KR102276745B1 - Cd6 결합 파트너의 용도 및 이에 기초한 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 T-헬퍼 17 (Th17) 및/또는 T-헬퍼 1 (Th1) T 림프구 (T 세포)에 의해 매개되는 질병 상태를 치료 및 예방하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 자가-반응성 Th17 및 Th1 T 림프구에 의해 매개되는 질병 상태의 치료를 위한 항-CD6 항체의 사용에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 또한 사이토카인 IL-23R의 생산을 억제하고 이로 인해 Th17 세포에 의해 매개되는 염증을 감소시킴으로써 면역 반응을 조절하기 위한 방법에 유용성을 갖는다.

Description

CD6 결합 파트너의 용도 및 이에 기초한 방법 {USE OF A CD6 BINDING PARTNER AND METHOD BASED THEREON}
1. 관련출원
본 출원은 인도 특허청에 2013년 7월 23일자로 출원된 인도 가특허 출원 제3264/CHE/2013호의 이익과 우선권을 주장한다. 2013년 7월 23일자로 출원된 상기 출원의 내용은 이의 모든 요소 또는 일부의 인용을 포함하여 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참고서 인용된다.
2. 기술분야
본 발명은 CD6 결합 파트너의 방법 및 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 T-헬퍼 17 (Th17) 및/또는 T-헬퍼 1 (Th1) T 림프구 (T 세포)에 의해 매개되는 질병 상태의 예방을 포함한 치료 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 자가-반응성(auto-reactive) Th17 및 Th1 T 림프구에 의해 매개되는 질병 상태를 치료하기 위한 항-CD6 결합 파트너의 용도에 관한 것이다. 나아가, 본 발명의 결합 파트너, 조성물, 방법 및 용도는 사이토카인 IL-23R (인터류킨 23 수용체)의 생성을 억제하고 이로 인해 Th17 세포에 의해 매개되는 염증을 감소시킴으로써 면역 반응을 조절하기 위한 방법 및 용도에 유용성을 갖는다.
발명의 배경에 대한 다음 논의는 단지 본원에 서술된 결합 파트너, 조성물, 방법 및 용도에 대한 이해를 돕기 위해 제공되고, 종래 기술을 설명하거나 구성하는 것으로 인정되지는 않는다.
특정 질병에 대한 보호 면역은 선청성 면역 시스템의 항원 제시 세포 (APCs), 예컨대 수지상 세포 (DCs) 및 대식세포에 의해 특정 전염증성(pro-inflammatory) T-세포 (T 림프구) 집단의 차별적인(differential) 유도에 의존한다. 광범위한 병원체 에 대한 세포성 면역을 매개할 책임이 있는 이러한 두 T-세포 집단은 Th1 및 Th17 세포이다. Th1 및 보다 최근에는 Th17 T 세포 집단은 모두 자가면역성 및 만성 염증성 질병의 매개체(mediators)로서 암시되어 왔고, 따라서 면역억제제에 대한 관련 세포 표적으로 작용한다. 또한, T-세포 반응의 개시제(initiators)로서 수지상 세포는 염증성 질병과 싸우기 위해 설계된 치료법에서 2차 세포 표적이다.
다발성 경화증(Multiple Sclerosis, MS)은 중추신경계(CNS)의 염증성 자가면역 질환으로, CNS 내의 T-세포, B 세포, 대식세포 및 국소(focal) 탈수초반(demyelinating plaques)의 염증성 침윤을 특징으로 한다. Th1 및 Th17 세포-매개 반응 모두 염증성 탈수초화의 발달에 역할을 하는 것으로 나타났다. MS 환자의 미엘린-반응성 T-세포는 Th1-매개 반응과 일치하는 사이토카인을 생성하며, 환자로부터 MS 병변의 마이크로어레이 연구는 IL-23R의 증가된 발현을 증명한다.
자가면역 염증 반응, 및 특히 MS의 메커니즘 연구를 위한 적절한 모델은 다발성 경화증 (MS)의 임상 및 신경 병리학적 변화를 나누는 염증성 탈수초성 질환의 실험적 자가면역 뇌수막염 (EAE) 동물 모델이다. EAE의 유도에서 CD8+ T-세포에 대한 병원성 역할 또한 입증되었지만, EAE는 주로 CD4+ Th1-매개 질병으로 오랫동안 받아들여졌다. 그러나 최근, T 세포 서브셋를 생성하는 IL-17이 EAE의 발병에 중요한 역할을 한다는 것이 입증되었다. 여전히 문헌에서 몇몇 논쟁은 있지만, Th1 및 Th17 세포는 기관-특이적 자가면역의 발달 유도에 협력할 개연성이 있다.
CD6은 인간 T 세포 및 B 세포의 서브셋, 뿐만 아니라 일부 B 세포 만성 림프구성 백혈병 및 뉴런에 의해 대부분 발현되는 중요한 세포 표면 단백질이다 [Aruffo et al., J. Exp. Med. 1991, 174:949; Kantoun et al., J. Immunol. 1981, 127:987; Mayer et al., J. Neuroimmunol. 1990. 29: 193]. CD6은 타입 I 대식세포의 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부 도메인 (scavenger receptor cysteine-rich, SRCR)에 상동의 하나 이상의 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질의 큰 패밀리의 구성원이다[Matsumoto, et al., J. Exp. Med. 1991, 173 :55 and Resnick et al., Trends Biochem. Sci. 1994, 19:5]. 상기 패밀리의 다른 구성원은 CD5 [Jones et al., Nature. 1986, 323 :346]; 시클로필린 C [Friedman et al. 1993, PNAS 90:6815]; 활성화된 보체 단백질 C3b 및 C4b를 결합하는 보체인자 I [Goldberger, et al., J. Biol. Chem. 1987, 262: 10065]; 타우(tau)/델타(delta) T 세포에 의해 발현되는 소(bovine)의 WC-1 [Wijingaard et al., J. Immunol. 1992, 149:3273] 및 M130 [Law et al., Eur J. Immunol. 1993, 23 :2320], 대식세포 활성 마커를 포함한다.
항-CD6 단일클론 항체 (mAbs)를 이용한 블로킹 연구는 CD6이 흉선 상피 (TE) 세포와 T 세포 부착 상호작용을 조절함으로써 T 세포 발달에 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다 (Patel et al., J. Exp. Med. (1995) 181 : 1563-1568). 추가적인 연구는 CD6이 T 세포 활성에 있어 중요한 보조 분자로서 기능할 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 특정 항-CD6 mAb는 직접적으로 T 세포에 대한 미토겐(mitogenic)이며 (Gangemi et al., J. Immunol. (1989) 143 :2439; Bott et al., Int. Immunol. (1993) 7:783), 반면에 다른 것들은 항-CD3, 항-CD2 또는 PMA와 함께 T 세포 증식을 공동 자극(co-stimulate)할 수 있다(Gangemi et al., J. Immunol. (1989) 143 :2439; Morimoto et al., J. Immunol. (1988) 140:2165-2170; Osorio et al., Cell. Immunol. (1994) 154:23). 역시 T 세포 활성화에 CD6의 역할의 추가적인 증거는 CD6이 Ser 및 Thr 잔기에 과인산화(Swack et al., Mol. Immunol. (1989) 26: 1037-1049; Swack et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:7137; Cardenas et al., J. Immunol., 145: 1450-1455 (1990)) 및 Tyr 잔기에 인산화(Wee et al., J. Exp. Med. (1993) 177:219-223)되고, T 세포 활성화되는 것을 보여주는 연구에서 비롯된다. 이들 및 다른 연구들은 CD6이 생체 내 미숙 및 성숙 T 세포 모두의 중요한 조절체(modulator)로서 작용하여, T 세포 활성화 및 신호 전달 모두에 영향을 미치는 것임을 보여준다 (De Wit, J., et al., Blood (2011) 118:6107-6114).
Annunziato, F., L. Cosmi, et al. (2007). "Phenotypic and functional features of human Th17 세포." J Exp Med 204(8): 1849-61. Bettelli, E., T. Korn, et al. (2008). "Induction and effector functions of T(H)17 cells." Nature 453(7198): 1051-7. Brucklacher-Waldert, V., K. Stuerner, et al. (2009). "Phenotypical and functional characterization of T helper 17 cells in multiple sclerosis." Brain 132(Pt 12): 3329-41. De Wit, J., Y. Souwer, et al. (2011). "CD5 costimulation induces stable Th17 development by promoting IL-23R expression and sustained STAT3 activation." Blood 118(23): 6107-14. Kleinewietfeld, M., F. Puentes, et al. (2005). "CCR6 expression defines regulatory effector/memory - ke cells within the CD25(+)CD4+ T- cell subset." Blood 105(7): 2877-86. Liao, F., R. L. Rabin, et al. (1999). "CC-chemokine receptor 6 is expressed on diverse memory subsets of T cells and determines responsiveness to macrophage inflammatory protein 3 alpha." J Immunol 162(1): 186-94. Liu, H. and C. Rohowsky-Kochan (2008). "Regulation of IL-17 in human CCR6+ effector memory T cells." J Immunol 180(12): 7948-57. Nair, P., R. Melarkode, et al. (2010). "CD6 synergistic co-stimulation promoting proinflammatory response is modulated without interfering with the activated leucocyte cell adhesion molecule interaction." Clin Exp Immunol 162(1): 116-30. Sallusto, F., D. Lenig, et al. (1998). "Flexible programs of chemokine receptor expression on human polarized T helper 1 and 2 lymphocytes." J Exp Med 187(6): 875-83. Singh, S. P., H. H. Zhang, et al. (2008). " Human T 세포 that are able to produce IL-17 express the chemokine receptor CCR6." J Immunol 180(1): 214-21. Yamazaki, T., X. O. Yang, et al. (2008). "CCR6 regulates the migration of inflammatory and regulatory T cells." J Immunol 181(12): 8391-401.
본원에는 피험자의 자가면역 질환 뿐만 아니라 동종이식편 거부반응 및 이식편대숙주병 치료(예방을 포함)에 지시된 방법, 용도 및 조성물이 개시되어 있다. 각각의 방법 및 용도는 CD6에 특이적으로 결합하는 결합 파트너의 치료적으로 유효한 양을 피험자에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 T-헬퍼 17 (Th17) 및/또는 T-헬퍼 1 (Th1) T 림프구 (T 세포)에 의해 매개되는 질병 상태의 치료(예방을 포함) 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 자가-반응성 Th17 및 Th1 T 림프구에 의해 매개되는 질병 상태를 치료하기 위한 항-CD6 항체의 용도에 관한 것이다. 또한 발명의 방법은 사이토카인 IL-23R의 생성을 억제하고 이로 인해 Th17 세포에 의해 매개되는 염증을 감소시킴으로써 면역 반응을 조절하기 위한 방법에 유용성을 갖는다.
첫 번째 양태에서 (i) T 헬퍼 17 (Th17) T 림프구의 증가된 수가 특징인 자가면역 질환, (ii) 동종이식편 거부반응, 또는 (iii) 이식편대숙주병을 앓는 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 따라서 상기 개체는 건강한 개체와 비교할 때 증가된 수의 Th17 T 림프구를 갖는 것으로 알려지거나 의심된다. 상기 방법은 CD6에 특이적으로 결합하는 결합 파트너를 개체에 투여하는 것을 포함한다.
두 번째 양태에서, 개체의 (i) 자가면역 질환, (ii) 동종이식편 거부반응, 또는 (iii) 이식편대숙주병의 치료에 사용하기 위한 CD6에 특이적으로 결합하는 결합 파트너가 제공된다. 개체는 건강한 개체와 비교할 때 증가된 수의 Th17 T 림프구를 갖는 것으로 알려지거나 의심된다. 이러한 Th17 T 림프구는 자가-반응성 Th17 T 림프구일 수 있다.
제1양태에 따른 방법 또는 제2양태에 따른 용도에 대한 CD6에 특이적으로 결합하는 결합 파트너의 일부 실시예에서, 또한 개체는 건강한 개체와 비교할 때 증가된 수의 Th1 세포를 갖는 것으로 추가로 알려지거나 의심된다. 이러한 Th1 T 림프구는 자가-반응성 Th1 T 림프구일 수 있다.
제1양태에 따른 방법 또는 제2양태에 따른 용도에 대한 CD6에 특이적으로 결합하는 결합 파트너의 일부 실시예에서, 자가면역 질환은 류마티스 관절염이다. 일부 실시예에서 자가면역 질환은 염증성 장 질환이다. 자가면역 질환은 예를 들어 크론병일 수 있다. 일부 실시예에서 자가면역 질환은 궤양성 대장염이다. 자가면역 질환은 일부 실시예에서 건선이다. 일부 실시예에서 자가면역 질환은 쇼그렌 증후군이다. 일부 실시예에서 자가면역 질환은 강직성 척추염이다. 일부 실시예에서 자가면역 질환은 I형 당뇨병이다.
