JP6868655B2 - Cd6結合パートナーの使用およびそれに基づく方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2013年7月23日にインド特許庁に出願されたインド特許仮出願第3264/CHE/2013号の利益および優先権を主張するものである。2013年7月23日に出願された前記出願の内容は、PCT規則4.18に準拠して、本明細書に収載され、PCT規則20.5(a)で言及されていない明細書、特許請求の範囲または図面の任意の要素または部分の組み込みを含めて、その全体がすべての目的で参照により本明細書に組み込まれている。
本開示は、CD6結合パートナーの方法および使用に関する。詳細には、本開示は、T−ヘルパー17(Th17)および/またはT−ヘルパー1(Th1)Tリンパ球(T細胞)によって媒介される病状の、予防を含む処置のための方法に関する。さらに、本開示は、自己反応性Th17およびTh1 Tリンパ球によって媒介される病状の処置のための抗CD6結合パートナーの使用に関する。本開示の結合パートナー、組成物、方法および使用は、サイトカインIL−23R(インターロイキン23受容体)の産生を抑制し、その結果、Th17細胞によって媒介される炎症を減少させることにより免疫応答をモジュレートする方法および使用にさらに有用である。
本開示を容易に理解し、実施することができるように、次に、添付の図を参照しながら例証して例示的実施形態に言及することにする。これらの図は、下記の詳細な説明と共に、本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を形成するものであり、本開示による、実施形態のさらなる例証ならびに様々な原理および利点の説明に役立つ。
本明細書および特許請求の範囲を含めて、本文書において用いる以下の用語は、別段の記述がない限り、下に与える定義を有する。
本発明者らは、抗CD3抗体との抗CD6抗体媒介同時刺激が非常に有意なものであり、IL−23Rの発現を促進することによって安定したTh17発生のためにナイーブT細胞を予備刺激する、抗CD28/CD3によって誘導される同時刺激と比較して明らかにより有意であるという、驚くべき発見をした。例えば、抗CD6抗体は免疫抑制活性を有し、Th1およびTh17(IL-23R産生T細胞)媒介炎症性自己免疫疾患を選択的に抑制するように作用する。
− 抗CD6抗体を含む治療有効量の組成物を用意する工程と、
− かかる処置を必要とする対象に、T−ヘルパー17リンパ球(Th17 T細胞)および/またはT−ヘルパー1リンパ球(Th1 T細胞)の活性化を抑制するのに十分な量の前記抗体を投与する工程と
を含む方法を提供する。
混合リンパ球反応およびサイトカイン分析:
PBMCの調製:
血液30mlを健常ドナーから採取する。PBMCを標準的フィコール(FICOLL)密度勾配遠心分離によって単離する。単球除去および樹状細胞誘導アッセイの準備:これらの細胞をCO2インキュベーター内で2時間インキュベートする。単球をプラスチック表面に付着させる。その後、非付着細胞(PBL)をフラスコから除去する。すべてのフラスコを1XPBSで1回洗浄する。DC培地20ml(アッセイ培地50ml中のストック50ml、GMCSF 10μlおよびIL-4 5μlから作製)を各フラスコに添加する。フラスコをCO2インキュベーター内で6日間保持する。
第6日に、LPSを有するDC培地を各フラスコに添加し(フラスコ内のLPSの最終濃度は4μg/mlである)、CO2インキュベーターに戻して40〜48時間保持する。
DCの調製:
LPS処置後、細胞懸濁液(DC)を2つのフラスコから回収する。各フラスコを1XPBSで1回洗浄する。細胞懸濁液を1500rpmで5分間回転沈降させ、培地3mlで再構成する。LPS処置DCを計数し、アッセイ要件に従って培地で再構成する。
前に述べたのと同じプロトコルに従って、別の健常個体からの血液採取後にフィコール分離を行う。単球除去後、非付着細胞(PBL)を回収し、1500rpmで5分間回転沈降させ、培地5mlで再構成する。PBLを計数し、1.0×106個の細胞/mlに再構成する。
