінокислотна послідовність необов'язково може містити ділянку зв'язування з рецептором поверхні клітин, наприклад, постійну ділянку важкого ланцюга імуноглобуліну. У деяких варіантах втілення поліпептидні ланцюги є ковалентно зв'язаними, наприклад, дисульфідно зв'язаними, через гетерологічну амінокислотну послідовність для утворення мультимерної сполуки.

У деяких варіантах втілення спосіб включає додатковий етап контакту мультимерної сполуки з агентом, який зв'язується з мультимерною сполукою через гетерологічну амінокислотну послідовність і викликає зшивання певної кількості антигенів РОЇ -1 на поверхні Т-клітини.

У деяких варіантах втілення спосіб включає етап викликання зшивання певної кількості антигенів РІ -1 на поверхні Т-клітини або МК-клітини, причому зшивання викликає шлях трансдукції сигналу, який в результаті призводить до смерті Т-клітини або МК-клітини.

У деяких варіантах втілення описаних авторами способів Т-клітина є активованою Т-клітиною. В одному прикладі Т-клітина є СО4-- Т-клітиною. В іншому прикладі Т-клітина є СОв'- Т-клітиною.

У деяких варіантах втілення описаних авторами способів спосіб включає етап визначення життєздатності

Т-клітини або МК-клітини після контакту зі сполукою (наприклад, мультимерною сполукою).

У деяких варіантах втілення описаних авторами способів спосіб включає етап визначення біологічної активності Т-клітини або МК-клітини після контакту зі сполукою (наприклад, мультимерною сполукою).

У деяких варіантах втілення спосіб включає викликання смерті активованої Т-клітини.

В іншому аспекті винахід стосується способу відбору модулятора функції РОС -1. Спосіб включає етапи: забезпечення клітини, яка експресує РБаї -1 на поверхні клітини; контакту клітини з випробуваною речовиною; і вимірювання життєздатності клітини після контакту клітини з випробуваною речовиною для того, щоб визначити, чи є випробувана речовина модулятором функції РОЇ -1.

В одному варіанті втілення спосіб включає етап виявлення смерті клітини, викликаної випробуваною речовиною, для визначення того, що випробувана речовина є модулятором функції РБЇ -1.

В одному варіанті втілення випробувана речовина є антитілом або фрагментом його зв'язування з антигеном, що специфічно зв'язується з РОС -1. В одному прикладі випробувана речовина є моноклональним антитілом, яке специфічно зв'язується з РОЗІ -1. В одному варіанті втілення спосіб включає етап контакту моноклонального антитіла з агентом, який зв'язується з моноклональним антитілом і викликає зшивання певної кількості антигенів РОС -1 на поверхні клітини.

В одному варіанті втілення спосіб включає етап викликання зшивання певної кількості антигенів РОС -1 на поверхні клітини, причому зшивання викликає шлях трансдукції сигналу, який в результаті призводить до смерті клітини.

В одному варіанті втілення Т-клітина є активованою Т-клітиною. В одному прикладі Т-клітина є СО4-- Т- клітиною. В іншому прикладі Т-клітина є СОв'- Т-клітиною.

В одному варіанті втілення спосіб включає етап одержання масової кількості випробуваної речовини і рецептування випробуваної речовини у фармацевтично прийнятний носій.

В іншому аспекті винахід стосується комплекту, який включає: сполуку, яка зв'язується з РБ(ЗІ-1 на поверхні Т-клітини, причому зв'язування сполуки з РОС -1 на поверхні Т-клітини викликає шлях трансдукції сигналу, який в результаті призводить до смерті Т-клітини; та інструкцію з застосування сполуки для лікування стану, пов'язаного з надмірною або небажаною опосередкованою Т-клітинами імунною реакцією або надмірною або небажаною проліферацією Т-клітин, такою як запалення, аутоімунність, відторгнення трансплантатів, алергічний стан або Т-клітинний рак.

В одному варіанті втілення комплект включає: (ї) мультимерну сполуку, яка зв'язується з принаймні двома білками РБОЇ-1 на поверхні Т-клітини, причому мультимерна сполука містить два поліпептидні ланцюги, кожен з поліпептидних ланцюгів включає (а) домен зв'язування, який зв'язується з РУСІ -1, та (р) гетерогогічну амінокислотну послідовність, у якій поліпептидні ланцюги є зв'язаними через гетерологічну амінокислотну послідовність для утворення мультимерної сполуки, причому зв'язування мультимерної сполуки з принаймні двома білками РБИЇ -1 на поверхні Т-клітини викликає шлях трансдукції сигналу, який в результаті призводить до смерті Т-клітини; та (ії) інструкцію з застосування сполуки для лікування стану, пов'язаного з надмірною або небажаною опосередкованою Т-клітинами імунною реакцією або надмірною або небажаною проліферацією Т- клітин, такою як запалення, аутоімунність, відторгнення трансплантатів, алергічний стан або Т-клітинний рак.

Перевага винаходу полягає в тому, що він може викликати виснаження Т-клітин та/або викликання апоптозу в Т-клітинах без викликання пов'язаної з ним небажаної або шкідливої імунної реакції. Наприклад, у деяких варіантах втілення введення суб'єктові антитіла проти РБОЇ-1 або описаної авторами мультимерної сполуки не призводить до небажаного підвищення рівня запальних цитокінів, таких як ІІ -2 або ТМЕ-альфа.

Іншою перевагою винаходу є те, що він викликає виснаження Т-клітин через застосування агоністичних композицій, які викликають апоптоз Т-клітин. Відповідно, винахід забезпечує активні імунодепресивні способи, а не пасивну імуносупресію, яка є результатом застосування антагоністичної композиції (наприклад, антагоністичні антитіла проти РБОЇ-1 або антагоністичні розчинні фрагменти селектину), які діють шляхом зв'язування імунних рецепторів і запобігання імунній активації, опосередкованої такими рецепторами.

Іншою перевагою винаходу є те, що він дозволяє спрямування білка поверхні клітин, РОС -1, експресія якого значною мірою обмежується лейкоцитами, зокрема, Т-клітинами та МК-клітинами. Таким чином, описані авторами сполуки в цілому не викликають значного рівня апоптозу інших типів клітин, таких як клітини печінки. спрямування Т-клітин та МЕС-клітин (важливий тип клітин СОЗ3", який бере участь у відторгненні трансплантатів) для вибіркового виснаження, без суттєвого викликання небезпечних для життя системних реакцій на цитокіни та шкоди для інших систем органів, є корисною характеристикою імунодепресивного агента.

Якщо немає іншого визначення, всі вжиті авторами технічні та наукові терміни мають значення, загальноприйняті серед спеціалістів у галузі, до якої належить цей винахід. Хоча для практичного втілення та випробування винаходу застосовують способи та матеріали, подібні або еквівалентні описаним авторами, прийнятні способи та матеріали описуються нижче. Усі публікації, патентні заявки, патенти та інші згадані авторами джерела є включеними шляхом посилання в їх повному обсязі. У разі невідповідності термінології переважну силу має даний опис. Крім того, описані матеріали та способи представлено лише для пояснення, і вони не є обмежувальними.

Інші особливості та переваги винаходу стануть зрозумілими з представлених нижче детального опису та формули винаходу.

Короткий опис фігур

Фіг.1 показує результати експерименту зі змінами в часі, в якому досліджували, коли активовані Т-клітини набувають чутливості до опосередкованих ТАВА (моноклональним антитілом проти РОЦІ -1) апоптозних сигналів.

Фіг2 показує результати біотинілування поверхні клітин та імунопреципітації антигену, розпізнаного антитілом ТАВА.

Фіг.3 показує експресію антигену РОЇ -1 на СО4-- Т-клітинах, СОв-- Т-клітинах, СО 19-- В-клітинах та МК- клітинах селезінки. фіг.4 показує експресію антигену РБОЇ -1 на тимоцитах СО4", СО8" та СО4-8: і САТ.

Фіг.5 показує рівень І/-2, одержаний у змішаній культурі лімфоцитів з застосуванням клітин селезінки, взятих з організму мишей Ваїр/с, які отримували ТАВА (або Ід хом'яка), як респондерів та Н2-неузгоджених клітин селезінки СЗН як стимулятора.

Фігб показує аналізи вестерн-блотингу, які демонструють, що (А) білки, піддані імунопреципітації антитілом ТАВ4, можуть бути розпізнані за допомогою антитіла серійного виробництва проти РБСІ-1, і (В) попереднє очищення лізату Т-клітин антитілом проти РОБИ -1 може виснажувати білки, розпізнані ТАВА.

Ффіг.7 показує відсоток збережених трансплантатів у мишей С57ВІ/6, яким було пересаджено шкірний трансплантат від мишей Ваїр/с і які отримували антитіло проти РБОИЇІ -1 (зафарбовані ромби) або контрольне антитіло (незафарбовані квадрати).

Фіг8 показує зміну в часі відсотка апоптозних Т-клітин після обробки активованих мононуклеарів периферичної крові людини антитілом РОС -1 проти людини.

Фіг.9 показує показники захворюваності на діабет у аутоїмунних самців миші з діабетом без ожиріння (МОЮ), які отримували антитіло проти РБОЇ-1 (зафарбовані квадрати) або контрольне антитіло (незафарбовані квадрати).

Фіг.10 показує зв'язування Р-селектину, Е-селектину та І-селектину миші з активованими Т-клітинами миші.

Фіг11А-11С показують викликання апоптозу активованих Т-клітин миші мультимерними формами Е- селектину (Фіг.11А), Р-селектину (Фіг.118В) та І -селектину (Фіг.11С).

Фіг.12 показує викликання апоптозу активованих Т-клітин миші іп мі шляхом зшивання розчинного злитого білка Р-селектин-Ес.

Винахід стосується способу модулювання активності Т-клітин шляхом модулювання функції молекул

РБІЇ -1, які перебувають на поверхні Т-клітини. Описаний авторами контакт РОЇ -1 з композиціями агоністів може спричинити виснаження Т-клітин і/або викликати апоптоз Т-клітин. Ці композиції агоністів, таким чином, є корисними як терапевтичні агенти для контролю над пов'язаними з імунітетом хворобами, такими як запальні хвороби, аутоїмунні хвороби, відторгнення трансплантатів, алергічні хвороби та/або Т-клітинний рак.

Композиції агоністів також застосовують для очищення від Т-клітин будь-якого біологічного зразка, в якому присутність або активність Т-клітин є небажаною.

Білок РБОЇ -1

РБОЇ-1 є адгезійною молекулою поверхні клітин, яка експресується на нейтрофілах, Т- та В-лімфоцитах,

МК-клітинах, моноцитах, дендритних клітинах та примітивних людських гематопоетичних прогеніторних клітинах СО34. Завдяки його здатності до взаємодії з селектинами, РОСІЇ -1 опосередковує прокочування лейкоцитів по ендотелію та екстравазацію лейкоцитів у запалені тканини. Диференційовано регулюють РБОЇ - 1-опосередковане зв'язування Т-клітин з Е- та Р-селектином або міграцію. Наприклад, появу епітопу СТА (шкірного лімфоцитарного антигену) вважають викликаною на Т-клітинах, які зазнають переходу від наївних клітин до клітин пам'яті. Лише активовані хелперні 1, але не хелперні 2 Т-клітини експресують функціональний

РБЇ -1 і є здатними до міграції у запалену ділянку шкіри.

