KR20210043479A - 이중특이성항체를 이용한 nk 세포 활성도 검사 방법 및 이와 관련된 질환의 진단 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이중특이성항체를 이용한 NK 세포 활성도 검사 방법 및 이와 관련된 질환의 진단 방법으로써, NK 세포 상에 구별되는 활성화 수용체인 NKG2D 및 2B4에 특이적인 시너지 활성화를 유발하는 이중특이성항체를 포함하는 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단을 위한 정보를 제공하기 위한 것인 조성물, 키트 및 정보제공방법을 제공한다.

Description

이중특이성항체를 이용한 NK 세포 활성도 검사 방법 및 이와 관련된 질환의 진단 방법{METHOD OF MEASURING OF NK CELL ACTIVITY USING BISPECIFIC ANTIBODY AND DIAGNOSING OF NK CELL ACTIVITY-MEDIATED DISEASE}
이중특이성항체를 이용한 NK 세포 활성도 검사 방법 및 이와 관련된 질환의 진단 방법에 관한 것이다.
NK 세포(natural killer cell)는 선천적 면역 및 후천적(adaptive) 면역계에 중요한 세포독성 림프구의 한 종류이다. NK 세포는 바이러스 감염된 세포나 암세포에 반응하는데, 전형적으로 세포 표면에 MHC(major histocompatibility complex)의 이상 현상을 감지한다. 이러한 NK 세포는 퍼포린(perforin)을 분비해 감염 세포나 암세포의 세포막에 구멍을 내고, 여기에 그랜짐(granzyme)을 내어 이 세포들을 사멸시키는 세포독성을 갖는다.
NK세포의 기능결함은 다양한 질병의 발병과 연관되어 있기 때문에 NK세포 활성은 건강검진, 질환진단 및 예후 측정을 위한 유용한 바이오마커가 될 수 있다. 실제로 암 혹은 자가면역질환 환자의 경우 건강한 일반인에 비해 NK세포의 활성도가 현저히 낮게 나타나는 것으로 보고되고 있다.
이러한 기술적 배경 하에서, NK세포의 기능결함에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으나(한국등록특허 10-17607640000), 아직은 미비한 실정이다.
일 양상은 NK 세포의 시너지한 활성을 일으키는 자극 물질로서, 상기 NK 세포 상에 구별되는 활성화 수용체인 NKG2D 및 2B4에 특이적인 시너지 활성화를 유발하는 이중특이성항체를 포함하는 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단을 위한 정보를 제공하기 위한 것인 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 시료 내의 NK 세포 상의 활성화 수용체인 NKG2D 및 2B4를 이중특이성항체로 자극하는 단계; 상기 활성화 수용체에 대한 자극으로 유발된, 상기 NK 세포의 시너지 활성화 정도를 측정하는 단계; 및 정상 NK 세포의 시너지 활성화 정도 대비 상기 NK 세포의 시너지 활성화 정도를 비교하는 단계를 포함하는, NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단에 대한 정보를 제공하기 위한 NK 세포의 활성도 검사 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 NK 세포의 시너지한 활성을 일으키는 자극 물질로서, 상기 NK 세포 상에 구별되는 활성화 수용체인 NKG2D 및 2B4에 특이적인 시너지 활성화를 유발하는 이중특이성항체를 포함하는 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단을 위한 정보를 제공하기 위한 것인 조성물을 포함하는 것인, NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단을 위한 정보를 제공하기 위한 것인 키트를 제공하는 것이다.
일 양상은 NK 세포의 시너지한 활성을 일으키는 자극 물질로서, 상기 NK 세포 상에 구별되는 활성화 수용체인 NKG2D 및 2B4에 특이적인 시너지 활성화를 유발하는 이중특이성항체를 포함하는 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단을 위한 정보를 제공하기 위한 것인 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "자연살해세포(Natural Killer cells)" 또는 "NK 세포"는 선천성 면역계의 주요 성분을 구성하는 세포독성 림프구로서, 대형과립림프구(large granular lymphocyte, LGL)로 정의되고 림프계 전구세포(common lymphoid progenitor, CLP) 생성 B 및 T 림프구로부터 분화된 제3의 세포를 구성한다. 상기 "자연살해세포" 또는 "NK 세포"는 임의의 조직 공급원(source)으로부터 유래된 추가적인 변형이 없는 자연살해세포를 포함하고, 성숙한 자연살해세포뿐 아니라, 자연살해 전구세포를 포함할 수 있다. 상기 자연살해세포는 인터페론 또는 대식세포-유래 사이토카인에 대한 반응으로 활성화되고, 자연살해 세포는 "활성화 수용체" 및 "억제성 수용체"로 표지되는, 세포의 세포 독성 활성을 제어하는 2가지 유형의 표면 수용체를 포함한다. 자연살해세포는 임의의 공급원, 예를 들어 태반 조직, 태반 관류액, 제대혈, 태반혈, 말초혈, 지라, 간 등으로부터의 조혈 세포, 예를 들어 조혈 줄기 또는 전구체로부터 생성될 수 있다.
상기 용어 "수용체"는 특정 물질과 결합하여 NK 세포의 활성을 변화시키는 모든 분자를 말한다. 상기 특정 물질은 화학적 조성물, 체내 유래 또는 인공적인 특정 단백질, 펩티드, 콜레스테롤, 당단백질을 포함하며, 다른 면역 세포 또는 NK 세포 스스로에 의한 사이토카인 또는 케모카인, 또는 표적 세포 또는 NK 세포 자체의 특정 수용체 또는 막단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 수용체는, NK 세포의 세포 표면에 위치하여 특정 물질과 결합하여 세포 내로 신호 전달하여 NK 세포의 활성을 일으키는 경우뿐만 아니라, 세포막을 통과하여 세포막 내면 또는 세포질에 존재하는 수용체로서 외부 특정 자극 물질과 결합하여 신호전달 작용을 일으킬 수 있는 모든 수용체를 포함한다. 상기 수용체의 예로는 NKG2D, 2B4 (CD244), DNAM-1 (CD226), CD2, NKp46 및 NKp80가 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 용어 “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성인 면역글로불린 분자를 포함하며, 다클론항체 (polyclonal antibody) 및 단일클론항체 (monoclonal antibody)를 모두 포함한다. 항체는 상기 인자들의 이소형에 대한 항체일 수 있으며, 단편은 항체의 단편으로서 활성을 일으키기에 충분한 상기 항체의 특정 부분만을 포함할 수 있다. 코팅은 하기 실시예에서 서술하는 바와 같이, 표적 세포와의 프리인큐베이션으로 수행할 수 있고, 또는 가교(cross-linking) 기법을 이용해서 상기 항체, 단편 또는 그 조합으로 플레이트 또는 다른 비드에 코팅할 수 있다.