제1양태에 따른 방법 또는 제2양태에 따른 용도에 대한 CD6에 특이적으로 결합하는 결합 파트너의 일부 실시예에서, 결합 파트너는 면역글로불린과 같은 항체다. 항체는 예를 들어 다클론 면역글로불린일 수 있다. 일부 실시예에서 항체는 단일클론 항체다. 일부 실시예에서 항체는 완전 비-인간 항체다. 일부 실시예에서 항체는 키메라 항체다. 항체는 일부 실시예에서 인간화 항체다. 일부 실시예에서 항체는 완전 인간 면역글로불린과 같은 완전 인간 항체다. 인간화 항체의 예시는 이톨리주맙이다.
제1양태에 따른 방법 또는 제2양태에 따른 용도에 대한 CD6에 특이적으로 결합하는 결합 파트너의 일부 실시예에서, 결합 파트너는 면역글로불린의 기능성 단편이다. 일부 실시예에서 각 기능성 면역글로불린 단편은 Fab-단편이다. 일부 실시예에서 기능성 면역글로불린 단편은 단쇄 가변 단편(single-chain variable fragment, scFv)이다. 일부 실시예에서 기능성 면역글로불린 단편은 나노바디다.
일부 실시예에서, CD6에 특이적으로 결합하는 결합 파트너는 약학적 조성물에 포함된다. 약학적 조성물은 CD6에 특이적으로 결합하는 결합 파트너와 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제(diluent), 담체(carrier) 또는 부형제(excipient)를 포함한다.
세 번째 양태에 있어, (i) TTh17 T 림프구 수가 증가됨을 특징으로 하는 자가면역 질환, (ii) 동종이식편 거부반응, 또는 (iii) 이식편대숙주병을 앓는 환자의 치료 방법을 제공한다. 따라서 개체는 건강한 개체와 비교할 때, 증가된 수의 Th17 T 림프구를 갖는 것으로 알려지거나 의심된다. 상기 방법은 CD6에 특이적으로 결합하는 결합 파트너 및 CD3에 특이적으로 결합하는 결합 파트너를 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, CD6에 특이적으로 결합하는 결합 파트너 및 CD3에 특이적으로 결합하는 결합 파트너는 서로 독립적으로 투여된다. 일부 실시예에서, CD6에 특이적으로 결합하는 결합 파트너 및 CD3에 특이적으로 결합하는 결합 파트너는 병용 투여된다.
네 번째 양태에 있어, 환자의 (i) 자가면역 질환, (ii) 동종이식편 거부반응, 또는 (iii) 이식편대숙주병의 치료에 사용하기 위한 CD6에 특이적으로 결합하는 결합 파트너 및 CD3에 특이적으로 결합하는 결합 파트너의 조합이 제공된다. 개체는 건강한 개체와 비교할 때, 증가된 수의 Th17 T 림프구를 갖는 것으로 알려지거나 의심된다. 이러한 Th17 T 림프구는 자가-반응성 Th17 T 림프구일 수 있다.
다섯 번째 양태에 있어, 건강한 개체와 비교할 때 증가된 수의 Th17 T 림프구를 갖는 것으로 알려지거나 의심되는 환자의 자가면역 질환 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다. 약학 조성물은 CD6에 특이적으로 결합하는 결합 파트너 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함한다.
여섯 번째 양태에 있어, 건강한 개체와 비교할 때 증가된 수의 Th17 T 림프구를 갖는 것으로 알려지거나 의심되는 환자의 자가면역 질환 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다. 약학 조성물은 CD6에 특이적으로 결합하는 결합 파트너를 포함한다. 또한 약학 조성물은 CD3에 특이적으로 결합하는 결합 파트너를 포함한다. 더욱이 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함한다.
본 발명을 쉽게 이해하기 위해서는, 첨부된 도면과 함께 예시된 실시예를 참조하여야 할 것이다. 하기의 상세한 설명과 함께 도면은, 명세서에 인용되어 명세서의 일부를 형성하고, 나아가 본 발명에 따른 실시예를 도시하고 다양한 원리 및 장점을 설명하는 역할을 한다:
도 1은 혼합 림프구 반응 분석에 있어 이소타입 대조 항체, 즉 인간화 단일클론 항체 니모투주맵(Nimotuzumab) ("Tlh")와 비교하여 인간화 단일클론 항체 이톨리주맙(Itolizumab)에 의한 Th1 및 Th17 사이토카인의 억제를 도시한다.
도 2는 항-마우스 CD6 도메인 1 특이 항체 (이톨리주맙에 대용(surrogate) 항체)가 Th1 및 Th17 사이토카인을 억제함을 보여준다. 항-마우스 CD6 항체로 처리한 EAE 유도된 동물의 비장세포, 및 쥐 항체로 처리한 그룹은 항 CD3 항체로 배양에서 재자극하였다. 쥐 항체로 처리한 군은 Th1 및 Th17 사이토카인 다량 배출과 관련된 높은 증식을 보였다. 반면에, MS의 이 마우스 모델에서 항-마우스 CD6 처리한 동물 군은 감소된 증식 및 Th1 및 Th17 특이적 사이토카인의 낮은 배출을 보였다.
도 3은 전염증성 CD4+T 세포 서브셋에서 CD6의 과발현을 나타낸다.
(A) Thnp (CD4+ T 세포에 대해 무극성(nonpolarizing)) 또는 Th17pol (Th17-극성(polarizing)) 조건에서 PBMC를 자극하고, 사중 웰(quadruplicate wells)로부터 상청액을 수집하여 모으고 분비된 IFN-γ (Th1 표시 사이토카인) 및 IL-17 (Th17 표시 사이토카인)에 대해 ELISA를 사용하여 분석하였다. Th17pol 및 Thnp 조건에서 IFN-γ (빈 삼각형) 또는 IL-17A (채워진 사각형)의 절대 농도 비율(Th17pol: Thnp)을 분석 일수에 따라 플로팅 하였다.
(B) 13일 째 IFN-γ (빈 바) 및 IL-17 (음영바)의 절대 레벨을 Thnp 및 Th17pol 조건에서 비교하였다. 표시된 데이터는 삼중 ELISA 웰에 대한 평균±SD이다 (p<0.001).
(C) PBMC를 Thnp 또는 Th17pol 조건에서 비자극 또는 자극한 채로 두었다. CD4+T 세포상의 CD25 발현은 3일째에 분석하였다.
(D) PBMC를 Thnp (실선) 또는 Th17pol (점선) 조건에서 비자극 (음영된 히스토그램) 또는 자극한 상태로 두었다. CD6 발현(검출 시약으로 비오틴 이톨리주맙을 사용)을 9일째에 분석하고 CD4+T 세포상에 게이트된(gated) CD6 오버레이 히스토그램(overlay histograms)으로 플로팅 하였다.
(E) 자극되지 않은 상태에서 게이트된 CD4+T 세포상의 CD6 MFI의 배수 증가를 계산하고, CD6 검출 시약으로서 3개의 다른 항체, 예컨대 MEM98, MT605 및 비오틴화 이톨리주맙 을 사용하여 Thnp (음영바) 및 Th17pol (빈 바) 조건 모두에 대해 막대 그래프로 그렸다. 표시된 데이터는 ±SD 평균이다 (p<0.05). 패널 A-C에서, 데이터는 다른 공여체로부터 2개의 독립적인 실험을 나타내고, D&E 패널에서 데이터는 6개의 다른 공여체로부터 2개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 4는 이톨리주맙이 Thnp 및 Th17pol 조건 모두에서 T 세포 활성화 및 증식을 억제함을 보여준다.
(A) PBMC를 이톨리주맙 또는 대조 항체의 존재 하에 Thnp 또는 Th17pol 조건에서 자극하였다. 3일째에, 세포를 게이트된 CD4+T 세포상에서 CD25 발현에 대해 분석하였다. 자극된 PBMC에서 % CD4+CD25+T 세포를 막대 그래프로 도시하였다. 표시된 데이터는 다른 공여체로부터 2개의 독립적인 실험에서 평균±SD이다.
(B) CFSE 염료로 표지된PBMC를 이톨리주맙 또는 대조 항체의 존재 하에 Thnp 또는 Th17pol 조건에서 자극하였다. 3일째에, 세포를 게이트된 CD4+T 세포상에서 CFSE 희석에 대해 분석하였다. 표시된 데이터는 1 실험에서이다.
도 5는 이톨리주맙 처리가 Th17 극성 상태에서 자극된 세포에서 IL-17 및 IFN-γ 사이토카인의 발현을 상당히 감소시킴을 보여준다.
PBMC를 이톨리주맙 또는 대조 항체 존재하에 Th17pol 조건에서 자극하였다. 3, 6, 8 및 13일째에, 대조 또는 이톨리주맙 단일클론 항체와 Th17pol 조건에서 자극된 세포를 5시간 동안 PMA-이오노마이신으로 자극하고 세포 내 사이토카인 IFN-γ 및 IL-17 A의 발현에 대해 분석하였다. 6일째에, 전형적인 유동 세포분석(flow cytometry) 점 도표 (게이트된 CD3+T 세포)를 패널 A에 표시하였다. 패널 B & C는 일에 걸쳐 유동세포계수법 분석(flow cytometry analysis)으로 얻은 것으로, 이톨리주맙 (빈 삼각형) 또는 대조 항체 (빈 원)의 존재 하에 각각 IFN-y+T 세포 및 IL-17A+T 세포의 %를 나타낸다. 데이터는 다른 공여체로부터 2개의 독립적인 실험을 대표한다. 분비된 사이토카인의 기초 수준(basal level)을 분석하기 위해, 상청액을 이톨리주맙 (빈 삼각형) 또는 대조 항체 (빈 원)의 존재 하에 Th17pol 조건에서 자극된 PBMC의 사중 웰로부터 수집하였다. ELISA에 의해 평가된 바와 같이, 분비된 (D) IFN-γ 및 (E) IL-17 수준을 일에 걸쳐 그렸다. 패널 D 및 E에서, 데이터는 평균 + SD (p<0.0001)로 표시되고 다른 공여체로부터 2개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 6은 이톨리주맙이 시그너처(signature) Th17 특이 마커의 감소를 일으킨다.
(A) PBMC를 대조 또는 이톨리주맙 항체의 존재 하에 Th17pol 조건에서 자극하고 3일째에 전사인자 pSTAT3의 발현에 대해 분석하였다. 표시된 데이터는 게이트된 CD4+T 세포에서 pSTAT3에 대한 히스토그램이다.
(B) 대조 또는 이톨리주맙 항체의 존재 하에 Th17pol 조건에서 자극된 세포를 5시간 동안 PMA-이오노마이신으로 재자극하고, 세포 내 사이토카인 IL-17A 및 Th17 시그너처 전사인자 RORyT의 발현을 분석하였다. 게이트된 CD3+T 세포상의 RORyT 및 IL-17A의 6일째 대표적인 점을 표시하였다.
(C) 패널 B 데이터를 대조 (빈 히스토그램) 또는 이톨리주맙 (점선 히스토그램) 항체의 존재 하에 Th17pol 조건에서 자극된 게이트된 CD3+T 세포에 RORyT MFI의 히스토그램 오버레이로 그렸다. 표시된 데이터는 다른 공여체로부터 2개의 독립적인 유사한 실험을 나타낸다. (D) 패널 A에서 설명한 바와 같이 실험에 대해, 게이트된 CD3+CCR6+ T 세포상의 CCR6 및 IL-17A의 6일째 대표적인 점을 표시하였다.
정의
달리 명시되지 않는 한, 상세한 설명 및 청구항을 포함하여 본원에서 사용되는 다음의 용어들은 하기 주어진 정의를 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같이 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내에 있는 값을 의미하며, 이는 값을 측정 또는 결정하는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존한다. 예를 들어, "약"은 기술분야의 관행에 따라, 1 또는 1 이상의 표준 편차 내에 있음을 의미할 수 있다. 또한 용어 “약”은 문제의 양 또는 값이 지정된 값이거나 거의 같은 일부 다른 값을 나타내는데 사용된다. 상기 문구는 유사한 값이 본원에 기재된 결합 파트너, 조성물, 방법 및 용도에 따라 동등한 결과 또는 효과를 촉진한다는 것을 전하기 위한 것이다. 이런 맥락에서, “약”은 최대 10% 이상 및/또는 이하 범위를 나타낼 수 있다. 용어 “약”은 일부 실시예에서 특정 값이 최대 5% 이상 및 이하 범위, 예컨대 최대 2%, 최대 1%, 또는 최대 0.5 % 이상 또는 이하 범위를 나타낸다. 일 실시예에서, “약”은 주어진 값의 최대 0.1 % 이상 및 이하 범위를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 “투여”는 화합물, 예컨대 약학적 화합물 또는 항원과 같은 다른 물질을 환자에 옮기거나(transferring), 전달하거나(delivering), 도입하거나roducing), 또는 운반하는(transporting) 것 중 어느 하나를 의미한다. 투여 형태는 경구 투여, 국소 접촉, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 비강 내, 또는 피하 투여 (하기 참조)를 포함한다. 나아가, 하나 이상의 치료제와 같은 물질과 "조합한" 투여는 동시 투여 및 순서에 상관없는 연속적인 투여를 포함한다.