РБІЇ-1 є сіаломуцином, який повинен бути специфічно сіалілований, фукозилований і сульфатований для зв'язування з Р-селектином. Молекула РБОІ-1 існує в ізоформах. які характеризуються місцями з різним ступенем глікозилування та сульфатування на їх М-кінцях. Спочиваючі Т- та В-клітини периферичної крові, лінії лімфоїдних клітин та іп міо активовані Т-клітини периферичної крові експресують подібний рівень РОБІ - 1. Однак лише активовані Т-клітини мають функціональну форму РБСІ-1 і активно зв'язуються з Р- селектином. Очевидно, така залежна від активації зв'язувальна активність є результатом диференційної посттрансляційної модифікації, про що свідчить підвищений рівень активності альфа (1,3) фукозилтрансфераз в активованих Т-клітинах. Ізоформи РБИЇ-1 також виявляють диференційну афінність до І-селектину та Е- селектину. Наприклад, людські Т-клітини, які мають Сі А-позитивну ізоформу, можуть прив'язуватися й прокочуватися по Е- та Р-селектину, тоді, як Т-клітини, які експресують РБСЇ-1 без епітопу СІА лише зв'язуються з Р-селектином. Крім того, зв'язування РОЇ -1 з Р-селектином залежить від присутності кінцевого декапептиду, який містить три тирозинові залишки для сульфатування і один треоніновий залишок для глікозилування.

Білок РБОІ-1 одержують рекомбінантними способами і/або шляхом відокремлення природного білка

РБОЇ-1 від біологічного матеріалу. Рекомбінантний білок РБСІ-1 може вироблятися у прокаріотних або еукаріотних клітинах, іп міо або іп мімо. Нуклеїнові кислоти, які кодують РО(І-1, застосовують для рекомбінантного вироблення білка (див., наприклад, СепВапк"М Ассезвзіоп ММ 003006 для прикладу нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид РБИІ-1). Антитіла, спрямовані на РОБ(І-1, також є загальновідомими і можуть бути застосовані для очищення антигену (див., наприклад, Не!топ еї аї. (2000)

Зсіеєпсе дип 2:;288(5471): 1653-56; МО 00/25808) і/або застосовані згідно з описаними авторами способами.

РБОЇ-1 також описано у джерелах, до яких, крім інших, належать Зако еї аї. (1993) СеїІ 75:1179; Масніпо еї а. (1995) 9. Вісі. Спет. 270:21966; і МеІдтап еї а. (1995) 9. Вісі. Снет. 270:16470.

Для рекомбінантного вироблення РБСІ-1 може вимагатися одночасна експресія РБ(І-1 та його модифікуючої альфа (1,3) фукозилтрансферази, Еис-ТМІІ, для функціональної експресії РОСІ-1. Додатково або як альтернативний варіант, рекомбінантне вироблення РОСІ-1 може супроводжуватися котрансфекцією нуклеїновою кислотою, яка кодує РАСЕ, для видалення пропептиду та/або нуклеїнової кислоти, що кодує тирозин сульфотрансферазу.

Антитіло проти РОСІЇ -1 застосовують для виділення та очищення антигену РБ(Ї-1 від біологічного матеріалу. Будь-який тип клітин, який експресує білок РБИЇ -1, наприклад, Т-клітини, взяті з організму або лінії

Т-клітин, може бути застосований як джерело білка. Відразу після очищення білок застосовують у різних описаних авторами способах. Наприклад, очищений білок РОСІЇ -1 може бути застосований в іп міїго відборі модуляторів функції РОСИ -1 на Т-клітинах або як імуноген для одержання антитіл, спрямованих проти білка.

Антитіла проти РБОІ -1

Поліпептиди РБИЇІ -1 (або їх імуногенні фрагменти або аналоги) можуть бути застосовані для вироблення антитіл, які застосовують у способах згідно з винаходом. Як описано вище, поліпептиди РОСІЇ -1 або їх пептидні фрагменти одержують рекомбінантними способами або синтезують, застосовуючи способи синтезу на твердій фазі. Рекомбінантні поліпептиди РОЇ -1 або їх пептидні фрагменти застосовують як імуноген для вироблення антитіл проти РОС -1. Крім того, антитіло проти РБОЇ-1, таке як моноклональне антитіло ТАВА, застосовують для очищення поліпептиду РБ(І-1, наприклад, поліпептиду РОСІ-1 в його природній конформації, який потім може бути застосований як імуноген для вироблення додаткових антитіл проти Ра - 1.

Антитіло згідно з винаходом може бути моноклональним, поліклональним або одержаним шляхом інженерії антитілом, яке специфічно зв'язується з поліпептидом РБСИІ-1. Антитіло, яке "специфічно зв'язується" з конкретним антигеном, наприклад, поліпептидом РОСІЇ -1, значною мірою не розпізнає і не зв'язується з іншими молекулами у зразку. Таким чином, винахід також стосується способів визначення випробуваної сполуки (наприклад, антитіла), що зв'язується з поліпептидом згідно з винаходом, шляхом контакту поліпептиду з випробуваною сполукою та визначення того, чи зв'язується поліпептид з випробуваною сполукою (наприклад, шляхом прямого виявлення зв'язування, виявлення молекули-конкурента, яка розриває зв'язування випробуваної сполуки з поліпептидом, та/(або виявлення зв'язування з застосуванням аналізу активності щодо викликання апоптозу).

Взагалі, поліпептиди РОСЇІ-1 можуть зв'язуватися з білком-носієм, таким як КІН, змішуватися з ад'ювантом і вводитися шляхом ін'єкції в організм ссавця-хазяїна. Антитіла, вироблені в організмі цієї тварини, після цього очищують шляхом афінної хроматографії з пептидним антигеном.

Зокрема, імунізують різних тварин-хазяїв шляхом ін'єкції поліпептиду РОСІ-1 або його антигенного фрагмента. Тваринами-хазяями, які зазвичай використовують, є кролі, миші, морські свинки та щури. Різні ад'юванти, які застосовують для підвищення імунологічної реакції залежать від виду хазяїна, і до них належать ад'ювант Фройнда (повний і неповний), мінеральні гелі, такі як гідроксид алюмінію, поверхнево- активні речовини, такі як лізолецитин, плюронік-поліоли, поліаніони, пептиди, олійні емульсії, гемоціанін лімфи равлика та динітрофенол. До потенційно корисних людських ад'ювантів належать ВСО (бацила СаІтейке-

Сиепп) та Согупебасіепут раг/ит. Поліклональними антитілами є гетерогенні популяції молекул антитіл, які містяться у сироватці імунізованих тварин.

Таким чином, до антитіл, які охоплюються обсягом винаходу, належать поліклональні антитіла, а також моноклональні антитіла, "олюднені" або химерні антитіла, одноланцюгові антитіла, фрагменти Раб, фрагменти

К(іабр)2 та молекули, які одержують, застосовуючи бібліотеку експресії Бар.

Моноклональні антитіла, які є гомогенними популяціями антитіл до конкретного антигену, одержують, застосовуючи вищеописані поліпептиди РОЇ -1 та стандартну гібридомну технологію (див., наприклад, Копієг еї аі.,, Маште 256:495 (1975); Копіег єї аї., Єиг У Іттипої! 6:511 (1976); Копіег еї аї., Єиг У Іттипої! 6:292 119761;

Наттетгіво еї а!., Мопосіопа! Апіїродієз апа Т Сеї! Нургідотав, ЕІземієг, М.У. (19811).

Зокрема, моноклональні антитіла одержують способом, який забезпечує вироблення молекул антитіла безперервними клітинними лініями у культурі, як описано у публікації Копіег еї аї., Майте 256:495 (1975), та

Патенті США Ме4,376,110; за допомогою В-клітинної гібридоми людини (Козбог еї аї., ІттипоЇоду Тодау 4:72 (1983); Соїе еї а!ї., Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 80:2026 (1983) та ЕВМ-гібридоми (Соїе еї аі!., Мопосіопа! Апіїродієв апа Сапсег Тпегару, Аап В. І ів, Іпс., рр.77-96 (19831). Такі антитіла можуть належати до будь-якого класу імуноглобулінів, включаючи Ідс, ДМ, ЧЕ, ІдА, дО та будь-який його підклас. Гібридому, яка виробляє тАр згідно з цим винаходом, культивують іп міго або іп мімо. Здатність до створення високих титрів тАбрз іп мімо робить цей спосіб вироблення особливо корисним.

Відразу після вироблення поліклональні або моноклональні антитіла випробують на специфічне розпізнання РБСІ-1 шляхом вестерн-блотингу або імунопреципітації, які здійснюють стандартними способами, наприклад, як описано вище у публікації А!изибеї еї а). Згідно з винаходом, застосовують антитіла, які специфічно розпізнають і зв'язуються з РБОЇ-1. Особливо корисними є антитіла проти РБСІ-1, які зв'язуються з антигеном РБОІ-1 на поверхні Т-клітини, наприклад, СОЗ-- клітина, і викликають виснаження та/або апоптоз Т-клітин в організмі суб'єкта.

Антитіла застосовують, наприклад, у межах терапевтичного режиму (наприклад, для зниження або уникнення небажаної імунної реакції, такої як опосередкована Т-клітинами імунна реакція, пов'язана з такими станами, як запальні хвороби, аутоїмунні хвороби, відторгнення трансплантатів, алергічні хвороби та Т- клітинний рак). Антитіла також можуть бути застосовані в аналізі з відбором для вимірювання здатності випробуваної сполуки до зв'язування з РОЇ -1.

Крім того, застосовують технології, розроблені для вироблення "химерних антитіл" (Моїтізоп еї аї., Ргос

Майї! Асай бсі ОБА 81:6851 (1984); Меибрегдег єї аІЇ, Машге 312:604 (1984); Такеада єї аї., Машге 314:452 (19841) шляхом зрощування генів з молекули антитіла миші з відповідною специфічністю до антигену разом з генами з молекули антитіла людини з відповідною біологічною активністю. Химерне антитіло є молекулою, в якій різні частини є взятими з різних видів тварин, наприклад, тих, які мають мінливу ділянку з моноклонального антитіла гризунів та постійну ділянку імуноглобуліну людини.

В альтернативному варіанті технології, описані для вироблення одноланцюгового антитіла (Патенти США

МоМо4,946,778, 4,946,778 та 4,704,692), можуть бути пристосовані для вироблення одноланцюгового антитіла проти поліпептиду РОСІЇ -1 або його фрагмента. Одно ланцюгові антитіла утворюють шляхом зв'язування важко- та легсоланцюгових фрагментів ділянки Ем через амінокислотний місток, в результаті чого одержують одноланцюговий поліпептид.