일 구체예에 있어서 “이중특이성항체”는 두가지 항원을 동시에 인식할 수 있는 항체를 의미할 수 있다. 상기 이중특이성 항체의 형태는 BiTE(bispecific T-cell engager), TandAbs(tetravalent bispecific antibody), Dab(domain antibodies), DAF(Dual Action Fab), DVD-Ig(dual variable domain) 및 IgG-scFv 를 포함한다.
상기 용어 “자극”은 수용체에 작용하여 NK 세포 내외의 특정 신호전달을 일으키는 것을 의미한다. 상기 자극을 일으키는 방법은 상기 수용체에 대해 특이적인 항체, 그 단편, 또는 펩티드, 특이적으로 유도 또는 억제하는 조성물, 및 가역적 또는 비가역적인 작용자(agonist) 또는 길항제(antagonist)를 이용할 수도 있고, NK 세포를 자극 할 수 있는 다양한 표적세포 (예를 들어, K562, 721.221, 또는 특정 수용체자극 항체로 코팅된 P815)를 포함하는 배양물과 배양하는 것을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 자극은 상기 수용체에 동시에 또는 순차적으로 이루어지는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 수용체에 구조적으로 결합하거나, 상기 수용체를 개조(modify)하여 자극할 수 있다. 상기 개조는 예를 들어 인산화, 유비퀴틴화, 설포닐화, 메틸레이션(methylation), 파릴레이션(parylation) 또는 당화(glycosylation)와 같은 번역후 개조(post-translation modification) 또는 절단을 포함할 수 있다.
상기 용어 "시너지"는 단일 인자 각각의 효과는 NK 세포활성을 효과적으로 유효하게 활성화 시키기에 부족하나 구별되는 각 인자가 동시적 또는 순차적으로 공동 자극된 경우, 단일 인자 각각 자극된 것 대비 현저하게 변화를 유발하거나, NK 세포 활성을 효과적으로 유효하게 활성화 시킬 수 있는 것을 의미한다. 따라서, NK 세포의 "시너지 활성" 또는 "시너지 활성화"는 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 수용체를 각각 및 이들의 조합에 대해 특이적으로 자극하여, 상기 각 수용체 및 이들의 조합에 대한 자극에 의한 상기 NK 세포의 활성을 측정하여, 상기 각 수용체의 자극에 의한 NK 세포 활성 정도 대비 (바람직하게는, 상기 각 수용체 중 더 많이 활성화된 NK 세포 활성 정도 대비)상기 각 수용체의 조합의 자극에 의한 NK 세포 활성 정도가 1.5배 이상, 2배 이상, 또는 3 배 이상인 경우, 시너지 활성이 유발된 것으로 결정할 수 있고, 바람직하게는 2배 이상인 경우 시너지 활성이 유발된 것으로 결정할 수 있다. 상기 시너지 활성화 정도는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 유동세포계측분석, 면역블롯(immunoblotting) 등을 이용하여, 하위인자의 인산화 또는 발현 정도, 탈과립화 활성, 세포독성 활성 및 NK 세포 자극에 의해 분비된 싸이토카인을 측정한 것을 기준으로 수치화할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에서, 상기 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단을 위한 정보를 제공하기 위한 것인 조성물은 상기 NK 세포의 시너지 활성화 존재 여부의 검출 결과를 시각적으로 표시하기 위한 물질로서, 염료(dye), 형광 염료, 2차 항체, 또는 생물학적 또는 분자적 탐침(probe)을 더 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 NK 세포의 시너지 활성화 존재 여부를 검출하는 물질은 퍼포린, 그랜자임, CD107a, CD107b, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TNF-α, TNF-β, RANTES, IL-8 및 IL-10 중 선택된 하나 이상에 대한 항체, 단편 또는 이들의 조합 중 선택된 하나 이상이거나 또는 형광 염료(dye)일 수 있다. 상기 항체, 단편 또는 이들의 조합은 형광 프로브(probe)로 표지되거나 표지되지 않은 것일 수 있다. 상기 형광 염료 또는 형광 프로브는 검출하고자 하는 대상, 상기 대상의 조합 또는 개수, 원하는 파장, 검출기 등의 조건에 따라 다양할 수 있고, 예를 들어, 페리디닌 클로로필(peridinin chlorophyll; PerCP), 피코에리트린(phycoerythrin; PE), 형광 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate; FITC), 또는 유로피움(europium)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 실시예에 따르면, IFN-γ 및 TNF-α에 형광 프로브인 FITC로 표지함으로써 2차적 처리 없이, 유동세포계측기로 상기 IFN-γ 및 TNF-α를 직접 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 실시예에 따르면, 형광 염료로 염색한 표적 세포(예를 들어, P815)에 대한 NK 세포의 활성화에 의해, 상기 표적 세포가 용해되어 배출되는 형광염료를 측정함으로써, NK 세포의 시너지 활성화 정도를 측정할 수 있다. 따라서, 상기 NK 세포의 시너지 활성화 존재 여부를 검출하는 물질로 형광 염료를 사용하는 것은, 세포 독성을 측정하는데 특히 유리할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 이중특이성항체는 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다. 각 서열에서 Anti-NKG2D 부분의 아미노산 서열은 호모 사피엔스(homo sapiens)에서 유래하였으며 anti-2B4 부분 아미노산 서열은 쥐(mus musculus)에서 유래하여 각각 human NKG2D와 human 2B4에 결합할 수 있다.
상기 서열번호 1 및 2는 IgG-scFv 형태의 이중특이성항체에 관한 것으로써, 서열번호 1은 Anti-2B4 중쇄-anti-NKG2D scFv이며, 서열번호 2는 Anti-2B4 경쇄이다. 상기 서열번호 1의 1번부터 119번 아미노산은 하이브리도마(hybridoma) #C1.7(Mouse anti-human 2B4)로부터 유래하였다. 또한 461번부터 711번 아미노산은 KYK2.0(Human anti-human NKG2D)로부터 유래하였다. 상기 서열번호 2의 1번부터 108번 아미노산은 하이브리도마(hybridoma) #C1.7(Mouse anti-human 2B4)로부터 유래하였다.
서열번호 3 및 4는 DVD-IgG 형태의 이중특이성항체에 관한 것이다. 서열번호 3은 Anti-NKG2D x CD244 DVD-Ig 중쇄이며, 서열번호 4는 Anti-NKG2D x CD244 DVD-Ig 경쇄이다. 상기 서열번호 3의 1번부터 121번 아미노산은 Anti-NKG2D VH로써 클론 KYK2.0에서 유래하였다. 134번부터 252번 아미노산은 Anti-CD244 VH로써, 클론 C1.7에서 유래하였다. 서열번호 4의 1번부터 110번 아미노산은 Anti-NKG2D VL로써 클론 KYK2.0에서 유래하였다. 123번부터 230번 아미노산은 Anti-CD244 VL로써 클론 C1.7에서 유래하였다.