용어 "항체"는 일반적으로 면역글로불린, 이의 단편 또는 면역글로불린-유사 기능을 갖는 단백질 결합 분자(하기 참조)를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "결합 파트너"는 약제가 복합체를 형성하도록 하는 충분한 상호작용, 일반적으로 비공유 결합을 통해 mRNA 분자를 포함하는 DNA 또는 RNA 분자 등의 핵산 분자, 뿐만 아니라 펩티드, 단백질, 단당류, 다당류 또는 지질과 결합할 수 있는 물질, 예컨대 분자, 특히 중합체 분자를 의미한다. 일부 실시예에서 결합 파트너는 PNA 분자이다. 일부 실시예에서 결합 파트너는 면역글로불린 또는 하기에 정의된 바와 같이 면역글로불린-유사 기능을 갖는 단백질 결합 분자를 의미한다. 일부 실시예에서 결합 파트너는 압타머다. 일부 실시예에서 결합 파트너는 특정 표적에 특이적이다. 일부 실시예에서 결합 파트너는 각각 특정 표적에 특이적인 결합 부위의 복수를 포함한다. 실례가 되는 예로서, 결합 파트너는 2개의 결합 부위와 면역글로불린-유사 기능을 갖는 단백질 물질일 수 있다. 예를 들어 이중특이성 단일 사슬 디아바디 등의 이중특이성 디아바디일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 면역글로불린 폴리펩티드 또는 여러 종의 서열을 포함하는 도메인 항체를 의미한다. 키메라 항체에서 중쇄 또는 경쇄는 인간 등의 한 종으로부터 가변 영역 서열 및 쥐 등의 다른 종으로부터 불변 영역 서열을 포함할 수 있다. 예로서, "키메라 항체"는 다른 분자, 예컨대 인간 항체 유래의 불변 도메인에 융합되는 쥐 또는 생쥐 등의 동물 항체 유래의 가변 도메인을 갖는 면역글로불린일 수 있다. 용어 "키메라 항체"는 (i) 중쇄는 키메라(chimeric)지만 경쇄는 한 종으로부터 V 및 C 영역을 포함; (ii) 경쇄는 키메라지만 중쇄는 한 종으로부터 V 및 C 영역을 포함; 및 (iii) 중쇄 및 경쇄 모두 키메라: 인 항체를 포함하는 것이다.
이와 관련하여, 본원에서 사용되는 "인간화 항체"는 면역글로불린 폴리펩티드 또는 인간 항체의 구조적 요소 및 비-인간 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 도메인 항체다. "인간화 항체"는 비-인간 항체로부터 최소한의 잔기를 포함한다. 예를 들어, 이들은 단지 비-인간 항체의 CDR 영역 또는 비-인간 항체의 초가변 영역을 구성하는 그들의 잔기를 포함할 수 있다. 또한 비-인간 폴리펩티드의 가변 영역 외부(outside)에서 특정 잔기, 예컨대 비-인간 항체의 구조를 모방하거나 입체적 간섭을 최소화하는데 필요한 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로 인간화 항체는 인간 면역글로불린 불변 영역과 실질적으로 동일, 즉 적어도 약85-90%, 예컨대 적어도 95% 동일한 임의의 불변 영역이 존재하는 인간 프레임워크, 비-인간 항체로부터 하나 이상의 CDR을 포함한다. 그러므로, 아마 CDR을 제외한 인간화 면역글로불린의 모든 부분이 하나 이상의 원래의(native) 인간 면역글로불린 서열의 상응하는 부분에 실질적으로 동일하다. 게다라, 인간화 항체는 인간 또는 비-인간 항체 중 하나와 일치하지 않는 잔기를 포함할 수 있다.
용어 "검출(detect)" 또는 "검출하는(detecting)"과, 생체표지자(biomarker)의 문맥에서 사용되는 용어 "결정(determine)" 또는 "결정하는(determining)"은 핵산 (DNA 및 RNA) 또는 단백질/폴리펩티드의 존재를 검출하는데 사용될 수 있는 임의의 방법을 의미한다. 단어 "수준(level)", "양(amount)" 또는 "값(value)"과 함께 본원에서 사용되는 경우, 용어 "검출", "검출하는", "결정" 또는 "결정하는"은 일반적으로 양적 또는 질적 수준을 나타내는 것으로 이해된다. 따라서, 본원에 개시된 방법 또는 용도는 절대적인 수치로 Th17 세포 양을 포함할 수 있다. 또한 본원에 개시된 방법 또는 용도는 Th17 세포의 상대적인 양을 측정하여 비교를 포함할 수 있으며, 예를 들어 하나 이상의 건강한 피험자의 기준 샘플과 비교할 수 있다. 또 다른 예로서, IL-17A 또는 TNFα의 절대량은 일부 실시예에서 측정될 수 있다. 일부 실시예에서, 첫 번째 샘플이 두 번째 샘플보다 높은 또는 낮은 또는 같은 IL-17A 또는 TNFα의 양을 포함하는지 분석할 수 있다. 또한 용어 "값," "양" 및 "수준"은 예를 들어 IL-17A, TNFα, IL-22, IL-17F, IL-21, 또는 IL-6의 합성률(the rate of synthesis)을 의미한다. "수준", "양" 또는 "값"의 정확한 특성은 특정 설계 및 T 세포 또는 예컨대 IL-17A, TNFα, IL-22, IL-17F, IL-21, 또는 IL-6을 검출하기 위해 사용되는 특정 분석 방법의 구성요소에 의존한다.
결합 파트너와 같은 물질의 "유효량" 또는 "치료 유효량"은, 단일 투여량으로서나 또는 일련의 투여량의 일부로서나, 관련된 병적 상태의 치료 또는 관리에 치료 효과를 제공, 또는 상태의 존재와 관련된 하나 이상의 증상을 지연 또는 최소화하기 위해 충분한 양이다. 이러한 상태는 면역억제, 예컨대 자가면역 질환과 연관될 수 있다.
생체표지자와 관련하여 용어 "발현하는(expressing)" 및 "발현(expression)"은 당업계에서 사용되는 통상적인 의미로 이해되는 것으로 의도된다. 생체표지자는 mRNA로 핵산의 전사, 이어서 접히고 가능한 추가 처리되는 폴리펩티드로 전사를 통하여 세포에 의해 발현된다. 게다가 본원에서 논의된 생체표지자는 각 세포의 표면으로 운반된다. 따라서, 세포는 이러한 생체표지자를 발현한다라는 표현(statement)은, 생체표지자는 세포의 표면에서 발견되는 것을 나타내고 각 세포의 발현 절차에 의해 합성되는 것을 의미한다. 따라서, T 세포와 같은 세포 집단 상황에서 용어 "발현 수준"은 그들의 세포 표면에 원하는 생체표지자를 갖는 세포의 수 또는 백분율을 나타낸다. 발현의 측정(determination)은 생체표지자의 표준화된 발현 수준에 기초한다. 발현 수준은 본 발명의 맥락에서 생체표지자가 아닌 유전자의 발현에 그것의 발현을 비교하여, 생체표지자의 절대 발현 수준을 보정함으로써 표준화된다. 또한 발현 수준은 상대적 발현 수준으로 제공될 수 있다.
각각의 생물학적 과정 자체에 관해서, 용어 "발현", "유전자 발현" 또는 "발현하는(expressing)"은 유전자의 핵산 서열에 인코딩된 정보를 먼저 전령 RNA(mRNA) 및 이어서 단백질로 변환하는 조절 경로 전체를 나타낸다. 따라서, 유전자의 발현은 일차 hnRNA로 전사, hnRNA를 성숙 RNA로 처리 및 mRNA 서열을 단백질의 대응하는 아미노산 서열로 번역을 포함한다. 이러한 맥락에서, 또한 용어 "유전자 산물"은, 예컨대 유전자 및 해당되는 각 전구체 단백질에 의해 코딩된 최종 단백질(이의 스플라이스 변이체를 포함) 등의 단백질 뿐만 아니라 유전자 발현의 과정에서 "첫 번째 유전자 산물"로 간주될 수 있는 각 mRNA를 나타내는 것에 유의해야한다.
면역글로불린 또는 단백질 결합 분자와 같은 폴리펩티드와 관련하여 "단편(fragment)"은 전체 길이 서열보다 짧고 단백질의 원하는 기능(면역글로불린의 경우 원하는 표적, 예를 들면 항원(예 : CD6)에 특이적으로 결합)을 수행할 수 있는 있는 한, 해당 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 서열을 의미한다. 용어 "면역글로불린 단편"은 면역글로불린의 일부, 보통 특정 분자에 대해 특이적 결합 친화도를 보이는 초가변 영역 및 주변 중쇄 및 경쇄의 일부를 나타낸다. 초가변 영역은 폴리펩티드 표적에 물리적으로 결합하는 면역글로불린의 부분이다. 당업계의 사용에 기인하여, 용어 "항체 단편" 및 "면역글로불린 단편"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 "기능적 단편"은, 하나 이상의 전체 길이 분자의 생물학적 활성을 보유하는 펩티드 또는 핵산 분자와 같은 분자의 단편을 나타낸다. 면역글로불린의 맥락에서, 기능적 단편은 면역학적 기능적 단편이다. 일반적으로 펩티드의 기능적 단편은 완전한 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 기능을 수행할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한" 표현은 올바른 의학적 판단 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 적당한 이익/위험 비율에 상응하는 다른 문제점이나 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 활성 화합물, 물질, 조성물, 담체, 및/또는 제형을 나타낸다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 나타내며, 생성물의 특정 최소 길이에 제한되지 않는다. 두 용어가 함께 사용되는 경우, 이러한 이중의 명명은 당엽계에서 나란히 두 용어의 사용을 설명한다.
의료/생리학적 맥락, 즉 생리 상태의 문맥에서 용어 "예방"은 유기체가 비정상 상태에 걸리거나 발생하는 확률을 감소시키는 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "특이적(specific)"은 결합 파트너가 본원에 개시된 생체표지자, 예컨대 CD6에 유도, 결합 또는 반응하는 것을 나타내는 것으로 이해된다. 따라서, 유도, 결합 또는 반응하는 것은 결합 파트너가 예컨대 CD6에 특이적으로 결합하는 것을 포함한다. 이 문맥에서 용어 "특이적으로(specifically)"는 결합 파트너가 CD6, 경우에 따라, 또는/및 이의 일부와 반응하지만, 적어도 본질적으로 다른 단백질과 반응하지 않는 것을 의미한다. 용어 "다른 단백질"은 예컨대 결합 파트너가 유도된 CD6 과 밀접하게 관련되거나 상응하는 단백질을 포함한 모든 단백질을 포함한다. 용어 "본질적으로 결합하지 않는"은 결합 파트너가 다른 단백질에 특정한 친화력을 갖지 않는 것을 의미하며, 예컨대 CD6 친화력에 비해 약 30% 이하의 교차-반응성을 나타낸다. 일부 실시예에서 결합 파트너는 약 20% 이하, 예컨대 약 10% 이하의 교차-반응성을 나타낸다. 일부 실시예에서 결합 파트너는 CD6 친화력에 비교할 때, 약 9, 8, 또는 7% 이하의 교차-반응성을 나타낸다. 일부 실시예에서 결합 파트너는 예를 들어 CD6 친화력에 비교할 때, 약 6%, 예컨대 약 5% 이하의 교차-반응성을 나타낸다. 본원에서 상기 정의된 바와 같이 결합 파트너가 특이적으로 반응하는지는, 그 중에서도 예컨대 CD6과 각 결합 파트너의 반응을 비교하고 경우에 따라 다른 단백질과 결합 파트너의 반응을 비교함으로써 쉽게 테스트할 수 있다. 용어 "이동된(directed to)" 또는 "반응하는"과 상호교환적으로 사용될 수 있는 용어 "특이적으로 인식하는"은 본 발명의 맥락에서 특정 분자, 일반적으로 면역글로불린, 면역글로불린 단편 또는 면역글로불린-유사 기능을 가진 단백질 결합 분자가 본원에서 정의된 항원결정부(epitope)의 적어도 2개, 적어도 3개를 포함, 예컨대 적어도 4개 또는 그 이상의 아미노산과 특이적으로 상화작용 및/또는 결합이 가능한 것을 의미한다. 대체로 분자와 결합하는 면역글로불린 또는 단백질 결합 분자는 그렇게 함으로써 예컨대 CD6의 각 항원결정부와 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 결합은 "자물쇠-열쇠 원리(lock-and-key-principle)"의 특이성을 예로 들 수 있다. 또한 "특이적 결합"은 예를 들어 Western blot, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-test, FACS, IHC 및 펩티드 스캔에 따라 결정할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대용(Surrogate) 항체"는 생쥐에서 항 CD6 도메인 1 결합 항체의 효과를 연구하기 위해 자체 개발되고 쥐 항 마우스 CD6 IgG 2c로 식별되는 이톨리주맙에 대한 대용 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 그것은 1. 마우스 CD6의 도메인 1에 결합, 2. ALCAM 결합과 경쟁하지 않음. 3. 항 CD3로 자극된 비장세포로부터 나이브(naive) T 세포의 증식을 억제. 4. 쥐의 전신적인(systemically) 고갈이 없음. 5. T1h의 그것과 비슷한 친화력을 갖는 등 이톨리주맙과 동등한 특성을 갖는다.