Фрагменти антитіла, які розпізнають і зв'язуються зі специфічними епітопами, можуть бути вироблені відомими способами. Наприклад, до таких фрагментів, крім інших, належать фрагменти Е(аб)2, які можуть бути одержані шляхом розщеплення пепсином молекули антитіла, та фрагменти Раб, які можуть бути утворені шляхом відновлення дисульфідних містків фрагментів Е(ар)2. В альтернативному варіанті можуть бути побудовані бібліотеки експресії Раб (Низе еї аї.. бсієпсе 246:1275 (19891), які дозволяють швидко й легко ідентифікувати моноклональні фрагменти Раб з потрібною специфічністю.

Антитіла олюднюють відомими спеціалістам способами. Наприклад, моноклональні антитіла з потрібною специфічністю зв'язування можуть бути олюднені на промисловому рівні (соїдепе, 5сойМапа; Охіога МоїіІесшіаг,

Раїо АЮ, Саїїйї). Повністю людські антитіла, на зразок тих, які експресуються у трансгенних тваринах, також є особливостями винаходу (Сгееєп єї аі!., Майшге Сепеїйсв 7:13 (1994); і патенти США МеМо5,545,806 та 5,569,825).

Мультимерні сполуки

Мультимерні сполуки, які зв'язуються з багатьма з білків РОСІЇ -1 на поверхні Т-клітини або МК-клітини, застосовують для викликання апоптозу у клітині. Мультимерна сполука містить принаймні два поліпептидні ланцюги. Кожен з поліпептидних ланцюгів містить (ї) домен зв'язування, який зв'язується з РОС -1, та (ії) гетерологічну амінокислотну послідовність.

Взагалі, мультимерна сполука зв'язується з принаймні двома різними білками РБОИЇ-1 на поверхні даної клітини. Однак може бути створена мультимерна сполука, яка має 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 або більше окремих доменів зв'язування РОБИ -1, що змушує мультимерну сполуку зв'язуватися з 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 або більшою кількістю різних білків РІС -1 на поверхні даної клітини.

Домен зв'язування може містити будь-яку амінокислотну послідовність (або будь-яку амінокислотну послідовність з модифікацією, наприклад, глікозилуванням та/або сульфатуванням), який зв'язується з РБЇ - 1. Домен зв'язування може відповідати природній або неприродній амінокислотній послідовності. Наприклад, домен зв'язування може містити домен зв'язування РОС -1 селектину (наприклад, Р-селектину, Е-селектину або І-селектину). Поліпептид, який містить домен зв'язування Ре(І-1 селектину необов'язково може включати: (ї) позаклітинний домен селектину (наприклад, Р-селектину, Е-селектину або І-селектину); (Ії) кальцій-залежний лектин-зв'язувальний домен селектину (наприклад, Р-селектину, Е-селектину або І1- селектину); або (ії) фрагмент позаклітинного домену селектину (наприклад, Р-селектину, Е-селектину або І1- селектину), який опосередковує зв'язування з РБСІ-1. Додатково до цих природних амінокислотних послідовностей, можливими є одна або кілька амінокислотних змін у природному домені зв'язування РОЇ -1, що в результаті дає неприродну послідовність, яка зберігає функцію РБаї-1-зв'язування. Наприклад, поліпептид може містити амінокислотну послідовність, яка зв'язується з РО -1 і є принаймні на 8095, 85905, 9095, 9595 або 9895 ідентичним будь-якому з доменів, до яких належать: (ї) позаклітинний домен селектину (наприклад, Р-селектину, Е-селектину або І -селектину); (ії) кальцій-залежний лектин-зв'язувальний домен селектину (наприклад, Р-селектину, Е-селектину або І -селектину); або (ії) фрагмент позаклітинного домену селектину (наприклад, Р-селектину, Е-селектину або І -селектину), який опосередковує зв'язування з РОЇ -1.

Для внесення змін у нуклеїновокислотній послідовності, яка кодує домен зв'язування РБОЇ -1, застосовують стандартні способи мутагенезу у молекулярній біології. Модифіковані домени зв'язування в такому разі піддають випробуванню на здатність до зв'язування з РОЇ -1, наприклад, іммобілізованим РОЇ -1 або РБОІ - 1 на поверхні клітини. Домен зв'язування також може містити домен зв'язування РБОЇ -1 антитіла проти РБИЇ - 1 або поліпептид, вибраний з бібліотеки фагів, або амінокислотну послідовність, яка зв'язується з РООСІ-1 і є принаймні на 8095, 8595, 9095, 9595 або 9895 ідентичною доменові зв'язування РБаї-1 антитіла проти РООІ -1 або поліпептиду, вибраного з бібліотеки фагів.

Домен зв'язування РБОСЇ-1 може містити амінокислотну послідовність, яка відповідає РБаї-1- зв'язувальному фрагментові Р-селектину. Прикладом поліпептидного ланцюга (описаної авторами мультимерної сполуки), який містить таку амінокислотну послідовність, є рекомбінантна химера мишачий Р- селектин/Рс (від НУО бувієетв, Міппеароїїх, ММ), що містить такі компоненти: () СОЗ33 сигнальний пептид (Мей -АІа16); (ії) мишачий Р-селектин (Тгр42-АІа709 позаклітинного домену); (ії) ІЕЄСАМО (5ЕО ІО МО 1); та (ім) людський да (Рго100-І ух330). Другим прикладом поліпептидного ланцюга, який містить таку амінокислотну послідовність, є рекомбінантна химера людський Р-селектин/Бс (від НЯ Зувіетв, Міппеароїїх, ММ), що містить такі компоненти: (ї) людський Р-селектин (Мей -АїІа771, позаклітинний домен); (її) ІЕСАМО (5ЕО ІЮ

МО-1); і (ії) людський Ідаї (Рго100-І уз330).

Домен зв'язування РБОСЇ-1 може містити амінокислотну послідовність, яка відповідає РБаї-1- зв'язувальному фрагментові Е-селектину. Прикладом поліпептидного ланцюга (описаної авторами мультимерної сполуки), що містить таку амінокислотну послідовність, є рекомбінантна химера мишачий Е- селектин/Ес (від НЯО Зувієетв, Міппеароїїз, ММ), що містить такі компоненти: (ї) мишачий Е-селектин (Мей-

Рго557, позаклітинний домен); (і) ІЕСАМО (5ЕО ІО МО 1); (ії) Нитап Ідаї (Рго100-І уз330); і (м) НННННН (5ЕО

І МО:2). Другим прикладом поліпептидного ланцюга, який містить таку амінокислотну послідовність, є рекомбінантна химера людський Е-селектин/Бс (від НЯ Бузієтв, Міппеароїї5, ММ), що містить такі компоненти: (ї) людський Е-селектин (Мейн-Рго556, позаклітинний домен); (її) ІЕСАМО (5ЕО ІО МО:2); (її) людський Ідаї (Рго100-І уз330); і (м) НННННН (5ЕО ІО МО:2).

Домен зв'язування РБОСЇ-1 може містити амінокислотну послідовність, яка відповідає РБаї-1- зв'язувальному фрагментові І-селектину. Прикладом поліпептидного ланцюга (описаної авторами мультимерної сполуки), що містить таку амінокислотну послідовність, є рекомбінантна химера І-селектин/Рс (від АЯО Зувіетв5, Міппеароїїх, ММ), що містить такі компоненти: () мишачий І-селектин (Меїй-Авп332, позаклітинний домен); (ії) ІЕСАМО (5ЕО ІО МО:1); (ії) Нитап да (Рго100-І уз330); і (м) НННННН (5ЕБО ІЮ

МО:2). Другим прикладом поліпептидного ланцюга, який містить таку амінокислотну послідовність, є рекомбінантна химера І-селектин/Бс (від НУО Бузіетв5, Міппеароїїх, ММ), що містить такі компоненти: (Її) людський І-селектин (Мей-А5зп332, позаклітинний домен); (ії) І(ЕЗАМО (5ЕО ІЮ МО:1); (ії) людський Ід (Рго100-І уз330); і (м) НННННН (5ЕО І МО:г).

Мультимерна сполука може бути утворена як гомомультимерна сполука або гетеромультимерна сполука.

Гомомультимерна сполука містить лише поліпептидні ланцюги, які мають ідентичні домени зв'язування РБаї - 1. Наприклад, гомомультимерна сполука може містити поліпептидні ланцюги, які містять ідентичні РОС -1- зв'язувальні фрагменти Р-селектину. Гетеромультимерна сполука містить поліпептидні ланцюги, які мають різні домени зв'язування РБОЇ-1. Наприклад, гетеромультимерна сполука може містити перший поліпептидний ланцюг, який містить РОС -1-зв'язувальний фрагмент Р-селектину та другий поліпептидний ланцюг, який містить Ра -1-зв'язувальний фрагмент Е-селектину.

Гетерологічна амінокислотна послідовність може бути будь-якою амінокислотною послідовністю. Однак амінокислотна послідовність описаних авторами поліпептидних ланцюгів не відповідає послідовності природного білка. Гетерологічна амінокислотна послідовність містить одну або кілька амінокислот, які дозволяють зв'язування поліпептидних ланцюгів. Наприклад, одна або кілька амінокислот можуть ковалентно зв'язувати, наприклад, через дисульфідний зв'язок, поліпептидні ланцюги. Одним прикладом гетерологічної послідовності є постійна ділянка важкого ланцюга імуноглобуліну. Дисульфідне зв'язування між Ес ділянками двох поліпептидних ланцюгів в результаті може забезпечувати утворення димерної сполуки.

Крім участі у зв'язуванні поліпептидних ланцюгів, гетерологічна амінокислотна послідовність також може містити ділянку зшивання, наприклад, ділянку зв'язування з рецептором поверхні клітин. В результаті зв'язування агента з такою ділянкою зв'язування може виникати зшивання поліпептидних ланцюгів та білків

РБОЇ-1 поверхні клітин, з якими вони зв'язуються. Постійна ділянка важкого ланцюга імуноглобуліну містить ділянку зв'язування Ес рецептора. Крос-лінкером може бути, наприклад, антитіло (наприклад, антитіло проти

Ес), яке специфічно зв'язується з ділянкою зшивання гетерологічної амінокислотної послідовності.

Аналізи з відбором сполук, які модулюють функцію РБОЇ -1

Винахід також охоплює способи розпізнання сполук, які взаємодіють з РОСІЇ -1 (або доменом РБаї -1), включаючи, крім інших, сполуки, які викликають виснаження Т-клітин та/або апоптоз Т-клітин після зв'язування з РБОЇ -1. Також він охоплює сполуки, які модулюють взаємодію РБаї-1 з трансмембранними, позаклітинними або внутрішньоклітинними білками, які регулюють активність РОС -1, та сполуками, які модулюють активність

РБОЇ--1.

До сполук, які можуть бути відібрані згідно з винаходом, належать, крім інших, пептид, антитіла та їх фрагменти та інші органічні сполуки, які зв'язуються з РБ(СЇ-1 і модулюють біологічну функцію, опосередковану РБИЇ -1, як описано авторами.