서열번호 5는 BiTE 형태의 이중특이성항체에 관한 것으로, scFv-human C kappa-KYK2.0 scFv이다. 서열번호 5의 6번부터 247번 아미노산은 Anti-CD244 scFv (VL+Linker+VH)로써 클론 C1.7에서 유래되었다. 396번부터 646번 아미노산은 Anti-NKG2D scFv (VH+Linker+VL)로써 KYK2.0 (Human anti-human NKG2D)에서 유래되었다.
또 다른 양상은 상기 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환은 과민성 면역질환, 자가면역질환, 면역결핍질환, 조직구증, 혈액암 및 고형암으로 이루어진 군에서 선택된 것인 조성물을 제공하는 것이다.
일 구체예에서, 상기 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환은 비정상적인 NK 세포의 시너지 활성도를 보이는 것으로서, 예를 들어, 과민성 면역질환, 자가면역질환, 면역거부반응, 면역결핍질환, 조직구증, 암, 2형 당뇨병, 기생충 감염 질환 및 바이러스 질환일 수 있다. 상기 과민성 면역질환은 천식 및 축농증 중 선택된 하나 이상의 것이거나, 상기 자가면역질환은 루푸스, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 1형 당뇨병 및 류마티스 관절염 중 선택된 하나 이상의 것이거나, 또는 상기 조직구증은 HLH, XLP1, 및 XLP2에서 선택된 어느 하나 이상의 것일 수 있다. 혈구탐식성 림프조직구증(HLH)은 제 2군 랑게르한스 세포 조직구증, 적혈구탐식성 림프조직구증식증 (가족성, 산발성), 감염연관성 혈구탐식증후군, 바이러스 연관성 혈구탐식증후군, 거대한 림프절병증을 동반한 조직구증, 또는 망상조직구증의 의미를 포함할 수 있다. 상기 "암"은 종양, 혈액암 또는 고형암을 포함하는 의미으로서, 개체의 NK 세포의 시너지 활성을 손상시키거나 또는 특정 조건에서 표적 세포로서 NK 세포의 시너지 활성을 일으키지 않는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 암은 폐암, 간암, 식도암, 위암, 대장암, 소장암, 췌장암, 흑색종, 유방암, 구강암, 뇌종양, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 자궁경부암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 고환암, 혈액암, 림프종, 피부암, 건선 및 섬유선종으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 암은 췌장암 또는 B 세포 림프종(B cell lymphoma)일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 바이러스 질환은 B형 간염일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 면역결핍질환은 디조지증후군(DiGeorge synderome) 또는 체디악히가시증후군(Chedial-Higashi syndrome)일 수 있다.
상기 NK 세포의 활성과 관련된 질환에 대한 정보는, 정상 NK 세포 대비 실험군 NK 세포의 시너지 활성화가 검출되지 않는 경우 비정상적인 NK 세포로 판단할 수 있고, 또는 특정 수용체에 대해 시너지 활성을 상실한 NK 세포가 표적 세포에 대해 비정상적으로 시너지 활성을 일으키거나 일으키지 않는 경우 상기 표적 세포가 특정한 질병과 관련이 있음을 판단할 수 있다. 상기 특정한 질병의 판단을 보다 용이하게 하기 위해서 상기 표적 세포는 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 수용체에 대한 항체, 단편 및 이들의 조합 중 선택된 하나 이상의 것으로 코팅하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 이중특이성항체는 비드 또는 플레이트에 코팅된 것인 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 시료 내의 NK 세포 상의 활성화 수용체인 NKG2D 및 2B4를 이중특이성항체로 자극하는 단계; 상기 활성화 수용체에 대한 자극으로 유발된, 상기 NK 세포의 시너지 활성화 정도를 측정하는 단계; 및 정상 NK 세포의 시너지 활성화 정도 대비 상기 NK 세포의 시너지 활성화 정도를 비교하는 단계를 포함하는, NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단에 대한 정보를 제공하기 위한 NK 세포의 활성도 검사 방법을 제공하는 것이다.
상기 시료는 개체, 예를 들면, 인간을 포함한 포유류 등으로부터 유래된 생물학적 시료일 수 있다. 또한, 상기 생물학적 시료는 개체로부터 분리된 것일 수 있으며, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 림프액, 소변, 분변, 조직, 세포, 기관, 골수, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 그들의 조합일 수 있다. 또한 상기 생물학적 시료는 PBMC, 정제된 NK 세포 또는 일차성 휴지기의 세포(primary resting cell) (즉, 혈액에서 바로 분리한)를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 시료는 혈액이다.
본 발명의 NK 세포의 활성도를 검사하는 방법에서, 정상 NK 세포 대비 상기 NK 세포의 시너지 활성화를 비교하는 단계는, 구체적으로 정상적인 NK 세포를 대조군으로 실험군과 동등한 조건에서 구별되는 두 개 이상의 수용체를 특정 조합으로 자극하였을 때, 정상적인 NK 세포에서 나타나는 시너지한 활성화 현상이 실험군에서 현저하게 높거나, 나타나지 않거나 그 정도가 현저하게 적은 경우 비정상으로 판단하는 것을 포함한다. 또한 단일 인자를 자극한 경우에 비해 공동 자극한 경우 비교가 용이하여 인위적으로 시너지 활성화를 유발하여 그 데이터를 비교함으로써 판단하는 것을 포함한다. 상기 단계에 의하여 비정상적인 NK 세포와 관련한 질환의 병리학적 징후, 바이러스 감염, 암 세포의 존재, 및 특정 암을 판단하고 상기 질병들에 대해 예후 예측 할 수 있다.
상기 "정상 NK 세포"는 질병을 갖지 않는 개체가 갖는 또는 그러한 개체로부터 유래된 NK 세포를 말하며, 상기 질병을 갖지 않는 개체는 적어도 NK 세포 활성에 영향을 미치는 것이라 알려진 신체적, 유전적, 또는 외래적 조건을 갖지 않는다.
일 구체예에서, 상기 활성화 정도를 측정하는 단계는 상기 NK 세포 상에 구별되는 두 개 이상의 수용체의 하위인자의 인산화 또는 발현 정도, 탈과립화(degranulation) 활성, 세포독성(cytotoxicity) 활성 및 NK 세포 자극에 의해 분비된 싸이토카인의 측정 중 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 용어 "하위인자"는 상기 NK 세포 상의 수용체가 자극되는 경우 영향을 받아 발현이 증가되거나, 인산화되는 세포 내 단백질 또는 변화되는 폴리펩티드 등을 의미하는 것으로서, 특히 인산화 반응에 대한 경우, 상기 하위인자는 기질(substrate)과 동일한 의미로 사용될 수 있다.