SEBの調製:SEBストック濃度は1mg/mlである。そのストックからのSEB 3μlを培地3mlに溶解してSEBの1μg/ml作業溶液を得る。処置:標準化プロトコルに従って、0.06×106個のDCをSEB 0.6μgで処置する。ストック0.1×106個の細胞/ml(LPS処置成熟DC)を作製する。このストックから、細胞懸濁液600μlをアッセイ培地2.4mlに溶解する(細胞懸濁液の全体積は、0.02×106個の細胞/mlを含有する3mlである)。これを1500rpmで5分間回転沈降させ、SEB(1ug/ml)600μlをそのペレットに添加する。これを37℃のCO2インキュベーター内で20分間インキュベートする。インキュベーション後に過剰な培地(2ml)をチューブに添加し、1500rpmで5分間洗浄する。上清を廃棄し、細胞を培地3mlで再び洗浄する。最後に、ペレットをアッセイ培地3mlに溶解する。
マイトマイシン溶液25μg/mlをマイトマイシンストック1mg/mlから作製する。0.5×106個のPBLを37℃のCO2インキュベーター内で30分間、マイトマイシン25μg/ml 500μlで処置する。インキュベーション後に過剰な培地(2ml)をそれに添加し、細胞を5培地のために1500rpmで洗浄する。上清を廃棄し、細胞を培地3mlで再び洗浄する。
MLRアッセイをDC:PBL=1:50比で行う。使用する陰性対照はニモツズマブである。6日後、プレートをアラマーブルーで読み取る。平行プレートから上清を採取し、Th1、Th2およびTh17 CBAヒトキット(BD biosciences, Pharmingen, USA)を使用してサイトカインについてアッセイし、これはその製造業者の指示に従って使用する。キットと共に供給される標準物質からサイトカインの濃度を決定する。Cyan−ADP、Beckman Coulter、フローサイトメーターとSumiit 4.3ソフトウェアですべての試料を分析した。
EAEの誘導および処置:
第0日に、結核菌(M. tuberculosis)H37Ra加熱死菌500μgを含有する等体積のCFAと併せたPBS中のMOG35−55 20μgからなるエマルジョン200μlを用いてマウスに皮下免疫した。エマルジョンを腰部の一方に注射し、その後、外側尾静脈を通して0.01M PBS中の百日咳(B. pertussis)毒素(0.2μg/100μl)100μlを静脈内注射した。百日咳毒素100μlの追加免疫用量を第3日に投与した。第7日に、MOG/CFAエマルジョン200μlを他方の側腹部に皮下注射してマウスを再び免疫した。第14日にマウスを無作為化し、対照よび抗CD6処置マウスとして群分けした。処置マウス群に抗マウスCD6 MAb(R&DSystem)/10D12 60μg/100μl/用量を1日おきに腹腔内注射した。対照マウスには同じ用量の抗ラットIgG MAbを注射した。マウスをEAEの症状について観察した。対照および処置群における疾患重症度および発症を、第14日から第32日まで臨床スコアとして次のような5段階評価で採点した−0、正常;0.5、硬い尾;1、ぐにゃぐにゃの尾;1.5、立てることができないぐにゃぐにゃの尾;2、1肢の麻痺;2.5、1肢の麻痺と他の1肢の脱力;3、後肢両方の完全麻痺;4、瀕死;5、死亡。1つの群の臨床スコアを合計し、その群の全マウス数で割ることによって平均臨床スコアを算出した。マウスにおける疾患の誘導は、95%より高かった。
マウスを第30日に屠殺した。各マウスからの脾臓および血液を評定した。同じマウス群から得た脾臓をインビトロ実験のためにプールした。MOG免疫した、対照および抗CD6 MAb処置マウスから得た脾細胞(0.2x106個の細胞/ウェル)を96ウェルプレート(Nunc)においてプレコート済み抗CD3 MAb(2.5μg/ml)で刺激した。未コートウェル内の脾細胞を無刺激対照細胞として使用した。細胞を3日間インキュベートした。第3日にアラマーブルー(30μl/ウェル;Invitrogen)を添加した。一晩のインキュベーション後、翌朝にBiotek Synergyプレートリーダーを使用して530/590nmでプレートを読み取った。データを両方の群の無刺激および刺激脾細胞からの平均相対蛍光単位(RFU)値として表した。