До таких сполук можуть належати, крім інших, пептиди, такі як, наприклад, розчинні пептиди, включаючи, крім інших, ті, які належать до бібліотек випадкових пептидів; (ат еї аї!., Мате 354:82 (1991); Ношоніеп еї аї,

Маїшге 354:84 (19911), і комбінаторної одержаної хімічним шляхом молекулярної бібліотеки, яка складається з амінокислот О- та/або І-конфігурації, фосфопептидів (включаючи, крім інших, ті, які належать до бібліотек випадково або частково дегенерованих, спрямованих фосфопептидів; бЗопдуапд еї аї., Се! 72:767 (19931), антитіла (включаючи, крім інших, поліклональні, моноклональні, олюднені, антиідіотипічні, химерні або одноланцюгові антитіла і бібліотеку експресії Рар-, Е(аб)2- та Бар-фрагментів та їх фрагменти, які зв'язуються з епітопами) і малі органічні або неорганічні молекули.

До інших сполук, які можуть бути відібрані згідно з винаходом, належать, крім інших, малі органічні молекули, які впливають на активність білка РООІ -1, як описано авторами.

Технології комп'ютерного моделювання та пошуку дозволяють ідентифікувати сполуки або поліпшити вже ідентифіковані сполуки, які можуть модулювати експресію або активність РОБИ -1. Після ідентифікації такої сполуки або композиції ідентифікують активні місця або ділянки. Такі активні місця зазвичай є місцями зв'язування для природного модулятора активності. Активне місце ідентифікують, застосовуючи відомі спеціалістам способи, включаючи, наприклад, визначення з-поміж амінокислотних послідовностей пептидів, нуклеотидних послідовностей нуклеїнових кислот, або на основі дослідження комплексів відповідної сполуки або композиції з її природним лігандом. В останньому разі застосовують хімічні або рентгенівські кристалографічні способи для пошуку активного місця шляхом визначення місцезнаходження на факторі модулятора (або ліганду).

Хоча вищеописане стосувалося проектування та вироблення сполук, які можуть змінювати зв'язування, також є можливим відбір серед бібліотек відомих сполук, включаючи природні продукти або синтетичні хімічні речовини та біологічно активні матеріали, включаючи білки, на наявність сполук, які зв'язуються з білком

РБІЇ-1 і спричинюють виснаження Т-клітин і/або викликають апоптоз Т-клітин.

Іп мйто системи можуть бути призначені для ідентифікації сполук, здатних взаємодіяти з РОС -1 (або доменом РБї -1). Ідентифіковані сполуки можуть бути корисними, наприклад, для модулювання активності Т- клітин, як описано авторами, і, таким чином, можуть бути корисними для лікування станів, пов'язаних з надмірною або небажаною опосередкованою Т-клітинами імунною реакцією або надмірною або небажаною проліферацією Т-клітин, такою як запалення, аутоіїмунність, відторгнення трансплантатів, алергічний стан або

Т-клітинний рак.

Принцип аналізів, застосованих для ідентифікації сполук, які зв'язуються з РОЗИ -1, включає приготування реакційної суміші РОСІЇ -1 (або його домену) та випробуваної сполуки в умовах і протягом часу, які є достатніми для взаємодії і зв'язування двох компонентів, таким чином, утворюючи комплекс, який може бути видалений і/або виявлений у реакційній суміші. Види РБИЇ -1 можуть бути різними, залежно від мети аналізу з відбором. У деяких ситуаціях перевагу віддають застосуванню пептиду, який відповідає доменові РО -1, злитому з гетерологічним білком або поліпептидом, що дозволяє скористатися перевагами в аналітичній системі (наприклад, міченням, виділенням утвореного в результаті комплексу і т. ін.).

Аналізи з відбором здійснюють різними шляхами. Наприклад, один спосіб здійснення такого аналізу включає заякорювання білка РБОЇ -1, поліпептиду, пептиду або злитого білка або випробуваної речовини на твердій фазі і виявлення комплексів РОЗИ -/ випробуваної сполуки, заякорених на твердій фазі наприкінці реакції. В одному варіанті втілення такого способу реагент РОЇ -1 може бути заякорений на твердій поверхні, і випробувану сполуку, яка не є заякореною, прямо або непрямо мітять.

На практиці зручним є застосування мікротитрувальних планшетів як твердої фази. Заякорений компонент іммобілізують шляхом нековалентного або ковалентного зв'язування. Нековалентне зв'язування здійснюють шляхом простого вкривання твердої поверхні розчином білка та висушування. В альтернативному варіанті застосовують іммобілізоване антитіло, краще - моноклональне антитіло, специфічне до білка, який має бути іммобілізований, для заякорювання білка на твердій поверхні. Поверхні підготовляють заздалегідь і зберігають.

Для здійснення аналізу неїммобілізований компонент додають до вкритої поверхні, що містить заякорений компонент. Після завершення реакції непрореаговані компоненти видаляють (наприклад, шляхом промивання) в умовах, за яких будь-які утворені комплекси залишаються іммобілізованими на твердій поверхні. Виявлення комплексів, заякорених на твердій поверхні, здійснюють різними способами. Якщо попередньо не іммобілізований компонент є попередньо міченим, виявлення мітки, іммобілізованої на поверхні, означає, що утворилися комплекси. Якщо попередньо не іммобілізований компонент не є попередньо міченим, застосовують непряму мітку для виявлення комплексів, заякорених на поверхні; наприклад, застосовуючи мічене антитіло, специфічне до попередньо не іммобілізованого компонента (антитіло, в свою чергу, може бути прямо мічене або непрямо мічене міченим антитілом проти Ід).

В альтернативному варіанті реакцію здійснюють у рідкій фазі, продукти реакції відокремлюють від непрореагованих компонентів і виявляють комплекси; наприклад, застосовуючи іммобілізоване антитіло, специфічне до білка РБСИІ-1, поліпептиду, пептиду або злитого білка або випробуваної сполуки для заякорювання будь-яких комплексів, утворених у розчині, та мічене антитіло, специфічне до іншого компонента можливого комплексу, для виявлення заякорених комплексів.

В альтернативному варіанті застосовують аналізи на основі клітин для ідентифікації сполук, які взаємодіють з РООІ-1. Для цього застосовують лінії клітин, які експресують Ра -1, або лінії клітин, піддані генній інженерії для експресії РБОЇ-1. Аналізи на основі клітин є особливо корисними для оцінки функціонального впливу сполуки, ідентифікованої шляхом описаного авторами відбору. Наприклад, відразу після ідентифікації сполуки на основі її здатності до зв'язування з білююом РОСИ -1 сполуку випробують на її здатність, наприклад, до викликання апоптозу Т-клітин іп міо або іп мімо або виснаження Т-клітин іп міїго або іп мімо.

Фармацевтичні композиції

Якщо метою даного винаходу є зміна імунної реакції в організмі суб'єкта, фармацевтична композиція, яка містить, наприклад, антитіла, мультимерні сполуки, малі молекули або інші сполуки, які специфічно зв'язуються з поліпептидами РОСІЇ -1, також є особливістю винаходу. В оптимальному прикладі сполука функціонує як агоніст РЕСЗЇ -1.

Фармацевтичні композиції для застосування згідно з даним винаходом рецептують традиційним шляхом, застосовуючи один або кілька фізіологічно прийнятних носіїв або наповнювачів. Таким чином, сполуки та їх фізіологічно прийнятні солі та сольвати рецептують для введення різними шляхами.

Сполуки рецептують для парентерального введення шляхом ін'єкції, наприклад, шляхом болюсної ін'єкції або безперервного вливання. Композиції для ін'єкцій можуть існувати у формі дозованих одиниць, наприклад, в ампулах або багатодозових вмістищах, з додаванням консерванта. Композиції можуть бути у формі суспензій, розчинів або емульсій в олійних або водних носіях і можуть містити агенти, які застосовують при рецептуванні, такі як суспендуючі агенти, стабілізатори та/"або диспергатори. В альтернативному варіанті активний інгредієнт може бути у формі порошку для змішування перед застосуванням з відповідним носієм, наприклад, стерильною водою без пірогену.

Способи контролювання опосередкованої Т-клітинами імунної реакції та виснаження популяцій Т-клітин

Сполуки на зразок тих, які є детально описаними у зв'язку з відбором, можуть бути корисними, наприклад, при модулюванні біологічної функції, опосередкованої поліпептидом РБаї -1, та/або для лікування порушень, пов'язаних з надмірною або небажаною імунною реакцією, наприклад, опосередкованою Т-клітинами імунною реакцією. До цих сполук належать, крім інших, пептиди, антитіла та їх фрагменти, а також інші органічні сполуки, які зв'язуються з РО(Ї-1 на поверхні Т-клітин і викликають шлях трансдукції сигналу, який в результаті призводить до смерті Т-клітини. Способи згідно з винаходом необов'язково включають додавання агента зшивання, який викликає зшивання РОСІЇ -1 на поверхні клітини. Описані авторами сполуки можуть застосовуватись у будь-якому разі, коли вимагається виснаження або усунення активності Т-клітини. До станів, для лікування яких особливо придатними є сполуки згідно з винаходом, належать запальні хвороби, аутоімунні хвороб, відторгнення трансплантатів, алергічні хвороби та Т-клітинний рак.

Прикладами станів, які піддають лікуванню з застосуванням описаних авторами сполук проти РБОЇ -1, належать, крім інших, цукровий діабет, артрит (включаючи ревматоїдний артрит, ювенільний ревматоїдний артрит, остеоартрит та псоріатичний артрит;, розсіяний склероз, енцефаломієліт, злоякісна міастенія, системний еритематозний вовчак, аутоїмунний тиреоїдит, дерматит (включаючи атопічний дерматит та екзематозний дерматит), псоріаз, синдром Шегрена, хвороба Крона, афтозна виразка, запалення райдужної оболонки ока, кон'юнктивіт, кератокон'юнктивіт. діабет І типу, запальні хвороби кишечника, виразковий коліт, астма, алергічна астма, шкірний еритематозний вовчак, склеродерма, вагініт, проктит, медикаментозні висипи, лепрозні зворотні реакції, егултета подозит Іергозит, аутоїмунний увеїт, алергічний енцефаломієліт, гостра некротизуюча геморагічна енцефалопатія, ідіопатична двостороння прогресуюча нейросенсорна втрата слуху, апластична анемія, справжня еритроцитарна анемія, ідіопатична тромбоцитопенія, поліхондрит, гранулематоз

Вегенера, хронічний активний гепатит, синдром Стівенса-Джонсона, ідіопатичні трофічні афти, плоский лишай, базедова хвороба, саркоїдоз, первинний біліарний цироз печінки, задній увеїт, інтерстиціальний фіброз легенів, реакція "трансплантат проти хазяїна", випадки трансплантації (включаючи трансплантацію з застосуванням алогенних або ксеногенних тканин), такі як трансплантація кісткового мозку, трансплантація печінки або трансплантація будь-якого органа або тканини, різні види алергії, такі як атопічна алергія, СНІД та

Т-клітинні новоутворення, такі як лейкемії та/або лімфоми.

Способи згідно з винаходом застосовують для виведення Т-клітин з популяції клітин, іп міго або іп мімо.