상기 하위인자의 발현 정도는 예를 들어, 자극된 NK 세포를 용해시킨 후, NK 세포 활성화에 관여하는 세포 내 단백질 중 하나인 Erk 또는 pY174-Vav1에 특이적인 항체를 이용하는 종래의 잘 알려진 면역블롯(immunoblot) 방식을 이용하여 측정할 수 있다.
상기 탈과립화 활성은 예를 들어, 퍼포린(perforin) 또는 그랜자임(granzyme) 분비로 표적 세포의 용해를 유도하는 것을 의미할 수 있고, 이를 FACS를 이용해 분석할 수 있다. 구체적으로, 시료에서 분리한 PBMC 혹은 순수 분리된 NK 세포를 자극한 후, 탈과립화와 비례하는 CD107a 발현을 플루오로크롬-접합된 항체를 이용하여 측정하는 방법을 이용할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 싸이토카인은 IFN-γ, TNF-α, TNF- β, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IL-8 및 IL-10 중 선택되는 것일 수 있다. 상기와 같은 NK 세포의 면역활성인자 발현 분석은 FACS, 세포 내 싸이토카인 염색 또는 ELISA 등을 이용하여 이루어질 수 있다. 구체적으로 플루오로크롬-접합된 특정 항체를 이용하여 NK 세포 표면을 염색한 후 세포를 투과성화(permeabilization)하고 플로오로크롬-접합된 다른 특정 면역활성인자(예를 들어, IFN-γ) 항체로 상기 싸이토카인 등을 염색하여 NK 세포 내의 면역활성인자의 발현을 측정하는 방법을 이용할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 이중특이성항체는 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 시료는 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 림프액, 소변, 분변, 조직, 세포, 기관, 골수, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 그들의 조합에서 분리된 것인 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 활성화 정도를 측정하는 단계는 상기 인자의 하위인자의 인산화 또는 발현 정도, 탈과립화 활성, 세포독성 활성 및 NK 세포 자극에 의해 분비된 싸이토카인의 측정 중 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 싸이토카인은 그랜자임 B, IFN-γ, TNF-α, TNF- β, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IL-8 및 IL-10 중 선택된 것인 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 청구항 1의 조성물을 포함하는 것인, NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단을 위한 정보를 제공하기 위한 것인 키트를 제공하는 것이다.
일 구체예에서, 상기 NK 세포의 활성도 검사용 키트는 상기 NK 세포의 시너지 활성화 존재 여부의 검출 결과를 시각적으로 표시하기 위한 물질로서, 염료, 형광 염료, 2차 항체, 또는 생물학적 또는 분자적 탐침을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 NK 세포의 시너지한 활성을 일으키는 자극 물질로서, 상기 NK 세포 상에 구별되는 활성화 수용체인 NKG2D 및 2B4에 특이적인 시너지 활성화를 유발하는 이중특이성항체를 포함하는 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단을 위한 정보를 제공하기 위한 것인 조성물, 키트 및 검사 방법을 제공함으로써, NK 세포의 활성화 정도를 측정하여 인체 질환의 진단과 예후 예측에 활용할 수 있다.
도 1은 NKG2D 및 2B4 이중특이성항체에 의한 휴지기 NKL에서의 시너지 활성화의 유도를 나타낸 결과이다.
도 2는 NKG2D 및 2B4 이중특이성항체에 의한 NF-κB 활성화의 메커니즘을 나타낸 결과이다.
도 3은 NKG2D 및 2B4 이중특이성항체의 NK 세포 시너지 활성화에 대한 특이도를 나타낸 결과이다.
도 4는 NKG2D 및 2B4 이중특이성항체의 NK 세포의 시너지 활성화를 나타낸 결과이다.
도 5는 XLP1 NK 세포의 이중특이성항체에 의한 NK 세포 활성화의 결함을 나타낸 결과이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: NK 세포의 배양
1-1. 인간 혈액 샘플 및 NK 세포주의 확립
정상적인 건강한 공여자로부터의 기관 검토위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 연구 목적으로 인간 혈액 샘플을 추출하였다. 말초 혈액 단핵 세포(Peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 밀도 구배 원심 분리 (LSM 림프구 분리 배지; MP biomedicals)에 의해 혈액 샘플로부터 분리하고 동결 보존 하였다. 기재된 바와 같이 NK 세포 단리 키트 (StemCell Technologies)를 사용하여 음성 선택에 의해 PBMC로부터 인간 NK 세포를 정제 하였다. 이들 세포는 유세포 분석에 의해 평가 된 바와 같이 97-99 % CD3-CD56 +였다. 인간 NK 세포주 NKL을 10 % FBS, 1mM 피루브산 나트륨 및 200U ml-1 재조합 IL-2 (rIL-2)이 보충 된 RPMI-1640에서 배양 하였다. NKL 세포를 5 % FBS 및 0.5mM 피루브산 나트륨이 보충 된 RPMI-1640에 24시간 동안 rIL-2없이 있게 하였다. 일부 실험에서는, PBMC를 밤새 100 U / ml rIL-2로 활성화시켰다.
1-2. NK세포의 체외 배양
환자 NK 세포의 제한된 공급으로 인해, 효과 기능(effector function)을 연구하기 위해 XLP1 환자로부터의 NK 세포가 체외 배양 되었다. 1 차 인간 NK 세포는 상기 한 바와 같이 건강한 공여자 및 XLP1 환자로부터 체외 배양되었다. PBMC (1.5 × 106 세포)를 줄기 세포 성장 배지(stem cell growth medium, SCGM, CellGenix)에서 100 Gy-로 조사 된 K562-mb15-41BBL 세포 (싱가포르 국립 대학교의 D. Campana의 기부; 1 × 106 세포)와 함께 24-웰 조직 배양 플레이트에서 배양 하였다. 상기 SCGM은 10 % FBS 및 10 U / mL rIL-2가 보충 되었다. 배지를 2 일마다 rIL-2를 사용한 새로운 배지로 교체하였다. 공동 배양 1 주 후, 잔류 T 세포를 CD3 + 선택 키트 (StemCell Technologies)로 고갈시켰다. 정제 된 NK 세포를 10 % FBS, 100 U / mL rIL-2 및 5ng / mL rIL-15 (Pepro Tech)가 보충 된 SCGM에서 2 주 동안 추가로 배양시켰다. 유세포 분석법을 사용하여 평가 한 결과, 생성 된 세포 집단은 96-99 % CD3- / CD56 +였다.
실시예 2: NK 세포의 항체의 수득
NK 세포 수용체 및 신호 전달 분자에 대한 항체는 다음의 공급원으로부터 수득되었다: NKG2D (MAB139; R & D Systems); CD244 / 2B4 (C1.7; BioLegend); 이소 타입 대조군 마우스 IgG1 (MOPC-21; BioLegend); 액틴 (G043; abm); p65 (F-6; 산타 크루즈 바이오 테크놀로지); pS536 p65 (93H1), Akt (9272), pS473 Akt (9271), Erk1 / 2 (9102) 및 pY202 / 204 Erk1 / 2 (9101); 세포 신호); 또한 플루오로 크롬-접합 된 항체를 유세포 분석에 사용 하였다: 항 -CD3-PerCP (SK7), 항 -CD56-PE (NCAM16.2), 항 -CD107a-FITC (H4A3) 및 항 -IFN-γ-FITC (25723.11; BD bioscience). 인간 Fc 차단은 항 -Fcγ (14-9161-73; ebioscience)로 수행 되었다.