본원에서 사용된 용어 "개체(subject)"(또한 개인으로 부름)은 인간 또는 비-인간 동물, 일반적으로 포유동물을 나타낸다. 개체는 토끼, 생쥐, 쥐, 기니피그, 햄스터, 개, 고양이, 돼지, 소, 염소, 양, 말, 원숭이, 영장류 또는 인간 등 포유류 종일 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법, 용도 및 조성물은 인간 및 동물 질환 모두에 적용할 수 있다. 샘플은 개체로부터 얻었다. 채액 샘플 또는 생검(biopsy) 샘플이 같은 경우, 당업계에서 일상적으로 사용되는 종래의 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 따라서 샘플에서의 발현 수준으로부터 결론을 도출하고, 그에 기초한 결정은 샘플을 채취한 개체에 대한 것으로 이해된다. 개체가 질환 또는 증상에 대한 치료를 받고 있는 살아있는 인간인 경우에는 "환자"라고도 한다.
본원에서 사용된 용어 "치료" 및 "치료하는"은 치료 효과를 갖는 예방 또는 예방을 위한 조치 및 개체의 유기체에서 병적을 포함한 비정상 상태를 예방, 늦춤(줄임), 또는 적어도 부분적으로 완화 또는 저해를 나탄낸다. 치료가 필요한 개체들은 이미 질병을 가진 개체, 뿐만 아니라 질병을 갖기 쉬운 개체 또는 질병이 방지(예방)될 수 있는 개체를 포함한다. 일반적으로 치료는 존재와 관련된 증상의 진행 및/또는 질환 또는 병리 상태의 진행을 감소, 안정화, 또는 억제한다. 용어 “투여”는 개체의 세포 또는 조직에 화합물을 포함하는 방법에 관한 것이다. 용어 "치료 효과"는 비정상 상태를 일으키거나 기여하는 요소의 억제 또는 활성화를 의미한다. 치료 효과는 비정상 상태 또는 질병의 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화한다. 용어 "비정상 상태"는 유기체에서 정상적인 기능에서 벗어난 유기체의 세포 또는 조직의 기능을 의미한다. 비정상 상태는 특히 세포 증식, 세포분화, 또는 세포 수명과 관련된다.
용어 "구성하는", "포함하는”, "함유한", "갖는" 등은 확장하거나 제약을 두지 않고 제한없이 읽어야 한다. 달리 명확하게 언급되지 않는 한, 단수는 복수의 개체를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "매개체"의 언급은 단일 매개체 뿐만 아니라 매개체의 복수(동일하거나 상이)를 포함한다. 마찬가지로 "세포"의 언급은 단일세포 뿐만 아니라 세포의 복수를 포함한다. 달리 명시하지 않으면, 일련의 요소에 선행하는 용어 "적어도"는 일련의 모든 요소를 참조하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "하나 이상" 및 "하나 이상의”는 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5 또는 그 이상의 요소를 포함한다. 더욱이 명시된 범위의 이상 및 이하의 약간의 차이는 범위 내의 값으로서 실질적으로 동일한 결과를 달성하기 위해 사용될 수 있는 것으로 이해해야한다. 또한, 달리 언급하지 않는 한, 발명의 범위는 최소 및 최대값 사이의 모든 값을 포함하는 연속적인 범위로 의도된다.
어떠한 사용된 용어의 범위 및 의미는 용어가 사용되는 특정 문맥으로부터 명백할 것이다. 더욱이 본원 전체에서 사용되는 선택된 용어의 구체적 정의는, 적용되는 경우, 상세한 설명의 적절한 문맥에 따른다. 다르게 정의되지 않는한, 설명, 도면 및 청구항에 사용된 모든 다른 과학 및 기술 용어는 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것으로서 통상적인 의미를 갖는다.
질병을 치료하기 위한 방법 및 용도
본 발명자들은 놀랍게도 항-CD3 항체와의 공동-자극(co-stimulation)으로 매개되는 항 CD6 항체가 매우 중요하고, IL-23R의 발현을 촉진함으로써 안정적인 Th17 발달(development)을 위한 나이브 T 세포를 준비시키는 항 CD28/CD3에 의해 유도된 공동-자극에 비해 명백히 더 중요함을 발견하였다. 따라서, 항-CD6 항체는 면역억제 활성을 갖고, Th1 및 Th17 (T 세포를 생산하는 IL-23R) 매개 염증성 자가면역 질환을 선택적으로 억제한다.
이론에 구속되는 것은 아니지만, 본 발명자들은 IL-23R이 항원 제시 세포, 예컨대 수지상 세포 및 대식세포에 의해 발현되는 것으로 추측하였다. 항원 제시 세포에 의한 IL-23R의 발현은 경우에 따라 자가면역 및 만성 염증성 상태를 매개하는 자가-반응성 T 세포가 될 수 있는 Th1 및 Th17 표현형과 함께 T 세포의 팽창을 벗어나 생성되는 T 세포 반응을 변화(skew)시킨다.
다발성 경화증과 같은 자가면역 및 만성 염증성 질병의 치료를 위한 현재의 요법은 주로 비특이적이며 심각한 부작용을 갖는 스테로이드 및 다른 NSAID의 사용에 초점을 맞추고 있다. 특히, 특정 이러한 치료는 주로 종양 괴사 인자 알파(Tumor necrosis factor alpha, TNF-α)의 발현 또는 기능적 활성을 억제하도록 작용한다. 예를 들어, 키메라 단일클론 항체 INFLIXIMAB (Remicade®) 는 TNF-α 기능을 표적으로 한다. 비록 특정 환자에 효과적이지만, 이러한 항-TNF-α 치료는 특정 환자 또는 특정 자가면역 상태 치료 시 효과적일 수 있으며, 또는 나아가, 또한 원치 않은 부작용의 발생을 초래할 수 있다.
본 발명자들은 Th1 및/또는 Th 17-매개 질병 및 상태, 특히 비정상적인 Th1 및/또는 Th17반응이 자가-반응성 Th1 및/또는 Th17 T 세포의 발생으로 인해 발생하는 자가면역 또는 면역-매개 상태의 치료에 본 발명의 결합 파트너 또는 조성물의 유용성을 확인했다.
본 발명에 따라 처리되는 개체는 건강한 개체와 비교할 때, Th17 T 세포의 증가된 수를 갖는 것으로 알려지거나 의심된다. Th17 T 세포는 시그너처 사이토카인 IL-17A의 생성의 이름을 따서 명명했다. 게다가, 또한 Th17 T 세포는 IL-17F, IL-21, IL-22, GM-CSF, TNFα 및 IL-6를 생성한다.
개체에서 Th17 T 세포 수의 증가는 개체 내 체액 또는 개체로부터 얻은 체액에서 T 세포 존재를 분석함으로써 검출할 수 있다.
개체 내 Th17 T 세포 수의 증가는 Th17 T 세포에 의해 생성되는 것으로 알려진 사이토카인의 수준을 분석함으로써 검출할 수 있다. 따라서, 일부 실시예에서 개체 내 Th17 T 세포 수의 증가는 개체 내 IL-17A의 수준을 감지하고 건강한 개체에서 IL-17A의 수준을 비교함으로써 검출할 수 있다. 일부 실시예에서 개체 내 Th17 T 세포 수의 증가수는 개체 내 TNFα의 수준을 검출하고 건강한 개체에서 TNFα의 수준을 비교함으로써 검출할 수 있다. 일부 실시예에서 개체 내 Th17 T 세포 수의 증가는 개체 내 IL-6의 수준을 검출하고 건강한 개체에서 TNFα의 수준을 비교함으로써 검출할 수 있다. 일부 실시예에서 개체 내 Th17 T 세포 수의 증가는 개체 내 인터페론 감마 (IFN-γ)의 수준을 검출하고 건강한 개체에서 인터페론 감마 (IFN-γ)의 수준을 비교함으로써 검출할 수 있다.
본원에 기재된 결합 파트너는 CD6에 특이적으로 결합한다. "CD6"은 "Cluster of Differentiation 6"(분화클러스터)의 약어이다. 단백질은 또한 T-세포 분화 항원 CD6, 뿐만 아니라 T12 또는 TP120으로 불린다. CD6은 일부 실시예에서 SwissProt/UniProt 수납번호(accession no.) Q61003 (2014. 7. 9.자 버전 117)의 마우스 단백질이다. 일부 실시예에서 CD6은 SwissProt/UniProt 수납번호 P30203 (2014. 7. 9.자 버전 125)의 인간 단백질이다. 일부 실시예에서 CD6은 SwissProt/UniProt 수납번호 Q8WWJ4 (2014. 4. 16.자 버전 59)를 갖는 인간 단백질 CD6의 이소형(isoform) d이다. 일부 실시예에서 CD6은 SwissProt/UniProt 수납번호 Q8WWJ6 ((2014. 4. 16.자 버전 59)를 갖는 인간 단백질 CD6의 이소형 c이다. 일부 실시예에서 CD6은 SwissProt/UniProt 수납번호 Q8WWJ3 (2014. 4. 16.자 버전 59)를 갖는 인간 단백질 CD6의 이소형 b이다. 일부 실시예에서 CD6은 SwissProt/UniProt 수납번호 Q8WWJ7 (2014. 4. 16.자 버전 60)를 갖는 인간 단백질 CD6의 이소형 e이다. 일부 실시예에서 CD6은 SwissProt/UniProt 수납번호 Q8N4Q7 (2014. 4. 16.자 버전 66)의 인간 단백질이다. 일부 실시예에서 CD6은 SwissProt/UniProt 수납번호 G5E973 (2014. 7. 9.자 버전 26)의 인간 단백질 CD6의 이소형 CRA d이다. 일부 실시예에서 CD6은 SwissProt/UniProt 수납번호 Q5FVU4 (2014. 7. 9.자 버전 69)의 쥐 단백질이다. 일부 실시예에서 CD6은 SwissProt/UniProt 수납번호 H9ZFC2 (2014. 4. 16.자 버전 7)의 히말라야 원숭이(Rhesus macaque) (Macaca mulatta, 붉은털 원숭이) 단백질이다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 일부 실시예에서, 개체의 혈액 세포 및/또는 수지상 세포에서 IL-23R 발현을 분석했다. 일부 실시예에서 환자의 체액 내 하나 이상의 TNF-α, IFN-감마, IL-17, 및 IL-17A의 수준을 분석했다. 혼합림프구반응에서, 도 1에 도시된 바와 같이 Th1 및 Th17 사이토카인 IL17A가 T1h의 존재 하에 감소되는 것을 관찰했다. CD6의 도메인 1에 대용 항체를 이용한 동물 모델에서, 도 2에 도시된 바와 같이 Th1 및 Th17 (IL17A) 사이토카인의 감소를 관찰했다.