Наприклад, біологічний зразок, взятий з організму суб'єкта, може бути звільнений від Т-клітин іп міго шляхом контакту зразка з описаною авторами сполукою проти РОС -1, необов'язково разом з агентом зшивання. Цей спосіб може бути корисним, якщо зважати, наприклад, на збільшення клітин, які не є Т-клітинами, у популяції клітин, а також шляхом зниження або усунення активності Т-клітин у популяції клітин.

Далі представлено приклади практичного втілення винаходу. Вони не повинні тлумачитись як такі, що якимось чином обмежують обсяг винаходу.

Приклади

Приклад 1: Одержання моноклонального антитіла проти білка, який викликає апоптоз Т-клітин ("ТА!ІР")

ТАІР-специфічне моноклональне антитіло одержували шляхом застосування загальновідомих способів злиття клітин за Колером та Мільштайном (Копіег апа Міївівїп (1976) Еигореап дошгпаї! ої Іттипоіоду 6:511- 519)) для одержання гібридоми, яка секретує потрібні антитіла. Клітини, які виробляють антитіло, взяті у хом'яка, якому шляхом ін'єкції вводили активовані конканаваліном А (Соп А) Т-клітини Ваїр/с селезінки, зливали з лінією клітин мієломи для утворення антитіла, яке секретує гібридому. Дві популяції клітин зливали з поліетиленгліколем, і одержані в результаті клітини, які виробляють антитіло, клонували і розмножували стандартними способами з застосуванням тканинної культури. Одна гібридома, вироблена згідно з цими способами, секретувала моноклональне антитіло під назвою ТАВА, яке було здатне викликати апоптоз Т- клітин іп міо і виснажувати Т-клітини іп мімо. Білок, який розпізнавався антитілом ТАВА4, визначали як білок, який викликає апоптоз Т-клітин (ТАЇ!Р).

Мишей С5781/62У (86) та ВА! В/с придбавали у даскбвоп Іаб (Ваг Набог, МЕ). Сирійських хом'яків придбавали у Апіта! Соге Расіїйу, Медичний коледж національного університету Тайваню (Маїйопаї! Таїмап

Опімегзйу Меаїса! СоПеде).

Концентрований супернатант культури гібридоми ТАВА центрифугували у кількості 20000 х г протягом 10 хвилин і супернатант розводили у співвідношенні 1:1 зв'язувальним буфером (0,1М ацетату натрію, рн5,0).

Колонку з С-білком (об'єм шару приблизно 1мл) тричі промивали 3-5мл зв'язувального буфера. Очищений супернатант культури подавали на колонку з Сс-білком і проточну рідину збирали і знову подавали на колонку.

Колонку промивали 6-10мл зв'язувального буфера і зв'язане антитіло елюювали з колонки за допомогою 5мл елююючого буфера (0,1М гліцину-НСІ, рнг,8). Кожна фракція містила їмл елюйованого антитіла, і елюйовану фракцію доводили до нейтрального рівня рН шляхом змішування кожного їмл фракції з 50 мікролітрами 1М

Тгів-НСЇ, рнН7,5. Фракції, які містили антитіло, об'єднували і тричі діалізували 2 літрами РВ5, рнН7 4 по три години на кожен діаліз. Концентрацію білка у зразках антитіла визначали за допомогою процедури, описаної

Бредфордом (Вгадюга), застосовуючи аналіз білка Віо-Ваа (ВІО-НАБ, Негсшев, СА).

Приклад 2: Одержання суспензії клітин селезінки мишей і активація та збагачення Т-клітин

Селезінку мишей занурювали у Змл збалансованого соляного розчину Хенка (НВ55), злегка подрібнювали стерильним покривним склом, переносили у 15мл центрифугувальну пробірку (Совіаї) і центрифугували у кількості 200 х г протягом 5 хвилин. Супернатант зливали і осад з клітинами ресуспендували у залишковому буфері шляхом легкого обстукування стінок. Забруднюючі еритроцити (АВС) піддавали лізисові шляхом додавання 1мл лізисного буфера для АВС (0,6М МНАаСІ, 0,17М Тгіз-основи, рН7,65), після чого здійснювали 2- хвилинну інкубацію при кімнатній температурі і швидке гасіння Умл НВ55. Клітини осаджували у кількості 200 х г протягом 5 хвилин, двічі промивали і ресуспендували у середовищі АРМІ. Концентрацію і життєздатність клітин у суміші визначали за допомогою гемоцитометра (Сатбгідде Зсієпійіс Іпс.) та виключення трипанового синього.

Клітини селезінки доводили до кінцевої концентрації З Х 10б/мл за допомогою середовища ВРМІ і додавали конканавалін А до кінцевої концентрації 2 мікрограма/мл для активації Т-клітин. Суспензію клітин переносили до 6б-лункового планшета (5мл/лунку) або 10-сантиметрові чашки для культивування (1О0мл/чашку) і інкубували при 37"С, 595 СО», протягом 48 годин перед збиранням. Активовані клітини селезінки, включаючи активовані Т-клітини, ресуспендували у Змл НВ55 і обережно переносили на 5-мілілітровий шар підкладки з 5595 розчину Перколл у центрифугувальній пробірці. При цьому намагалися не порушити відокремлені шари.

Клітини безперервно центрифугували у кількості 1900 х г протягом 13 хвилин при 25"С. Збагачені Т-клітини збирали з контактної поверхні між двома шарами, двічі промивали НВ55, і після цього вони були готовими до експериментів.

Приклад 3: Апоптоз активованих Т-клітин

Активовані Т-клітини (див. Приклад 2) ресуспендували до кінцевої концентрації 5 Х 10Зклітин/мл. у середовищі АРМІ, яке містило 5нг/мл 1І--2, і обробляли контрольним Ід, ТАВА або анти-СОЗ згідно з умовами, показаними у Таблиці 1.

Таблиця 1

Експери- ментальні Обробка " групи

Негативний /|Змкг/мл Ід хом'яка контроль Бнг/мл 1-2

Змкг/мл крос-лінкерного антитіла

Ід проти хом'яка)

ТАВаА Змкг/мл ТАВА тАбБ хом'яка

Бнг/мл 1-2

Змкг/мл крос-лінкерного антитіла

Ід проти хом'яка

Позитивний | мкг/мл анти-СОЗ тАб контроль 5нг/мл І -2 1Тмкг/мл крос-лінкер антитіло (Ід проти миші) 7; Кінцева концентрація зазначених реагентів у середовищі.

Після періоду інкубації, який триває 18-24 годин, визначали ступінь апоптозу в кожній культурі, застосовуючи аналіз апоптозу 7-ААЮ. Оброблені клітини переносили у пробірки РАС5 (Раїсоп), двічі промивали крижаним розчином БАС5 (195 ембріональної телячої сироватки, 0,0595 азиду натрію у РВ5), осаджували у кількості 200 х г при 4"С. Клітини ресуспендували у крижаному розчині ЕАС5 до кінцевої концентрації 1-2х10"клітин/мл. Для забарвлення 0,1мл ресуспендованих клітин змішували з 7-ААО до кінцевої концентрації 2мкг/мл, а потім інкубували при 4"С у темряві протягом 20 хвилин. І нарешті, забарвлені клітини двічі промивали крижаним розчином ЕАС5, ресуспендували у 0,5мл розчину ГАС5 і аналізували шляхом проточної цитометрії на ВО І 5А (Вескюп Оіскізоп).

Фіг.1 показує результати репрезентативного експерименту зі змінами у часі, в якому досліджували, коли активовані Т-клітини набувають чутливості до опосередкованих ТАВА (анти-ТАІР) апоптозних сигналів.

Спленоцити мишей активували Соп-А і тримали у середовищі, яке містило ІІ-2. Активовані Т-клітини збирали, ресуспендували, і перевіряли на імунність моноклональним антитілом ТАВА або контрольним да хом'яка у присутності антитіла проти Ідс хом'яка як крос-лінкера. Здатність зшивання ТА!ІР до викликання низького рівня (6,595) апоптозної смерті клітин виявлялася у перший день. Однак ступінь викликаного ТАВ4А4 апоптозу збільшувався з 17905 на 2-й день, досягав піку 5295 на 4-й день і знижувався до 4495 на 6-й день. Контрольний

Ід хом'яка не викликав специфічної апоптозної смерті Т-клітин, порівняно з культурами, які отримували лише

І--2. Апі-СОЗ (як позитивний контроль) викликав апоптоз у 3895 Т-клітин через 48 годин активації (дані не показано).

Приклад 4: Експресія антигену ТАЇР у різних тканинах

Клітини двічі промивали крижаним розчином ЕАС5 (195 ембріональної телячої сироватки. 0,0595 азиду натрію у РВ5) і центрифугували у кількості 200 х г при 4"С у пробірці ЕАСЗ5 (Раїсоп). Клітини ресуспендували у крижаному розчині ЕАСЗ5 до кінцевої концентрації 1 х 10"клітин/мл і аліквоту 0,1мл ресуспендованих клітин у пробіці ЕАС5 (Раісоп) застосовували для кожного аналізу. Для поверхневого забарвлення до клітин додавали моноклональне антитіло ТАВА або контрольний Ід хом'яка у кінцевій концентрації 2мкг/мл і суміші інкубували при 4"С протягом 30 хвилин у темряві. Клітини промивали один раз крижаним ЕАС5Б, а потім забарвлювали: (1) для клітин селезінки - цихром-кон'югованим антитілом проти СОЗ (2мкг/мл), ЕІТО-кон'югованим Ід проти хом'яка та РЕ-кон'югованим антитілом проти СО8/С04/С2019/С011р/рап-МК/-А/-Е/Мас-3 (2мкг/мл) у 100мкл крижаного розчину БАС; і (2) для клітин вилочкової залози -РІТО-кон'югованим Ід проти хом'яка, РЕ- кон'югованим анти-СО8 та цихром-кон'югованим анти-СО4 антитілами (2мкг/мл) у 100 мкл крижаного розчину

ЕАС5. Реакцію здійснювали при 4"С протягом 30 хвилин у темряві. | нарешті, забарвлені клітини двічі промивали крижаним розчином ЕАС5, ресуспендували в їмл розчину ГАС5 і піддавали аналізові шляхом проточної цитометрії на ВО І 5А (Вескюп Оіскізоп). фіг.3 та 4 демонструють через аналіз ЕАС5 розподіл антигену ТАЇ!Р на різних субпопуляціях спленоцитів та тимоцитів. Як показано на Фіг.3, клітини СО19" В експресували низьку, але таку, що піддається виявленню, кількість білків ТАІР на поверхні. Значну вищу кількість білків ТАІР виявляли на СОЮЗ» Т-клітинах та фракції МК- клітин. Більшість Т-клітин вилочкової залози СО", СО8" та СО4787 експресували значну кількість білків ТАІР.

Натомість, білки ТАІР експресувалися лише на невеликій популяції Т-клітин СО4-8: вилочкової залози (Ффіг.4).