NK 세포의 플레이트 고정화(Plate-immobilized) 항체는 다음과 같이 준비 되었다. 2μg / mL의 NKG2D 및 / 또는 2B4 단일클론항체, 5μg / mL의 NKG2D + 2B4 이중특이성항체(IgG-scFv, DVD-Ig)는 ELISA 코팅 버퍼 (BioLegend; 421701)에서 혼합되었다. 항체로 편평한 바닥 마이크로 플레이트 스트립 웰 (COSTAR; 2592)을 코팅 하였다. 밀봉 테이프로 덮고 4 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.
실시예 3: NKG2D + 2B4 이중특이성항체에 의한 칼슘 동원의 확인
휴지기(resting) NK 세포의 효율적인 활성화는 사이토카인-자극 NK 세포의 활성화와는 상이하며, 활성화 수용체의 특정 조합을 필요로 한다. NKG2D + 2B4 이중특이성항체가 NK 세포 활성을 상승시키는 지 여부를 조사하기 위해, NKG2D + 2B4 이중특이성항체로 자극 된 휴지기의 인간 NK 세포주 NKL에서 Ca2+ 동원을 측정함으로써 유세포 분석을 수행하였다.
유세포 분석은 하기와 같이 이루어졌다. 단일 클론 항체 및 NK 수용체에, 이중특이성항체(bsAbs)로 코팅 된 비드로 세포를 자극한 후 그랜자임 B (Granzyme B, R & D 시스템), IFN-γ (Thermo Scientific) 및 MIP-1α (R & D 시스템) 생산을 ELISA로 측정했다. NK 세포주에 대한 비드는 DPBS에서 염소 항-마우스-코팅 비드 (4 × 106; Dynabeads, 11033)를 배양함으로써 제조되었다. DBPS는 2 % FBS 및 0.01 % Tween®-20을 함유하는 PBS 중 단백질 G 비드 (10 × 106; Dynabeads, 10003D)를 포함하며, 4℃에서 1시간 동안 단일클론항체 및 이중특이성항체를 배양하였다. 휴지기 NKL 세포를 α-NKG2D (1D11; BD pharmigen) 항체 또는 α-2B4 항체로 차단하거나 아무 항체도 투여되지 않은 상태로 실온에서 30 분 동안 방치했다. 2 % FBS 또는 PBS, 0.01 % Tween®-20를 포함하는 DBPS로 세 번 세척 한 후, 비드 (4 × 106, 10 × 106)를 37 ℃에서 지시 된 시간 동안 500μL IMDM, 5 % FBS에서 휴지기 NKL 세포 (0.5 × 106)와 함께 인큐베이션 하였다. 활성화하는 동안 배양을 엔드-오버-엔드로 회전시킨 후, 상청액을 분석 하였다.
세포 내 Ca2 + 동원은 Fluo-4 AM (Invitrogen)으로 표지 된 NKL 세포에서 다중 모드 플레이트 리더 (VICTOR V4, Perkin Elmer)에 의해 측정되었다. 간단히 말하면, NKL 세포를 염료 로딩 버퍼 (1 % FBS, 2μM Fluo-4 AM 및 4mM 프로 베네 시드를 포함하는 행크스 평형 염 용액 (Hanks’ balanced salt solution, HBSS))로 30 ℃에서 30 분 동안 표지 하였다. 세포를 2 회 세척하고 HBSS, 1 % FBS, 4mM 프로 베네 시드에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 플레이트에 고정화된 이중특이성항체 및 단일클론항체의 NKG2D 및 / 또는 2B4와 함께 배양 하였다. Flou-4 AM (494/506 nm)의 흡광도를 측정하기 전에, 플레이트 고정화된 항체에서 세포를 15 ℃에서 1 분 동안 300rpm으로 원심 분리 하였다.
NK 세포의 탈과립화는 기술 된 바와 같이 세포 표면에서의 CD107a 발현에 의해 평가되었다. 간단히 말해서, 1 차 휴지기 NK 세포 및 IL-2 100 Uml-1 로 활성화된 NK 세포 (모넨신 및 항 -CD107a-FITC 단일클론항체의 존재 하)를 플레이트 고정화된 이중특이성항체 및 NKG2D 및 / 또는 2B4의 단일클론항체와 함께 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션 하였다. 세포 펠렛을 FACS 완충액 (2 % FBS의 인산 완충 식염수 (PBS))에 재현탁시키고 4 ℃에서 30 분 동안 항 -CD3-PerCP, 항 -CD56-PE 및 항 -CD107a-FITC로 염색 하였다. . 림프구를 전방 산란 / 측 산란에 게이팅하고, NK 세포에서 CD107a 발현을 유세포 분석법 및 FlowJo 소프트웨어에 의해 분석 하였다. 그랜자임 B 방출 분석을 위해, IL-2 활성화 된 1 차 NK 세포를 37 ℃에서 24 시간 동안 플레이트 고정화 이중특이성항체 및 NKG2D 및 2B4의 단일클론항체로 자극 하였다. 그 후, 상청액으로의 그랜자임 B 방출을 ELISA로 측정 하였다. 1 차 NK 세포에 의한 사이토카인 생성은 기재된 바와 같이 IFN-γ의 세포 내 발현에 의해 결정되었다. 1 차 휴지기 NK 세포 또는 IL-2 100 U ml-1 활성화 된 NK 세포를 37 ℃에서 1 시간 동안 플레이트 고정화 이중특이성항체 및 NKG2D 및 2B4 단일클론항체로 자극 하였다. 그 후, 브레펠딘 A(brefeldin A, GolgiPlug; BD Bioscience) 및 모네신(monensin, GolgiStop; BD Bioscience)을 함유하는 단백질 수송 억제제를 첨가 한 후, 총 6 시간 동안 추가로 5 시간 동안 배양 하였다. 이어서, 세포를 4 ℃에서 어두운 곳에서 30 분 동안 항 -CD3-PerCP 및 항 -CD56-PE 단일클론항체로 표면 마커에 대해 염색 하였다. 4 ℃에서 밤새 항 -IFN-γ-FITC 단일클론항체로 세포 내 염색하기 전후에, 세포를 BD Perm / Wash buffer (BD Bioscience)로 2 회 세척 하였다. 이어서, NK 세포 상에 게이트 된 유세포 분석에 의해 세포를 분석 하였다.