サイトカイン分析のために、同じ増殖アッセイの設定を脾細胞の刺激に用いた。簡単に言うと、MOG免疫した、対照および抗CD6 MAb処置マウスから得た脾細胞(0.2x106個の細胞/ウェル)を96ウェルプレート(Nunc)においてプレコート済み抗CD3 MAb(2.5μg/ml)で刺激した。未コートウェル内の脾細胞を無刺激対照細胞として使用した。第3日に上清を回収し、サイトメトリックビーズアレイ(CBA)炎症性サイトカインキット(インターロイキン−6、インターロイキン−10、インターロイキン−12p70、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子−α)(BD Biosciences, USA)を製造業者の指示に従って使用してサイトカイン測定を行うまで−80℃で保存した。簡単に言うと、別個の蛍光強度を有し、サイトカイン特異的捕捉抗体でコートされた混合ビーズ集団50μlを上清50μlおよび炎症性サイトカイン抗体用のフィコエリトリン検出試薬50μlに添加した。同時に、各サイトカイン用の標準物質(0〜5000pg/ml)を同様にサイトカイン捕捉ビーズおよびフィコエリトリン検出n試薬と混合した。ボルテックスした混合物を2時間、室温で暗所においてインキュベートした。ビーズを洗浄し、フローサイトメーター(CyAnDMADP, Dako)で獲得した。キットと共に供給されたサイトカイン標準物質から標準曲線を導出し、標準グラフを使用してそれぞれのサイトカインの量(pg/ml)を算出した。
方法:
1.Th17分極のためのヒトPBMC培養
健常ボランティアから同意説明文書へのサイン後にヒト血液を採取し、Ficoll Paque(GE Healthcare Bio-sciences AB, Uppsala, Sweden)での標準密度勾配遠心分離によってPBMC(末梢血単核細胞)を分離した。PBMCを計数し、96ウェル平底プレートに1ウェル当たり100,000個の細胞の密度でプレーティングし、非分極条件(Thnp)およびTh17分極条件(Th17pol)下、抗CD3/抗CD28コートビーズ(1ウェル当たり100,000個の細胞のために5ngの最終濃度で各抗体をビーズにコーティングした)で刺激した。Th17pol条件では、分極サイトカインおよび成長因子をIL−1β 10ng/mL、IL−6 10ng/mL、TGF−β 15ng/mL、IL−23 10ng/mL、抗IL−4 10μg/mLおよび抗IFN−γ 2.5μg/mLの最終濃度で添加した。イトリズマブまたは無関係のアイソタイプ対照抗体(対照)をThnp条件とThpol条件の両方で、40μg/mLの最終濃度で細胞に添加した。細胞を37℃のCO2インキュベーター内で13日間培養し、様々な時点(第3日、第6日、第8日および第13日)でサイトカイン、細胞表面および細胞内マーカー分析のために試料採取した。連続的に培養した細胞については、培地50μLを第6日および第10日に、Thnp条件に関してはIL−2 2ng/mLを含有するRPMI完全培地およびTh17pol条件に関してはIL−2 2ng/mLと共にIL−23 10ng/mlを含有するRPMI完全培地で置換した。
各時点で、細胞上清100μLを四つ組ウェルから回収してプールし、−80℃で凍結させた。サイトカイン分析は、ヒトIFN−γ Quantikine SixPak(SFI50)およびヒトIL−17(IL-17A)(R&D SystemsからのQuantikine SixPak(S1700)キット)を使用して製造業者の指示に従って行った。SpectraMax M5eリーダー、Molecular Device、Sunnyvale、CA、USAを使用して450/630nmで吸光度を読み取った。
細胞表面マーカー染色:各時点で、四つ組ウェルから細胞を収集し、ヒトFc受容体結合阻害剤でブロックし、4℃で30分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、細胞表面マーカー(例えば、CD4、CD8、CD25、CD6)に対する抗体を含有する染色バッファー(1X PBS中の2%FBS)に再懸濁した。試料の獲得および分析は、Cyan−ADPフローサイトメーターとSummitバージョン4.3ソフトウェア(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)を使用して行った。リンパ球を前方および側方散乱によってゲートをかけ、さらにCD4+T細胞にゲートをかけた。
GraphPad Prism 6.0ソフトウェア(GraphPad software, San Diego, CA, USA)をすべての統計解析に使用した。統計的有意性は、対応のないt検定、続いてα=5.000%でホルム・サイダック法を用いて決定した(図3B)。