Тканини з мишей Вб та ВАЇ Б/с, включаючи головний мозок, вилочкову залозу, серце, легені, печінку, шлунок, нирки, селезінку та шкіру, збирали, фіксували у 1095 формальдегіді до наступного дня при кімнатній температурі і включали у парафінові блоки. Зрізи тканин по 4 мкм завтовшки, брали з парафінових блоків за допомогою мікротома І єїса АМ2135, поширювали у 457 воді і клали на предметне скло. Скельця висушували при 37"С, і після цього вони були готові до наступних експериментів.

Скельця, які містили зрізи тканини у парафіні, депарафінізували і висушували серіями ксилол-10095 етанол згідно зі стандартним протоколом і, нарешті, тримали у 10095 етанолі. Зрізи піддавали регідратації шляхом серійних інкубацій в 10095 етанолі-9095 етанолі-8595 етанолі-7095 етанолі-РВ5 згідно зі стандартним протоколом до кінцевого розчину у РВ5. Усі представлені нижче реакції здійснювали у зволоженій камері.

Неспецифічне зв'язування блокували шляхом інкубації зрізів тканин у блокуючому буфері (195 нормальної сироватки кози) протягом 1 години при кімнатній температурі (або 4"С до наступного дня). Блокуючий буфер видаляли і до зрізів додавали ТАВА або нормальний Ід хом'яка (розведення 1:200) і інкубацію продовжували ще протягом години при кімнатній температурі (або 4"С до наступного дня). Зрізи двічі промивали у РВБ5, кожен по 5 хвилин, для видалення первинного антитіла, піддавали реакції з розведеним 1:250 кон'югованим з лужною фосфатазою Ід кози проти хом'яка і інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. Зрізи знову двічі промивали РВ5, по 5 хвилин кожен, для видалення кон'югату антитіло-фермент і кольорову реакцію проявляли субстратним розчином ВСІР/МВТ при кімнатній температурі протягом 30 хвилин у темряві.

Зрізи знову промивали РВ5 для видалення надлишкового ферментного субстрату, дегідратували серіями

РВ5-етанол-ксилол і закріпляли на склі для мікроскопі.

Результати показували, що експресія білків ТАІР виявлялася лише у тканинах, які походили від кісткового мозку, але не на решті випробуваних тканин.

Приклад 5: Біотинілування поверхні клітини та імунопреципітація антигену ТАІР

Клітини 5 х 107 ВІ 41 або МІН-3Т3 піддавали біотинілуванню поверхні в їмл РВ5, який містив 0,5мг/мл сульфо-МН5-біотину (Рієгсе) протягом 30 хвилин на льоду. Реакцію припиняли шляхом інкубації клітин з 0,5мл модифікованого Дульбекко середовища Ігла (Ге Тесппоіодієв, Іпс.) протягом 10 хвилин на льоду. Клітини один раз промивали їмл модифікованого Дульбекко середовища Ігла і двічі - їмл фосфатно-буферного розсолу.

Мічені клітини піддавали лізисові при густині 5,0 х 10"клітин/мл у холодному лізисному буфері (195 Тіп Х- 100, 20мМ Тіів-НСЇ, рна,0, 160мМ Масі, 1мМ Сасі»), який містив повний коктейль інгібітора протеази (НКоспе) протягом 15 хвилин і нерозчинний матеріал осаджували у кількості 10000 х г протягом 10 хвилин; ці та всі наступні етапи здійснювали при 4"С. Для імунопреципітації лізат попередньо інкубували протягом 30 хвилин з 5Омкл Сі-білка-сефарози (Атегепат РНагтасіа Віоїесії) для видалення білків, які неспецифічно зв'язуються.

Кульки осаджували і аліквоти супернатанту (які зазвичай відповідають 5,0 х 10 клітин) інкубували з 20мкл (- білка-сефарози з попереднім введенням 1Омкг тАр ТАВ4 або ІдсС;ї з нормальної сироватки хом'яка. Після інкубації протягом 4год. при 4"С смолу промивали чотири рази промивальним буфером (0,0595 Типйоп Х-100, 50мММ Тіїз-НСЇ, рнНе,5, 400мМ Масі, їмм Сасі», Імг/мл яєчного альбуміну), двічі - подібним промивальним буфером, який містив 250мММ замість 400мМ Масі. Білки, специфічно зв'язані з ТАВА, елюювали з 50мкл 1х505 буфера для зразка. Елюйовані білки відокремлювали за допомогою 895 505-РАСЕ і переносили на нітроцелюлозну мембрану (МіШроге). Фільтри піддавали аналізові на біотиніловані білки кон'югованим з пероксидазою авідином (РпагМіпдеп) і проявляли хемілюмінесцентним реагентом (МЕМ"М |Ме Зсієпсе

Ргодисів).

Як показано на Ффіг.2, біотинілований поверхневий білок з молекулярною масою приблизно 120кДа ідентифікували за допомогою ТАВА у клітинах ВІ 21 (клітини ТАЇІР" Т-), але не у клітинах 373 (клітини ТАЇР").

Натомість с-білок-сефароза, вкрита нормальною сироваткою хом'яка, не може відшукувати цей 120-кДа білок.

Ці результати свідчать, що цей 120-кДа білок є антигеном, розпізнаним моноклональним антитілом ТАВА на поверхні клітини Т-клітин.

Приклад 6: Виснаження Т-клітин іп мімо

Для дослідження впливу ТАВ4 на популяцію Т-клітин та інших клітин іп мімо мишам шляхом внутрішньочеревинної ін'єкції вводили З0Омкг ТАВА4 контрольного ІД хом'яка і на 4-й день спленоцити, тимоцити та мононуклеари периферичної крові збирали для підрахунку загальної кількості клітин і для аналізів маркерів поверхні клітин за допомогою ЕАС5.

Для аналізів БАС клітини фіксували 295 параформальдегідом при 4"С протягом 20 хвилин, двічі промивали і ресуспендували у крижаному розчині ЕАС5 до кінцевої концентрації 1х10"клітин/мл. Для кожного аналізу застосовували аліквоту 100мкл ресуспендованих клітин у пробірці ЕАС5 (РаїЇсоп). До клітин додавали

ТАВА або контрольний Ід хом'яка у кінцевій концентрації 2мкг/мл і суміші інкубували при 4"С протягом 30 хвилин у темряві. Клітини промивали один раз крижаним ЕАСЗ і піддавали реакції: (1) для клітин селезінки - з цихром-кон'югованим антитілом проти СОЗ (2мкг/мл), ЕІТО-кон'югованим Ід проти хом'яка та РЕ-кон'югованим антитілом проти СО8В/С04/С019/2011Б/рап-МК/-А/-Е/Мас-3 (2мкг/мл) у 100мкл крижаного розчину ЕАС5; і (2) для клітин вилочкової залози - з ЕІТО-кон'югованим Ід проти хом'яка, РЕ-кон'югованим анти-СО8 та цихром- кон'югованим анти-СО4 антитілами (2мкг/мл) у 100мкл крижаного розчину ЕАС5. Реакцію здійснювали при 4"7С протягом 30 хвилин у темряві. | нарешті, забарвлені клітини двічі промивали крижаним розчином ЕАС5, ресуспендували у 1000мкл розчину ГАС5 і піддавали аналізові шляхом проточної цитометрії на ВО І 5А (Вескюоп Оіскізоп).

Через чотири дні після ін'єкції відсоток СОЮЗ" Т-клітин у лейкоцитах периферичної крові (РВІ) знизився з 36,796 у контрольних мишей до 4,195 у мишей, які отримували ТАВА (Таблиця 2). Обробка ТАВА викликала невелике зниження загальної кількості спленоцитів. Однак у мишей, які отримували ТАВА4, спостерігали 6290 зниження у кількості СОЮЗ" Т-клітин, 5095 зниження у кількості МК-клітин і невелике підвищення загальної кількості СО19-- В клітин. Загальна кількість тимоцитів, взятих у мишей, які отримували ТАВА, становила лише 4895 від рівня, який спостерігали у контрольних тварин (зниження на 5295). Крім того, за винятком СО4- Т-

клітин, всі інші СО8-, СО4-С0О08- та С04-СО08- Т-клітини знижувалися, причому субпопуляція СО4-С08-- зазнала найбільш серйозного впливу (зниження на 64,790).

Таблиця 2 срср | 72е | 777777117534. |771711177298 11111068 11111111. | Безобробки | Нормальнийідхом'яка | Обробка ТА-ВА | Виснаження (9) (репрезентативні дані трьох експериментів)

Приклад 7: Антитіло проти ТАЇ!Р не викликає секреції ІІ -2 або ТМЕ-альфа

Мишам Ваїр/с (Н-2а) здійснювали внутрішньочеревинну ін'єкцію 300 мікрограмів ТАВА або контрольного Ід хом'яка. Спленоцити виділяли через 7 днів після ін'єкції і використовували як респондери у культурі з обробленими мітоміцином С СЗН (Н-2К) спленоцитами (як стимуляторами). Через три дні супернатанти культур збирали і вимірювали вміст ІЇ-2 за допомогою ЕГІЗА (РпагмМміпдеп). Як показано на Фіг.5, вироблення

І/-2 пригнічувалося у клітинах-респондерах, які брали у мишей, які отримували ТАВ4, порівняно з контрольними мишами. Рівень у плазмі ІІ -2 та ТМЕ-альфа також піддавали аналізові, і значних розбіжностей у рівні І/-2 (або ТМЕ-альфа) у сироватці контрольних мишей та мишей, які отримували ТАВ4, не помічали.

Оскільки вироблення 1-2 є ключовим чинником активності Т-клітин, результати показують, що специфічне до

ТАЇІР антитіло, таке як ТАВ4А, може бути застосоване іп мімо для маніпулювання Т-клітинами та контролю над небажаними опосередкованими Т-клітинами імунними реакціями, такими як ті, що є пов'язаними з аутоїмунними хворобами та відторгненням трансплантатів.

Приклад 8: Застосування антитіла проти ТАЇІР для запобігання відторгненню трансплантатів

Мишей (придбаних у Часквоп І арогайюгу) віком від 8 до 12 тижнів анестезували ацепромазин малеатом (Гептепіа Апіта! Неаййп Со., Капзаз Сйу, МО). Перед пересадженням шкірного трансплантата мишам- реципієнтам С57ВІ/6 (Н-252), у яких не було видалено вилочкову залозу, робили внутрішньочеревинну ін'єкцію 50Омкг ТАВА або ізотипних контрольних антитіл за сім днів до хірургічної операції з пересадження шкіри.

Через сім днів шкіру з бочка повністю алогенних невідповідних мишей Ваїр/сі (Н-27) пересаджували на бочок мишей С57ВІ/6, яким попередньо вводили антитіло. Через сім днів після трансплантації мишам знову шляхом ін'єкції вводили 500мкг ТАВ4 або ізотипного контрольного антитіла. Мишей спостерігали щодня після трансплантації. Трансплантати вважали відторгненими, якщо 5095 донорської шкіри були змертвілими.

Відсоток виживаності трансплантатів показано на Фіг.7 (п-8). Дані показують, що введення антитіла ТАВА збільшувало виживаність алогенних шкірних трансплантатів.