도 1A에 나타난 바와 같이, NKG2D + 2B4 이중특이성항체의 음성 대조군 인 MOPC21-scFv는 비히클 대조군으로서, 칼슘 동원을 유발하지 않았다. 이것은 조작 된 MOPC21-scFv가 NKG2D + 2B4 이중특이성항체(IgG-scFv)의 적절한 음성 대조군임을 시사한다. 예상 한 바와 같이, NKG2D의 단일클론항체 및 2B4 조합을 통한 NKL의 자극은 비히클 대조군과 비교하여 NKL에서 세포 내 Ca2+의 상당한 증가를 유발 하였다. NKG2D + 2B4 이중특이성항체(IgG-scFv)는 또한 NKG2D 및 2B4 수용체를 통해 NKL을 자극하고 NKG2D 및 2B4의 결합과 유사하게 현저한 칼슘 동원을 유도 하였다. 이는 NKG2D + 2B4 이중특이성항체가 NKL에서 시너지 활성화를 유도함을 나타냈다.
실시예 4: NKG2D + 2B4 이중특이성항체에 의한 세포 활성의 확인
NKG2D + 2B4 이중특이성항체를 통해 NK 세포를 자극 한 후 사이토카인 분비가 측정되는지 여부를 확인하기 위해, 인간 NK 세포주 NKL 수용체를 α-NKG2D 및 / 또는 α-2B4 항체로 차단 하였다. 유세포 분석은 실시예 3과 동일한 방법으로 수행되었다.
NKL에서 NKG2D 및 / 또는 2B4 수용체를 차단한 후, NKL을 이중특이성항체 (IgG-scFv)로 코팅된 비드와 함께 37 ℃에서 6 시간 동안 배양 하였다. 활성화 된 NK 세포는 그랜자임 B, IFN-γ 및 MIP-1α의 시너지 생산을 보인다. 상청액으로 방출 된 사이토카인을 ELISA에 의해 정량화 하였다. 도 1B, 1C 및 1D에 나타난 바와 같이, NKG2D 및 2B4 수용체를 차단시 사이토카인의 가장 기초적인 발현량만을 분비하고, 각각의 단일 수용체만 차단하면 그랜자임 B(granzyme B), IFN-γ 및 MIP-1α을 약하게 발현했다.
또한 대조를 위하여, 세포를 NKG2D + 2B4 이중특이성항체 (IgG-scFv)와 함께 배양 하였고, NKG2D + 2B4 이중특이성항체 (IgG-scFv)는 NKL을 자극하였다. 이는 NKG2D 및 2B4 수용체를 차단하지 않고 NKL이 배양되게 하였다. 그랜자임 B, IFN-γ 및 MIP-1α의 분비는 NKG2D + 2B4 이중특이성항체 (IgG-scFv) 자극에 의해 유의하게 증가하였으며, 이는 NKG2D + 2B4 이중특이성항체 (IgG-scFv)가 NKG2D 및 2B4 수용체를 통해 NK 세포를 특이적으로 자극 함을 나타냈다. 종합하면, NKG2D + 2B4 이중특이성항체는 NKG2D 및 2B4 수용체를 통해 NK 세포 사이토카인 분비를 특이 적으로 향상시킨다.
실시예 5: NKG2D 및 2B4 이중특이성항체에 의한 NF-κB 활성화의 확인
NKG2D + 2B4 이중특이성항체 (IgG-scFv, DVD-Ig)에 의한 NF-κB의 시너지 활성화를 평가하기 위해, κBGFP 리포터 구축물로 형질 도입 된 NKL 리포터(NKL-κB-GFP) 세포를 사용하여 NF-κB 전사 반응 요소의 제어하에 GFP를 발현시켰다.
NK-κB 리포터 분석은 하기와 같이 수행되었다. NK-κB 전사의 제어 하에서 GFP를 발현하는 NKL 리포터 세포 (NKL-κB-GFP)반응 요소는 기술 된 바와 같이 렌티 바이러스 κB-GFP 구축물 (System Bioscience)로 NKL 세포를 형질 도입함으로써 생성되었다. NF-κB 활성화를 평가하기 위해, NKL-κB-GFP 세포를 플레이트 고정화 이중특이성항체 또는 NK 수용체에 특이적인 단일클론항체로 자극하고, 리포터 NKL 세포에서의 GFP 발현을 유세포 분석에 의해 분석 하였다. 유세포 분석은 실시예 3과 동일한 방법으로 수행되었다.
면역블러팅법은 하기와 같이 수행되었다. 자극 된 NKL 세포를 빙냉 DPBS로 세척하고 용해 완충액 (50mM Tris-HCl (pH 7.5)), 150mM NaCl, 1 % Triton X-100, 5mM EDTA, 1mM NaVO3, 50mM NaF, 1mM 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드 (PMSF) 및 프로테아제 억제제 혼합제(thermo)에 얼음상에서 30분동안 용해시켰다. 핵을 포함한 세포 잔해물을 원심 분리로 제거하고 상청액을 회수 하였다. 용해물을 50mM 디티오 트레이톨을 함유하는 1x NuPAGE LDS 샘플 완충액 (Invitrogen)에 재현 탁시키고, 70 ℃에서 10 분 동안 추가로 배양 하였다. 각각의 샘플에 대해 동일한 양의 단백질을 8 % Tris-HCl 겔 또는 4-20 % Tris-HEPES 겔 (thermo)에서 용해했다. 그 후, 전달 완충액 (25mM Tris, 192mM 글리신, 20 % (v/v) 메탄올) 내의 PVDF 막 (Millipore)으로 옮겼다. 상기 막을 1 시간 동안 TBS-T (0.1 % 트윈 -20을 함유하는 트리스 완충 식염수) 중 탈지유로 차단 한 후, 1 차로 항체, HRP- 접합 된 2 차 항체와 함께 인큐베이션 하였다. 얼룩(blots)은 SuperSignal West Pico (Thermo)를 사용하여 개발되었으며 LAS-4000 (Fujifilm)을 사용하여 탐지되었다.
도 2A에 나타난 바와 같이, GFP 발현의 시너지 활성화는 NKG2D + 2B4 이중특이성항체 (IgG-scFv, DVD-Ig) 자극을 사용한 NF-κB 리포터 분석에 의해 입증되었다. MOPC21-scFv의 이소 타입 대조군 IgG1 및 음성 이중특이성항체 대조군은 κB-GFP 발현을 유도하지 않았다. 도 2B에 나타난 바와 같이, 이중특이성항체의 구조 (IgG-scFv 및 DVD-Ig)는 NKG2D 및 2B4 공동-결합의 단일클론항체보다 증가 된 수준의 GFP 발현을 나타낸다. 대조적으로, NKG2D 또는 2B4 단일항체의 단독 수용체 활성화는 GFP의 발현 수준을 상당히 감소 시켰으며, 이는 단일 수용체가 NF-κB 활성화를 자극하기에 충분하지 않다는 것을 의미한다.