본 발명의 맥락에서 모든 이용 가능한 방법이 핵산 또는 단백질의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에서 공지된 확립된 표준절차를 포함한다. 이러한 기술의 예는 RT-PCR, RNAse 보호 분석법, Northern 분석, Western 분석, ELISA, 방사면역측정법 또는 형광 적정 분석을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다. 세포 내/상 IL-17, IFN-감마 또는 TNF-α 등 생체표지자의 양을 평가는 각 생체표지자를 코딩하는 세포 내 핵산(예: RNA)의 양 평가를 포함한다. 핵산 프로브(probe)는 생체표지자의 핵산 분자 양을 검출하기 위한 모든 보통의 혼성화법에 의해 샘플을 검사하는데 사용될 수 있다. 핵산 프로브를 얻기 위해 화학 합성을 수행할 수 있다. 먼저 합성된 핵산 프로브는 각각의 프로브를 얻기 위해, 기본적으로 적절한 템플릿을 이용하여 표준 PCR 프로토콜에 따른 알려진 PCR 기술에 따라 수행되는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에서 프라이머로서 사용될 수 있다. 통상의 기술자는 생체표지자로 이용할 서열에 기초하여 이러한 프로브를 쉽게 설계할 수 있을 것이다. 혼성(hybridization) 프로브는 방사능표지(radiolabel), 효소 라벨, 형광 라벨, 비오틴-아비딘 라벨, 화학발광 또는 나노입자 등 표준 라벨링 기술에 의해 표시될 수 있다. 혼성 후, 프로브는 표준 기술을 이용하여 시각화할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 검출 방법은 핵산 또는 단백질에 의한 신호의 증폭, 예컨대 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 또는 예컨대 면역글로불린에 접합된 형태로, 비오틴-스트렙타비딘을 사용하는 것을 포함할 수 있으며, 기에서 더욱 상세히 설명한다. 예를 들어 검출 방법은 예컨대 Western 분석 또는 ELISA에서, 부착된 라벨에 연계될 수 있는 항체(예: 면역글로불린)의 사용을 포함할 수 있다. 원하는 경우, 검출을 위해 세포 내 면역글로불린을 사용할 수 있다. 검출 단계의 일부 또는 전부는 자동 감지 시스템의 일부일 수 있다. 이러한 시스템의 예로는 자동화 실시간 PCR 플랫폼(real-time PCR platforms), 자동 핵산 분리(isolation) 플랫폼, PCR 생성물 분석기(product analysers) 및 실시간 검출 시스템이 있다. 전술한 바와 같이, 본원에서 사용된 용어 "항체"는 선택된 단백질(예: L-셀렉틴 또는 T 세포에 특이적 단백질)에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 및 면역글로불린 단편, 뿐만 아니라 면역글로불린-유사 기능을 가진 각각의 단백질 결합 분자를 포함하는 것으로 이해된다. 항체는 예를 들어 EGF-유사 도메인, 크링글(Kringle)-도메인, 피브로넥틴 타입 I 도메인, 피브로넥틴 타입 II 도메인, 피브로넥틴 타입 III 도메인, PAN 도메인, Gla 도메인, SRCR 도메인, 쿠니츠/소(Bovine) 췌장 트립신 억제제 도메인, 텐다미스타트(tendamistat), 카잘-형 세린 프로테아제 억제제 도메인, 트레포일 (P-형) 도메인, 폰빌레브란트 인자 타입 C 도메인, 아나필라톡신-유사 도메인, CUB 도메인, 티로글로불린 타입 I 반복(repeat), LDL-수용체 계열 A 도메인, 스시 도메인, 링크(Link) 도메인, 트롬보스폰딘 타입 I 도메인, 면역글로불린 도메인 또는 면역글로불린-유사 도메인 (예를 들어 도메인 항체 또는 카멜 중쇄 항체), C-형 렉틴 도메인, MAM 도메인, 폰빌레브란트 인자 타입 A 도메인, 소마토메딘 B 도메인, WAP-형 4개의 이황화 코어(four disulfide core) 도메인, F5/8 타입 C 도메인, 헤모펙신 도메인, SH2 도메인, SH3 도메인, 라미닌-형 EGF-유사 도메인, C2 도메인, "카파바디(Kappabody)" (111. et al., Protein Eng (1997) 10, 949-957), "미니바디(Minibody)" (Martin et al., EMBO J (1994) 13, 5303-5309), "디아바디" (Holliger et al., PNAS U.S.A. 90, 6444-6448 (1993)), "야누신(Janusin)" (Traunecker et al., EMBO J (1991) 10, 3655-3659 or Traunecker et al., Int J Cancer (1992) Suppl 7, 51-52), 나노바디, 애드넥틴(adnectin), 테트라넥틴, 마이크로바디, 아필린(affilin), 아피바디(affibody) 또는 안키린(ankyrin), 크리스탈린, 노틴(knottin), 유비퀴틴, 아연집게(zinc-finger) 단백질, 자가형광 단백질, 안키린 또는 안키린 반복 단백질 또는 류신-풍부 반복 단백질일 수 있다(또한 아래 참조).
예를 들어 수준 또는 영의 측정은 분광, 광화학, 측광, 형광, 방사선, 효소 또는 열역학적 수단에 의존할 수 있다. 분광 검출 방법의 일례는 형광 상관 분광법이다. 광화학 방법은 예를 들어 광화학 교차-결합이다. 광활성, 형광, 방사성 또는 효소 라벨의 사용은 각각 측광, 형광, 방사선 및 효소 검출 방법에 대한 예이다. 열역학적 검출 방법의 일례는 등온 측정 열량법이다. 라벨의 구체적인 예로서, 수용성, 바이오-기능화된 반도체 양자점의 사용에 대한 자세한 프로토콜은 Lidke et al. (Current Protocols in Cell Biology, [2007] Suppl. 36, 25.1.1-25.1.18)에 의해 주어졌다. 이러한 양자점은 특히 높은 광안정성을 가지며, 일, 시간, 분에 대한 위치 측정을 모니터링 할 수 있다. 이들은 일반적으로 형광 나노입자다. 양자점의 종류를 단일 레이저 선에 의해 자극(excited)할 수 있기 때문에, 다중-컬러 라벨링을 수행할 수 있다. 검출은 예를 들면 유세포 분석기(flow cytometer)의 다른 형광 채널에서 편리하게 수행될 수 있다. 양자점 은 IL-17, IFN-감마 또는 TNF-α의 결합 파트너에 결합할 수 있다.
사용되는 측정은 일반적으로 선택된 임계값의 범위 내에서, 관심있는 생체표지자(예: IL-17, IFN-감마 또는 TNF-α)를 발현하는 세포를 검출할 수 있는 감도인 것을 선택하며, 특히 IL-17, IFN-감마 또는 TNF-α를 발현하는 세포가 임계값 이하인지 결정할 수 있는 감도를 선택한다. 일반적으로 IL-17, IFN-감마 또는 TNF-α의 결합 파트너는 각각 검출할 수 있는 마커와 함께 사용한다. 이러한 IL-17, IFN-감마 또는 TNF-α의 결합 파트너는 각각 IL-17, IFN-감마 또는 TNF-α에 대한 검출할 수 있는 친화력과 특이성을 갖는다. 일반적으로, 결합은 결합 친화도가 10-6M 보다 높은 경우 특이적으로 여긴다. 예컨대 IL-17, IFN-감마, TNF-α, 또는 IL-23R의 결합 파트너는 일부 실시예에서 각각 약 10-8 M 또는 이상, 또는 약 10-9 M 또는 이상의 친화도를 갖는다.
예컨대 IL-17, IFN-감마, TNF-α, 또는 IL-23R의 각 결합 파트너, 뿐만 아니라 다른 선택된 세포-특징적 단백질(cell-characteristic protein)에 대한 결합 파트너는 면역글로불린, 이의 단편 또는 면역글로불린-유사 기능을 갖는 단백질 결합 분자 다. 항체 단편은 보통 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. (재조합) 항체 단편의 예는 Fab 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 단일-사슬 Fv 단편 (scFv), 디아바디 또는 도메인 항체 (Holt, L.J., et al., Trends Biotechnol. (2003), 21, 11, 484-490) 등 면역글로불린 단편이다. 면역글로불린-유사 기능을 가진 단백질 결합 분자의 예는 리포칼린 패밀리의 폴리펩티드를 기초로 한 뮤테인이다(WO 03/029462, Beste et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96, 1898-1903). 빌린(bilin) 결합 단백질, 인간 호중구 젤라티나제-관련 리포칼린(the human neutrophil gelatinase-associated lipocalin), 인간 아포지질단백질 D 또는 글리코델린 등 리포칼린은 합텐으로 알려진 선택된 작은 단백질 영역에 결합하도록 수정할 수 있는 생체작용물질(natural ligand)-결합 부위를 가지고 있다. 다른 단백질 결합 분자의 예로는 소위 글루바디(glubodies) (국제 특허 출원 제 WO 96/23879 호 또는 Napolitano, E.W., et al., Chemistry & Biology (1996) 3, 5, 359-367을 참조), 안키린 스캐폴드(scaffold)에 기초한 단백질 (Mosavi, L.K., et al., 단백질 Science (2004) 13, 6, 1435-1448) 또는 크리스탈린 스캐폴드 (e.g. 국제 특허 출원 제 WO 01/04144호), Skerra, J. Mol. Recognit. (2000) 13, 167-187에 기재된 단백질, 애드넥틴, 테트라넥틴 및 아비머(avimers)가 있다. 아비머는 일부 세포 표면 수용체에 여러 도메인의 스트링(string)으로 발생하는 소위 A-도메인을 포함한다 (Silverman, J., et al., Nature Biotechnology (2005) 23, 1556-1561). 인간 피브로넥틴 도메인에서 유래된 애드넥틴은 표적에 면역글로불린-유사 결합을 조작할 수 있는 3개의 루프를 포함한다(Gill, D.S. & Damle, N.K., Current Opinion in Biotechnology (2006) 17, 653-658). 인간 동형 삼량체(homotrimeric) 단백질에서 유래된 테트라넥틴은 마찬가지로 원하는 결합을 설계할 수 있는 C-형 렉틴 도메인에 루프 영역을 포함한다(Gill, D.S. & Damle, N.K., Current Opinion in Biotechnology (2006) 17, 653-658). 단백질 리간드로 작용할 수 있는 펩토이드는 측쇄가 탄소 원자보다 아미드 질소에 연결된 펩티드와는 다른 올리고(N-알킬) 글리신이다. 펩토이드는 보통 프로테아제 및 다른 수정 효소에 내성이 있고, 펩티드 보다 훨씬 높은 세포 투과성을 가질 수 있다(Kwon, Y.-U., and Kodadek, T., J. Am. Chem. Soc. (2007) 129, 1508-1509 참조). 또한 적합한 항체는 일부 실시예에서 여러 면역글로불린 단편을 포함하는 다중특이성 항체일 수 있다. [0253] 면역글로불린 또는 면역글로불린-유사 기능을 갖는 단백질 결합 분자는 필요하다면 페길화(PEGylated) 또는 과글리코실화 될 수 있다. 일부 실시예에서 면역글로불린-유사 기능의 단백질 결합 분자는 상기 예시적인 단백질 결합 분자 중 하나 및 알부민-결합 도메인(예컨대 연쇄상 구균 단백질 G의 알부민-결합 도메인)의 융합 단백질이다. 일부 실시예에서 면역글로불린-유사 기능의 단백질 결합 분자는 단일-사슬 디아바디 등 면역글로불린 단편 및 면역글로불린 결합 도메인(예: 박테리아 면역글로불린 결합 도메인)의 융합 단백질이다. 구체적인 예로서, 단일-사슬 디아바디는 Unverdorben et al.에 기술된 바와 같이, 포도상구균 단백질 A의 도메인 B에 융합될 수 있다(Protein Engineering, Design & Selection [2012] 25, 81-88).
본 발명의 일 양태에 따르면, 자가-반응성 Th1 및/또는 Th17 T 세포에 의해 발생된 자가면역 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하며, 방법은 하기의 단계를 포함한다:
- 항-CD6 항체를 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 제공하는 단계; 및
- 자가-반응성 Th1 및/또는 Th17 T 세포에 의해 발생된 자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 개체에게 T-헬퍼 17 림프구 (Th17 T 세포) 및/또는 T-헬퍼 1 림프구 (Th1 T 세포)의 활성을 억제하기에 충분한 양의 상기 항체를 투여하는 단계.