Приклад 9: Ідентифікація ТА!ІР як РБОИЇ -1

Р-селектин ліганд-1 глікопротєїну (РБОЇ-1), також відомий під назвою СО162, є основним лігандом Р- селектину, який експресується на лейкоцитах, включаючи Т-клітини (Зако еї а!. (1993) СеїІ 75:1179; Масніпо єї аї. (1995) 9. Віої. Спет. 270:21966; МеІйтап еї аї. (1995) 9. Віої. Спет. 270:16470). Біохімічні характеристики

ТА!ІР, такі як його молекулярна маса та його схильність до димеризації, вказували на ймовірність того, що

ТАВ4 може бути аналогічним РОСЇ-1. Для того, щоб дослідити зв'язок між цими двома антигенами, з'ясовували: 1) чи може антиген, осаджений за допомогою ТАВА, бути розпізнаний антитілом проти РБОЇ 1 серійного виробництва; і 2) чи може антитіло проти Р5ОЇІ 1 вивести ТАВА з лізату клітин.

ВІ 41 Т-клітини піддавали лізисові при густині 1.0х1Оклітин/мл у лізисному буфері (195 Тип Х-100, 20мММ

Тив-НСЇ, рна,0, 160мМ Масі, 1мМм Сасі»), який містив повний коктейль інгібітора протеази, протягом 1 години і нерозчинний матеріал осаджували у кількості 10000 х г протягом 10 хвилин. Ці та всі наступні етапи здійснювали при 42С. Лізат, який відповідав 5,х107 клітин, інкубували з 20мкл С-білка-сефарози з попереднім введенням 10 мкг анти-РБаї -І тАбБ (клон 2РНІ, РпагМіпдеп, Зап Оіедо, СА), анти-ТАІР тАБ, ТАВА або да з нормальної сироватки хом'яка. Після інкубації протягом 4 годин при 4"С кульки промивали п'ять разів промивальним буфером (0,0595 Топ Х-100, 50мМ Ттіз-НСЇІ, рна,5, 400мМ Масі, 1мМ Сасі», 1мг/мл яєчного альбуміну) і двічі - подібним промивальним буфером, який містив 250мМ замість 400мМ Масі. Зв'язані білки елюювали з 40мкл 1х505 буфера для зразка. Елюйовані білки відокремлювали за допомогою 695 505-РАСЕ і переносили на нітроцелюлозну мембрану. Мембрани піддавали імуноблотингові з застосуванням анти-Р5ИЇ - 1 тАБ і виявляли за допомогою пероксидаза-кон'югованим ІдсСь кози проти щура (Н-Ї) з наступною хемілюмінесценцією (Непаїіззапсе, МЕМ).

Поверхневі біотиніловані ВІ 41 Т-клітини піддавали лізисові при густині 1,0 х 108клітин/мл у лізисному буфері. Екстракт клітин інкубували 2Омкг антитіла, зв'язаного з 40мкг с-білка-сефарози при 4"С до наступного дня. Виснаження здійснювали, застосовуючи анти-Р5аї -І тАБ (2РНІ) або контрольний Іда щура, з ТАВА або контрольною сироваткою нормального хом'яка. Виснажені лізати далі піддавали імунопреципітації з застосуванням ТАВА або анти-Р5С21-1 тАБ, відповідно. Імунопреципітати відокремлювали на 695 505- поліакриламідному гелі і виявляли шляхом флюорографії. Як показано на Фіг.б, антитіло проти РОСІ-1 може виводити ТАЇІР білок з лізатів Т-клітин. Крім того, білки, піддані імунопреципітації з застосуванням антитіла проти ТАІР (ТАВА4), можуть бути розпізнані антитілом проти РОСІЇ -1 шляхом вестерн-блот-аналізу.

Приклад 10: Викликання апоптозу у людських Т-клітинах антитілом проти РОС -1

Для визначення ролі, яку відіграє РОСІЇ -1 в апоптозі людських Т-клітин, здійснювали експерименти зі змінами у часі, щоб дослідити, коли активовані людські Т-клітини набувають чутливості до РОЦІ -1- опосередкованих апоптозних сигналів. Людські Т-клітини стимулювали мітогеном фітогемаглютиніну (РНА) і далі поширювали у середовищі, яке містило І/-2. Активовані Т-клітини збирали, а потім перевіряли на імунність за допомогою анти-РБИї -І у присутності ІЇ-2 та зшиваючих антитіл.

Людську периферичну кров брали у здорових дорослих людей, гепаринізували і збагачували на мононуклеари периферичної крові (РВМС) на основі диференційної густини з застосуванням РісоіІ-Радне Рів (Рпагтасіа Віоїеєсп). РВМС активували 195 РНА (Це Тесппоіодієз, СсірсоВвВ|) протягом 48 годин і після цього тримали у рекомбінантному людському 1-2 (Знг/мл) протягом періоду аналізу. Для оцінки здатності до викликання апоптозу антитіла РБаЇ -1 проти людини активовані клітини обробляли: (1) 1мкг/мл клона антитіла проти РБОЇ-1 КРІ-1 (ВО РпатмМміпдеп) та крос-лінкнерним Ід кроля проти миші (0,5мкг/мл) (Часквоп

ІттипоВезеаїгсі І арогаюгієв); (2) ізотипним контрольним очищеним Ід миші та крос-лінкерним Ід кроля проти миші; або (3) лише крос-лінкерним Ід кроля проти миші. Після шести годин обробки визначали відсоток ранніх апоптозних клітин шляхом ЕАС5, з забарвленням анти-Аппехіп М (ВО РнагМіпдеп) та РІ (Зідта).

Як показано на Фіг.8, сигнал, викликаний РБОЇ -1 з застосуванням антитіла проти РОС -1 та крос-лінкера викликав значний рівень апоптозу у РНА-активованих людських РВМСОС (здебільшого Т-клітинах). Відсоток апоптозних клітин збільшувався з 8,595 на 3-й день до 2495 на 8-й день в оброблених анти-Р5ИІ-1 культурах.

Ні ізотопний узгоджений контроль, ні саме лише зшивання антитіла не мали жодного впливу на ці клітини.

Приклад 11: Застосування антитіла проти агоніста РОЇ -1 для лікування аутоїмунної хвороби

Мишей з діабетом без ожиріння (МОБ), ретельно відібраних тварин з аутоїмунним діабетом, розводили у стандартних умовах. Спонтанний діабет розвивався у МОЮ-мишей у віці приблизно 20 тижнів. В експериментальній групі мишам внутрішньочеревинно вводили три дози антитіла проти РБОИІ-1 (ТАВ4) у кількості ЗООмкг на мишу у віці 14, 15 та 17 тижнів. Дві додаткові ін'єкції однакової дози вводили у віці 24 та 26 тижнів. Контрольній групі вводили Ід хом'яка в такій самій дозі. Мишей спостерігали на рівень глюкозурію за допомогою Меаі-Теві Ссійсозе (Маспегеу-Мадеї, Німеччина) двічі на тиждень по досягненню віку 15 тижнів.

Рівень глюкози у сечі після їди понад 300 мг/дл для двох послідовних вимірювань вважали діабетичним.

Як показано на фіг.9, введення антитіла ТАВА (анти-Р5ИЇ -1) забезпечувало значний захист порівняно з введенням контрольного антитіла. Таким чином, введення антитіла проти РОЇ -1 може послабити активність аутоїмунних Т-клітин і затримати початок діабету І типу.

Приклад 12: Зв'язування Р-Селектину, Е-Селектину та І -Селектину з активованими Т-клітинами

Для визначення здатності селектинів (Р-Селектину, Е-Селектину та І-Селектину) до зв'язування з активованими Т-клітинами щойно підготовлені спленоцити мишей С57ВІ /6 активували і збирали на 2, 4 та 6-й дні. Неактивовані Т-клітини (тобто, щойно підготовлені спленоцити на 0-й день) також піддавали аналізові.

Зразок на 2-й день включав Зх109клітин/мл спленоцитів, які активували 2мкг/мл конканаваліну А (Соп А) у

ОМЕМ--1095 ЕВ5 протягом 2 днів. Живі клітини відокремлювали за допомогою Рісої! градієнта. Зразок на 4-й день одержували з клітин, які активували Соп А протягом З днів, і тримали у середовищі, яке містило 5нг/мл

І--2, протягом ще одного дня. Зразок на 6-й день одержували з клітин, які активували Соп А протягом З днів, і тримали у 5нг/мл ІІ -2 протягом З днів.

Для оцінки зразків шляхом аналізу ЕАС5 2х105 клітин на лунку, взятих на 0, 2, 4 та 6-й дні, інкубували при 4"С протягом 30 хвилин з 40мкл/лунку Р-Селектину, Е-Селектину або І-Селектину мишей, злитого з Ес- ділянкою людського ІДС (80 Зузієтв, Міппеароїїх, ММ) у концентрації від 20мкг/мл з дворазовим серійним розведенням до 0,156мкг/мл. Після інкубації клітини промивали буфером їх ЕАСбсап (1 х РВ5 без іонів кальцію та магнію від Віоспгот Ас, Вепіп і 295 ЕВ5). Зразки далі інкубували при 4"С протягом 30 хвилин з 95мкл/лунку анти-Тпу1.2 та вторинним реагентом (РІТС-Іда проти людини, який є специфічним до фрагмента

Ес, який отримували від Часкхоп ІттипоВезеагсі І арогаюгез, Іпс., МУев5і Сгоме, РА) у кількості 3,25мкг/мл, а потім промивали буфером їх ЕАС5сап.

Результати аналізу ЕАС5Саїїриг показано на Фіг.10. При 20мкг/мл зв'язування Р-селектину з активованими

Т-клітинами миші поступово підвищувалося, досягало піку на 4-й день і дещо знижувалося на 6-й день.

Зв'язування Е-селектину значно зростало з 2-го по 4-й дні, а потім залишалося на піковому рівні на 6-й день.

Зв'язування І -селектину з активованими Т-клітинами мишей не виявлялося і не змінювалося протягом періоду активації, тобто, з 0 по 6-й дні. Результати, які спостерігали з І-Селектином, могли бути зумовлені явною низькою афінністю зв'язування І-селектину з його лігандом. Подібні результати також одержували, коли в експериментах застосовували нижчі концентрації трьох селектинів.

Приклад 13: Мультимерні форми Е-Селектину та Р-Селектину викликають апоптоз активованих Т-клітин 96-лунковий планшет (МОМ) вкривали 5Омкл Ес Ід проти людини у кількості 20мкг/мл у їхРВ5 при 4"С до наступного дня, блокували за допомогою 195 В5А при 37"С протягом 2 годин і інкубували з 50мкл злитого селектину-людського Ес (від 0,063 до 5мкг/мл) при кімнатній температурі протягом 2 годин. На всіх етапах експерименту кожну лунку п'ять разів ретельно промивали їхРВ5. Потім у кожну лунку додавали 2х109 попередньо активованих Соп А протягом чотирьох днів Т-клітин і інкубували при 37"С протягом 5 годин перед центрифугуванням планшетів у кількості 200 х г протягом 5 хвилин при 4"С. Утворений в результаті осад, який містив активовані Т-клітини, інкубували з кон'югатом Аппехіп М-біотин при кімнатній температурі протягом 15 хвилин, а потім авідиновим кон'югатом (ЗА-реїа-да! при розведенні 1:5000) ще протягом 30 хвилин при 37"С.