실시예 6: NKG2D 및 2B4 이중특이성항체에 의한 Akt 및 Erk1 / 2 인산화의 확인
NF-κB 활성화에서 NKG2D + 2B4 이중특이성항체의 시너지 관여를 뒷받침하기 위해, 세린 473에서 Akt의 시너지 인산화 및 트레오닌 202 및 티로신 204에서 Erk1 / 2를 평가 하였다. 면역블러팅법은 실시예 5와 동일한 방법으로 수행되었다.
도 2C에 나타난 바와 같이 이중특이성항체 (IgG-scFv)로 자극함으로써 2분 및 5 분이 경과된 때 Akt 및 Erk1 / 2의 인산화가 관찰되었다. Akt 경로를 통한 부위-선택적 인산화 S536-p65를 고려하면, p65의 인산화는 이중특이성항체 (IgG-scFv) 자극에 의해 10 분에도 명확하게 관찰되었다. 이들 결과는 NKG2D + 2B4 이중특이성항체가 NKGD 및 2B4 단일클론항체의 조합과 비교하여 NF-κB 활성화에 대해 보다 강력한 시너지 상승 효과를 촉진한다는 것을 시사 하였다.
실시예 7: NKG2D 및 2B4 이중특이성항체의 NK 세포에 관한 특이도 확인
1 차 NK 세포에서 NKG2D + 2B4 이중특이성항체의 NK 세포 특이도를 확인하기 위해 분석 특이성에 대한 NK 세포 게이트(gate)를 분석 하였다. 유세포분석은 실시예 3과 동일한 방법으로 수행되었다.
도 3A에 나타난 바와 같이, NK 세포는 일반적으로 인간에서 CD3- / CD56+로 정의되며, 다른 세포, NKT (CD3+ / CD56+), T 세포 (CD3+ / CD53-) 및 이중 음성 세포 (CD3- / CD56-)는 표시된 대로 분석되었다. 도 3B 내지 E에 나타난 바와 같이, NKT, T 세포 및 이중 음성 세포는 CD107a 발현 또는 IFN-γ 분비 중 그 어느 것도 나타나지 않았으나 NK 세포 (CD3- / CD56+)만이 NKG2D + 2B4 이중특이성항체 (IgG-scFv 및 DVD-Ig)의 두 구조에 의해 특이적으로 세포 독성을 유도 하였다.
실시예 8: NKG2D 및 2B4 이중특이성항체의 NK 세포에 관한 시너지 활성화 확인
NKG2D + 2B4 이중특이성항체가 1 차 NK 세포 진단에 적용 가능한지 여부를 확인하였다. 밀도 구배 원심 분리(density gradient centrifugation)에 의해 건강한 공여자 혈액 샘플로부터 PBMC를 단리하고, 동결 보존 하였다. NKG2D + 2B4 이중특이성항체에 의한 진단을 위한 적절한 세포 상태를 결정하기 위해, 건강한 공여자로부터 수득한 PBMC를 휴지기 및 IL-2 100 U ml-1 로 활성화하는 것인 두 개의 상이한 조건에서 배양 하였다.
NKG2D + 2B4 이중특이성항체 (IgG-scFv, DVDIg), 및 NKG2D 및 2B4 조합의 단일클론항체는 평평한 마이크로 플레이트에 미리 코팅되었다. PBMC 세포 내 다수의 Fc 수용체 차단을 위해 항-Fcγ (14-9161-73; ebioscience)로 배양한 다음 항체로 미리 코팅 된 평평한 플레이트에서 배양되었다 마지막으로, 유세포 분석에 의해 CD107a의 발현 수준, NK 세포 세포 독성의 마커, 및 NK 세포에서의 IFN-γ의 생산 수준을 측정 하였다. 유세포분석은 실시예 3과 동일한 방법으로 수행되었다.
도 4A 및 B에 나타난 바와 같이, IL-2로 활성화 된 NK 세포는 NKG2D + 2B4 이중특이성항체 (IgG-scFv 및 DVD-Ig)로 자극함으로써 증가 된 CD107+ 발현을 나타냈다. 그러나, NK 세포의 휴지기 조건 하에서, 세포 활성의 부족이 관찰되었으며 이는 휴지기 NK 세포가 본질적으로 IL-2 활성화 NK 세포보다 덜 용해성인 것을 의미한다. 휴지기 NK 세포의 메커니즘은 명확하게 정의되지 않았지만, 그들의 활성화에 있어서 훨씬 강한 자극이 필요할 것으로 보인다.
사이토카인에 대한 인간 NK 세포의 반응성이 광범위하게 연구되었다. IL-2 처리 조건 하에서 NKG2D + 2B4 이중특이성항체에 대한 NK 세포 반응성은 IL-2와 같은 사이토카인에 노출 될 때 NK 세포가 표적 세포에 대해 반응하기 위해 '잘 갖추어진다'고 설명 될 수 있다. 사이토카인-자극 된 NK 세포는 NKG2D 및 2B4와 같은 활성화 수용체의 결합에 반응하여 휴지기 NK 세포보다 활성화에 대한 임계 값이 낮기 때문에 활성유도가 용이하다. 도 4C 및 D에 나타난 바와 같이, IFN-γ의 생산에서, IL-2 활성화 된 NK 세포는 활성화 수용체와의 결합에서 생산 유도를 나타내었지만, 휴지기인 NK 세포는 생산 유도가 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다. NKG2D + 2B4 이중특이성항체 (IgG-scFv, DVD-Ig) 및 NKG2D 및 2B4 조합의 단일클론항체는 IL-2 활성화 된 NK 세포 조건 하에서만 IFN-γ 생산을 유도하였다. NKG2D + 2B4 이중특이성항체에 의한 NK 세포 세포 독성의 결과에 기초하여, IL-2 활성화 된 NK 세포로부터의 그랜자임 B 및 IFN-γ 분비는 ELISA에 의해 측정되었다. 도 4E 및 F에 나타난 바와 같이 공여자간에 차이가 있었음에도 불구하고, NKG2D + 2B4 이중특이성항체는 그랜자임 B 및 IFN-γ 분비의 유의한 유도를 나타냈다. 이는 NKG2D + 2B4 이중특이성항체 (IgG-scFv 및 DVD-Ig)는 NKG2D 및 공동-결합 2B4 수용체에 의해 나타나는 상승 효과의 새로운 측면을 제시한다.
실시예 9: XLP1 NK 세포의 이중특이성항체에 의한 활성화 결함 확인
XLP1 환자는 SH2D1A 유전자 돌연변이, SAP의 결함 발현을 특징으로 한다. NKG2D 및 2B4의 시너지 활성화 후 NF-κB 활성화 및 NK 세포 반응에 결함이 있음을 확인하기 위해 XLP1 환자의 NK 세포를 사용하여 그것이 NKGD + 2B4 이중특이성항체 (IgG-scFv, DVDIg)에 어떻게 반응하는지 확인하였다.