일부 실시예에서, 관심있는 유전자의 발현 수준을 결정하는 것은 mRNA로 전사 수준의 결정을 포함한다. IL-17, IFN-감마, TNF-α, 또는 IL-23R 등 샘플에 관심 단백질을 코딩하는 RNA는 모든 이용가능한 증폭 기술을 사용하여 증폭할 수 있으며, 예로는 다중 PCR, 네스티드(nested) PCR 및 ARMS(amplification refractory mutation specific) PCR(또한 대립유전자-특이(allele-specific) PCR (AS-PCR)이라고도 함) 등 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 회전환 증폭(rolling circle amplification, RCA), nucleic acid sequence based amplification (NASBA), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR), QB 복제효소 연쇄 반응, 고리-매개 등온 증폭 (LAMP), 전사 매개 증폭(TMA) 및 게놈 가닥 교체 증폭(WGSDA), 다중 가닥 교체 증폭 (MSDA), 및 유전자 특이적 가닥 교체 증폭 (GS-MSDA)등 가닥 교체 증폭(SDA)이 있다. 수득된 증폭 산물의 검출은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 예로는 브롬화 에티듐 염색 등의 염색과 결합하여 아가로스 겔 전기영동과 같은 전기영동 방법을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 실시간 PCR 등 실시간 검출을 포함한다. 이러한 실시예에서, 증폭 과정의 시간 경과를 모니터링한다. 당업계에서 일반적으로 사용되는 실시간 검출 수단은 증폭 과정 전, 염료의 추가를 포함한다. 이러한 염료의 예로는 형광 염료 SYBR Green이 있으며, 이는 이중-가닥 핵산에 결합해야만 형광 신호를 낸다.
보통 검출 가능한 표지 또는 마커를 사용한다. 이러한 마커 또는 라벨은 증폭된 서열을 포함하는 핵산에 포함된다. 또한 마커는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 또한 반응 과정에서 증폭 산물에 혼입될 수 있다. 일부 실시 예에서, 이러한 마커 화합물(예: 핵산에 포함)은 시각적으로 검출가능한 표지, 형광단, 또는 발색단이다. 마커 화합물의 구체적인 예는 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein, FAM)이다.
구체적인 예로서, 실시간 PCR은 IL-17, IFN-감마, TNF-α, 또는 IL-23R 등 샘플 내 관심있는 단백질을 코딩하는 RNA의 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 PCR 절차는 실시간 검출 하에서 수행되므로, 증폭 과정의 시간 경과를 모니터링한다. PCR은 표적 서열의 대수 증폭을 특징으로 한다. RNA의 증폭을 위해, 역 전사효소-PCR을 사용한다. 본 발명의 생체표지자 발현을 검출하기 위해 요구되는 프라이머 및 프로브의 설계는 통상의 기술자의 기술 범위 내이다. 일부 실시 예에서, 샘플로부터 RNA를 RNAse가 없는 조건에서 분리하고, 역전사효소의 사용을 통해 DNA로 변환한다. 역전사는 하나의 반응 용기 내에서, RT-PCR 분석에 앞서 또는 동시에 수행된다. RT-PCR 프로브는 형광 부분(reporter dye 라고도 함)을 갖는 올리고뉴클레오티드이며, 5' 말단에 부착되고 소광제 부분은 3' 말단에 연결된다(또는 그 반대). 이 프로브는 일반적으로 PCR 생성물의 내부 영역에 혼성화(hybridize)하도록 설계된다. 비-혼성화 상태에서, 형광(fluor) 및 소광(quench) 분자의 근접은 프로브로부터 형광 신호의 검출을 방해한다. PCR 증폭 동안, RT-PCR 프로브가 결합된 템플릿을 중합효소가 복제할 때, 중합효소의 5'-3' 뉴클레아제 활성은 프로브를 가른다(cleave). 이에 의하여 형광 및 소광(quenching) 부분이 분리된다. 그 다음 형광은 프로브 절단 양에 비례하는 방식으로, 각 주기에서 증가한다. 반응으로부터 방출된 형광 신호를 측정하거나, 일상적이고 통상적인 기술을 이용하여 시판되고 있는 장치를 사용하여 시간에 걸쳐 추적할 수 있다. 평가되는 샘플 내 생체표지자 RNA의 정량은 RNA의 양을 유사한 방법으로 평가하여 공지된 하나 이상의 표준 곡선과 증폭 신호의 비교에 의해 수행된다. 일부 실시 예에서, 생체표지자 발현의 차이는 임계(threshold) 형광에 도달하는 PCR 사이클 시간의 차이 또는 "dCT"로 측정한다.
본원에 기재된 방법 또는 용도의 일부 실시 예에서, 자가면역 질환이 치료되고 있다. 본 발명의 특정 실시 예에서, 본원에 개시된 조성물은 T-헬퍼 17 림프구 (Th17) 매개 면역 반응 및 T-헬퍼 1 림프구 (Th1) 매개 면역 반응 모두 억제한다. 특장 실시 예에서, 자가-반응성 T 세포에 의해 매개되는 질환은 자가면역 질환 또는 만성 염증성 질환이다.
본 발명의 특정 실시 예에서, 자가면역 질환은 다발성 경화증 (MS)이다. 일부 실시예에서, 자가면역 질환은 류마티스 관절염 (RA)이다. 일부 실시예에서, 자가면역 질환은 크론병과 같은 염증성 장 질환 (Inflammatory Bowel Disease, IBD) 이다. 자가면역 질환은 일부 실시예에서 궤양성 대장염이다. 일부 실시 예에서, 자가면역 질환은 제1형 당뇨병이다. 일부 실시 예에서, 자가면역 질환은 건선이다.
본 명세서에서 이전에 공개된 문서의 목록 또는 고찰은, 반드시 문서가 종래 기술의 일부이거나 일반 상식이라는 인정으로 간주되어서는 안된다.
본원에 예시적으로 설명된 결합 파트너, 조성물, 방법 및 용도는 본원에서 명확하게 기재되지 않은, 어떤 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에서 적절하게 실시될 수 있다. 게다가, 본원에서 사용된 용어 및 표현은 설명의 용어로 사용되고, 제한되지 않으며, 도시되고 설명된 특징, 또는 이의 부분에, 어떤 상당 하는 것을 배제하는 이러한 용어 및 표현의 사용 의도는 없지만, 다양한 변형이 가능하다는 것이 인식된다. 따라서, 본 결합 파트너, 조성물, 방법 및 용도가 실시 예 및 선택적인 특징에 의해 구체적으로 나타나 있지만, 본원 내 포함된 결합 파트너, 조성물, 방법 및 용도의 수정 및 변형은 통상의 기술자에 의해 의지할 수 있고, 이러한 수정 및 변형은 개시된 결합 파트너, 조성물, 방법 및 용도의 범위 내에 속하는 것으로 간주되는 것으로 이해하여야 한다.
결합 파트너, 조성물, 방법 및 용도는 본원에 광범위하고 일반적으로 설명되어있다. 또한 포괄적인 개시내용에 속하는 보다 좁은 종 및 아속 그룹 각각은 결합 파트너, 조성물, 방법 및 용도의 일부를 형성한다. 이는 절단되는 개체가 본원에 구체적으로 열거되어 있는지와 관계없이, 속(genus)으로부터 어떤 개체를 제거하는 부정적 한정 또는 조건(proviso)을 갖는 결합 파트너, 조성물, 방법 및 용도의 일반적인 설명을 포함한다.
다른 실시 예들은 청구범위 내에 있다. 게다가, 결합 파트너, 조성물, 방법 및 용도의 특징 또는 양태가 마쿠쉬 그룹의 용어로 기재되어 있는 경우, 또한 통상의 기술자는 결합 파트너, 조성물, 방법 및 용도가 이에 마쿠쉬 그룹의 개별 구성원 또는 구성원의 하위그룹의 용어로 기술되어 있음을 인식할 것이다.
결합 파트너, 조성물, 방법 및 용도가 쉽게 이해되고 실질적으로 실행되기 위하여, 이제 특정 실시 예가 다음의 비-제한적인 실시 예의 방식에 의해 설명될 것이다.
실시예 1:
혼합림프구반응 및 사이토카인 분석:
PBMC의 제조:
혈액 30 ml를 건강한 기증자로부터 채취하였다. PBMC를 표준 피콜(FICOLL) 밀도 구배 원심분리 Monocyte Depletion & Setting up Dendritic Cell Derivation Assay에 의해 분리했다: 이들 세포를 2시간 동안 CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 단핵구를 소성(plastic) 표면에 부착하였다. 이어서 비-부착 세포 (PBLs)를 플라스크에서 제거하였다. 모든 플라스크를 1XPBS로 한번 세척하였다. DC 배양액 20 ml (분석배지 50 ml 내 스톡 50 ml, GMCSF 10 μl 및 IL-4 5 μl로 제조)를 각 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 6일 동안 CO2 인큐베이터에 보관하였다.
성장한 수지상 세포에 LPS 처리:
6일째, LPS와 함께 DC 배양액을 각 플라스크에 첨가하고(플라스크 내 LPS의 최종 농도는 4 μg/ml), 40- 48시간 동안 CO2 인큐베이터에 보관하였다.
혼합 림프구 분석을 위한 세포의 제조:
DC의 제조:
LPS 처리 후, 세포 부유액(DC)을 2개의 플라스크에서 채취하였다. 각 플라스크를 1XPBS로 한번 세척하였다. 세포 부유액을 5분 동안 1500rpm에서 원심분리(spun down)하고 3 ml 배지에서 환원(reconstituted)하였다. DC로 처리된LPS를 계산하고, 분석 요구사항에 따라 배지에서 재구성하였다.
PBL의 제조:
전술한 바와 같이 동일한 프로토콜에 따라, 다른 건강한 개인으로부터 혈액을 채취한 후 피콜 분리를 수행하였다. 단핵구 고갈 후, 비부착 세포(PBLs)를 수집하고, 5분 동안 1500 rpm에서 원심분리하고, 5 ml 배지에서 환원하였다. PBL를 계산하고 1.0 X 106 세포/ml로 제구성하였다.
수지상 세포에 SEB 처리:
SEB의 제조: SEB 스톡 농도는 1mg/ml이다. 스톡으로부터 SEB의 작동용액 1 μg/ml를 얻기 위해 SEB 3 μl를 3 ml 배지에 용해시켰다. 처리: 표준화된 프로토콜에 따라, 0.06 x 106 DC를 SEB 0.6 μg으로 처리하였다. 스톡 0.1 x 106 세포/ml (성숙된 DC 처리한LPS)를 만들었다. 이로부터, 세포 현탄액 600μl를2.4 ml 분석 배지에 용해시켰다 (세포 현탁액의 총 부피는 0.02 x 106 세포/ml를 포함하는 3 ml). 이를 5분 동안 1500rpm에서 원심분리하고 SEB(1μg/ml) 600μl를 펠릿에 첨가하였다. 이를 37°C에서 20분 동안 CO2 인큐베이터 내에서 배양하였다. 배양 후 추가 배양액(2ml)을 튜브에 첨가하고 5분 동안 1500rpm에서 세척하였다. 상층액을 버리고 세포를 다시 배양액 3 ml로 세척하였다. 마지막으로 펠릿을 분석 배지 3 ml에 용해시켰다.
PBL에 미토마이신 C 처리:
25μg/ml 미토마이신 용액을 1mg/ml의 미토마이신 스톡으로부터 제조하였다. 0.5 x 106 PBL을 37°C에서 CO2 인큐베이터 안에서 30분 동안 25μg/ml 미토마이신 500μl으로 처리하였다. 배양 후 추가 배양액(2ml)을 첨가하고, 세포를 5개의 배지에 1500rpm에서 세척하였다. 상층액을 버리고 세포를 다시 배양액 3 ml로 세척하였다.
MLR 분석 - 증식의 억제:
MLR 분석을 DC:PBL = 1:50비율에서 수행하였다. 사용된 음성 대조군은 니모투주맵이다. 6일 후 플레이트를 알라머 블루(alamar blue)로 읽었다. 평행 판으로부터 상층액을 채취하고, 제조업체의 지시에 따라 사용되는 Th1, Th2 및 Th17 CBA 인간 키트 (BD biosciences, Pharmingen, USA)를 사용하여 사이토카인에 대해 분석하였다. 사이토카인의 농도는 키트와 함께 제공된 표준에서 결정된다. 모든 샘플을 Summit 4.3 Software을 이용하여 Cyan -ADP, 벡크만 쿨터(Beckman Coulter), 유세포 분석기로 분석하였다.
결과: 평가된 중요한 사이토카인에서 유의한 차이는 대조군(니모투주맵) 처리된 그룹과 비교하여, 이톨리주맙의 존재 하에서 관찰된다. 평균 Th17결정 사이토카인, IL17 이 거의 50% 감소했다.