При кожній реакції зв'язування кожну лунку тричі промивали зв'язувальним буфером Аппехіп М. Кольорового проявлення досягали шляхом інкубації 11Омкл суміші 2-буфера (54мкл 2-меркаптоетанолу у 20мл 2-буфера) і

ЗОмкл ОМР (0,04г/1Омл) при 4"С до наступного дня. Записували показники оптичної густини при 420нм.

Рівень викликаного селектином апоптозу активованих Соп-А Т-клітин зростав зі збільшенням концентрації (з 0,06Змкг/мл до 5мкг/мл) Р-селектину (Ффіг.11А) або Е-селектину (Фіг.118), злитого з Ес людського да.

Антитіло ТАВ4А хом'яка викликає апоптоз активованих Т-клітин (див. Приклад 1), і його у цих експериментах застосовували як позитивний контроль Як негативний контроль, Ес проти людини, людський Ід (НіІд) та В5А не викликали апоптозу. Значного апоптозу не виявляли у присутності злитого білка І -селектину та людського Ес (Фіг.11С), що відповідало нездатності І|-селектину до належного зв'язування з активованими Т-клітинами (Приклад 12).

Отже, зв'язаний на планшеті злитий білок, який містив Ра -1-зв'язувальний фрагмент Р-селектину або

Е-селектин та фрагмент людського Ес, викликав апоптоз активованих Т-клітин

Приклад 14. Зшивання розчинного злитого білка Р-Селектин-Ес викликає апоптоз активованих Т-клітин

Селектини мишей (Р-Селектин, Е-Селектин та І-Селектин) зливали з Ес ділянкою людського ІДС, як детально описано вище, для утворення розчинних димерних злитих білків. Для того, щоб визначити, чи можуть розчинні селектини викликати апоптоз активованих Т-клітин, здійснювали експеримент, як детально описано у Прикладі 13, за винятком того, що при цьому не використовували зв'язаний на планшеті Ес Ід проти людини Незначний або низький рівень апоптозу активованих Т-клітин спостерігали у присутності лише розчинної форми злитого білка Р-селектину (димеру) (Фіг.12). Однак після додавання крос-лінкера (Бс-дроти людини) апоптозна активність суттєво зросла до приблизно апоптозного рівня, викликаного присутністю зв'язаного на планшеті антитіла, ні Ес проти людини, ні людський Ід (НІд), ні В5А не викликали апоптоз.

Для злитого білка Е-селектин-Ес одержували результати, подібні до тих, які отримували для злитого білка

Р-селектин-Ес. Крім того, згідно з результатами, одержаними для зв'язаного на планшеті (мультимерної форми) І -селектину, розчинна форма злитого білка І -селектину не викликала апоптозу активованих Т-клітин.

Інші варіанти втілення

Слід розуміти, що хоча винахід було описано у зв'язку з його детальним описом, представлений вище опис пояснює, але не обмежує обсягу винаходу Інші аспекти, переваги та модифікації винаходу охоплюються обсягом представленої нижче формули. т що Ї 51.83 о. в яз

Ж вві пт во г | стеження м. Ї й

Б ОЮ г ів 'ТАВа

ЩЕ Інн гі г | 15.76 ї» щи ко г ї о з

А З Ко й з ЕМ

Ден Дечь? 0 День4 День й

Дні після перкниної активації чи.

Яви хлітян; ЕІ. 51 313 до ТА-ВЯ НМ тТА-ВА БМ сш сн В ИН В

Не М п но ч - пт ом вн ли їй а ОН нн в -- ши

АЬ ЇВ: айтитіло, яке застосовують для імунопроннштанії

ТА-Васмовокловпальне антитіло ТА

Ме: нормальна сироватка хом'яка

ФІГ.

я ша Е - соат о я ай олова

Ь с. Але ща - їх шк , ж нь ке «В! ре ї : ; ші ке 51 7 у лая щ- й ВВЕШЬ. с це М хи ки

ЗО зом кН дент

Му Де яй 16 її ій 4 вх «Б Диня ре Я ОК кл нн у таде ОНИ т Оле

Сп цвхром я - ! й т і КА ее ЩЕ КУ і - з пе їх зх я

СОВТ трос. 1

Ї і ' з КІ | Ще

Й Оси 2 ке гл ке ши а м: й й М, кт пет 1. г ЕКОН ння -. в Де Н. ши ри т т я тр я а Яни

СОУ-чихром . .

Бе НН й ік «До : ня в и Ж сі У сив со М - о:

НВ; ша п оай нт - ; й бра ПЕН і ща

ФМ аа хх о

У я ЕК Ки г Я є й

Є ші КУБ кзевя що 1 А І ше вд яв ВО я ех жк НА і

ЗШ асан ся тра роко

Ст цихром ня - ярок то ще з ! Я я ре ї Бі я шт ре: 87 й й В 4 і ж г ков и. мер Б в й їі

Р 5 з- М Я Н пе ож ПпЖих ВОК ско. . 4 "и НА ра ее ї є і ап-і ше я Не с весну тод : ек МЕ

І я ка ке 4 а й, Вюу ; ТАНЯ пак оз об ен

Спи хром

Іа ж лу срех ! свв зва чї 2 -і поту вус ве Що 1 А т .

Кк и ВВ . НИ зе ! ги цен КЕН т КЕ щі кл ва

УЗИН о 51 не | гу ВЕ а МИ ня ї- К 2 х ЕЕ я. дея 5 і: те 1 і г з К у що Її ші си БК і ЩЕ де х я я. С; ак ФЕН ; Креслення шк МОм вк ща и Я зи они т со нн и пла тд вот ще че и "АВЯ тва сОі-пихром сг-8- ї | Ш - СЮ.

А з вх й їщ ії Кк Я ве х КЕ АК ЯНЕ - - вих і т

Ох 5 | НН: р : - І х Вк 1, ; : х ДЕШІ

Крат БИЧ, т рю Кок: хх «г Код меня Роден, я ве яко Я е ей у бе ОО тА тАВа

Г.Я

ДЖ орннннннннннннннннннтянннтттттнтя

ЩЕ Й Ге хом'яка і що впож -ї пи ШИ

Ку Г Е 1

З | | !

Е 3 а Й ай 2 І Н Ї і і ше ше | шки ї с. | й ! От, і п нн ШО Проонайвон ; й НСС... сх Я КЕ ах 4х10

Кількість клітин-респонцерій

ФІ, 5

Блотингз анти РОСА ІВ з ТАБА ка ота ють ою Я ШК Кене но в и НІМ ТЕ ВИ Мини дно ж а и ен оту шт нн С ши ви на МОМ ях ше и ан а в й ит мія т пив пн 00 пи шо 00 ша М и ня я шо КН Я Ком ро ваше сно о нн ей МВТ со У Ее и В ЕВ ша, Б еи

Ше. сс а прое ау

СПЕ мання я в НН (ро РЕСІ-1 ТАВА МНЬ Виснаження: анти-З5і- дО щура

ФІГ. 6 то нини и

Й У щеня | х І

ВО ї ! тк анти - РВС

У, виживаності х х -3- Контроль мшкірних М. с х і трансплантатів. 99 | х і ї

І і 0 г 1 у ! у ! ї х і і же 29 | | и ! | ; у мч

До бенкет фальш оєчьсьскомьена ьо 0 й 10 15 о ко що

Днів після

ФІГ.7

25 дн

Шо анчевасИ АС ! КЕ Кочтральн. КЕ СІ; В

З - ве, !

ГЗНейороабт і 15 ні апоптозу ше ' у

Ін щи и

БО М ше ОЗ ШО ши ше зншс ЗБ В

Денць: З День День Ден Лень 7 День

Ді після активації

ФВ

109 пн

Фо. ше --У-ЇЕ хом'яка дО / - й -- АВ

НЕ Ши че - Я | , дов / я по ж і. ме п Її 89 я ц за дьедннЯ : ; оУ Ї ю- / 04 а | ! з ; ; гу т з й

І 20 22 2А 26

Вік Сейжни) г. 9

Забарвлення селектину мищей (23 мими) во па а нн й

ДО рн птн ; даніх хг Не пана а а а ан пер. до о фреон

Шов панна ти пнететечкнаутттткнитоункнкапстнуднтикнтечякинажии В днснтетт в

Є «о тя кон нн и нин и зо нн п ПЕТ

ШЕ нн вих

ГНН зехевнння деддиовоюке і виш фронт я і вн я ПИ НН п ші

День 0. Девь 2 День 4 День 5

Дні активації

ФІГ. 15

Р-селектни пив п и и ож Ї нання Мені нн ший. БИ і БУК і й я песен інн ин ше і

Ді фонетнятттттннннт В я екшн док ВВ ня : у : кох к «мов ге я й 0.4, ж Я М як. НК ни ни ши шк шк Я ї к Кт д. Ф (7 в шко м е щ в

ФА

Е-седектин п.6. ГО кос по п в С сина ек Син сни и о НО п ' ца Нет нжтія тату нюктнт «ках тт пиджот квт ул нн кі ул жить, ше як ет о 02 Моя заколки ї: зт яю тю тя т телят вот | кт |. їж я і ! у НИ о НВ вини с З Я що 5 ЕЕ Б Б Б ЕЕ Б Б є ш З ще ШЕ ШЕ ШЕ Ф - їх г Ф х шо щ

Є ГУ їв Кл Ф - я

ГІВ

1-селектин 0.8 Ні я лення - лення з як т х і і

ЙО ев менйне ку хкляуюнк ня В стен нантнутнт в текст нт пня Мотттня тент км ше

В

ГяА. і - що 04 | : - й 7 ск шко джень мото жінк пдозжжеаавсяж я дехто нти чне жна нехмві ж ск ожтжнияк і ло ян й Ер н з х ; і А ї г Б Бої шо Фі щ Ге ше ж ши шк НН НН МЕ

Е Ж Ф пк Я - -Ж їй х « 5-й 5 - - ї- - КУ ш КУ май ї її

ФС г пнннннннжжижжлжнжнлжалашюшшаиананннивнни 1

Резчійний Р-сслектин ! і обла ПЕ Ер ЕЕ в В шен а и аа Я Пан а Увеиа ДК ; 03 КИ я ра если я НВО пк, пояс В

Шон и ит Гея из, шир нин Кеди 0,2 до ж й що я я у що ще що МО їх Я уми яні о кола у ТКУ Че і в Веелттте тут а с і

Ї щи ОСИ - и ж ВЕНЬ Мк Ж

ОД рен оте тт я в ван и і пи ин ана ссеи Ба ! ах же хх Я ви і кову пи щі 2 Я

Є -У Ух ще хг - є «З ! Кк рт щ і х ще р) є Н ї В; ; ки

Як а? ! 2 Й

ФІГ.