XLP1 환자 NK 세포의 제한된 공급량으로 인해, XLP1 환자로부터의 NK 세포는 효과기 기능을 연구하기 위해 체외 배양되었다. 유세포 분석법에 의해 CD107a 발현 및 IFN-γ 생산 수준을 측정하는 NK 세포 세포 독성 분석을 수행 하였다. 유세포분석은 실시예 3과 동일한 방법으로 수행되었다.
건강한 공여자 및 XLP1 환자로부터의 확장된 NK 세포 (ENK)는 단일클론항체의 NKG2D 및 2B4 조합 및 NKG2D + 2B4 이중특이성항체 (IgG-scFv, DVD-Ig)로 자극되었다. 도 5A에 나타난 바와 같이, NKG2D 및 2B4 단일클론항체의 조합과 비교하여, NKG2D + 2B4 이중특이성항체 (IgG-scFv, DVD-Ig)는 건강한 공여자로부터의 ENK에 대해 상당한 자극을 나타냈다. 특히, NKG2D + 2B4 이중특이성항체 (IgG-scFv)는 이중특이성항체 (DVD-Ig)에 비해 CD107a 발현을 강력하게 유도하였다.
대조적으로, XLP1 환자의 ENK는 NKG2D + 2B4 이중특이성항체, IgG-scFv 및 DVD-Ig의 구조 둘 다에 의해 CD107a 발현이 감소되었다. 이중특이성항체 (IgG-scFv)는 건강한 공여자와 XLP1 환자의 ENK간에 CD107a 수준에서 많은 차이를 보인 것이 중요했다. 도 5B에 나타난 바와 같이, NKG2D + 2B4 이중특이성항체의 두 구조는 IFN-γ 생산에 있어 훨씬 더 확실한 차이가 관찰되었다. XLP1 환자의 ENK는 NKG2D + 2B4 이중특이성항체 (IgG-scFv, DVD-Ig)에 의한 IFN-γ 생산 유도 능력이 심각하게 손상되었다. 이러한 결과는 NKG2D와 2B4 단일클론항체의 조합을 사용하는 것보다 NKG2D + 2B4 이중특이성항체 (IgG-scFv, DVD-Ig)가 더 효율적임을 의미한다.
<110> THE ASAN FOUNDATION <120> METHOD OF MEASURING OF NK CELL ACTIVITY USING BISPECIFIC ANTIBODY AND DIAGNOSING OF NK CELL ACTIVITY-MEDIATED DISEASE <130> PN128907KR <150> KR KR2019/126285 <151> 2019-10-11 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 711 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-2B4 heavy chain-anti-NKG2D scFv <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(119) <223> Anti-CD244 VH (from hybridoma #C1.7: Mouse anti-human 2B4) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (461)..(711) <223> Anti-NKG2D scFv (VH+Linker+VL) (from KYK2.0: Human anti-human NKG2D) <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Val Leu Asp Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-2B4 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(108) <223> Anti-CD244 VL (from hybridoma #C1.7: Mouse anti-human 2B4) <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Ile Ile Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Asp Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Phe Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 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Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 325 330 335 Cys <210> 5 <211> 646 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv-human C kappa-KYK2.0 scFv <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(247) <223> Anti-CD244 scFv (VL+Linker+VH) (from clone C1.7) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (396)..(646) <223> Anti-NKG2D scFv (VH+Linker+VL) (from KYK2.0: Human anti-human NKG2D) <400> 5 Val Ala Gln Ala Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Ile Ile 1 5 10 15 Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser 20 25 30 Ser Ile Ser Ser Ser Asp Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val 50 55 60 Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Phe Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 Tyr His Arg Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr 130 135 140 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 145 150 155 160 Val Leu Asp Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 165 170 175 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 180 185 190 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 195 200 205 Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220 Val Arg Leu Gly Tyr Asp Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 225 230 235 240 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gln Ala Gly Gln Gly Gly Gly Gly 245 250 255 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Leu Arg Thr Val 260 265 270 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 275 280 285 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 290 295 300 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 305 310 315 320 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 325 330 335 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 340 345 350 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Leu Pro Val Thr 355 360 365 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser Leu Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly 370 375 380 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Val 385 390 395 400 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 405 410 415 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val 420 425 430 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Tyr 435 440 445 Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 450 455 460 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 465 470 475 480 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Arg Gly 485 490 495 Leu Gly Asp Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 500 505 510 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 515 520 525 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala 530 535 540 Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly 545 550 555 560 Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu 565 570 575 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro 580 585 590 Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala 595 600 605 Phe Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 610 615 620 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly 625 630 635 640 Thr Lys Leu Thr Val Leu 645

Claims (11)

  1. NK 세포의 시너지한 활성을 일으키는 자극 물질로서, 상기 NK 세포 상에 구별되는 활성화 수용체인 NKG2D 및 2B4에 특이적인 시너지 활성화를 유발하는 이중특이성항체를 포함하는 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단을 위한 정보를 제공하기 위한 것인 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 이중특이성항체는 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환은 과민성 면역질환, 자가면역질환, 면역결핍질환, 조직구증, 혈액암 및 고형암으로 이루어진 군에서 선택된 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 이중특이성항체의 형태는 IgG-scFv, DVD-Ig 또는 BiTE 인 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 이중특이성항체는 비드 또는 플레이트에 코팅된 것인 조성물.
  6. 시료 내의 NK 세포 상의 활성화 수용체인 NKG2D 및 2B4를 이중특이성항체로 자극하는 단계;
    상기 활성화 수용체에 대한 자극으로 유발된, 상기 NK 세포의 시너지 활성화 정도를 측정하는 단계; 및
    정상 NK 세포의 시너지 활성화 정도 대비 상기 NK 세포의 시너지 활성화 정도를 비교하는 단계를 포함하는,
    NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단에 대한 정보를 제공하기 위한 NK 세포의 활성도 검사 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 이중특이성항체는 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 시료는 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 림프액, 소변, 분변, 조직, 세포, 기관, 골수, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 그들의 조합에서 분리된 것인 방법.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 활성화 정도를 측정하는 단계는 하위인자의 인산화 또는 발현 정도, 탈과립화 활성, 세포독성 활성 및 NK 세포 자극에 의해 분비된 싸이토카인의 측정 중 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 싸이토카인은 그랜자임 B, IFN-γ, TNF-α, TNF- β, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IL-8 및 IL-10 중 선택된 것인 방법.
  11. 청구항 1의 조성물을 포함하는 것인, NK 세포의 시너지 활성과 관련된 질환의 진단을 위한 정보를 제공하기 위한 것인 키트.
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Hun Sik Kim et al, Immunity (2010.02.), vol 26, no 32(2), pp 175-186. doi:10.1016/j.immuni.2010.02.004. *

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