실시 예 2:
EAE의 유도 및 치료:
마우스를 0일에 열-사멸된 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) H37Ra 500μg을 포함하는 CFA의 동일 부피와 혼합된 PBS 내 MOG 35-55의 20μg으로 구성된 에멀전 200μl로 피하 면역시켰다. 에멀전을 배부(dorsum) 아래 중 하나에 주입하고, 그 다음 0.01M PBS 내 B. 백일해 독소(pertussis toxin, 0.2μg/100μl) 100μl을 측면 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사하였다. 3일 째에 B. 백일해 독소 100μl를 추가 접종하였다. 7일째에 다른 측면에 피하 주입된 MOG/CFA 에멀전 200μl으로 마우스를 재-면역시켰다. 14일째, 마우스를 대조군 및 항 CD6 처리 마우스로서 무작위로 분류했다. 치료된 마우스 그룹에 항-마우스 CD6 MAb (R&DSystem)/10D12 60μg/100ul/용량을 격일마다 복강 내 주입하였다. 대조 마우스에 항-쥐 IgG Mab을 같은 용량으로 주입하였다. 마우스를 EAE 증상에 대해 관찰하였다. 대조군 및 치료된 그룹에서 질병 심각도 및 발병을 14-32일에 5점 척도(point scale)로 임상 점수로 기록했다(0, 정상; 0.5, 뻣뻣한 꼬리; 1, 축 처진 꼬리; 1.5, 오른쪽 불능의 축 처진 꼬리; 2, 사지 하나의 마비; 2.5, 사지 하나의 마비와 다른 사지 하나의 약함; 3, 뒷다리 모두 완전 마비; 4, 빈사상태; 5, 죽음). 평균 임상 점수를 하나의 그룹에 대한 임상 점수를 가산하고 해당 그룹의 마우스 총수에 의해 나눔으로써 계산했다. 마우스에서 질환의 유도는 95% 이상이었다.
T 세포 수용체 (CD3) 매개 증식 분석
마우스를 30일째에 희생시켰다. 비장과 혈액을 각 마우스에서 평가하였다. 같은 마우스 그룹에서 얻은 비장을 체외 실험을 위해 모았다. 면역된MOG에서 얻은 비장세포 (0.2x106 세포/웰); 대조군 및 항CD6 MAb 처리 마우스를 96 웰 플레이트(Nunc)에서 피복(precoated) 항CD3 MAb (2.5μg/ml)로 자극하였다. 코팅되지 않은 웰에 비장세포를 자극되지 않은 대조 세포로 사용했다. 세포를 3일 동안 배양하였다. 3일째에 알라머 블루 (30μl/웰; Invitrogen)을 첨가하였다. 하룻밤 후, 다음날 아침 배양 판을 Biotek Synergy 플레이트 측정기를 이용하여 530/590 nm에서 읽었다. 데이터를 두 그룹의 비자극 및 자극 비장세포로부터 평균 상대 형광 단위 (Relative fluorescence unit, RFU) 값으로 나타냈다.
사이토카인 분석
사이토카인 분석을 위해 증식 분석의 동일한 설정을 비장세포의 자극을 위해 사용했다. 요약하면, 면역된MOG에서 얻은 비장세포 (0.2x106 세포/웰); 대조군 및 항CD6 MAb 처리 마우스를 96 웰 플레이트(Nunc)에서 피복(precoated) 항CD3 MAb (2.5μg/ml)로 자극하였다. 코팅되지 않은 웰에 비장세포를 자극되지 않은 대조 세포로 사용했다. 3일째에 상청액을 채취하고, 제조사의 지침에 따라 시토미터릭 비드 어레이(Cytometeric bead array, CBA) 염증성 사이토카인 키트 (인터류킨-6, 인터류킨-10, 인터류킨-12p70, 인터페론-γ, 종양 괴사 인자-α) (BD Biosciences, USA)를 이용하여 사이토카인 측정을 실시할 때까지 -80°C에서 보존하였다. 요약하면, 분리 형광 강도 및 사이토카인 특정 포획 항체로 코팅된 혼합 비즈(bead) 집단 50μl를 상청액 50μl와 염증성 사이토카인 항체에 대한 피코에리트린 검출 시약 50 μl에 첨가했다. 동시에, 각 사이토카인(0-5000pg/ml)에 대한 표준을 마찬가지로 사이토카인 포획 비즈 및 피코에리트린 검출 n 시약과 혼합하였다. 와류(vortexed) 혼합물을 2시간 동안 실온, 어둠 속에서 배양시켰다. 비드를 유세포 분석기(CyAnDMADP, Dako)에서 세척하고 획득했다. 표준 곡선을 키트와 함께 제공된 사이토카인 표준으로부터 유도하고, 각 사이토카인의 양(pg/ml)을 표준 그래프를 이용하여 계산했다.
인터류킨-17A의 검출을 위해 플렉스 세트 분석 키트(BD Biosciences, USA)를 제조사의 지침에 따라 사용하였다. 요약하면, IL-17A 특정 포획 항체로 코팅된 포회 비드 용액 50 μl를 상청액 또는 표준(0-5000 pg/ml) 50μl에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 비드를 세척하고 피코에리트린 검출 시약 50 μl와 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 비드를 세척하고 유세포 분석기 (CyAnDMADP, Dako)에서 획득했다. 표준 곡선을 키트와 함께 제공된 사이토카인 표준으로부터 유도하고, IL-17A 의 양(pg/ml)을 표준 그래프를 이용하여 계산했다.
결과: 항-마우스 CD6 항체로 처리된 마우스는 쥐 항체 처리군에 비해 상당한 임상적 개선을 보였다. 통계상으로 대조 쥐 IgG 처리군에 비해 항 마우스 CD6 처리군에서 다음의 사이토카인 TNFα, IL6, IFNy 및 IL17에 대해 상당한 차이가 관찰됐다.
실시예 3:
방법:
1. Th17 극성(polarization)에 대한 인간 PBMC 배양
인간 혈액을 건강한 지원자로부터 피험자 동의서에 서명 한 후 채취하고, PBMC를 (말초 혈액 단핵 세포, peripheral blood mononuclear cell) Ficoll Paque (GE Healthcare Bio-sciences AB, Uppsala, Sweden)를 통해 표준 밀도구배 원심분리에 의해 분리시켰다. PBMC를 계산하고, 웰 당 10만 세포 밀도에서 96 웰 평 바닥판에 평판 배양하고, 비-극성(polarizing) (Thnp) 및 Th17 극성(polarizing) 상태 (Th17pol) 하에서 항-CD3/항-CD28 코팅 비드 (웰 당 10만 세포에 대한 5ng 의 최종 농도에서 비드에 코팅 각 항체)로 자극했다. Th17pol 상태에서, 극성 사이토카인 및 성장 인자를 IL-1β 10ng/mL, IL-6 10ng/mL, TGF-β 15 ng/mL, IL-23 10ng/mL, 항-IL-4 10μg/mL 및 항-IFN-γ 2.5μg/mL의 최종 농도에 첨가했다. 이톨리주맙 또는 무관한(irrelevant) 이소타입 대조 항체 (대조군)을 40μg/mL의 최종 농도에서 Thnp 및 Thpol 상태 모두 내 세포에 첨가했다. 세포를 37°C CO2 인큐베이터에서 13일 동안 배양하고, 사이토카인, 세포-표면 및 세포 내 마커 분석에 대해 다양한 시점(3일, 6일, 8일 및 13일)에서 샘플링했다. 지속적으로 배양되는 세포의 경우, 배지 50μl를 Thnp 조건의 경우 2ng/mL IL-2를 포함하는 RPMI 완전 배지 및 Th17pol 조건의 경우 10ng/ml IL-23과 함께 2ng/mL IL-2 로 6일과 10일째에 대체했다.
2. 사이토카인 분석
각 시점에서, 세포 상청액 100μl를 사중 웰에서 채취 및 모으고 -80℃에서 얼렸다. 사이토카인 분석을 제조사의 지침에 따라 R&D Systems로부터 Human IFN-γ Quantikine SixPak (SIF50) 및 Human IL-17 (IL-17A) Quantikine SixPak (S1700) 키트를 이용하여 수행했다. SpectraMax M5e 리더, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA을 이용하여 흡광도를 450/630nm에서 읽었다.
3. 유동세포계수법 분석
세포 표면 마커 염색: 각 시점에서, 사중 웰(quadruplicate well)로부터 세포를 회수하고, 인간 Fc 수용체 결합 억제제로 저지하고, 30분동안 4℃에서 배양했다. 세포를 원심분리하고, 세포 표면 마커 (예: CD4, CD8, CD25, CD6)에 대한 항체를 포함하는 염색 버퍼 (2% FBS in 1X PBS)에서 재현탁했다. 시료의 수집 및 분석을 Summit version 4.3 software (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)의 Cyan-ADP 유세포 분석기를 이용하여 수행했다. 림프구는 전면 및 측면 산란(scatter)에 의해 게이트(gated)되고, 나아가 CD4+T 세포 상에 게이트(gated) 됐다.
4. 통계 분석
GraphPad Prism 6.0 software (GraphPad software, San Diego, CA, USA)를 모든 통계 분석에 대해 사용했다. 통계적 유의도를 알파=5.000%으로, Holm-Sidak 방법에 따른 언페어 t 검증(unpaired t test)을 이용하여 결정했다(도 3B).
결과:
Th17 극성 상태에서 T 세포 활성화 및 CD6 과발현.
도 3A에 나타난 바와 같이, 13일까지, 분비된 IL-17 수준 증가는 Thnp 세포 (항-CD3/항-CD28로 자극된PBMC, 비-극성 상태; Thnp)에 비해, Th17pol 조건 (Th17극성, Th17pol, 사이토카인의 존재 하에 항-CD3/항-CD28로 자극된 PBMC)에서 자극된 세포 내 IFN-γ 방출 상승보다 3-4 배 높았다. 13일째에 IL-17 및 IFN-γ의 절대 농도를 도 3B에 도시했다. Th17pol 조건에서 자극된 세포에 의해 방출된 IFN-γ는 Thnp 세포에 비해 상당히 낮았다. 마찬가지로 이들 Th17pol 세포는 Thnp 세포에 비해 분비된 IL-17 수준에서 3-4 배 증가를 보였다. 이러한 결과는 Th17pol 조건 하에서 Th17 세포에 대한 변화는 13일까지 전체 확립(establishment)으로 3일만큼 일찍 시작되는 것을 나타낸다. Thnp 뿐만 아니라 Th17pol 조건에서 발현에 대한CD25 (IL-2Ra) 의해 나타낸 바와 같이, 3일째에 CD4+ T 세포의 유사한 활성화가 있었다(도 3C).
CD4+ T 세포에서 CD6 수용체의 표면 발현은 자극 48시간 후에 증가했고, 극성 실험의 종료, 12/13일까지 지속되었다. 9일째 대표 분석을, 한 기증자에 대한 CD4+T 세포에 CD6 발현에 대한 히스토그램 오버레이로 도 3D에 나타냈다. 검출 시약으로서 비오틴화(Biotinylated) 이톨리주맙 (항-인간 CD6)은, Thnp 및 Th17pol 조건에서 각각 CD4+T 세포의 15-30%와 25-35%에 CD6 과발현을 확인했다(도 3D). 도 3E (6개의 다른 공여체 데이터)에 도시된 바와 같이, Thnp 및 Th17pol CD4+T 세포는 자극되지 않은 세포 상에 CD6 MFI에 있어 일관성있는 증가를 보였다. 또한 CD6 발현 증가를 시판되는 도메인 1 결합 항-CD6 항체를 이용하여 확인하였다(MEM98 및 MT605 클론 도 3E). Thnp 세포에 비해 Th17pol에서 CD6 MFI 증가는(도 3D 및 E) Th1 세포에 비해 CD6을 과발현하는 Th17 세포의 클론에서 유래한 임상 샘플의 보고와 일치한다(Brucklacher-Waldert, Stuerner et al. 2009). 이러한 과발현은 CD4+ T 세포에 한정되는 것이 아니라 활성화된 CD8+ T 세포에서도 관찰되었다.
실시예4:
방법:
1. Th17 극성에 대한 인간 PBMC 배양: 실시예3에 기재된 바와 같다. 실험은 이 특정 경우에 있어서 3일 및 6일까지 수행했다.
2. CFSE 라벨링 및 T 세포 증식 분석
PBMC를 최종 농도 5μΜ에서 CFSE 염료로 배양, 37 °C, CO2 인큐베이터에서 15분 동안 배양하고(간헐적 흔듦), 원심분리하고 완전 배지에서 재현탁(resuspended)하고, 안정화를 위해 다시 30분 동안 37 °C, CO2 인큐베이터에서 배양했다. 세포를 세척하고 Thnp 및 Th17pol 조건에서 대조군 또는 이톨리주맙 항체로 자극했다. 자극 후 3일째에, 세포를 유세포 분석법을 사용하여 CD4+T 세포 상의 CFSE 희석에 대해 분석했다.