Th17分極条件でのT細胞活性化およびCD6過発現:
図3Aに示すように、第13日までの分泌IL−17レベルの増加は、Thnp細胞(抗CD3/抗CD28、非分極条件;Thnpで刺激したPBMC)と比較してTh17pol条件で刺激した細胞(Th17分極、Th17pol、サイトカインの存在下、抗CD3/抗CD28で刺激したPBMC)ではIFN−γ放出の上昇より3〜4倍高かった。第13日におけるIL−17およびIFN−γの絶対濃度を図3Bに示す。Th17pol条件で刺激した細胞によって放出されたIFN−γは、Thnp細胞と比較して有意に低かった。同様に、これらのTh17pol細胞は、Thnp細胞と比較して分泌IL−17レベルの3〜4倍増加を示した。これらの結果は、Th17pol条件下でTh17細胞へのシフトが第3日ほどもの早期に開始され、第13日までに完全に確立されたことを示す。ThnpならびにTh17pol条件でもDC25(IL-2Rα)過発現が示す通り第3日にCD4+T細胞の同様の活性化があった(図3C)。
方法:
1.Th17分極のためのヒトPBMC培養:実施例3で記載したのと同じ。この特定のケースでは実験を第3日および第6日までしか行わなかった。
PBMCを5μMの最終濃度でのCFSE色素と共にインキュベートし、37℃、CO2インキュベーターで15分間(間欠的に振盪しながら)インキュベートし、遠心分離し、完全培地に再懸濁させ、安定化のために37℃、CO2インキュベーターで30分間、再びインキュベートした。細胞を洗浄し、対照またはイトリズマブ抗体を用いてThnpおよびTh17pol条件で刺激した。刺激後第3日にフローサイトメトリーを用いて細胞をCD4+T細胞でのCFSE希釈について分析した。
細胞表面マーカー染色:各時点で、四つ組ウェルから細胞を収集し、ヒトFc受容体結合阻害剤でブロックし、4℃で30分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、細胞表面マーカー(例えば、CD4、CD8、CD25)に対する抗体を含有する染色バッファー(1X PBS中の2%FBS)に再懸濁させた。試料の獲得および分析は、Cyan−ADPフローサイトメーターとSummitバージョン4.3ソフトウェア(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)を使用して行った。リンパ球を前方および側方散乱によってゲートをかけ、さらにCD4+T細胞にゲートをかけた。
イトリズマブはThnpおよびTh17pol条件でのT細胞活性化および増殖の阻害と関連付けられる。
方法:
1.Th17分極のためのヒトPBMC培養:実施例3で記載したのと同じ
IL−17AおよびIFN−γについての細胞内サイトカイン染色を次のように行った。分析の時点で、細胞を無刺激で置くか、またはBD Golgi Stop Plug(商標)の存在下でPMA 50ng/mLおよびイオノマイシン 1μg/mLで刺激し、5時間、37℃でインキュベートした。細胞を収集し、染色バッファーで洗浄し、ヒトFc受容体結合阻害剤でブロックした。表面マーカー染色後、細胞をBD Cytofix/Cytoperm(商標)固定/透過性化バッファーに再懸濁させ、細胞内染色を製造業者の指示に従って行った。試料の獲得および分析は、Cyan−ADPフローサイトメーターとSummitバージョン4.3ソフトウェア(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)を使用して行った。それぞれの実験に関して述べたように、リンパ球を前方および側方散乱によってゲートをかけ、さらにCD3+T細胞にゲートをかけた。
各時点で、細胞上清100μLを四つ組ウェルから回収してプールし、−80℃で凍結させた。サイトカイン分析は、ヒトIFN−γ Quantikine SixPak(SFI50)およびヒトIL−17(IL-17A)(R&D SystemsからのQuantikine SixPak(S1700)キット)を使用して製造業者の指示に従って行った。SpectraMax M5eリーダー、Molecular Device、Sunnyvale、CA、USAを使用して450/630nmで吸光度を読み取った。