3. 유동세포계수법 분석
세포 표면 마커 염색: 각 시점에서, 사중 웰(quadruplicate well)로부터 세포를 회수하고 인간 Fc 수용체 결합 억제제로 방지하고 30분 동안 4℃에서 배양했다. 세포를 원심분리하고 세포 표면 마커 (e.g. CD4, CD8, CD25)에 관한 항체를 포함하는 염색 버퍼 (1X PBS 내 2% FBS)에서 재현탁했다. 시료의 수집 및 분석을 Summit version 4.3 software로 Cyan-ADP 유세포 분석기를 이용하여 수행했다(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). 림프구는 전면 및 측면 산란(scatter)에 의해 게이트(gated)되고, 나아가 CD4+T 세포 상에 게이트(gated) 됐다.
결과:
이톨리주맙은 Thnp 및 Th17pol 조건에서 T 세포 활성화 및 증식과 관련된다.
우리는 이전에 이톨리주맙의 존재에서 항-CD3 뿐만 아니라 항-CD3 및 ALCAM 공동-자극(co-stimulated) 세포에 대한 CD25 발현의 50-55% 감소를 보고했다 (Nair, Melarkode et al. 2010). 여기서, 우리는 이톨리주맙의 존재 하에 Thnp 및 Th17pol 조건에서 자극된 CD4+ T 세포 상의 CD25 발현의 상당한 감소(-50% 감소)가 있다는 것을 보였다(도 4A). 이는 다양한 자극 상황에서 항체가 지속적 및 유사하게 T 세포의 활성을 억제할 수 있다는 것을 의미한다.
T 세포 활성의 억제와 유사하게, 또한 이톨리주맙이 T 세포의 증식을 억제하는 것을 발견했다. 이톨리주맙의 존재 하에, T 세포 활성화 및 증식에 이톨리주맙의 억제 역할을 확인하면서 CD4+T 세포 증식에 상당한 감소(Thnp에서 -38% 및 Th17pol 상태에서 -62 % 감소)가 관찰됐다(CFSE lo 세포의 감소된 수에 의해 표시) (도 4B).
실시예 5:
방법:
1. Th17 극성에 대한 인간 PBMC 배양: 실시예3에 기재된 바와 같다
2. 유동세포계수법 분석
IL-17A 및 IFN-γ에 대한 세포 내 사이토카인 염색을 다음과 같이 수행했다. 분석의 각 시점에서, 세포를 BD Golgi Stop Plug™ 존재 하에 PMA 50 ng/mL 및 이오노마이신 1μg/mL로 비자극 또는 자극하고, 37℃에서 5시간 동안 배양했다. 세포를 회수하고, 염색 버퍼에서 세척하고, 인간 Fc 수용체 결합 억제제로 방지했다. 표면 마커 염색 후, 세포를 BD Cytofix/Cytoperm™ 고정(fixation)/투과화(permeabilization) 버퍼에서 재현탁하고, 제조사의 지침에 따라 세포 내 염색을 수행했다. 시료의 수집 및 분석을 Summit version 4.3 software로 Cyan-ADP 유세포 분석기를 이용하여 수행했다(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). 각 실험에서 언급된 바와 같이 림프구는 전면 및 측면 산란(scatter)에 의해 게이트(gated)되고, 나아가 CD3+T 세포 상에 게이트(gated) 됐다.
3. 사이토카인 분석
각 시점에서, 세포 상청액 100μl를 사중 웰에서 채취 및 모으고 -80℃에서 얼렸다. 사이토카인 분석을 제조사의 지침에 따라 R&D System으로부터 Human IFN-γ Quantikine SixPak (SIF50) 및 Human IL-17 (IL-17A) Quantikine SixPak (S1700) 키트를 이용하여 수행했다. SpectraMax M5e 리더, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA를 이용하여 흡광도를 450/630nm에서 읽었다.
4. 통계 분석
GraphPad Prism 6.0 software (GraphPad software, San Diego, CA, USA)를 모든 통계 분석에 대해 사용했다. 통계적 유의도를 알파=5.000%으로, Holm-Sidak 방법에 따른 언페어 t 검증(unpaired t test)을 이용하여 결정했다 (도 5 D 및 E).
결과:
이톨리주맙은 Th17 홀마크(hallmark) 사이토카인의 감소와 관련이 있다
Th17pol 조건 하에서, Th1 (IFN-γ) 및 Th17 (IL-17A) 시그너처 사이토카인의 세포 내 발현을 대조 항체 및 이톨리주맙 처리 세포 사이에서 비교했다. 6일 날로부터 대표 점 도표는 대조군과 비교하여, 이톨리주맙 처리시 IFN-γ 및 IL-17A 모두의 최소한의 발현을 나타낸다(도 5A). 또한 이톨리주맙 처리로 유사한 감소가 Thnp 조건에서 관찰됐다.
3, 6, 8 및 13일에 걸쳐 시간경과 연구는6일 및 8일째에 세포 내 IFN-γ에서 최대 감소를 보였다(도 5B). 이와 유사하게, 또한 이톨리주맙에 의한 세포 내 IL-17A의 최대 감소(80-90%)가 이 날들에 관찰됐다(도 5C). 또한 이톨리주맙 처리시 IFN-γ 및 IL-17 방출에 있어 해당 상관관계 및 감소를(분비된 사이토카인을 측정함으로써 평가) 관찰했다(도 5D 및 E). 측정된 세포내 사이토카인과 분비된 사이토카인 모두에 대한 유사한 억제 패턴은 2가지 주요한 효과기 Th 서브셋에서의 이톨리주맙의 효과를 확인하였다. .
실시예 6:
방법:
1. Th17 극성에 대한 인간 PBMC 배양: 실시예3에 기재된 바와 같다
2. 유동세포계수법 분석
pSTAT3에 대한 세포 내 염색을 다음과 같이 수행했다. 분석의 각 시점에서 세포를 회수하고, 염색 버퍼에서 세척하고, 인간 Fc 수용체 결합 억제제로 방지했다. 표면 마커 (CD4) 염색 후, 세포를 2% PFA (각 염색 웰에 대해 100μl)로 고정시키고 4℃에서 15-20분 동안 배양했다. 세포를 PBS로 두번 세척하고, 100% 냉각 메탄올로 투과시켰다. 세포를 서서히 와류(vortexing)시키는 동안 냉각 메탄올 500μl를 첨가하고, 20분 동안 4℃에서 배양했다. 원심분리 후, 4 ℃에서 5분동안 ~250 x g에서 메탄올을 따라내고, 세포를 염색 버퍼에서 재현탁(resuspended)했다. 세포 내 염색에 대한 항체를 염색 버퍼에서 희석하고, 적절한 희석액에 첨가하고, 플레이트를 30분동안 4℃에서 배양했다. 세포를 염색 버퍼에서 세번 세척하고, 1x PBS로 재현탁(resuspended)하고, 수득했다 (모든 세척은 4℃에서 행함).
IL-17A 및 전사인자 RORγT 에 대한 세포 내 사이토카인 염색을 다음과 같이 수행하였다. 분석의 각 시점에서, 세포를 BD Golgi Stop Plug™ 존재 하에 PMA 50 ng/mL 및 이오노마이신 1μg/mL로 비자극 또는 자극하고, 37℃에서 5시간 동안 배양했다. 세포를 회수하고, 염색 버퍼에서 세척하고, 인간 Fc 수용체 결합 억제제로 방지했다. 표면 마커(CD3) 염색 후, 세포를 BD Cytofix/Cytoperm™ 고정(fixation)/투과화(permeabilization) 버퍼에서 재현탁하고, 제조사의 지침에 따라 세포 내 염색을 수행했다.
IL-17A와 표면 마커 CCR6 및 CD3에 대한 세포 내 사이토카인 염색을 다음과 같이 수행하였다. 분석의 각 시점에서, 세포를 BD Golgi Stop Plug™ 존재 하에 PMA 50 ng/mL 및 이오노마이신 1μg/mL로 비자극 또는 자극하고, 37℃에서 5시간 동안 배양했다. 세포를 회수하고, 염색 버퍼에서 세척하고, 인간 Fc 수용체 결합 억제제로 방지했다. 표면 마커(CD3 및 CCR6) 염색 후, 세포를 BD Cytofix/Cytoperm™ 고정(fixation)/투과화(permeabilization) 버퍼에서 재현탁하고, 제조사의 지침에 따라 세포 내 염색을 수행했다.
시료의 수집 및 분석을 Summit version 4.3 software로 Cyan-ADP 유세포 분석기를 이용하여 수행했다(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). 각 패널에서 언급한 바와 같이 림프구는 전면 및 측면 산란(scatter)에 의해 게이트(gated)되고, 나아가 CD4+ 또는CD3+T 세포 상에 게이트(gated) 됐다.
결과:
이톨리주맙의 존재 하에 시그너처 Th17 특이 마커의 감소
Th17 분화(differentiation)는 pSTAT3 및 RORγT 전사인자의 시너지 조합을 포함한다 (Annunziato, Cosmi et al. 2007; Bettelli, Korn et al. 2008; de Wit, Souwer et al. 2011). 이전에 우리는 활성화된 T 세포에 pSTAT3 발현의 이톨리주맙 매개 감소를 보고했으며(Nair, Melarkode et al. 2010), 또한 본 연구에서 확인했다(도 6A). 또한 우리는 Th17pol 조건에서 대조 항체 처리된 세포에 비해, 이톨리주맙의 존재 하에 IL-17A 및 RORγT 이중 양성(double positive) T 세포에 상당한 감소가 있는 것을 밝혔다. 효과기 사이토카인의 최대 억제와 관련하여(도 5B-E), 발명자들은 6일째에 이러한 이중 양성 세포 (70-80% 감소) 및 전체 RORγT MFI에 상당한 감소를 관찰했다 (각각 도 6B 및 6C). 비슷한 경향이 8일째에도 관찰되었다.
CCR6은 Th17 세포에 대한 시그너처 표면 마커다(Liu and Rohowsky-Kochan 2008; Singh, Zhang et al. 2008). 그러므로 IL-17 생성 T 세포의 CCR6 발현 및 그들에 이톨리주맙의 효과를 평가하는 것에 흥미가 있다. 6일째에 분석된 바와 같이, Th17pol 조건에서, CCR6+IL-17A+ (이중 양성) CD3+T 세포 발현의 50-60% 감소를 대조군과 비교할 때 이톨리주맙의 존재 하에 관찰했다(도 6D). 10일째에 유사한 감소도 관찰되었다.
CCR6+T 세포는 기억 또는 조절(Treg) 세포 중 하나이지만(Yamazaki, Yang et al. 2008), 모든 이러한 세포가 IL-17 생산 Th17 세포는 아니다(Sallusto, Lenig et al. 1998; Liao, Rabin et al. 1999; Kleinewietfeld, Puentes et al. 2005). 이톨리주맙은 IL-17-CCR6+에 거의 영향을 주지 않았다 (비-Th17 세포). 이 관찰은 대조군에 비해 이톨리주맙의 존재 하에 전체 RORγT MFI에 관찰된 감소와 구별되며(도 6C), 이는 이톨리주맙이 전사인자 RORγT의 발현을 하향조절(down regulate)할 수 있지만 단지 CCR6 발현 T 세포의 IL17+ 서브셋에 영향을 줄 수 있다는 것을 시사한다. 이러한 실험은 prove that 일에 걸쳐 이톨리주맙이 RORγT + IL-17A+ and CCR6+IL-17+ T 세포와 함께 주요 전사인자 pSTAT3, RORγT을 억제함으로써 Th17 세포의 활성 및 분화를 억제한다는 것을 증명한다(도 6).

Claims (5)

  1. CD6의 D1에 특이적으로 결합하는 인간화 항체인 이톨리주맙을 포함하는, 개체의 이식편대숙주병의 억제 또는 치료에 사용하기 위한 약학 조성물로,
    상기 개체는 CD25 발현이 증가되고, 증가된 수의 T 헬퍼 17 (Th17) 세포를 가지며, 상기 이톨리주맙은 CD25의 발현을 감소시키고, CD4 + T 세포, CD8+ T 세포 및 Th17 림프구의 증식을 감소시키고, 상기 Th17 림프구는 TNF-알파, IL-17 및 IL-17A 중 하나 이상을 생성하며, 상기 감소는 이톨리주맙이 투여되지 않은 이식편대숙주병을 갖는 개체가 기준인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 개체는 건강한 개체와 비교할 때 증가된 수의 T 헬퍼 1 (Th1) 세포를 갖는 것으로 추가로 알려진, 약학 조성물.

  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
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