GraphPad Prism 6.0ソフトウェア(GraphPad software, San Diego, CA, USA)をすべての統計解析に使用した。統計的有意性は、対応のないt検定、続いてα=5.000%でホルム・サイダック法を用いて決定した(図5DおよびE)。
イトリズマブはTh17ホールマークサイトカインの低減と関連付けられる。
T17pol条件下でのTh1(IFN-γ)およびTh17(IL-17A)シグネチャーサイトカインの細胞内発現を対照抗体処置細胞とイトリズマブ処置細胞間で比較した。第6日からの代表ドットプロットは、対照と比較して、イトリズマブ処置するとIFN−γとIL−17A両方の最小限の発現しか示さない(図5A)。イトリズマブ処置と同様の低減がThnp条件でも観察された。
方法:
1.Th17分極のためのヒトPBMC培養:実施例3で記載したのと同じ
pSTAT3についての細胞内染色を次のように行った。分析の時点で、細胞を収集し、染色バッファーで洗浄し、ヒトFc受容体結合阻害剤でブロックした。表面マーカー(CD4)染色後、細胞を2%PFA(各染色ウェルに100μl)で固定し、4℃で15〜20分間インキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄し、100%冷却メタノールで透過性化した。細胞を穏やかにボルテックスしながら冷却メタノール500μlを添加し、4℃で20分間インキュベートした。4℃で約250xgでの5分間の遠心分離後、メタノールをデカントし、細胞を染色バッファーに再懸濁した。細胞内染色用の抗体を染色バッファーで希釈し、適切な希釈度で添加し、プレートを4℃で30分間インキュベートした。細胞を染色バッファーで3回洗浄し、1xPBSに再懸濁し、獲得した(すべての洗浄を4℃で行った)。
イトリズマブの存在下でのシグネチャーTh17特異的マーカーの低減
Th17分化は、pSTAT3転写因子とRORγT転写因子の相乗的組み合わせを伴う(Annunziato, Cosmi et al. 2007; Bettelli, Korn et al. 2008; de Wit, Souwer et al. 2011)。以前に、本発明者らは、活性化T細胞上でのpSTAT3発現のイトリズマブ媒介低減に関して報告しており(Nair, Melarkode et al. 2010)、本研究ではそれをさらに確証した(図6A)。本発明者らは、Th17pol条件で、対照抗体処置細胞と比較してイトリズマブの存在下でIL−17AおよびRORγT二重陽性T細胞の実質的低減があることも示す。エフェクターサイトカインのピーク阻害(図5B〜E)と相関して、本発明者らは、第6日にこれらの二重陽性細胞の実質的低減(70〜80%低減)および全RORγT MFIの実質的低減を観察した(それぞれ図6Bおよび6C)。同様の傾向が第8日にも観察された。
Annunziato, F., L. Cosmi, et al. (2007). "Phenotypic and functional features of human Thl7 cells." J Exp Med 204(8): 1849-61.
Bettelli, E., T. Korn, et al. (2008). "Induction and effector functions of T(H)17 cells." Nature 453(7198): 1051-7.
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- 対象における同種移植片拒絶または移植片対宿主病の処置において、Tヘルパー17(Th17)リンパ球の低減に使用するための、CD6のD1に特異的に結合するヒト化抗体であるイトリズマブを含む医薬組成物であって、
前記対象は、健常対象と比較して、Th17リンパ球数が増加しており、
前記イトリズマブがCD4+T細胞および前記Th17リンパ球の発現および活性を低下させ、
前記Th17リンパ球が、TNF−α、IL−17およびIL−17Aの1以上を発現する、医薬組成物。 - 前記対象は、健常対象と比較したとき、Tヘルパー1(Th1)細胞数増加を有することがさらに分かっている、請求項1に記載のイトリズマブを含む医薬組成物。
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